Protocolo para obtencion de embriones de pollo en laboratorio

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura
Departamento de Biología - Área Zoología
EMBRIOLOGÍA ANIMAL
PROTOCOLO PARA OBTENCIÓN DE
EMBRIONES DE POLLO EN LABORATORIO
Lic. María Teresa Sandoval
Jefe de Trabajos Prácticos. Asignatura Embriología Animal.
PROTOCOLO PARA OBTENCIÓN DE EMBRIONES DE POLLO EN LABORATORIO
MATERIALES NECESARIOS
- Huevos de pollo recién puestos (sin incubar). Estos deben ser de buena calidad, de un
origen de confianza que asegure huevos fértiles.
- Estufa de cultivo
- Elementos de disección: tijeras, pinzas, bisturí, aguja histológica, etc.
- Pipetas Pasteur
- Cápsulas de Petri
- Cucharitas plásticas
- Pincel de cerdas suaves
- Formol al 10%
- Glicerol (1 parte de glicerina + 3 partes de alcohol 96°) + granos de Timol
-Azul de Metileno
PROCEDIMIENTO PARA LA INCUBACIÓN DE HUEVOS
Colocar los huevos en forma horizontal (Fig. 1 a) en la incubadora, previamente templada
a 37-38°C y aproximadamente 40-45 % de humedad y dejarlos por el período de tiempo
deseado. Controlar periódicamente que la temperatura y humedad se mantengan dentro de
los límites mencionados.
FIJACIÓN DE EMBRIONES TEMPRANOS (hasta 5 días de incubación)
Tomar un huevo y perforar la cáscara por el extremo romo (Fig. 1 b), donde se halla la
cámara de aire (utilizar el ovoscopio para identificar su posición). A continuación, introducir
delicadamente la tijera de disección por el orificio y realizar una abertura en la cáscara
(Fig. 1 c-e), teniendo la precaución de no dañar la yema. Luego, con ayuda de una pipeta
Pasteur, retirar la albúmina y en su reemplazo colocar formol al 10% hasta cubrir
completamente al embrión (Fig. 1 f y g). Rotular los ejemplares y colocarlos en recipientes
de boca ancha con tapa hermética y cubrirlos con formol.
PREPARACIÓN DE EMBRIONES TEMPRANOS
Luego de varios días de fijación, 7 como mínimo, romper la cáscara, tomar la yema con
una cuchara y disponerla sobre una placa de Petri con abundante agua (Fig. 2 a y b). El
embrión debe quedar hacia arriba. Con ayuda de un pincel de cerdas suaves, retirar restos
de albúmina que hayan quedado adheridos (Fig. 2 c y d).
A continuación realizar un corte circundando al embrión, dejando un espacio de 3-5 cm
como mínimo a su alrededor (Fig. 2 e). Esto servirá para tomar y mover el embrión sin
dañarlo. Una vez realizado el corte superficial, continuar con la sección profunda de la
yema de modo tal que se separe un “casquete” conteniendo al embrión. A continuación, y
con ayuda de una cuchara plástica, separar cuidadosamente el “casquete” y sumergirlo en
una placa de Petri con agua limpia (Fig. 2 f)
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
FIGURA 1: Fijación de embriones tempranos.
LIMPIEZA DEL MATERIAL: consiste en retirar el vitelo a fin de aislar al embrión.
Con ayuda de una pinza sujetar el “casquete” que contiene al embrión y con una aguja
histológica o la punta de otra pinza comenzar a retirar el vitelo, muy suavemente. Para ello,
introducir delicadamente la aguja desde abajo (nunca desde arriba ya que se dañaría el
ejemplar) y, con delicados movimientos, desprender el vitelo. Comenzar por la parte más
externa e ir avanzando hacia el centro del “casquete” (Fig. g y h). Este procedimiento debe
realizarse con mucho cuidado ya que el embrión es extremadamente delicado. Se
recomienda cambiar el medio por agua limpia cuantas veces sea necesario. Para ello
retirar el líquido con una pipeta Pasteur y reemplazarlo del mismo modo. Se puede agitar
suavemente la placa a fin de desprender el vitelo que haya quedado adherido.
Si se ha adquirido suficiente práctica en el manejo de los embriones, se puede voltear el
ejemplar y retirar los gránulos vitelinos con ayuda de un pincel de cerdas suaves.
Una vez limpio el embrión, colocarlo en un medio limpio. Para mover los embriones de un
recipiente a otro, tomarlo desde un extremo (sujetando con la pinza las membranas que lo
acompañan) y colocarlo cuidadosamente sobre una cuchara plástica. Luego, con ayuda de
una pinza o pipeta con líquido deslizar al embrión en el recipiente deseado (Fig. 3 a – e)
! IMPORTANTE: mantener siempre al embrión en un medio líquido, ya que se deshidrata
rápidamente.
COLORACIÓN DE LOS EMBRIONES
Colocar los ejemplares en una cápsula y agregar el colorante (Azul de Metileno) diluido en
agua destilada. (Fig. 3 e - g). El tiempo de coloración dependerá del ejemplar, la
concentración del colorante y necesidades del observador.
CONSERVACIÓN DE EJEMPLARES
Colocar los embriones en placas o recipientes planos con tapa hermética y cubrirlos con
glicerol (Fig. 3 h) o formol 10%
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
FIGURA 2: Obtención y limpieza de embriones tempranos.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
FIGURA 3: Coloración de embriones.
FIJACIÓN DE EMBRIONES AVANZADOS (a partir de los 5 días de incubación)
Tomar el huevo y colocarlo sobre el ovoscopio para ubicar la cámara de aire. Perforar la
cáscara y realizar una abertura en esa región cuidando de no sobrepasar la membrana
interna de la cáscara (Fig. 4 a – c). Con ayuda de una pinza o bisturí romper,
suavemente, dicha membrana (Fig. 4 d - f). Tener la precaución de no tocar al embrión o
dañar la yema. A continuación colocar el huevo en un recipiente con tapa hermética y
cubrirlo completamente con Formol 10% (Fig. 4 g) Para asegurar una buena fijación,
dejar los ejemplares durante al menos 10 días en el fijador, antes de utilizarlos. Luego
pueden conservarse en alcohol 70%.
Para aislar y colorear los embriones, se procede como en el caso anterior.
OBSERVACIÓN DE EMBRIONES IN VIVO.
Tomar un huevo incubado y observarlo en el ovoscopio a fin localizar la posición de
embrión y de la cámara de aire. Realizar una abertura en la cáscara sobre el embrión.
Comenzar desde la cámara de aire y avanzar hacia el extremo opuesto, teniendo la
precaución de no dañar al embrión (Fig. 5 a – c). Para ello mantener la hoja de la tijera
aplicada sobre la cáscara (nunca en profundidad).
Esta técnica permite visualizar los latidos cardíacos, la circulación sanguínea por venas y
arterias vitelinas, movimientos espontáneos del embrión, etc (Fig. 5 d).
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
FIGURA 4: Fijación de embriones avanzados.
a)
b)
c)
b)
FIGURA 5: Observación de embriones in vivo.
PLANILLA DE EJEMPLARES
NÚMERO
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
012
013
014
015
016
017
018
019
020
021
FECHA/ HORA
INICIO
INCUBACIÓN
FECHA/HORA
FIJACIÓN
ESTADIO T°/ Hum. OBSERVACIONES