R. Callejón

Desarrollo de un método de HPLC para la determinación de
aminoácidos en vinagre y su validación en muestras reales
Trabajo de investigación presentado por
Raquel Callejón
Para optar al Diploma de Estudios Avanzados del Programa de Doctorado en Enología
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN
1.1.
EL VINAGRE
1.1.1. Tipos de vinagre
1.1.2. Historia
1.1.3. Las bacterias acéticas
1.1.4. Métodos de elaboración de vinagre
1.1.4.1.
Métodos tradicionales de acetificación con cultivo
superficial
1.1.4.2.
Métodos de acetificación con cultivo sumergido
DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN PRODUCTOS
DERIVADOS DE LA UVA
1.2.1. Aplicaciones del análisis de aminoácidos en enología
1.2.2. Métodos de análisis de aminoácidos
1.2.3. Derivatización de aminoácidos
1.2.4. Elección del método óptimo
1
1
1
2
2
6
6
11
1.2.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
13
13
16
19
30
31
2.1.
MATERIAL
2.1.1. Muestras
2.1.2. Reactivos
2.1.3. Instrumentación
Cromatógrafo líquido de alta eficacia
2.1.3.1.
2.1.3.2.
Instrumentación y material
31
31
32
34
34
34
2.2.
MÉTODOS
2.2.1. Preparación de las fases móviles
2.2.2. Condiciones cromatográficas
2.2.3. Preparación de patrones
2.2.4. Preparación de muestras
2.2.5. Reacción de derivatización
2.2.6. Identificación
2.2.7. Cuantificación
2.2.8. Límites de detección y cuantificación
2.2.9. Estudios de precisión
2.2.10. Estudios de recuperación
2.2.11. Estudios de dilución de las muestras
35
35
35
36
38
38
39
40
41
42
43
44
2.3.
44
TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1.
ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES
CROMATOGRÁFICAS
45
45
3.2.
VALIDACIÓN DEL MÉTODO
3.2.1. Especificidad o selectividad
3.2.2. Linealidad
3.2.3. Exactitud
3.2.4. Límites de detección y cuantificación
3.2.5. Estudios de precisión
3.3.
ELECCIÓN DE LA DILUCIÓN ÓPTIMA DE LAS
MUESTRAS
46
46
47
48
51
51
53
3.4.
APLICACIÓN DEL MÉTODO A MUESTRAS DE VINAGRE 54
3.4.1. Consumo de nitrógeno total
55
3.4.2. Evolución en el perfil de aminoácidos libres y amonio
57
4. CONCLUSIONES
5. BIBLIOGRAFÍA
6. ANEXO
62
64
71
Introducción
1. INTRODUCCIÓN
1.1. EL VINAGRE
Según la Reglamentación Técnico Sanitaria correspondiente (Presidencia del
Gobierno, 1993) con la denominación genérica de vinagre se designa: “el líquido apto
para el consumo humano resultante de la doble fermentación, alcohólica y acética de
productos de origen agrario que contengan azúcares o sustancias amiláceas, con una
riqueza mínima de 50 g/L”. Se entiende por grado de acidez de los vinagres su acidez
total expresada en gramos de ácido acético por 100 mL, a 20ºC. El contenido permitido
por la norma para los vinagres, expresado en ácido acético, no será inferior a 50 g/L;
excepto para el vinagre de vino, que será, al menos, de 60 g/L.
1.1.1. Tipos de vinagre
Cualquier sustrato azucarado o amiláceo puede ser utilizado en la elaboración de
vinagres. Asimismo los métodos de elaboración serán diferentes. Por tanto, los vinagres
se pueden clasificar en función del tipo de sustrato empleado o del método usado en su
elaboración.
Según la materia prima originaria se establecen los siguientes tipos (Presidencia
del Gobierno, 1993):
-
-
-
Vinagre de vino: Es el producto obtenido exclusivamente por
fermentación acética de vino.
Vinagre de frutas: Es el producto obtenido a partir de frutas o bayas.
Vinagre de alcohol: Es el producto obtenido por la fermentación acética
de alcohol destilado de origen agrario.
Vinagre de cereales: Es el producto obtenido sin destilación intermedia
por el procedimiento de doble fermentación alcohólica y acética, de
cualquier cereal en grano, cuyo almidón se ha desdoblado en azúcares
mediante un procedimiento distinto de la diastasa de la cebada malteada.
Vinagre de malta: Es el producto obtenido sin destilación intermedia por
el procedimiento de doble fermentación alcohólica y acética a partir de la
cebada malteada, con o sin adición de grano, cuyo almidón se ha
desdoblado en azúcares mediante la diastasa de la cebada malteada.
Vinagre de miel: Es el producto obtenido a partir de la miel.
Vinagre de suero de leche: Es el producto obtenido a partir de suero de
leche.
1
Introducción
1.1.2. Historia
El vinagre ha formado parte de la alimentación humana desde la antigüedad más
remota como condimento y conservador de alimentos, así como base de remedios
sencillos para hombres y animales. La fermentación alcohólica seguida de la acética se
produce espontáneamente sobre cualquier sustrato azucarado expuesto al polvo y a los
insectos que transportan levaduras y bacterias. Duddington (1961) afirma que la
elaboración de vino es un arte que data al menos de hace unos 10.000 años, por lo que
podemos suponer la existencia del vinagre desde este tiempo. Las referencias más
antiguas al uso del vinagre se hallan en la cultura babilónica (5000 a.C.) sobre la
obtención de vinagre de dátiles.
En 1732, el holandés Boerhaave hace notar que la llamada “madre del vinagre”
es un organismo vivo, aunque sin precisar su papel en la acetificación. Lavoisier
demuestra que la acetificación consiste en la oxidación de etanol, pero sin sospechar la
existencia de bacterias acéticas. Persono, (1822) describe las películas grasas que se
forman en la superficie del vino, la cerveza o el vinagre como sustancias de naturaleza
vegetal, y en la “Micología europea” añade nuevas especies de Micoderma: ollare,
mesentericum, lagenoe y pergameneum. También Chaptal había observado que la
producción de vinagre va bien cuando en la superficie del vino aparecen las llamadas
“flores de vino”, cuya aparición anuncia y precede a la acetificación, pero sobre esto
Berzelius advertía que en todas las materias orgánicas en descomposición, expuestas al
aire aparece el mismo tipo de vegetación. La acetificación también llega a formar parte
de la controversia entre químicos como Berzelius y Liebig quienes mantienen que el
proceso era puramente químico (Berzelius 1829-1833) y aquellos que afirmaban que en
dicha transformación intervenía un “ser organizado”. En cuanto a la ”madre del
vinagre”, Kützing observó que la débil película que recubre la superficie del líquido
acidificado está formada por glóbulos seis veces más pequeños que los de las levaduras;
se trataba de bacterias acéticas que fueron observadas al microscopio por primera vez
por Kützing (1837) por lo que, en las primeras clasificaciones taxonómicas de estos
microorganismos, se denominó Acetobacter kützingianum a una especie de ellos
(Llaguno, 1991).
Pasteur publicó en el año 1864 una amplia memoria sobre la fermentación
acética “Études sur le vinaigre, sa fabrication, ses maladies, mohines de les prévenir”
que recoge la conferencia que pronunció en Orleáns en 1867. Pasteur afirma que
siempre que el vino se transforma en vinagre, es debido a la acción de un velo de
Micoderma aceti desarrollado en su superficie.
1.1.3. Las bacterias acéticas
Las bacterias acéticas fueron observadas por primera vez al microscopio por
Kützing en 1837. Estas bacterias constituyen un grupo ecológico que comprende
bacterias gram-negativas (gram-positivas en cultivos viejos), aerobias estrictas y muy
sensibles al SO2. Son catalasa positiva y oxidasa negativa, pueden presentar
pigmentación en cultivos sólidos y producir diferentes tipos de polisacáridos (De Ley et
al., 1984).
2
Introducción
Al microscopio óptico las bacterias acéticas se presentan como pequeñas células
cilíndricas, frecuentemente en parejas cocobacilares, cortas y algo gruesas, alineadas o
en cadenas, y a menudo agrupadas en forma de ocho. Constituyen un grupo de
morfología variable, que se presentan en forma elipsoidal o de bastoncillos (Suárez e
Iñigo, 1990). Las bacterias acéticas crecen en medios azucarados y alcoholizados,
ligeramente ácidos como flores, frutas, cerveza, vino, sidra, vinagre, zumos de fruta
agrios y miel. En estos sustratos, las bacterias acéticas oxidan los azúcares y los
alcoholes, produciendo una acumulación de ácidos orgánicos como producto final.
Cuando el sustrato es etanol, producen ácido acético, lo que ha originado el nombre que
reciben estas bacterias. La oxidación del etanol tiene lugar en dos pasos. En el primero,
el etanol es oxidado a acetaldehído y en el segundo el acetaldehído es oxidado a acetato.
En ambas reacciones, los electrones son transferidos y el último aceptor es el oxígeno
(Figura 1.1). Esta oxidación de etanol a ácido acético es la característica mejor conocida
de la bacteria acética, pero estas bacterias también pueden oxidar glucosa a ácido
glucónico, etc. Algunas de estas transformaciones resultan interesantes desde el punto
de vista de la biotecnología. La aplicación industrial mejor conocida de las bacterias
acéticas es la producción de vinagre pero también se usan para producir sorbosa,
sorbitol y celulosa.
Etanol
2H
NAD+
Cit
Cit
O2
Acetaldehído
2H
Acetato
CAT: ciclo de los ácidos
tricarboxílicos
CR: cadena respiratoria
CAT
1/2 O2
CR
CO2
H2 O
Figura 1.1. Proceso de oxidación del etanol.
Las primeras clasificaciones de bacterias acéticas se hicieron atendiendo
exclusivamente a criterios morfológicos. Visser`t Hooft (1925) toma en consideración
también su fisiología, y más tarde Asai (1968) clasifica las bacterias acéticas según su
capacidad para metabolizar la glucosa y el ácido acético. Frateur (1950) propone un
sistema de clasificación del género Acetobacter en cuatro grupos, basado en los
caracteres bioquímicos siguientes: producción de catalasa, oxidación de acetato y
lactato a carbonato, formación de compuestos cetónicos, producción de ácido glucónico
y capacidad para crecer en un medio con alcohol y sales de amonio como única fuente
de nitrógeno (medio de Hoyer). Propuso los siguientes grupos: Acetobacter peroxydans,
Acetobacter mesoxydans, Acetobacter oxydans y Acetobacter suboxydans. El nombre de
3
Introducción
cada grupo alude fundamentalmente a su capacidad para oxidar el etanol a ácido
acético.
Durante largo tiempo se aceptó que las bacterias acéticas móviles, pertenecientes
al género Acetobacter, tenían flagelos polares monotricos, y dicho género estaba
incluido por lo tanto en la familia Pseudomonodaceae. Sin embargo, Leifson (1954)
descubrió que 30 cepas de Acetobacter no mostraban este tipo de flagelos, poniendo de
manifiesto otro tipo de disposición de flagelos: flagelación perítrica. Propuso entonces
separar Acetobacter en dos géneros: Acetobacter y Acetomonas género nov., incluyendo
en este último las especies con flagelos polares multitricos y las no flageladas, todas
incapaces de oxidar el acetato y el lactato a CO2 y H2O.
Según la clasificación recogida en el manual de Bergey, en su 8ª edición (1974),
las bacterias acéticas pertenecen al orden Pseudomonodales, familia
Pseudomonodaceae, incluyendo en esta última dos géneros distintos al género
Pseudomonas (sobre todo por su capacidad de crecimiento a pH inferior a 4.5): el
género Gluconobacter y el género Acetobacter, que incluye a su vez tres especies
importantes: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus y Acetobacter peroxydans. El
género Acetobacter puede variar en su forma de elipsoide a barra derecha, o ligeramente
curva, 0.6-0.8 µm x 1.0-1.4 µm. Se encuentran no agrupadas, en pares o formando
cadenas. Las células pueden ser móviles o no. Si son móviles, los flagelos son peritricos
o laterales, oxida acetato y lactato a CO2 y H2O. El pH óptimo para el crecimiento es de
5.4-6.3 (De Ley et al., 1984). Sin embargo, estas bacterias pueden crecer a pH bajos,
entre 3-4. El género Gluconobacter es capaz de producir grandes cantidades de ácido
glucónico a partir de glucosa, tiene incapacidad de formar películas en medios líquidos
y pobre crecimiento en sustratos que contienen etanol. Además, es incapaz de oxidar el
acetato.
En una serie de trabajos publicados por diversos autores, principalmente
Shinwell y Carr (1960), se pone de manifiesto la clara tendencia de las especies de
Acetobacter a dar cepas mutantes, originándose especies distintas a las ya existentes.
Carr (1968) publicó un trabajo en el que pone de manifiesto las observaciones hechas
por Shimwell, y afirma que en general, las bacterias acéticas no son genéticamente
estables, aunque unas especies sean más estables que otras.
La taxonomía tradicional de los microorganismos, basada fundamentalmente en
criterios morfológicos y fisiológicos, se ha visto sometida a continuas reordenaciones y
cambios. Esto se ha debido fundamentalmente a la aplicación de técnicas moleculares
muy potentes al estudio taxonómico como son la hibridación ADN-ADN, la
secuenciación de diferentes regiones del genoma bacteriano, etc. La familia
Acetobacteriaceae no ha sido una excepción a este proceso de reordenación de géneros
y especies. En el año 1997, a los dos géneros mencionados, Acetobacter y
Gluconobacter, hay que sumarle la definición de dos nuevos géneros de bacterias
acéticas: Gluconoacetobacter y Acidomonas (Yamada et al.,1997); y en los dos últimos
años se han definido otros dos nuevos géneros más: Asaia (Yamaguchi y Ninomiya,
2000) y Kozakia (Lisdiyanti et al., 2002).
Por tanto, en estos momentos, la familia Acetobacteriaceae está formada por 6
géneros y 34 especies de bacterias acéticas (Tabla 1.1). Acetobacter y
4
Introducción
Gluconoacetobacter, con 14 y 11 especies respectivamente, son los géneros donde
existe una mayor diversidad de especies (Guillamón et al., 2003).
El conocer qué cepas y bacterias acéticas están implicadas en la transformación
de etanol en ácido acético es de gran importancia por su repercusión y aplicación a la
producción industrial. En general, la producción de vinagres sólo se ha asociado con las
especies: A. aceti, A. pasteurianus, Ga. europaeus Gax. No obstante, es probable que la
especie G. oxydans se encuentre asociada a la producción de “condimentos
alimentarios” que parten directamente de mosto para la producción de acético, como
sería el “Aceto Balsamico Tradizionale” (Guillamón et al., 2003).
Tabla 1.1. Géneros y especies de bacterias acéticas descritos según Yamada, 2003.
Acetobacter
Gluconoacetobacter
Gluconobacter
A. aceti
A. pasteurianus
A. Pomorum
A. peroxydans
A. indonesiensis
A. tropicalis
A. syzygii
A. cibinongensis
A. orientalis
A. orleanensis
A. lovaniensis
A. estunensis
A. malorum
A.cerevisiae
Ga. Liquefaciens
Ga. diazotrophicus
Ga. xylinus
Ga. hansenii
Ga. obodiens
Ga. intermedius
Ga. sacchari
Ga. entanii
Ga. johannae
Ga. azotocaptans
Ga. europaeus
G. oxydans
G. frateurii
G. assaii
Acidomonas
Asaia
Kozakia
Ac. methanolica
A. bogorensis
A. siamensis
A. indonesiensis
A. krungthepensis
K. baliensis
La microbiología del proceso no se comprende todavía en su totalidad (Giudici,
2003). En el caso de las bacterias acéticas, se están desarrollando nuevas líneas de
investigación centradas en la búsqueda de técnicas de identificación rápida que además
pueden aplicarse a una correcta clasificación de las mismas. Mediante la aplicación de
las distintas técnicas de biología molecular se pretende alcanzar el objetivo de
identificar las bacterias viables responsables del proceso sin necesidad de que sean
previamente cultivadas. Como técnicas específicas para la cuantificación e
identificación de la bacteria en el proceso de acetificación se aplican en la actualidad las
siguientes:
5
Introducción
•
PCR cuantitativa: Esta técnica ya ha sido aplicada para la
cuantificación del número total de bacterias (mediante el uso de
cebadores universales) en una muestra biológica (Franke et al., 2000).
En el caso de bacterias acéticas se podrían utilizar cebadores
universales de bacterias acéticas diseñados ya para los métodos de
identificación (Ruiz et al., 2000), así como cebadores particulares de
especie, lo que permitiría una segunda cuantificación a nivel de
especie.
•
Sistemas basados en el uso de marcadores fluorescentes, como
epifluorescencia y FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation). La
primera de ellas ha sido utilizada para la cuantificación de bacterias
acéticas totales (Mesa et al., 2003). La técnica de FISH podría
permitir la identificación de bacterias acéticas a nivel de especie lo
que sería de gran utilidad y posiblemente complementaria de la PCR
cuantitativa (Franke et al., 1999).
1.1.4. Métodos de elaboración de vinagre
En el mercado existen dos tipos de vinagres. El primero se obtiene como
producto de la fermentación o acetificación con cultivo superficial, las bacterias acéticas
se encuentran en contacto directo con oxígeno gaseoso, situadas bien en la interfase
líquido/gas o bien fijadas a soportes de materiales tales como virutas, elaborándose así
la mayoría de los vinagres tradicionales. El segundo tipo se elabora por la acetificación
o fermentación con cultivo sumergido, donde las bacterias acéticas están sumergidas
libremente en el seno del líquido a fermentar, en el que constantemente se introduce
aire, (solo o enriquecido con oxígeno), en condiciones que permitan la máxima
transferencia posible desde la fase gaseosa a la fase líquida. Así se obtienen de forma
rápida los vinagres comerciales actuales de menor precio.
El vinagre de vino, se produce en los países mediterráneos de forma mayoritaria
en biorreactores y con cultivo sumergido, que puede después envejecerse o no en
madera. Los métodos tradicionales, lentos, con cultivo superficial se llevan a cabo en
toneles de madera de diferente capacidad y suponen un menor volumen de producción
(Garcia-Parrilla et al., 1998).
1.1.4.1. Métodos tradicionales de acetificación con cultivo superficial
a) Método de Orleáns
Es uno de los métodos más antiguos para fabricar vinagres. Emplea toneles de
aproximadamente 250-300 litros de capacidad, que se colocan tumbados en filas
horizontales y superpuestas, provistos de 2 agujeros de aproximadamente 5 cm en cada
extremo de los fondos de cada barril a 2/3 de la altura del fondo, que se rellenan con
6
Introducción
estopa para evitar la entrada de las moscas del vinagre, pero que dejan pasar aire
(Figura 1.2).
Figura 1.2. Pilas de botas para la acetificación en una fábrica de vinagre por el método de Orleáns.
Además, en el lateral superior se hace otro orificio que se tapa con un tapón de
corcho por donde penetra un tubo de vidrio, recto, que llega casi hasta el fondo del
líquido permitiendo renovar el sustrato sin alterar el velo bacteriano situado en la
superficie (Figura 1.3). Se trata de un procedimiento estático donde el líquido a
acetificar es una mezcla de vino de bajo grado alcohólico con un 20% de vinagre turbio.
Los rendimientos de la transformación de etanol en acético son bajos y el proceso dura
de 8 a 10 días una vez comenzada la acetificación, la velocidad depende de la
temperatura, ya que la temperatura de 30 ºC es la óptima para el crecimiento de la
bacteria acética.
7
Introducción
Embudo cubierto de gasa
Orificio tapado
con algodón
Entrada de aire
cubierta con gasa
Orificio de
observación
Indicador
de nivel
Grifo
Figura 1.3. Acetificación por el método de Orleáns (Adams, 1980).
b) Método Luxemburgués
El fundamento de este método y su diferencia fundamental con el método de
Orleáns estriba en emplear virutas de haya que periódicamente quedan sumergidas en el
líquido que está acetificándose. Así se consigue aumentar la superficie de acetificación
de la bacteria y mejorar la transferencia de oxígeno, por lo que aumenta la velocidad de
acetificación.
La cuba giratoria más elemental (Figura 1.4) se prepara con un orificio grande
en el centro de uno de los fondos, para procurar la entrada de aire. En uno de los
costados de esta cuba, en la parte más alejada de la abertura, se practica un orificio
estrecho, que puede obturarse con un tapón; es una canilla de madera o vidrio para
vaciado del envase. El tonel está dividido en dos partes desiguales por un falso fondo,
agujereado, con numerosos y finos orificios. La parte menor del tonel está llena de
virutas de haya. En este compartimento penetra un largo termómetro para controlar la
temperatura, aspecto muy interesante para todo método rápido o semirrápido. Se
obtienen cantidades de vinagre, que pueden llegar como máximo, cada cuarenta y ocho
horas, a la cuarta parte del contenido de un tonel. El vinagre elaborado, que se extrae de
las cubas, se sustituye por porciones iguales de vino, continuando la elaboración
indefinidamente (Xandri-Tagüeña, 1977).
8
Introducción
Figura 1.4. Cuba rotatoria del método Luxemburgués.
c) Método de Schüzenbach o Método Alemán
Se emplean toneles o generadores verticales de encina con doble fondo
(Figura 1.5). Sobre el primero, agujereado, se colocan una serie de capas de virutas de
madera de haya, impregnadas de vinagre de buena calidad. Sobre el borde superior lleva
un diafragma perforado, con los orificios obturados con algodón. Al pasar el vino por el
diafragma, burbujea aire que existe entre las virutas. El vinagre se extrae por la parte
inferior. Se pueden emplear barriles de roble giratorios, parcialmente llenos de virutas,
consiguiéndose así una mejor aireación. Las ventajas que se destacan de este proceso
son la regulación de oxígeno y su uso para la producción continua de vinagre.
El vinagre obtenido con el método de cultivo superficial tiene el aroma y el
gusto propio de la lentitud de la acetificación que se ve favorecido por el simultáneo
envejecimiento (Llaguno y Polo, 1991a).
9
Introducción
X
Y
X
Y
Figura 1.5. Esquema de un generador vertical, para la producción de vinagres vínicos.
Los principales inconvenientes de los métodos de acetificación en cultivo
superficial que emplean las virutas como soporte son:
-
-
Acumulación de bacterias muertas sobre las virutas (debido a falta de
aireación o aumentos de temperaturas).
Desarrollo de bacterias productoras de celulosa.
La infección por anguílulas (pequeños nematodos) que son imposibles de
combatir una vez que se desarrollan.
Aumentos de temperatura difícilmente controlables, pérdidas de alcohol
por evaporación en la corriente ascendente de aire caliente, con bajada
del rendimiento.
Necesidad de gran espacio (generadores de relleno).
10
Introducción
Entre los vinagres artesanales producidos por fermentación con cultivo
superficial con denominación de origen y reconocimiento internacional destacan el
“Aceto Balsámico Tradicionale“ de la ciudad italiana de Módena y el no menos
prestigioso “Vinagre de Jerez”.
1.1.4.2. Métodos de acetificación con cultivo sumergido
Se entiende por fermentación sumergida aquella en la que no se utiliza material
poroso o soporte, sino que se hacen circular pequeñas burbujas de aire a través de la
biomasa, con lo que se favorece el proceso fermentativo. Emplea toneles de madera o
tanques acero inoxidable quedando siempre una parte del vinagre de la operación
anterior como inóculo para iniciar el ciclo siguiente. Se llena con el vino, y se introduce
posteriormente una fuerte corriente de aire. La acetificación es muy rápida. Este proceso
se utiliza ampliamente en la actualidad. Los rendimientos de la transformación del
alcohol en ácido acético (hasta el 94%) resultan ser muy elevados. La velocidad a la que
se desarrolla el proceso es mayor (25-30 horas), así como la uniformidad del producto
y, sobre todo, se puede lograr la acetificación de iguales volúmenes de alcohol en
mucho menor volumen de instalación, con el consiguiente ahorro de espacio. Se puede
trabajar con dispositivos automáticos que no sólo regulen el control de la aireación, sino
también los ciclos de carga y descarga (Llaguno y Polo, 1991a).
Modelos Frings
En 1878, Heinrich Frings fundó en Aquisgrán una sociedad productora de
vinagre, que más tarde, en 1950, incorpora las patentes de invención resultantes de la
investigación del proceso de fermentación sumergida, alcanzando un alto grado de
desarrollo. Nació así el Acetator Frings, base de la biotecnología vinagrera actual.
A partir de las investigaciones de Hromatka y Ebner (1949), en los años 40 fue
construido el “Acetator Frings” (Figura 1.6) que se mantiene funcionando, con algunas
modificaciones, en gran parte de las industrias vinagreras actuales y en el que se elabora
la mayor parte de la producción.
11
Introducción
Figura 1.6. Acetator Frings en acero inoxidable
A, bomba de carga; B, aireador y motor; C, dispositivo para determinación de alcohol residual; D,
válvula entrada agua refrigeración; E, termostato reguladora ; F, rotámetro; G, serpentín de
refrigeración; H, entrada de aire; I, salida de gases; J, dispositivo antiespuma.
El fundamento es la presencia de cultivo sumergido en el seno del líquido a
acetificar, que se satura constantemente de pequeñas burbujas de aire. Una mayor
población bacteriana así como la disponibilidad de oxígeno para los microorganismos
permiten obtener un mayor rendimiento de la transformación de etanol en ácido acético
(del 94%) y una mayor velocidad del proceso (25-30 horas). Este procedimiento
requiere la estricta vigilancia de tres parámetros: la temperatura, la presión parcial de
oxígeno y los ciclos de carga y descarga.
La bacteria acética es viable entre 28-33ºC, pero la velocidad de fermentación
varía en función de la temperatura. La temperatura de la fermentación debe estar
comprendida dentro del intervalo entre 30-31ºC (Ormaechea, 1991) que es la
temperatura óptima para obtener un mayor rendimiento. Es obvio que la oxidación de
etanol a ácido acético es una reacción exotérmica que puede producir alrededor de 8.4
MJ por cada litro de etanol que se oxida (Adams, 1985) elevando la temperatura del
depósito. Por otra parte, cuando la temperatura es elevada aumentan las pérdidas de
alcohol y productos volátiles y, en menor cuantía, de ácido acético, pero quizás lo más
importante, es que puede ocurrir la parada del proceso por la muerte de bacterias.
Un elevado suministro de aire puede causar el fenómeno de sobreoxidación y
arrastre de los componentes volátiles y, por otro lado, su carencia puede paralizar la
acetificación dado el carácter aerobio de las bacterias acéticas. Además de la cantidad
de aire, se ha de tener en cuenta su calidad y pureza, ya que las bacterias acéticas son
sensibles a los contaminantes de este.
Todos los parámetros están interrelacionados en la acetificación; el etanol no
debe llegar a agotarse totalmente ya que las bacterias acéticas mueren rápidamente y se
pierde el cultivo. Por ello en este tipo de sistema de producción de vinagre se suele
12
Introducción
llevar a cabo la acetificación de forma discontinua realizándose ciclos de descargacarga. Así se impide que las bacterias acéticas metabolicen el ácido acético formado
convirtiéndolo en CO2 y agua. Se descarga aproximadamente el 40-45% del volumen de
líquido, que se repone con nueva materia prima suministrándole sustrato a la bacteria.
Por eso, se puede trabajar de forma automatizada con dispositivos que regulen el control
de la temperatura y de la aireación, así como los ciclos de carga y descarga. El
acetificador está constituido por un depósito de acero inoxidable de capacidad entre 100
y 300 HL. Los conductos están rodeados por un intercambiador de calor de agua para
disipar el calor producido en el proceso y mantener la temperatura a 30ºC. Para evitar
las pérdidas de compuestos volátiles se ha desarrollado un sistema cerrado (Cantero et
al., 1996), mejorando sensiblemente los resultados del proceso fermentativo. El
fermentador consta de un sistema de recirculación de aire y un sistema de control
automatizado que inyecta oxígeno en dicha corriente a medida que éste es consumido
por la biomasa. Se alcanzan así rendimientos cercanos al 100% (Gómez et al., 1993).
Los aminoácidos libres presentes en el medio son las principales fuentes de
nitrógeno para las bacterias acéticas. Ya que el sustrato para la fermentación acética
proviene de una fermentación previa realizada por levaduras (Ciani et al., 1998) resulta
importante asegurar que dicho sustrato posea suficiente nitrógeno disponible para las
bacterias.
1.2. DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN PRODUCTOS DERIVADOS
DE LA UVA
1.2.1. Aplicaciones del análisis de aminoácidos en enología
El análisis de aminoácidos encuentra aplicación en muchos campos de
investigación siendo uno de los más importantes la estimación del valor nutritivo de
alimentos para humanos y para animales. La elevada demanda de información
relacionada con el valor nutritivo ha dado lugar al desarrollo de métodos precisos para
aminoácidos. Además, es creciente el número de aplicaciones como la detección de
posibles adulteraciones en alimentos y bebidas o la determinación de aminoácidos,
péptidos o derivados potencialmente tóxicos producidos por las nuevas técnicas de
procesado de alimentos (White yHart, 1992b).
Ya en 1958, Stein y Moore aplican la cromatografía de líquidos para determinar
aminoácidos utilizando una columna de intercambio iónico y reacción postcolumna con
ninhidrina. La importancia del análisis de aminoácidos no ha dejado de crecer desde
entonces, tanto desde el punto de vista clínico como farmacéutico y alimentario.
Es conocida la importancia de los aminoácidos del mosto como nutrientes para
el desarrollo de las levaduras que realizan la fermentación alcohólica, así como el papel
que se les atribuye como precursores de los compuestos del aroma. Por otra parte, la
composición en aminoácidos del mosto está muy relacionada con la madurez de las
uvas y con la fertilización del terreno, por lo que son muchos los laboratorios
interesados en el análisis de estos compuestos (Cáceres et al., 1986). Los aminoácidos
libres representan la parte más importante del nitrógeno total en los mostos y vinos,
13
Introducción
aproximadamente entre el 30 y 40 % (Hérberger et al., 2003). Estos aminoácidos tienen
varios orígenes. Algunos proceden de la uva y pueden ser metabolizados parcial o
totalmente por levaduras al final de la fermentación o liberados de las levaduras muertas
y otros son producidos por la degradación enzimática de las proteínas de la uva. El
contenido de aminoácidos de las uvas depende de varios factores como fertilización,
condiciones climáticas y duración de la maceración de la piel en el mosto (Soufleros et
al., 2003).
Por tanto, la composición de aminoácidos es de gran importancia en la
producción de vino (Kosir y Kidric, 2001 ). Muchos aminoácidos experimentan una
serie de biotransformaciones, dando lugar a alcoholes de alto peso molecular, aldehídos,
ésteres y ácidos cetónicos, los cuales tienen un gran impacto en las propiedades
organolépticas del vino. Por este motivo a los aminoácidos se les atribuye el papel de
precursores del aroma (Soufleros et al., 2003).
A pesar de los diversos factores que afectan a los aminoácidos presentes en el
vino, muchos investigadores los han empleado para la diferenciación del producto
(Csomos y Simon-Sarkadi, 2001). Con dicho fin, así como para establecer la
autenticidad del vino, se han aplicado diferentes procedimientos quimiométricos:
análisis de cluster, análisis de componentes principales y análisis discriminante.
Hérberger et al. (2003) encontraron que la aplicación de técnicas quimiométricas al
contenido de aminoácidos y aminas biógenas resultó ser una buena herramienta para
clasificar vinos húngaros en función de la tecnología de elaboración empleada, sin
embargo, la diferenciación de las mismas según su origen geográfico, variedad y
cosecha no fue del todo satisfactoria.
Asimismo, Soufleros et al. (2003) estudiaron el perfil de aminoácidos de vinos
blancos griegos procedentes de siete variedades de uva, seis regiones geográficas, y tres
vendimias y aplicando el análisis discriminante los clasificaron en función de dichas
variables (variedad, origen geográfico y vendimia).
Brescia et al. (2002) diferenciaron vinos procedentes de pequeñas áreas de
producción de la misma región aplicando estadística multivariante a las determinaciones
de aminoácidos por resonancia magnética nuclear (RMN). Con esto se consiguió un
método útil para la protección de la denominación de origen controlada (DOC) contra la
adulteración.
Por otro lado, ya que las levaduras juegan un importante papel en el contenido
de aminoácidos en el vino, otra de las aplicaciones ha sido el estudio de la influencia de
diferentes cepas de levadura sobre los cambios que sufren los aminoácidos, péptidos y
proteínas durante el envejecimiento del cava (Martínez-Rodríguez et al., 2002). En este
estudio se utilizó el mismo vino base y cinco cepas de levaduras. Con los datos
obtenidos se dedujo que los cambios que se producen en el proceso de envejecimiento
del cava ocurren en al menos cuatro fases claramente diferenciadas y además se observó
que el empleo de una cepa de levadura u otra influye en el contenido de aminoácidos
libres y péptidos.
Pérez-Coello et al. (1999) analizaron 15 vinos elaborados en La Mancha con
varias cepas de Saccharomyces cerevisiae, utilizando la composición volátil y el perfil
14
Introducción
de aminoácidos con el objeto de determinar la cepa más adecuada para inocular los
mostos de esta región.
En otros trabajos se adicionó amonio y aminoácidos a los mostos para estudiar
su efecto en la composición aromática y en las propiedades sensoriales de los vinos
obtenidos (Hernández-Orte et al., 2002; 2005; 2006). A pesar de que el factor
determinante de la composición volátil de los vinos es la cepa de levadura, la adición
de nitrógeno a los mostos también influye, reduciendo el contenido de β-feniletanol,
metionol e isoamilalcohol y aumentando el ácido propiónico. Además, se observó que
los vinos que habían sido enriquecidos con amonio eran más ricos en lactato de etilo y
cis-3-hexenol mientras que los vinos enriquecidos con aminoácidos eran más ricos en γbutirolactona e isobutanol. Desde el punto de vista sensorial, la adición de amonio dio
lugar a un descenso en notas sulfhídricas y a un incremento en olor cítrico. Por otro
lado, se observó que las fermentaciones son mucho más rápidas en los mostos
enriquecidos (Hernández-Orte et al., 2005).
En el campo de los vinagres el análisis de aminoácidos se ha dirigido a la
caracterización de vinagres de vino (Kutlán y Molnár-Perl, 2003) y a las
transformaciones químicas y bioquímicas que se producen en los vinagres de Jerez
durante las diferentes fases de envejecimiento (Palacios et al., 2002).
La formación de vinagre implica esencialmente la conversión del etanol en ácido
acético. Los microorganismos responsables de dicha transformación son bacterias
acéticas pertenecientes a los géneros Acetobacter y Gluconobacter y los aminoácidos
presentes en el medio constituyen la principal fuente de nitrógeno para estas bacterias.
Debido a que el sustrato inicial procede de una fermentación previa realizada por
levaduras, es esencial asegurarse de que haya una cantidad adecuada de nitrógeno para
que se lleve a cabo la fermentación acética (Valero et al., 2005).
Además, se han desarrollado métodos para la determinación conjunta de
aminoácidos y otras sustancias de interés como las aminas biógenas y poliaminas en
vinos y en vinagres (Bauza et al., 1995; Herbert et al., 2000; Kutlán y Molnár-Perl.,
2003; Lozanov et al., 2004). Las aminas biógenas son compuestos que afectan a la salud
y pueden ser indicadores de unas condiciones de producción antihigiénica, formándose
a partir de ciertos aminoácidos por descarboxilación. Sin embargo, la cuantificación
rutinaria de estas sustancias no se emplea en el control cualitativo de los vinos debido
principalmente a las dificultades del análisis. De ahí la importancia de desarrollar
métodos sencillos que permitan determinar simultáneamente las aminas biógenas y
aminoácidos en vinos o en vinagres. Las poliaminas, por el contrario, tienen múltiples
funciones en los organismos vivos, tales como factores de crecimiento, antioxidantes,
estabilizadores de ADN y ARN, reguladores metabólicos, nutrientes y segundos
mensajeros.
Los estudios de racemización constituyen otra área en el análisis de los
aminoácidos. Los L-aminoácidos de las proteínas de los alimentos se isomerizan
parcialmente a D-isómeros por tratamiento alcalino o por calor. Este tratamiento puede
afectar al valor nutritivo y seguridad de los alimentos, ya que la mayoría de los Daminoácidos no pueden ser utilizados por los humanos y algunos son tóxicos. Los
isómeros tienen idénticas propiedades químicas y por tanto, deben ser convertidos en
dipéptidos diastereométricos mediante una reacción con un agente quiral antes de la
15
Introducción
cromatografía. Alternativamente, se puede emplear una fase estacionaria o fase móvil
quiral. Para conseguir la separación en un solo cromatograma de todos los aminoácidos
en sus formas D y L, es necesario utilizar columnas largas y tiempos de análisis de
incluso horas.
Se han propuesto diferentes métodos para la determinación aminoácidos
enantiómeros y aminas quirales tanto en vinos, vinagres, como en alimentos, cada uno
de ellos con sus ventajas e inconvenientes (Brüeckner et al., 1995; Jin et al., 1999; Voss
y Galensa, 2000; Toyo´oka et al., 2001; Abe et al., 2002; Erbe y Brüeckner, 1998 ).
1.2.2. Métodos de análisis de aminoácidos
Durante los últimos años, la evolución del análisis instrumental ha permitido la
detección y cuantificación de un gran número de aminoácidos con gran precisión y
sensibilidad. La determinación de aminoácidos en muestras de mostos, vinos y vinagres
debe permitir: la detección de aminoácidos primarios y secundarios, como la prolina,
que es el aminoácido más abundante de los vinos; un análisis exacto de la arginina,
debido a la implicación toxicológica de este compuesto en reacciones posteriores que
dan lugar a la formación de etilcarbamato y urea; bajos límites de detección para todos
los aminoácidos; un tiempo de análisis corto, con objeto de poder tener un análisis
rutinario para la certificación del vino o del vinagre; y la habilidad de crear una base de
datos con las características de productos químicos para ayudar a la identificación de
adulteraciones (Herbert et al., 2000).
Existen diferentes técnicas empleadas en el análisis de aminoácidos en vinos,
aunque son tres las que se usan con mayor frecuencia: cromatografía de intercambio
iónico con derivatización postcolumna empleando ninhidrina como agente derivatizante
y detección por ultravioleta (UV); separación de derivados volátiles de aminoácidos
por cromatografía gaseosa (CG) y detección por espectrometría de masas (EM) y
separación de aminoácidos derivados por cromatografía de líquidos (CL) y su detección
por fluorescencia. La resonancia magnética nuclear (RMN) y la electroforesis capilar
(EC) son otras de las técnicas usadas en el análisis de aminoácidos (Herbert et al.,
2000).
a) Separación por cromatografía líquida de intercambio iónico
Las resinas de intercambio iónico son polímeros sulfonados con partículas de 5 a
10 micras de diámetro. El mecanismo de separación está basado en la interacción iónica
con un soporte fuertemente ácido, aunque no se pueden excluir una interacción
secundaria con el polímero que constituye la base del intercambiador. En primer lugar
eluyen los aminoácidos ácidos, seguidos por los hidroxilados, luego los neutros y por
último los básicos (Cáceres et al., 1986). Actualmente las columnas son muy eficaces,
con lo que los tiempos de análisis son más cortos, pero son bastante caras.
Tradicionalmente el análisis de aminoácidos se ha llevado a cabo mediante
cromatografía de intercambio catiónico, donde los aminoácidos se separaban y
posteriormente reaccionaban con ninhidrina en un sistema de derivatización
16
Introducción
postcolumna. Finalmente se detectaban por absorbancia en la región del UV-visible a
una o dos longitudes de onda. Aunque ha demostrado tener buena fiabilidad y excelente
poder de resolución, los tiempos de análisis son demasiado largos, la sensibilidad es
limitada, pueden resultar picos demasiado anchos y los sistemas de derivatización
postcolumna resultan difíciles de manejar y mantener. Por otro lado, aunque este
método da buenos resultados requiere una larga preparación de las muestras, y su
aplicación en vinos no permite la cuantificación de la cisteína, la cual es un precursor de
los tioles característicos de la variedad Sauvignon (Pripis-Nicolau et al., 2001), entre
otras. Además tiene problemas con las interferencias de la matriz y con los límites de
detección (Herbert et al., 2000). De todos modos, esta técnica se ha empleado
extensamente en la caracterización de vinos en función del contenido de aminoácidos
(Csomos y Simone, 2002).
b) Separación por cromatografía de líquidos en fase reversa
La mayor parte de los trabajos realizados sobre análisis de aminoácidos por
cromatografía de líquidos (CL) se ha llevado a cabo en columnas de fase reversa que
tienen como fase estacionaria sílice, a la que se unen grupos C-8 o C-18. Estas
columnas, empaquetadas con partículas de sílice muy pequeñas (3-10 µm) y de pequeño
diámetro (2-5 mm), están sometidas a una alta presión con una velocidad de flujo de las
fases móviles muy controlada.
Las fases móviles más utilizadas en fase reversa son mezclas de agua y un
disolvente orgánico (metanol, acetonitrilo, o tetrahidrofurano, normalmente). Cuando la
muestra tiene sustancias que contienen grupos ácidos o básicos débiles, como son los
aminoácidos, se recurre al control del pH de la fase móvil mediante un tampón (Cáceres
et al., 1986).
La cromatografía en fase reversa utiliza las propiedades de solubilidad de la
muestra para distribuirla entre un solvente hidrofílico y otro lipofílico. La distribución
de los componentes de la muestra entre las dos fases va a depender de sus respectivas
características de solubilidad. Los componentes menos hidrofóbicos se asociarán
primeramente con la fase hidrofílica, y los componentes más hidrofóbicos se
encontrarán en la fase lipofílica. El proceso entero depende del poder extractivo de la
fase hidrofílica. En fase reversa, las partículas de sílice cubiertas con cadenas
hidrocarbonadas representan la fase lipofílica, mientras que la mezcla acuosa de un
solvente orgánico que rodea las partículas representa la fase hidrofílica.
Puesto que el conjunto de los aminoácidos muestra una amplia gama de
polaridades, para resolverlos en un solo cromatograma es preciso ir variando la
composición de la fase móvil a lo largo de la separación, aumentando su poder de
elución; de esta forma, mediante el empleo de un gradiente de polaridad, se consigue
separar todos los compuestos en un tiempo razonable, lo que sería imposible de
conseguir con una elución isocrática (Cáceres et al., 1986).
Esta técnica tiene muchas aplicaciones como por ejemplo la caracterización de
vinos (Soufleros et al., 2003) y diferenciación de vinagres en función de la composición
en aminoácidos (Valero et al.,2005); el estudio de la evolución de los aminoácidos en el
proceso de elaboración del vino (Martínez-Rodríguez et al.,2002); relación del
17
Introducción
contenido en aminoácidos con los compuesto volátiles en el vino (Pozo-Bayón et al.,
2005) y la determinación simultánea de aminas biógenas y aminoácidos en vinos y en
vinagres (Krause et al. 1995; Lozanov et al., 2004; Kutlán y Molnár-Perl, 2003).
Además, la cromatografía de líquidos se ha utilizado para determinar los
isómeros L y D de los aminoácidos en vinos (Brüeckner et al., 1995; Jin et al., 1999;
Voss y Galensa, 2000; Toyo´oka et al., 2000). Los isómeros tienen idénticas
propiedades químicas y por tanto, deben ser convertidos en dipéptidos diastereométricos
mediante una reacción con un agente quiral antes de la cromatografía. Alternativamente,
se puede emplear una fase estacionaria o fase móvil quiral.
c) Cromatografía de gases (CG)
La cromatografía de gases capilar constituye otra alternativa para el análisis de
aminoácidos. Esta técnica es rápida, y tiene un alto poder de resolución y sensibilidad,
pero se necesita gran experiencia. Además, como los aminoácidos libres no son
suficientemente volátiles necesitan ser convertidos en derivados volátiles para poder
determinarlos. Los ésteres de aminoácidos acilados son la clase más frecuente de
derivados para el análisis de aminoácidos por CG.
La principal desventaja de la cromatografía de gases parece ser el procedimiento
de la derivatización, debido a la complejidad de las reacciones y los tipos de reactivos
usados. La velocidad de derivatización difiere de un aminoácido a otro y la
reproducción estricta de las condiciones de reacción es esencial para todas las muestras.
Además, la mayoría de los derivados de aminoácidos volátiles se pueden perder también
durante la concentración de la muestra. Por otro lado esta técnica requiere una
minuciosa extracción y preconcentración de la muestra, por lo que se deben tener en
cuenta a la hora de asegurar la fiabilidad de los resultados finales (Herbert et al., 2000).
Se ha comparado la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de
gases en cuanto a la precisión. Ninguno de los métodos fue claramente superior. La CG
resultó tener una menor varianza intralaboratorio excepto para la histidina y la arginina.
También se ha comparado la CG y CL. Considerando muchos factores como la
facilidad de la derivatización y la duración del tiempo de análisis el método de elección
fue la CL. Aunque la CG tiene ventajas (velocidad y sensibilidad) la mayoría de los
análisis de aminoácidos todavía se llevan a cabo por la clásica cromatografía de
intercambio iónico o por la cromatografía de líquidos en fase reversa. Muchos autores la
han aplicado para la determinación de D-aminoácidos y separación de enantiómeros
tanto en vinos (Abe et al., 2002) como en vinagres ( Erbe y Brüeckner, 1998).
d) Electroforesis capilar
La técnica de electroforesis capilar (EC) se ha usado para separar y detectar
aminoácidos, péptidos y proteínas.
La EC permite el análisis de muestras extremadamente pequeñas, y por lo tanto
se requieren detectores de alta sensibilidad. Estos detectores incluyen fluorescencia
inducida por láser, la cual tiene unos límites de detección del orden de 10-20 moles para
18
Introducción
la separación por electroforesis capilar de zona de aminoácidos derivatizados con
isotiocianato de fluoresceína. Un inconveniente de esta técnica es el consumo de tiempo
que conlleva la preparación de las muestras, ya que requieren un proceso de
derivatización y preconcentración previo a su análisis (Kosir y Kidric, 2002).
Así mismo, se puede aplicar la EC con un detector de fluorescencia inducida por
láser para reacciones postcolumna usando como agentes derivatizantes el o-ptaldehido y
el naptaneno-2,3-dicarboxialdehido (Male y Luong, 2001; Kilgore y Smith, 2003).
El análisis por electroforesis capilar de zona de aminoácidos seleccionados tiene
unos límites de detección extremadamente bajos. En la práctica, no se precisan límites
de detección tan bajos en el análisis rutinario de aminoácidos en alimentos. Sin
embargo, podrían producirse nuevos compuestos en métodos de procesado de alimentos
del futuro en unos niveles suficientemente bajos como para poder recomendar la
aplicación de esta técnica.
e) Resonancia magnética nuclear
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se ha aplicado
ampliamente en el campo del análisis químico de alimentos ya que es una técnica no
destructiva, sensible y capaz de detectar simultáneamente un gran número de
compuestos, concretamente aminoácidos, en mezclas complejas como es el caso del
vino ( Kosir y Kidric, 2001; 2002).
Aunque la cromatografía de líquidos y la electroforesis capilar son más
sensibles, requieren una preparación de las muestras antes del análisis. Normalmente, la
separación, derivatización y preconcentración en el caso de compuestos presentes en
bajas concentraciones, son pasos imprescindibles en el procedimiento. Por el contrario,
la preparación de muestra para la resonancia magnética nuclear es más simple y
consume menos tiempo. Otra gran ventaja de esta técnica es la posibilidad de detectar la
resonancia magnética de diferentes núcleos presentes en una molécula en diferentes
ambientes electrónicos y espaciales.
Esta técnica ha sido empleada, obteniéndose muy buenos resultados, en la
caracterización de la autenticidad del vino, determinación del origen geográfico y año
de producción (Brescia et al., 2002).
1.2.3. Derivatización de aminoácidos
Los aminoácidos pueden ser detectados directamente en el ultravioleta, ya que
absorben a una longitud de onda entre 190-210 nm. Sin embargo, en esta región del
espectro también absorben la mayoría de los disolventes y otros componentes de las
muestras, por lo que normalmente se recurre a la formación de derivados detectables a
otras longitudes de onda o fluorescentes (Cáceres et al., 1986).
19
Introducción
La derivatización puede llevarse a cabo antes de la separación cromatográfica
(precolumna), inmediatamente después de la elución (postcolumna) o, menos frecuente,
en la misma columna. Cada forma de obtener el derivado presenta ventajas e
inconvenientes (Tabla 1.2).
En la derivatización postcolumna la separación de aminoácidos no derivatizados
se lleva a cabo con una resina de intercambio catiónico con un gradiente de tampones
acídicos. Después de la separación se convierten en derivados de ninhidrina coloreados
para la detección colorimétrica, o en derivados de ortoftaldehído para la detección por
fluorescencia.
Tabla 1.2. Ventajas e inconvenientes de la derivatización precolumna y postcolumna
(Cáceres et al., 1986)
Derivatización
Ventajas
Inconvenientes
-Presencia de interferencias debidas al exceso de
reactivo o a productos de degradación.
Postcolumna
-Es posible utilizar varios sistemas de
detección y eluir los compuestos de la -Pérdida de resolución producida por el
columna detectándolos por métodos no ensanchamiento de la banda cromatográfica en el
reactor donde se produce la reacción.
destructivos antes de derivatizarlos.
-La reacción es reproducible sin -No se pueden utilizar tiempos de retención muy
largos.
necesidad de formar un único derivado.
-Puede resultar un método caro debido a las
modificaciones que hay que realizar en el equipo
instrumental para llevar a cabo la reacción.
-La única limitación a las condiciones de
-Presencia de picos interferentes en los
la reacción es que se complete en un
cromatogramas debidos al mismo reactivo, a
periodo de tiempo razonable y que sea
productos de reacción o de degradación o a
cuantitativa.
impurezas de los reactivos.
Precolumna
-La reacción se puede desarrollar en un
-Conviene eliminar el exceso de reactivo,
disolvente no compatible con la fase
disolvente u otros componentes de la mezcla de
móvil utilizada en la separación
reacción antes de la inyección en el cromatógrafo.
cromatográfica.
- Una parte sustancial de todos los derivados será
-Se pueden separar los productos
idéntica. Pequeñas diferencias de la cadena lateral
secundarios formados, en la misma
de los aminoácidos tendrán un efecto menor en el
columna o antes de la separación
comportamiento cromatográfico de los derivados,
cromatográfica.
dando una separación más dificultosa.
Aunque la derivatización precolumna ofrece más ventajas, los métodos tradicionales
postcolumna no se han eliminado totalmente.
20
Introducción
Los agentes derivatizantes más utilizados en el análisis de aminoácidos son:
a) Ninhidrina
La ninhidrina se utiliza para la determinación de los aminoácidos tras su separación
en su forma natural por cromatografía de intercambio iónico. Por tanto, la derivatización
con ninhidrina es exclusivamente postcolumna (White y Hart, 1992a).
La reacción de la ninhidrina con los aminoácidos es muy sensible, llegándose a
detectar cantidades inferiores a un picomol pero raramente reproducibles por debajo de
100 picomoles. Esta limitación la hace inadecuada para muchas de las aplicaciones
demandadas actualmente. La sensibilidad de la ninhidrina depende de una serie de
factores: es muy sensible a la luz, al oxígeno atmosférico, a cambios de temperatura y
de pH.
Con los aminoácidos primarios forma un complejo morado (Ruhemann´s purple)
que absorbe a una λ de 570 nm, y con los aminoácidos secundarios, prolina e
hidroxiprolina, forma un complejo amarillo que absorbe a 440 nm. Cuando empieza a
oxidarse el reactivo, su color no se desarrolla bien a 570 nm pero la absorción a 440
permanece constante. Por eso cuando la altura de la prolina a 440 nm es igual a la altura
del ácido glutámino a 570 nm indica la degradación del reactivo.
Algunos autores han aplicado esta técnica para la caracterización de vinos en
función del contenido de aminoácidos (Herberger et al., 2003).
b) Cloruro de dansilo
El cloruro de dansilo (DNS-Cl) es un reactivo fluorogénico de derivatización
precolumna que permite la determinación de aminas primarias y secundarias.
La dansilación se ha usado como un método para la determinación de
aminoácidos libres, tanto los procedentes de la hidrólisis de proteínas como los
aminoácidos terminales de proteínas y péptidos. Los derivados son detectables por
fluorescencia (λex 360 nm; λem 470) o por ultravioleta (254 nm) y los niveles de
detección están en el orden de picomoles o fentomoles dependiendo de la sensibilidad
del detector (White y Hart, 1992a).
La reacción de los aminoácidos con el cloruro de dansilo transcurre en
condiciones óptimas entre 35-50 minutos en medio básico, a temperatura ambiente y en
la oscuridad. Además de los dansilaminoácidos se forma como producto secundario el
ácido dansilsulfónico. Por otro lado, el exceso de cloruro de dansilo reacciona con los
dansilaminoácidos formando dansilamida. La formación de la dansilamida era una
inevitable limitación del método y la cantidad formada depende de la concentración de
aminoácidos y del exceso de cloruro de dansilo. Conviene, pues, reducir en lo posible la
aparición de tales productos secundarios (Cáceres et al., 1986).
21
Introducción
Los derivados son relativamente estables a la hidrólisis lo que no ocurre con el
reactivo. Hay que evitar, sin embargo, la exposición a la luz por ser fotosensibles. Los
dansilaminoácidos son estables al menos 7 días si se mantienen a –4 ºC.
Esta técnica se utiliza generalmente en derivatización precolumna. Numerosos
autores lo han empleado para la determinación de aminoácidos en mostos de uva, vinos
y vinagres (Botella et al., 1990; Valero et al., 2005).
La mayoría de aminoácidos dan monodansil derivados, excepto lisina, ornitina,
histidina, tirosina y cisteína que forman didansil derivados.
Este método ofrece una buena reproducibilidad para la mayoría de los
aminoácidos excepto para la histidina debido a la baja respuesta relativa de
fluorescencia del derivado didansilado y por la formación de dos dansil derivados
(White y Hart, 1992a).
c) Cloruro de dabsilo
Los derivados obtenidos con el cloruro de dabsilo tienen una absorción máxima
a 420 nm (región visible), son altamente estables y son rápidamente separados y
detectados a niveles de picomoles. Los derivados se mantienen perfectamente estables
durante cuatro semanas a temperatura ambiente.
Una limitación del método es que la presencia de una excesiva cantidad de sal,
urea, fosfato, o bicarbonato amónico alterará el pH del tampón e interferirá en la
reacción de dabsilación.
Para un análisis cuantitativo de muestras desconocidas, los estándares de
aminoácidos dabsilados tienen que obtenerse de una mezcla de estándares de
aminoácidos hidrolizada y dabsilada en paralelo en las mismas condiciones que las
muestras (White y Hart, 1992a)
Krause et al. (1995) propusieron el uso del cloruro de dabsilo como un método
alternativo al análisis convencional de aminoácidos y aminas biógenas en alimentos y
muestras biológicas, logrando separar más de cuarenta compuestos simultáneamente.
d) Dinitrofluorobenceno
El dinitrofluorobenceno (DNFB) es un agente de derivatización precolumna que
se utiliza para la caracterización de aminoácidos terminales de cadenas peptídicas
(Cáceres et al., 1986).
Este agente reacciona con los aminoácidos primarios y secundarios formando
compuestos que muestran fluorescencia a 365 nm. La reacción se lleva a cabo a 50 ºC
durante 30 minutos. Los derivados son estables durante 48 horas si se protegen de la
luz.
22
Introducción
Con este reactivo se pueden detectar pequeñas cantidades de aminoácidos, del
orden de picomoles, y es muy adecuado para determinar aminoácidos que otros
reactivos resuelven peor. Uno de los inconvenientes de este método está en que destruye
los péptidos (White y Hart, 1992a).
e) Fenilisotiocianato
El agente derivatizante fenilisotiocianato se ha utilizado durante más de 30 años
en el método de la degradación de Edman para secuenciar proteínas y péptidos. Este
agente reacciona con los aminoácidos libres produciendo feniltiocarbamil aminoácidos
(Cáceres et al., 1986). Se ha empleado, asimismo, para determinar aminoácidos en
zumos de naranja (Naulet et al., 1997), vinos ( Botella et al., 1990; Lehtonen et al.,
1996; Puig-Deu y Buxaderas, 1994; Hernández-Orte et al., 1999; Fox et al., 2001) y
vinagres (Palacios et al., 2002).
Hay que señalar que se consigue la cuantificación de los aminoácidos
secundarios prolina e hidroxiprolina. A diferencia de la ninhidrina y ortoftaldehído, los
derivados feniltiocarbamil de la prolina y la hidroxiprolina tienen aproximadamente la
misma respuesta molar que los otros aminoácidos.
La selectividad es adecuada y no hay evidencia de formación de derivados
disustituidos con tirosina o histidina. Sólo lisina y cistina reaccionan con dos moléculas
del agente. En condiciones suaves, la reacción se completa en menos de diez minutos, y
como el reactivo es volátil, se puede usar en exceso. Este exceso se elimina a baja
presión. Las muestras secas pueden ser almacenadas a –20 ºC, y resultan estables
durante 4 semanas.
Debido a que los derivados no son fluorescentes, la técnica está limitada a la
detección por UV, la cual se lleva a cabo a 254nm (λmáx = 269 nm). Esta técnica no es
tan sensible como las que utilizan reactivos fluorescentes, pero la alta absorción en el
UV de los derivados hace que puedan ser detectados a niveles de picomoles, los cuales
representan los niveles prácticos de sensibilidad para muestras reales. El límite de
sensibilidad es 50 picomoles en una relación señal / ruido de 2.5, la cual es 50 veces
menos sensible que la detección de los derivados de ortoftaldehído y 9-fluorenilmetil
cloroformato.
f) Ortoftaldehido
El ortoftaldehido (OPA), fue introducido en 1971 y es el agente de
derivatización más comúnmente usado en cromatografía líquida de alta resolución en
fase reversa para la determinación de aminoácidos. Se ha aplicado a vinos (Pozo-Bayón
et al., 2005; Soufleros et al., 2003; Lehtonen et al., 1996) y vinagres (Kutlán y MolnárPerl, 2003). Otra de las aplicaciones de este reactivo ha sido la determinación de
aminoácidos enantiómeros en alimentos y bebidas (Brüeckner et al., 1995).
El OPA es un reactivo que no tiene fluorescencia natural, la desarrolla al
reaccionar con funciones amino primarias. La reacción tiene lugar en medio acuoso a
pH fuertemente alcalino en presencia de un agente reductor como el 2-mercapto-etanol,
23
Introducción
3-mercapto-1-propanol o etanotiol. El derivado isoindólico formado es inestable y debe
ser estabilizado por acidificación. La reacción se completa totalmente en 1 ó 2 minutos
a temperatura ambiente (Cáceres et al., 1986).
Este reactivo se puede emplear tanto para la derivatización postcolumna como
para la precolumna.
No es necesario eliminar el exceso de OPA antes de inyectar la muestra ya que
el reactivo por sí mismo no interfiere en la separación o detección. Sin embargo, como
los derivados OPA-aminoácidos son inestables, para conseguir unos resultados
reproducibles es esencial una completa automatización de la reacción precolumna
controlando de manera muy precisa el tiempo de reacción. El límite de detección con
este reactivo está en el rango de los fentomoles, lo que demuestra que esta técnica es
diez veces más sensible que la reacción con ninhidrina.
Por otro lado, el OPA no reacciona con grupos amino secundarios, por tanto, si
queremos determinar prolina e hidroxiprolina simultáneamente con el resto de los
aminoácidos, hay que recurrir a una oxidación con hipoclorito sódico que rompe el
anillo y los convierte en aminoácidos primarios. Otra alternativa es utilizar OPA con
otro agente que permita derivatizar los aminoácidos secundarios. Algunos autores
usaron una doble derivatización con ortoftaldehído y 9-fluorenilmetil cloroformato para
determinar los aminoácidos primarios y secundarios en mostos y vinos (Herbert et al.,
2000; Martínez-Rodríguez et al., 2002). Pripis-Nicolau et al. (2001) desarrollaron un
método para determinar la cisteína y otros aminoácidos en mostos y vinos utilizando
una derivatización previa con ácido iodoacético (IDA) seguida de otra con OPA.
Otro inconveniente de este reactivo es la débil respuesta de la lisina, que puede
ser debida a la presencia de dos estructuras isoindólicas fluorescentes que interaccionan.
La cisteína es también un aminoácido que presenta una débil respuesta debido
probablemente a la fácil descomposición del derivado. La solución que proponen
algunos autores es realizar una oxidación previa con ácido peroxifórmico o una
carboximetilación y detectar el aminoácido como ácido cistéico o carboximetilcisteína
(Cáceres et al., 1986).
Los derivados también se pueden detectar en ultravioleta a 330 nm, pero para
una mayor sensibilidad, se utiliza con preferencia la detección por fluorescencia, cuya
emisión se mide a una λ de 430 nm.
g) 9-Fluorenilmetil cloroformato
Se ha demostrado que el 9-fluorenilmetil cloroformato (FMOC-CL) es adecuado
para la detección por fluorescencia de aminoácidos primarios y secundarios. Este
reactivo da lugar a derivados estables y altamente fluorescentes (Bauza et al., 1995).
A diferencia de los otros derivatizantes precolumna que producen derivados
fluorescentes, el FMOC-CL es por sí mismo fluorescente. FMOC y los productos
obtenidos de su hidrólisis pueden interferir en la cuantificación de los aminoácidos
derivados, sin embargo, esta propiedad no tiene por qué ser un factor limitante, ya que
el exceso de reactivo y los productos fluorescentes formados en reacciones laterales se
24
Introducción
pueden eliminar sin que se pierdan los aminoácidos derivados mediante una extracción
líquido-líquido. Otra método alternativo para evitar la interferencia del FMOC-OH es
que el exceso de FMOC reaccione con una amina muy hidrofóbica para formar un
derivado que eluya después de los picos de interés (White y Hart, 1992a).
Este agente derivatizante se ha empleado para determinar aminas biógenas y sus
aminoácidos precursores en vinos (Bauza et al., 1995; Lehtonen et al., 1996) y en
alimentos (Kirschbaum et al., 1994).
h) Etoximetilenmalonato de dietilo
El etoximetilenmalonato de dietilo (EMMDE), es otro agente de derivatización
precolumna capaz de reaccionar con aminoácidos primarios y secundarios dando lugar a
derivados detectables en la región UV-visible.
Este agente se ha aplicado para determinar el contenido de aminoácidos en
muestras de vino (Chichón et al., 2001) y posteriormente en diferentes tipos de mieles
españolas (Hermosín et al.,2003). En este último trabajo de investigación, se examinó la
información obtenida para establecer si la composición de aminoácidos libres de una
miel podía explicar sus orígenes botánicos.
Más recientemente, Hermosín et al. (2006) han desarrollado un método para el
análisis conjunto de aminas biógenas, aminoácidos e ión amonio en vinos. Este método
consiste en la separación mediante CL en fase reversa de las aminoenonas formadas por
reacción de los aminoácidos, las aminas biógenas y el ión amonio con el agente
prederivatizante etoximetilenmalonato de dietilo (EMMDE).
La reacción de derivatización se realiza en medio metanólico básico, durante 30
minutos. Posteriormente, la muestra se calienta 2 horas a 70ºC para la completa
degradación del exceso de reactivo y de sus productos secundarios de reacción. La
mayoría de los derivados obtenidos son perfectamente estables, al menos durante la
primera semana, excepto prolina e hidroxiprolina, por lo que de ser necesaria su
cuantificación, el análisis debería realizarse en las 24 horas siguientes a la reacción de
derivatización. Este es uno de los inconvenientes del método.
Sus ventajas son: derivatización directa sin preparación previa; cuantificación
simultánea de 24 aminoácidos (incluida prolina), 9 aminas biógenas y el ión amonio;
empleo del detector UV-Visible, el más habitual en cualquier laboratorio y no
interferencia en el cromatograma del exceso de agente derivatizante.
Los límites de detección están por debajo de 0.4 mg/L entre los aminoácidos, y
de 0.07 mg/L entre las aminas biógenas. Con otros agentes se han conseguido límites de
detección más bajos por lo que este reactivo se debe usar cuando no se requiera una
sensibilidad por debajo de picomoles. Otro inconveniente es el tiempo de
derivatización, ya que con otros agentes se consiguen procesos de derivatización más
cortos (Alaiz et al., 1992).
25
Introducción
i) 6-Aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato
El 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) es un agente para la
derivatización de grupos aminos, específicamente diseñado para el análisis de
aminoácidos, con la idea de simplificar la reacción de derivatización, aumentar los
rendimientos de la reacción e incrementar la sensibilidad y selectividad de los derivados
formados cuando se trabaja con detección por fluorescencia (Cohen y Michaud, 1993;
Cohen y Antonis, 1994; Wandelen y Cohen, 1997). Hernández–Orte et al. (2003)
optimizaron las condiciones de separación propuestas por Cohen y Michaud (1993) para
conseguir una cuantificación simultánea de los aminoácidos libres de los mostos y vinos
sin problemas de interferencia debidos al contenido de azúcar.
Este compuesto reacciona rápidamente con los aminoácidos primarios y
secundarios formando productos altamente estables con una fuerte fluorescencia a
395 nm (Figura 1.7). Los derivados que resultan son estables a temperatura ambiente
durante, al menos, una semana y se separan fácilmente por CL en fase reversa utilizando
una columna de C18.
H
O
N
O
R1
+
N
HN
O
R2
N
O
AQC
Aminoácido 1º y 2º
R1
H
N
HO
N
O
O
N
+
R2
O
N
Aminoácido derivatizado
NHS
Figura 1.7. Reacción de derivatización del AQC
El exceso del reactivo se hidroliza durante la reacción para formar 6aminoquinolina (AMQ) (Figura 1.8), cuyas características espectrales son netamente
diferentes a cualesquiera de los aminoácidos derivatizados. Ello permite programar una
longitud de onda que maximice la respuesta de emisión de los derivados y reduzca al
mínimo la respuesta del AMQ. En esta hidrólisis del reactivo también se forma N-
26
Introducción
hidroxisuccinimida (NHS) y dióxido de carbono pero éstos no interfieren en el análisis
cromatográfico. La destrucción de exceso del reactivo es completa en un minuto.
O
NH
O
+
N
H2O
O
N
O
AQC
O
NH2
+
HO
N
+
CO2
N
O
AMQ
NHS
Figura 1.8. Hidrólisis del exceso de AQC
El protocolo de derivatización, agregado del reactivo y calefacción de la muestra
previamente tamponada, es simple y directo. Los derivados de los aminoácidos se
inyectan directamente sin preparación adicional de la muestra, mientras que las sales
(presentes en la muestra) prácticamente no causan interferencias en la reacción o en la
reproducibilidad de los resultados (Wandelen y Cohen, 1997).
Este método ha sido optimizado para su uso con un detector de fluorescencia con
el fin de lograr límites de detección de 50-300 fentomoles para los aminoácidos
existentes en péptidos e hidrolizados de proteínas (Hernández-Orte et al., 2003).
Utilizando un detector de UV, a 250 nm, el AMQ absorbe alrededor de 200
veces más que cualquiera de los aminoácidos derivatizados y esto puede ocasionar
dificultades en la cuantificación del ácido aspártico, que es el primero de los
aminoácidos en eluir. Esto no ocurre cuando la detección se lleva a cabo por
fluorescencia, ya que la señal del AMQ es mucho menor a la obtenida en el UV. Otra
característica del AMQ es que su tiempo de retención puede variar dependiendo del pH
de la fase móvil.
La presencia de dos grupos fluorescentes en una misma molécula puede
disminuir considerablemente su fluorescencia debido a un fenómeno conocido como
"quenching interno". Este efecto se observa muy débilmente en el caso de la molécula
27
Introducción
de lisina, pero es bien notorio con el triptófano. En este caso la sensibilidad del método
se ve ampliamente favorecida por el uso de un detector UV.
Tanto el análisis de muestras con triptofano, como el análisis de aminoácidos libres en
una solución intravenosa, puede ser eficazmente realizado usando ambos detectores en
serie, primero el de fluorescencia para la mayoría de los aminoácidos y luego el detector
UV para el triptofano.
Este reactivo también se ha utilizado como una alternativa al reactivo de
derivatización más común, OPA, para determinar aminas biogénicas en vinos (Busto et
al., 1996) y para estudiar la evolución de los aminoácidos y péptidos durante la
fermentación alcohólica y autolisis de los vinos (Alexandre et al., 2001).
En la siguiente tabla se muestra un resumen de los agentes empleados en la
derivatización de los aminoácidos con sus ventajas e inconvenientes.
Tabla 1.3. Agentes empleados en la derivatización de aminoácidos
Reactivo
Ninhid
rinaa
DNSCla b
DABS-CL
DNFB
a
Derivatiz.
Postcolumna
Precolumna
y
Postcolumna
Precolumna
Precolumna
Mec
separación
Intercambio
iónico
Tipo detec.
-Reaciona con aa
primarios y secundarios
UV
-Capaz de detectar
picomoles
Fluorescencia
Fase reversa
UV
Fase reversa
Fase reversa
Aplicado en muestras de vino
b
Ventajas
Visible
Fluorescencia
-Reacciona con aa
primarios y secundarios
-Capaz de detectar
picomoles o fentomoles
-Derivados estables a la
hidrólisis
-Buena reproducibilidad
para todos aa menos para
His
-Muy adecuado para
determinar Cys
-Reacciona con aa
primarios y secundarios.
-Derivados muy estables
(4 semanas a Tª
ambiente)
-Capaz de detectar
picomoles
-Reacciona con aa
primarios y secundarios
-Capaz de detectar bajos
niveles de picomoles
-Determina aa que otros
agentes resuelven peor
Inconvenientes
-No reproducible en
cantidades menores a 100
picomoles
-Problemas de
interferencias con la
matriz
-Sensible a la luz, O2,
cambios Tª y pH
-El exceso de reactivo
interfiere en el cromatog.
-Los derivados son
fotosensibles
-Reacción lenta
-His forma picos
múltiples
-No es específico y
reacciona con otros
compuestos
-El exceso de reactivo
interfiere en el cromatog.
-Las sales y detergentes
presentes en las muestras
interfieren
-Produce múltiples
derivados
-Los derivados son
fotosensibles
-Reacción muy lenta.
-Método destructivo para
péptidos
Aplicado en muestras de vinagre
28
Introducción
Tabla 1.3. Agentes empleados en la derivatización de aminoácidos (Continuación)
Reactivo
Derivatiz.
Mec
separación
PITCa b
Precolumna
Fase reversa
OPAa b
Precolumna
y
Postcolumna
Fase reversa
y
Cromatg.
Intercambio
iónico
Precolumna
Fase reversa
FMOCa
EMMDE
Precolumna
Tipo detec.
UV
Fluorescencia
UV
Fluorescencia
Fase reversa UV-Visible
Fluorescencia
AQCa
Precolumna
Fase reversa
UV
a
Aplicado en muestras de vino
b
Ventajas
Inconvenientes
-Problemas de
interferencias con la
-Reacciona con aa
matriz en el análisis de
primarios y secundarios.
mostos
-Determina Prolina e
-No adecuado para su
Hidroxiprolina con una
automatozación
sensibilidad de picomoles
-Sensibilidad menor a
-Reacción rápida
otros métodos (50 veces
-Forma derivados más
menor que OPA y
estables que otros
FMOC)
reactivos
-El reactivo se puede usar
-El proceso es lento
en exceso porque no
porque necesita un paso
interfiere
de evaporación a
sequedad
-Los derivados son
inestables
-El reactivo se puede usar
-No reacciona con aa
en exceso porque no
secundarios (prolina)
interfiere
-Necesita una completa
-Reacción rápida
automatización de la
-Derivados altamente
reacción
fluorescentes
-Respuesta de la
-10 veces más sensible
Lys,Hidroxilisina y Cys
que reacción con
baja
Ninhidrina
-Derivados se
descomponen
-Reacciona con aa
-Produce múltiples
primarios y secundarios
derivados
-Reacción rápida (30
-El reactivo es por sí
segundos)
mismo fluorescente e
-Derivados estables y
interfiere en el cromatog.
altamente fluorescentes
-El Proceso de derivatiz.
-Muy sensible
es lento ya que se tiene
que eliminar el reactivo
-Reacciona con
aminoácidos primarios y
secundarios
-Derivatización directa
sin previa preparación
-El exceso de reactivo no
interfiere
-Sensibilidad de
picomoles
-El exceso de reactivo no
interfiere
-Reacciona con aa
primarios y secundarios
-Derivados estables y
altamente fluorescentes
-Muy sensible (50-300
fentomoles)
-Reacción rápida
-Derivados se inyectan
sin previa preparación de
la muestra
-Las sales y detergentes
de muestras no interfieren
-Proceso de
derivatización lento
-Inestablilidad de los
derivados de prolina e
hidroxiprolina
-No sensible a niveles
inferiores a picomoles
-Lys y Trp muestran una
menor fluorescencia por
el llamado “quenching
interno”
-Si el amonio no se
derivatiza totalmente, el
exceso de éste puede
distorsionar el análisis de
Arg y Thr
Aplicado en muestras de vinagre
29
Introducción
Aunque la derivatización precolumna ofrece más ventajas, ninguno de los
agentes prederivatizantes estudiados se considera el agente universal ya que ninguno
cumple todos los requisitos:
•
Reaccionar rápidamente bajo condiciones suaves para obtener el
derivado de forma cuantitativa.
•
Reaccionar con aminoácidos primarios y secundarios.
•
Los derivados deberían ser estables durante varios días, preferiblemente
a temperatura ambiente para permitir el análisis automatizado de
múltiples muestras.
•
Respuesta lineal en los niveles de concentración típicos de la mayoría de
las aplicaciones.
•
El exceso de reactivo o productos secundarios no deberían interferir en el
análisis de aminoácidos.
1.2.4. Elección del método óptimo
Cada uno de los métodos tiene sus propias ventajas e inconvenientes. El criterio
predominante que influirá en la selección de la derivatización y en los procedimientos
de CL son la resolución, la sensibilidad y la velocidad.
Hasta ahora los agentes derivatizantes que se han aplicado para la determinación
de aminoácidos en vinagres ha sido cloruro de dansilo, fenilisotiocianato y
ortoftaldehído. El ortoftaldehído es el más utilizado para la determinación de
aminoácidos tanto en muestras de vino como de vinagre, sin embargo, lo descartamos
ya que no reacciona con la prolina, que es uno de los aminoácidos más abundantes en
las muestras de vinagre. Además, los derivados que se obtienen son inestables. Los
otros dos agentes (cloruro de dansilo y fenilisotiocianato), también se descartaron ya
que se ha visto que dan problemas de interferencias con la matriz y el proceso de
derivatización es lento. Otro de los motivos por lo que se descartó el cloruro de dansilo
fue la fotosensibilidad de los derivados.
Por otro lado, el etoximetilenmalonato de dietilo, a pesar de sus numerosas
ventajas también se descartó por tener un proceso de derivatización más largo y por la
inestabilidad que presentan los derivados de la prolina. Los restantes reactivos
derivatizantes, también mostraban problemas en cuanto a la estabilidad de los derivados
y a la interferencia del exceso de reactivo en el cromatograma.
En este trabajo de investigación, se propone la utilización del método empleado
por Hernández-Orte et al., (2003) para aplicarlo a la determinación de aminoácidos en
muestras de vinagre de vino y para el seguimiento del proceso de acetificación. Los
aminoácidos de separan mediante CL tras una previa derivatización con el agente AQC
y se determinan por fluorescencia. La validación de este método para vinagres
comprende la determinación de los parámetros analíticos: selectividad, exactitud,
precisión, linealidad, sensibilidad y límites de detección y cuantificación.
30
Materiales y Métodos
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. MATERIAL
2.1.1 Muestras
La determinación se llevó a cabo en un total de 36 muestras de vinagres de vino
o de vinos en proceso de acetificación (Tabla 2.1), que se obtuvieron a partir de dos
sustratos vínicos distintos. La acetificación de los mismos se llevó a cabo mediante
cultivo superficial (método de Orleáns) utilizando barricas de diferentes tipos de
maderas.
La codificación empleada para identificar las muestras de vinagre es de la forma
XYZn.
X indica el vino del que proviene el vinagre, por tanto, tomará los dos posibles
valores:
-
F, vino tinto procedente del sur de Francia cuyas características aparecen
en la Tabla 2.1., con elevado azúcar residual.
-
T, vino tinto de la denominación de origen Priorato cuyas características
aparecen en la misma Tabla.
Se han seguido seis acetificaciones por cada sustrato que se indican con los
dígitos YZ. Las acetificaciones de cada sustrato se llevaron a cabo en seis barricas de 60
L de capacidad que se llenaron con un total de 40 L. Estas barricas presentan diferencias
en cuanto a sus características de madera (indicado con la letra Y) y tonelería (indicado
con la letra Z). Las acetificaciones duraron entre 1.5 - 2.5 meses para las muestras del
sustrato vínico F y entre 5 - 9 meses para las del sustrato vínico T.
n indica el momento de la toma de muestra durante el proceso de acetificación,
tomando 3 posibles valores:
i si se encuentra al inicio (0.37 – 0.62 grados acéticos)
m si se encuentra a mitad del proceso de fermentación (3.5 – 4 grados
acéticos)
f si se encuentra al final del proceso de fermentación (5.5 – 6 grados
acéticos)
31
Materiales y Métodos
Tabla 2.1. Muestras estudiadas en la presente memoria
Puntos de muestreo durante la acetificación
Vino de partida
Madera
Inicio
Sustrato F
Grado alcohólico: 9.2
Grado acético: 0.9
Sustrato T
Grado alcohólico: 11.3
Grado acético: 0.9
AL
BL
CK
CL
CM
DL
AL
BL
CL
DK
DL
DM
FALi
FBLi
FCKi
FCLi
FCMi
FDLi
TALi
TBLi
TCLi
TDKi
TDLi
TDMi
Mitad
FALm
FBLm
FCKm
FCLm
FCMm
FDLm
TALm
TBLm
TCLm
TDKm
TDLm
TDMm
Final
FALf
FBLf
FCKf
FCLf
FCMf
FDLf
TALf
TBLf
TCLf
TDKf
TDLf
TDMf
2.1.2. Reactivos
a) Reactivo empleado para la reacción de derivatización
Kit “AccQ-Fluor”, constituido por 6-Aminoquinolil-N-Hidroxisuccinimidil
Carbamato (AQC), acetonitrilo para disolver el reactivo y disolución tampón de borato
sódico 0.2 mM a pH 8.8. Waters WAT052880 (Milford, MA, USA).
b) Sustancias patrón
Se han empleado un total de 24 patrones comerciales, correspondientes a los
principales aminoácidos en el vino y en vinagre, amonio y patrón interno (Tabla 2.2)
32
Materiales y Métodos
Tabla 2.2. Patrones de aminoácidos
Aminoácido
Proveedor
Referencia
L-Ácido Aspártico
L-Asparagina
L-Serina
L-Ácido Glutámico
L-Histidina
L-Glutamina
L-Glicina
L-Arginina
L-Treonina
L-Alanina
L-Prolina
Ácido γ-Aminobutírico
Ácido α-Aminobutírico (PI)*
L-Cisteina
L-Tirosina
L-Valina
L-Metionina
L-Ornitina monohidroclorada
L-Lisina
L-Isoleucina
L-Leucina
L-Fenilalanina
L-Triptófano
Sulfato Amónico
Aldrich
Fluka
Fluka
Aldrich
Sigma
Fluka
Merck
Fluka
Fluka
Aldrich
Fluka
Sigma
Fluka
Fluka
Fluka
Fluka
Fluka
Merck
Sigma
Fluka
Fluka
Fluka
Fluka
Sigma
A9,310-0
11150
84960
12,843-0
H-8000
49419
1.04201
11009
89179
A2,680-2
81710
2129
07200
30089
93830
94620
64320
1.06906
L-5501
58880
61820
78020
93659
A-2939
* PI: Patrón Interno
c) Otros Reactivos
Para la preparación de los eluyentes se han utilizado distintos productos de calidad
HPLC (Tabla 2.3). El agua desionizada fue obtenida con un sistema de purificación
Milli-Q “Millipore”.
Tabla 2.3. Reactivos para eluyentes
33
Materiales y Métodos
Reactivo
Proveedor
EDTA cálcico disódico
Acetato sódico trihidratado
Trietilamina (TEA)
Ácido fosfórico
Acetonitrilo
Sigma
Fluka
Fluka
Sigma-Aldrich
Merck
Referencia
ED2SC
71190
90335
466123
1.14291
Adicionalmente se emplearon para la preparación de las disoluciones de
patrones:
Ácido Clorhídrico 32%
Amoniaco 25%
Merck
Merck
1.00319
1.05432
2.1.3. Instrumentación
2.1.3.1. Cromatógrafo líquido de alta eficacia
- Equipo cromatográfico “Waters”, formado por:
Inyector automático Waters 717
Bomba cuaternaria Waters 600E System Controller
Horno Waters Steel Columm Heater Module
Estación de datos Millennium 32
Desgasificador en línea AF Waters
Detector de haz de fotodiodos Waters 996
Detector de fluorescencia Waters 474
- Columna de sílice Luna C18 en fase reversa, tamaño de partícula 5µm, 250 x
4.6 mm “Phenomenex” (Torrance, CA, USA) (Distribuida por Jasco Analítica
SPAIN, Madrid).
- Precolumna 4.0 mm x 3.0 mm “Phenomenex” (Torrance, CA, USA).
(Distribuida por Jasco Analítica SPAIN, Madrid).
- Software Millennium32 Chromatography Manager de “Waters”.
2.1.3.2. Instrumentación y material
34
Materiales y Métodos
•
Balanza Analítica “Mettler” con aproximación de 0.0001g
•
Agitadores magnéticos “Selecta-P”
•
Baño Ultrasonido “Selecta-P” con capacidad de 6 L
•
Bomba de Vacío de Membrana Vacuubrand “Schott Iberia” de 1.7
m3/h
•
pH-metro “Crison” GLP22
•
Baño de agua termostatizado “Selecta-P” Digiterm 3000542
•
Vortex “IKA” 230V, 50/60Hz
•
Sistema de filtración de agua Milli-Q “Millipore”
•
Filtros con un tamaño de poro de 045µm “Millipore”
•
Micropipeta digital Nichipet EX “Nichiryo” de 10 a 100µl
•
Micropipeta digital Nichipet EX “Nichiryo” de 100 a 1000µl
•
Desecador de vidrio con gel de sílice
2.2. MÉTODOS
2.2.1. Preparación de las fases móviles
La disolución de acetato sódico se preparó disolviendo 19.05 g de acetato sódico
trihidratado con agua Milli-Q hasta un volumen final de 1 L. Seguidamente se ajustó el
pH de dicha disolución a 5.5 con una disolución de ácido fosfórico en agua al 10%
(p/v). Una vez ajustado el pH se añadió 1 mL de una disolución de EDTA cálcico
disódico en agua (1g/L) y 2.37 mL de trietanolamina (TEA). Finalmente se ajustó de
nuevo el pH bien a 4.92 (para la preparación la fase móvil D) o a 5.15 (para la
preparación de las fases B y C) con el ácido fosfórico al 10% y se añadió la
correspondiente proporción de acetonitrilo (fases D, C y B). Para la fase móvil A se
utilizó acetonitrilo y agua en la proporción 60:40.
Todas las disoluciones fueron filtradas a través de un filtro de membrana
“Millipore” con un tamaño de poro de 0.45 µm antes de ser usadas.
2.2.2. Condiciones cromatográficas
35
Materiales y Métodos
Los derivados de aminoácidos se separaron empleando un gradiente cuaternario
compuesto por las siguientes fases móviles:
•
Fase Móvil A: acetonitrilo - agua Milli-Q (60:40)
•
Fase Móvil B: acetato sódico pH 5.15 - acetonitrilo (80:20)
•
Fase Móvil C: acetato sódico pH 5.15 - acetonitrilo (96:4)
•
Fase Móvil D: acetato sódico pH 4.92 - acetonitrilo (96:4)
Partiendo del gradiente propuesto por Hernández-Orte et al. (2003) se realizaron
sucesivas pruebas de gradiente, resultando ser el más adecuado el que figura en la
siguiente tabla:
Tabla 2.4 . Gradiente de elución
Tiempo (min)
0
20
22
25
28
44
64
84
94
%A
0
0
0
0
0
0
0
100
0
%B
0
0
0
31
34
57
100
0
0
%C
0
0
100
69
66
43
0
0
0
%D
100
100
0
0
0
0
0
0
100
Los cambios de gradiente se realizaron de manera lineal y el análisis
cromatográfico se llevó a cabo a 34º C. El volumen de inyección fue de 20 µL.
2.2.3. Preparación de patrones
Se prepararon disoluciones para cada uno de los patrones de aminoácidos
estudiados, así como para el amonio. Las disoluciones de cada patrón se prepararon
disolviendo en agua Milli-Q una cantidad correspondiente a 400 mg de patrón hasta un
36
Materiales y Métodos
volumen final de 25 mL. Para algunos aminoácidos fue necesaria la adición de ácido
clorhídrico o amoniaco para su completa disolución como se indica en la Tabla 2.5.
Tabla 2.5. Concentraciones de las distintas disoluciones empleadas
Patrones
Riqueza
%
mg
Patrón 1
(mg/L)
Patrón 3
(mg/L)
Aspártico (Asp)
Asparagina (Asn)a
Serina (Ser)
Ácido Glutámico (Glu)a
Histidina (His)
Glutamina (Gln)a
Glicina (Gly)
Arginina (Arg)
SulfatoAmónico (NH4+)
Treonina (Thr)
Alanina (Ala)
Prolina (Pro)
Ácido γ-Aminobutírico (GABA)
Cisteina (Cys)a
Tirosina (Tyr)a
Valina (Val)a
Metionina (Met)a
Ornitina monohodroclorada (Orn)
Lisina (Lys)
Isoleucina (Ileu)a
Leucina (Leu)a
Fenilalanina (Phe)
Triptófano (Trp)b
98
>99
99
99
99
>99.5
99.7
>99.5
98
>99.5
99
99
99
400
400
400
400
400
400
400
400
1498
400
400
400
400
400
400
400
400
515
400
400
400
400
400
1.568
1.584
1.584
1.584
1.584
1.592
1.595
1.592
1.600*
1.592
1.584
1.584
1.584
1.592
1.584
1.584
1.584
1.600**
1.568
1.584
1.584
1.584
1.592
333.2
330.66
265.32
368.28
388.08
366.16
189.43
437.8
45.2
298.102
222.948
289.08
259.38
455.4
293.04
374.22
332
366.52
328.68
328.68
413.82
513.42
*
Concentración de amonio
Concentración de ornitina
**
a
b
>99.5
>99
>99
>99
99
98
>99
99
>99
>99.5
Se añadió ácido clorhídrico al 32% hasta disolución
Se añadió amoniaco al 25%hasta disolución
La preparación de la disolución del patrón interno α-aminobutírico (disolución
“patrón 2”) empleada en el estudio se llevó acabo en dos pasos. En primer lugar se
disolvió 26.04 mg de patrón en 50 mL de agua Milli-Q, resultando una disolución de
520 mg/L teniendo en cuenta su riqueza. En segundo lugar, se tomó 1.25 mL de la
disolución anterior y se llevó a un volumen final de 10 mL con agua Milli-Q. Esta
nueva disolución tiene una concentración de 64.45 mg/L de ácido α-aminobutírico.
Los aminoácidos y el ión amonio son inestables en disolución a temperatura
ambiente y con el tiempo se van descomponiendo. Por este motivo se deben conservar a
37
Materiales y Métodos
una temperatura entre 4 y 8ºC y los más inestables (cisteina, metionina, triptófano,
ornitina, tirosina y amonio) a –20ºC.
A partir de las disoluciones “patrón 1” de los distintos estándares se prepararon,
mediante sucesivas diluciones, la disolución “patrón 3” y la disolución “mezcla
enriquecimiento”.
La disolución “patrón 3”, es una mezcla de todos los aminoácidos estudiados y
se empleó para preparar los diferentes niveles de concentración de la recta de calibrado.
Por otro lado, la disolución “mezcla enriquecimiento” que se utilizó para realizar
los estudios de recuperación se preparó añadiendo todos los aminoácidos estudiados,
resultando tener una concentración final de 1 mg/L de cada uno de ellos. Debido a que
los estándares de aminoácidos contienen como impureza ión amonio, se preparó, de
forma independiente, una disolución con la misma concentración (1 mg/L), que sólo
contenía dicho compuesto.
Antes de la derivatización, se procedió del siguiente modo, tanto para disoluciones de estándares, como
para muestras:
- Se tomaron 50 µL de α-ABA (PI) de la disolución “Patrón 2” (64.45 mg/L), 125 µL bien de las
disoluciones estándares o de las muestras diluidas y se añadió agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5
mL. A esta disolución se le denominó “mezcla prederivatización”.
La mezcla prederivatización de aminoácidos usada para la selección del
gradiente más adecuado contenía una concentración de 0.01 mM de PI, 0.1 mM de
ornitina, 0.15 mM de triptófano y cisteina y 0.05 mM del resto de aminoácidos y
amonio.
2.2.4. Preparación de muestras
Las muestras de vinagre se filtraron con papel de filtro y posteriormente se
diluyeron al 25% añadiendo 500 µL de la muestra a 1500 µL de agua Milli-Q. A partir
de las muestras así diluidas se preparó la mezcla prederivatización correspondiente tal y
como se ha explicado en el apartado anterior.
2.2.5. Reacción de derivatización
La reacción de derivatización se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del kit
(Cohen y Michaud, 1993). Para ello se añadieron 20 µL de la mezcla prederivatización
de los estándares o de las muestras diluidas a 60 µL de una disolución tampón de borato
sódico 0.2 mM a pH 8.8 y se agitó vigorosamente con un vortex durante 10 segundos.
Posteriormente, a esta mezcla se le añadió 20 µL de la solución AQC agitando
nuevamente otros 10 segundos y se llevó a un baño de agua a 55ºC durante 10 minutos
(Figura 2.1).
38
Materiales y Métodos
60 µL tampón borato
20 µL AQC
Mezcla
Prederivatización
Inyectan 20 µL
20 µL
55ºC-10 min
Figura 2. 1. Protocolo de derivatización
2.2.6. Identificación
La detección de los distintos aminoácidos y el amonio se realizó con un detector
de fluorescencia usando una λex de 250 nm y una λem de 395 nm.
La identificación se llevó a cabo utilizando los tiempos de retención
correspondientes a los picos cromatográficos de los patrones y los tiempos de retención
relativos de éstos frente al patrón interno (Tabla 2.6). Para conocer tanto los tiempos de
retención como el orden de elución de los compuestos estudiados se comenzó
inyectando de forma individual 0.04 nmoles del PI, 0.4 nmoles de ornitina, 0.6 nmoles
de triptófano y cisteina y 0.2 nmoles del resto de aminoácidos y el amonio y finalmente
se inyectó una mezcla de todos los patrones para comprobar la resolución de los picos
cromatográficos.
39
Materiales y Métodos
Tabla 2.6. Tiempos de retención
Tiempo de
retención
23.784
AMQ*
*
Tiempo de retención relativo
0.442
Ac Aspártico(Asp)
30.414
0.566
Asparagina (Asn)
31.566
0.588
Serina (Ser)
32.938
0.613
Ac Glutámico(Glu)
34.599
0.643
Histidina (His)
34.863
0.648
Glutamina (Gln)
35.578
0.662
Glicina (Gly)
35.914
0.668
Arginina (Arg)
38.610
0.718
+
Amonio (NH4 )
39.881
0.742
Treonina (Thr)
41.453
0.771
Alanina (Ala)
43.773
0.814
Prolina (Pro)
47.865
0.890
Ac γ-Aminobutírico (GABA)
49.809
0.925
Ácido α-Aminobutírico (PI)
53.772
1.000
Cisteina (Cys)
57.716
1.073
Tirosina (Tyr)
60.323
1.122
Valina (Val)
64.239
1.195
Metionina (Met)
65.736
1.222
Ornitina (Orn)
67.124
1.248
Lisina (Lys)
69.727
1.297
Isoleucina (Ileu)
75.565
1.405
Leucina (Leu)
76.346
1.420
Fenilalanina (Phe)
77.165
1.435
Triptófano (Trp)
77.883
1.448
AMQ: derivado de la hidrólisis del reactivo AQC que tiene lugar durante la reacción de derivatización
(Figura 1.8 de “Introducción”)
2.2.7. Cuantificación
La cuantificación se llevó a cabo utilizando un patrón interno. Para ello se
construyeron rectas de calibrado tomando los cocientes entre las áreas de los picos de
40
Materiales y Métodos
cada compuesto y la del patrón interno frente a la concentración de cada compuesto en
la mezcla prederivatización.
Como se señaló en el apartado 2.2.3, para realizar las rectas de calibrado de los
aminoácidos se tomaron diferentes volúmenes de la mezcla “patrón 3”, cuyas
concentraciones se muestran en la Tabla 3.2 del apartado 3.2.2 de “Resultados y
Discusión”. Para el caso del ión amonio y debido a que los estándares de aminoácidos
contienen como impureza ión amonio, se preparó de forma independiente una
disolución “patrón 3” que contenía sólo dicho compuesto, a partir de la cual, tomando
diferentes volúmenes, se construyó la recta de calibrado del amonio.
Las rectas de calibrado se construyeron inyectando por duplicado los distintos
niveles de concentración, previa derivatización también por duplicado.
2.2.8. Límites de detección y cuantificación
Dado un método analítico determinado, se entiende por límite de detección
(LDD) la mínima concentración o cantidad de analito presente en la muestra que se
puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo las condiciones
experimentales descritas; y por límite de cuantificación (LDC) la mínima concentración
o cantidad de analito en la muestra que se puede cuantificar, bajo dichas condiciones
experimentales, con una adecuada precisión y exactitud.
Existen diferentes formas de determinar los límites de detección y cuantificación
dependiendo si el procedimiento es no-instrumental o instrumental (ICH, 1996):
• Basados en una evaluación visual
• Basados en la señal/ruido
• Basados en la desviación estándar de la respuesta y la pendiente
• Basados en la extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero
En nuestro caso, los límites de detección y cuantificación fueron determinados
por el método basado en la relación señal/ruido. Este método, uno de los más conocidos
y empleados, requiere que el procedimiento de análisis sea instrumental y que
proporcione una señal blanco, un ruido de fondo o una línea de base, es decir una señal
residual a concentración cero del analito tal como ocurre en los métodos
cromatográficos.
Para estimar los límites de detección y cuantificación en estos casos se han
propuesto estrategias basadas en la medida de la magnitud del ruido y de la altura de los
picos de los analitos. Generalmente se define el límite de detección como la
concentración que origina una señal/ruido (S/R), igual a un determinado valor, que
generalmente es 3. Análogamente, el límite de cuantificación corresponde a una
relación S/R de 10. Así pues, en la práctica fue preciso medir la magnitud del ruido,
multiplicar su valor por el factor elegido y convertirlo en una concentración mediante la
recta de calibrado. Para estimar la magnitud del ruido se realizaron mediciones sobre la
línea base de un cromatograma obtenido con un blanco, midiéndose su amplitud, es
decir la diferencia entre el valor máximo y el mínimo.
41
Materiales y Métodos
Debido a que no es posible encontrar en nuestro caso muestras “blancas”, es
decir muestras de vino o vinagre sin aminoácidos, para la elaboración del blanco se
realizó la reacción de derivatización sobre una disolución acuosa que contenía
exclusivamente el patrón interno.
2.2.9. Estudios de precisión
El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad del método de
ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo método de
ensayo. Como consecuencia de la existencia de estos errores, los análisis efectuados
sobre muestras idénticas, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a
resultados idénticos. Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de un
ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos,
tiempo, etc.) de aquí la importancia del estudio de la precisión.
La precisión es una medida del grado de separación o dispersión entre las
medidas realizadas empleando un método analítico y trabajando en condiciones
normales de operación. Se expresa normalmente como porcentaje de desviación
estándar relativa (DER) o coeficiente de variación (CV). La precisión debe evaluarse a
tres niveles: repetitividad, precisión intermedia y reproducibilidad.
La repetitividad es una medida del grado de dispersión de una serie de medidas
realizadas en un espacio de tiempo corto (en un mismo día). La precisión intermedia es
una medida de la dispersión de los resultados obtenidos por un método analítico en un
espacio de tiempo más amplio que la repetitividad, modificando ciertas condiciones de
operación: diferentes días, analistas, equipos, etc. Por último, la reproducibilidad
expresa la precisión entre laboratorios, formando parte de los estudios interlaboratorio.
Para cumplir los objetivos marcados en el presente trabajo, la precisión fue
evaluada a dos niveles: repetitividad y precisión intermedia. Se determinó tanto para el
método analítico como para el proceso de derivatización.
La medida de precisión, expresada como coeficiente de variación (CV), se
determinó mediante la expresión:
% CV = (s/x) × 100
Donde s y x representan los valores de desviación estándar y valor medio de una
serie de medidas repetidas.
Para los estudios de precisión se utilizó una muestra de vinagre diluida al 15%
enriquecida con una concentración de 250 µg/L de cada patrón .
a) Repetitividad
42
Materiales y Métodos
•
Repetitividad del proceso de derivatización: Para llevar a cabo la
repetibilidad del proceso de derivatización se realizaron 5 derivatizaciones
de la muestra diluida inyectando cada una por duplicado en la misma sesión
de trabajo.
•
Repetitividad del método analítico: En este caso se realizaron 5 replicados de
la muestra derivatizada en una única sesión de trabajo.
b) Precisión intermedia
•
Precisión intermedia del proceso de derivatización: Para la precisión
intermedia del proceso de derivatización se realizaron 5 derivatizaciones de
la muestra diluida en 5 sesiones de trabajo diferentes, a lo largo de un
periodo de 25 días, inyectando cada una de ellas por duplicado.
•
Precisión intermedia del método analítico: En el caso de la precisión
intermedia del método se analizó la muestra derivatizada en 5 sesiones de
trabajo a lo largo de un periodo de 7 días.
2.2.10. Estudios de recuperación
La exactitud se evaluó mediante los estudios de recuperación. Para llevar a cabo
dichos estudios se realizó la adición de patrones a una muestra de vinagre diluida al
15% a tres niveles de concentración: Nivel 0 = 250 µg/L, Nivel 1 = 300 µg/L, Nivel 2 =
350 µg/L. Estas concentraciones se eligieron por estar dentro del intervalo de linealidad
de los distintos patrones.
La adición se llevó a cabo en la mezcla prederivatización del siguiente modo:
•
Nivel 0: Se tomaron 125 µL de la muestra de vinagre diluida, 125 µL de la
mezcla enriquecimiento y 50 µL de la disolución “patrón 2” del PI, y se
diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5 mL, obteniéndose
una concentración de 250 µg/L de cada patrón. (En el apartado 2.2.3 se
explica como se preparó la mezcla enriquecimiento).
•
Nivel 1: Se tomaron 125 µL de la muestra de vinagre diluida, 250 µL de la
mezcla enriquecimiento y se diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen
final de 2.5 mL, obteniéndose una concentración de 300 µg/L de cada patrón.
•
Nivel 2: Se tomaron 125 µL de la muestra de vinagre diluida, 375 µL de la
mezcla enriquecimiento y se diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen
final de 2.5 mL, obteniéndose una concentración de 350 µg/L de cada patrón.
Posteriormente se llevó a cabo la reacción de derivatización de los diferentes
niveles por duplicado y se inyectó en el cromatógrafo 20 µl de cada duplicado.
43
Materiales y Métodos
2.2.11. Estudio de dilución de las muestras
Dada la elevada sensibilidad del método fue necesario diluir las muestras. Con objeto de
determinar la dilución óptima de las mismas se realizaron diferentes diluciones en agua
tanto para vino como vinagre: 5, 15, 25, 35 y 50%.
2.3. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS
Con objeto de establecer si existen o no diferencias significativas entre las
muestras se aplicó el análisis de la varianza (ANOVA), usando el programa informático
STADISTICA 99, versión 5.5.
44
Resultados y Discusión
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
Se partió de las condiciones cromatográficas recomendadas en el método
original para vinos (Hernández-Orte et al., 2003):
-
Fases móviles: acetato sódico 0.14 M a pH 4.92 y 5.15, acetonitrilo y agua
Milli-Q.
Flujo: 1 mL/min.
Temperatura de la columna: 34ºC.
Detección: fluorescencia con λex de 250 nm y λem de 395nm.
La resolución entre los picos correspondientes a la parte inicial y final del
cromatograma obtenido de la disolución patrón no era satisfactoria por lo que se
hicieron varias modificaciones en el gradiente hasta conseguir la mejor resolución. Las
fases móviles y el gradiente definitivo aparecen en la Tabla 2.4 de “Materiales y
Métodos”. El resto de las condiciones se mantuvieron igual que en el método original.
En la Figura 3.1. se muestra un cromatograma de una disolución de patrones en
las condiciones óptimas del método.
Figura 3.1. Cromatograma de una disolución de patrones en las condiciones óptimas del
método. R: AMQ (Producto de la hidrólisis del reactivo); 1: Asp; 2: Asn; 3: Ser; 4: Glu; 5: His; 6: Gln;
7: Gly; 8: Arg; 9: Amonio; 10: Thr; 11: Ala; 12: Pro; 13: GABA; 14: Cys; 15: Tyr; 16: Val; 17: Met; 18:
Orn; 19: Lys; 20: Ileu; 21: Leu; 22: Phe; 23: Trp.
45
Resultados y Discusión
Una vez establecidas las condiciones cromatográficas se llevó a cabo la
validación del método.
3.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO
La definición ISO (International Standars Organization) de validación aplicada a
los métodos analíticos podría interpretarse como el proceso mediante el cual queda
establecido, por estudios experimentales, que la capacidad del método satisface los
requisitos para la aplicación analítica requerida.
Existe una gran variedad de documentación acerca de la validación de los
métodos analíticos (Huber, 1998; AEFI, 2001; ICH, 1996), especialmente para métodos
concretos (Filipe-Ribeiro y Mendes-Faia, 2006), y numerosas organizaciones
promueven su difusión e importancia, como la AOAC (Association of Official
American Chemists), EPA (Environmental Protection Agency), FDA (Food and Drug
Administration), ICH (International Conference on Harmonization), USP (United States
Pharmacopeia), EURACHEM (European Analytical Chemistry), etc.
La validación de la metodología propuesta se realizó siguiendo las
recomendaciones de la ICH y EURACHEM publicados en guías para la validación de
métodos y procedimientos analíticos (EURACHEM, 1993; ICH, 1996).
La validación lleva consigo la evaluación de varios parámetros del método como
la selectividad, exactitud (estudios de recuperación), precisión, linealidad de la
respuesta del detector frente a la concentración, sensibilidad, así como límites de
detección y cuantificación (Huber, 1998).
3.2.1. Especificidad o selectividad
Ambos términos se utilizan con frecuencia indistintamente, aún siendo
conceptos diferentes. Para los métodos cromatográficos, la especificidad es la capacidad
del método para medir con exactitud la respuesta de un analito en presencia de todos los
posibles componentes de una muestra, mientras que el término selectividad se refiere a
un método que proporciona respuestas para un número de entidades químicas que
pueden o no ser distinguidas de otras. Si la respuesta se distingue de todas las demás, se
dice que el método es selectivo. Por tanto, el término adecuado en nuestro caso es
selectividad (Huber, 1998).
La selectividad se determinó en un sustrato vínico y en muestras de vinagre
tomándose como criterio que los picos adyacentes correspondientes a los analitos
tuvieran una resolución de al menos 1.5 respecto a los picos restantes. Cuando se
calcula la resolución en el sustrato vínico y vinagre todos los aminoácidos presentan
resoluciones superiores a 1. En el sustrato vínico (Tabla 3.1 “Resolución A”), de todos
los pares de picos, 16 tienen valores superiores a 2 y sólo tres entre 1 y 1.5 (resolución
entre Ser-Glu, Glu-His y NH4+). Por otro lado, la resolución de los picos en las
46
Resultados y Discusión
muestras de vinagre (Tabla 3.1 “Resolución B”) también fueron para casi todos los
pares de picos superiorres a 1.5 y sólo para dos de ellos entre 1.1 y 1.5 (resolución entre
Glu-His y Arg-NH4+).
Tabla 3.1. Resolución de los picos cromatográficos
Compuesto
Asp
tR (min)
30.414
Ser
32.938
Glu
34.599
His
34.863
Gly
35.914
Arg
38.610
NH4+
39.881
Thr
41.453
Ala
43.773
Pro
47.865
GABA
49.809
AABA(PI)
53.772
Tyr
60.323
Val
64.239
Met
65.736
Orn
67.124
Lys
69.727
Ileu
75.565
Leu
76.346
Phe
77.165
Resolución A
Resolución B
3.2
3.0
1,2
2,8
1,1
1.33
1,5
1,7
3,6
4,0
1,7
1,2
1,1
2,0
3,5
2,6
5,7
4,6
2,9
1,6
4,5
5,1
8,4
8.0
5,0
5,5
2,4
2,0
2.0
3,4
2,8
3,6
7,3
8,6
2,1
1,8
2,2
2.0
Resolución A: Valores de resolución calculados en el sustrato vínico diluido al
25%
Resolución B: Valores de resolución calculados en muestras de vinagre diluidas al
25%.
3.2.2. Linealidad
La linealidad de un procedimiento analítico se define como su capacidad (dentro
de un intervalo) para obtener resultados que sean directamente proporcionales (o por
47
Resultados y Discusión
medio de ecuaciones matemáticas) a la concentración (cantidad) de analito en la
muestra.
Para determinar la linealidad se tomó el área relativa de los picos de cada uno
de los aminoácidos estudiados y amonio a diferentes niveles de concentración (entre 5 y
9), dentro del intervalo esperable en las muestras de vinagre, vino y sustratos de partida
para los procesos de acetificación una vez que hayan sido diluidas convenientemente
para su análisis (al 25%). Los ensayos se realizaron por duplicado.
En la Tabla 3.2 aparece el intervalo de concentración lineal, los niveles de
concentración, la ecuación de regresión lineal de la concentración frente a la respuesta
del detector y el coeficiente de regresión lineal de cada compuesto. Se observó una
adecuada linealidad obteniéndose en todos los casos unos coeficientes de correlación
superiores a 0.992 en los intervalos de concentración indicados en dicha Tabla.
Tabla 3.2. Rectas de calibrado de los aminoácidos y amonio determinado en vinagres
Compuestos
Intervaloa
n*
Ecuación
r2
Asp
33.28 – 1663.75 7
y = 0.0003x - 0.0029
0.995
Asn
33.03 – 1651.50 7
y = 0.0003x + 0.0395
0.993
Ser
13.14 – 1313.63 7
y = 0.0004x + 0.069
0.992
Glu
18.39 – 1839.13 8
y = 0.0003x + 0.0093
0.999
His
19.40 – 1939.50 8
y = 0.0005x + 0.0325
0.997
Gln
18.27 – 1826.88 8
y = 0.0003x +0.0174
0.996
Gly
9.38 – 938.38
7
y = 0.0009x + 0.0205
0.998
Arg
21.80 – 2177.50 9
y = 0.0005x - 0.0006
0.999
NH4+
4.5 – 112.5
5
y = 0.0035x + 0.7566
0.997
Thr
14.89 – 1489
8
y = 0.0006x + 0.0132
0.999
Ala
11.14 – 1113.63 8
y = 0.0008x + 0.0190
0.999
Pro
14.40 – 1439.13 8
y = 0.0003x - 0.0008
0.999
GABA
12.89 – 1289
9
y = 0.0007x + 0.0109
0.996
Cys
30.29 – 1514.50 8
y = 0.0001x + 0.0014
0.998
Tyr
45.30 – 2264.88 8
y = 0.0003x + 0.0060
0.999
Val
14.64 – 1464.38 8
y = 0.0009x + 0.0105
0.998
Met
18.65 – 1865.13 9
y = 0.0006x + 0.0021
0.999
Orn
16.52 – 1652
7
y = 0.0004x + 0.0225
0.998
Lys
36.55 – 1827.38 9
y = 0.0003x + 0.0104
0.999
Ileu
16.40 – 1639.75 9
y = 0.0011x + 0.0199
0.998
Leu
16.40 – 1147.82 8
y = 0.0013x - 0.0078
0.995
Phe
20.65 – 1445.41 7
y = 0.0013x + 0.0158
0.996
Trp
127.6 – 2552.8
5 y = 0.00004x + 0.0019 0.994
a
Concentración en µg/L (referido a la mezcla prederivatización)
*
Niveles de concentración
L.D.D.a
L.D.C.a
25.15
16.5
14.0
13.91
35.1
26.14
6.42
45.73
5.07
0.92
0.20
36.61
10.21
17.4
33.81
17.82
26.11
24.24
14.35
7.53
16.39
32.12
110.37
53.99
33.00
28.52
35.84
70.05
52.27
14.74
62.05
16.90
2.11
9.61
64.40
21.87
34.8
55.96
25.92
39.75
60.59
43.86
14.35
31.55
83.51
280.78
3.2.3. Exactitud
La exactitud de un método analítico es un parámetro que indica la cercanía de
los resultados obtenidos por este método a un valor considerado como real.
48
Resultados y Discusión
Existen varios procedimientos para determinar la exactitud de una metodología
analítica:
-
Aplicación del procedimiento analítico a materiales de referencia certificados
(MRC), cuya concentración de analito es conocida y comparación del valor
medido con el valor certificado como real.
-
Comparación de los resultados obtenidos por la metodología propuesta con
aquellos obtenidos mediante un método normalizado cuya trazabilidad es
conocida.
-
Recuperación de cantidades conocidas de analito, obtenidas mediante el
enriquecimiento de las muestras. La media de las réplicas indica el grado de
exactitud del método.
Para validar la exactitud de la propuesta metodológica, se optó, ante la ausencia
de un MRC para este tipo de analitos en muestras de vinagres, por el
enriquecimiento de las muestras.
En nuestro caso, la recuperación media se calculó a partir de los valores
obtenidos al inyectar por duplicado una muestra de vinagre diluida al 15% enriquecida
con todos los patrones a tres niveles de concentración: nivel 0 (250 µg/L), nivel 1 (300
µg/L) y nivel 2 (350 µg/L). Las recuperaciones así obtenidas se presentan en la Tabla
3.3.
Tabla 3.3. Ensayo de recuperación en una muestra de vinagre enriquecida con aminoácidos y
amonio a tres niveles de concentración.
Compuesto
Asp
Asn
Ser
Glu
His
Gln
Gly
Añadido
(µ
µg/L)
Recuperado
(%)
Recuperación
Media (%)
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
77.5
73.5
77.04
92.2
86.7
91.5
52.9
68.5
71.6
89.7
84.8
90.9
84.5
82.4
82.3
103.5
102.1
102.5
79.0
80.2
81.6
76.0
90.1
64.35
88.5
88.5
102.7
80.3
49
Resultados y Discusión
Tabla 3.3. Ensayo de recuperación en una muestra de vinagre enriquecida con aminoácidos y
amonio a tres niveles de concentración (continuación)
Compuesto
Arg
NH4+
Thr
Ala
Pro
GABA
Cys
Tyr
Val
Met
Orn
Lys
Ileu
Leu
Phe
Trp
Añadido
(µ
µg/L)
Recuperado
(%)
Recuperación
Media (%)
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
250
300
350
85.0
75.3
83.4
82.74
86.7
90.2
92.6
87.8
89.7
91.1
78.1
92.1
86.4
73.8
87.8
106.9
105.3
106.6
52.8
46.2
59.9
90.9
91.4
93.5
89.1
85.8
84.8
91.7
91.3
90.9
69.7
83.1
86.0
84.5
85.9
90.2
88.1
86.3
88.2
78.1
82.5
84.7
86.2
92.2
94.5
68.8
88.3
82.8
81.22
86.6
90.1
87.11
82.7
106.3
53.0
91.9
86.5
91.3
79.6
86.9
87.6
81.8
91.0
80.0
50
Resultados y Discusión
Según el manual de la AOAC (Huber, 1998), para concentraciones entre 1 ppm
y 100 ppb las recuperaciones deben ser entre el 80 y 110%. En nuestro caso, para casi
todos los aminoácidos las recuperaciones fueron superiores al 80%, y por tanto están de
acuerdo con los valores propuestos por la AOAC. Únicamente serina y cisteína
mostraron recuperaciones más bajas, pero, coincidiendo con Valero et al. (2005), en las
muestras de vinagre este aminoácido se encuentra en pequeña concentración e incluso,
no se consigue determinar. Además, en muchos trabajos de investigación se ha
comprobado que la cisteína también se encuentra en muy pequeña concentración,
incluso no detectable, en muestras de vino (Hernández-Orte et al., 2003; Pripis-Nicolau
et al., 2001; Puig-Deu y Buxaderas, 1994; Botella et al, 1990). Sin embargo, en los
vinagres de Jerez tradicionales si se ha podido determinar este aminoácido con una
concentración media de 10 mg/L (Palacios et al., 2002).
3.2.4. Límites de detección y cuantificación
Los límites de detección y cuantificación se determinaron según la relación
señal/ruido (S/R) tal como se explicó en el apartado 2.2.8 de “Materiales y Métodos”.
Los resultados obtenidos, mostrados en la Tabla 3.2, fueron una media de diez
veces superiores a los obtenidos por Hernández-Orte et al. (2003) para casi todos los
aminoácidos y amonio excepto para la treonina y alanina. Los límites de detección
oscilaron entre 0.20(Ala)-45.73(Arg) µg/L y los límites de cuantificación entre 2.11
(Thr) –70.05 (His) µg/L, excepto para el caso del triptófano, el cual tuvo unos límites
superiores (LDD: 110.37 µg/L y LDC: 280.75 µg/L). Estos valores demostraron que el
método era suficientemente sensible para determinar los aminoácidos y amonio
presentes en las muestras de vinagre de vino.
3.2.5. Estudios de precisión
Para cumplir los objetivos marcados en el presente trabajo, la precisión fue
evaluada a dos niveles: repetitividad y precisión intermedia. Se determinó tanto para el
método analítico como para el proceso de derivatización. (En el apartado 2.2.9 de
“Materiales y Métodos” se explica como se determinó la repetitividad y la precisión
intermedia).
c) Repetitividad y precisión intermedia del método analítico
Los valores de repetitividad obtenidos, medidos como CV, variaron entre 0.2
para la arginina y el amonio y 11.6 para la asparagina (Tabla 3.4). Estos valores están de
acuerdo con los propuestos por el manual de la AOAC (Huber, 1998), donde para
concentraciones comprendidas entre 1 ppm y 100 ppb se aceptan unos coeficientes de
variación entre 11 y 15%.
51
Resultados y Discusión
La precisión intermedia del método analítico se realizó durante 5 sesiones de
trabajo mediante la medida de la muestra derivatizada, la cual se repitió cinco veces. En
la Tabla 3.4 se muestran los valores de precisión intermedia expresados como
coeficiente de variación (CV). Estos valores variaron en un intervalo de entre 0.3
(leucina) y 13.9 (asparagina).
Tabla 3.4. Repetitividad y precisión intermedia del método analítico
Compuestos
Asp
Asn
Ser
Glu
His
Gln
Gly
Arg
NH4+
Thr
Ala
Pro
GABA
Cys
Tyr
Val
Met
Orn
Lys
Ileu
Leu
Phe
Trp
a
Repetitividad
(n = 5)
Mediaa
C.V. (%)
350.1
3.2
142.3
11.6
207.4
1.5
522.0
1.4
297.8
2.6
270.8
1.8
324.7
0.5
545.6
0.2
222.2
0.2
311.0
2.8
395.3
1.2
639.8
1.3
333.6
6.9
132.0
5.6
330.0
2.8
306.4
2.1
240.2
2.8
260.7
0.6
392.3
1.9
262.7
1.5
315.8
1.7
349.3
4.4
172.1
1.7
Precisión Intermedia
(n = 5)
Mediaa
C.V. (%)
402.1
8.3
142.3
13.9
294.1
0.9
532.3
3.3
283.3
1.4
281.0
0.9
416.9
3.2
526.0
2.4
178.1
0.8
472.9
0.9
467.4
2.3
691.8
2.6
297.1
1.2
188.2
4.8
375.7
2.4
325.7
0.9
225.2
3.5
292.2
1.1
361.7
3.3
266.8
0.6
320.7
0.3
363.9
1.5
170.4
1.1
Media de la concentración en µg/L (referido a la mezcla prederivatización)
d) Repetitividad y precisión intermedia del proceso de derivatización
En la Tabla 3.5 se muestran los valores de repetitividad y de precisión intermedia, expresados como
coeficientes de variación. Los valores encontrados para la repetitividad oscilaron entre 0.1 para el amonio y 12.5 para
la fenilalanina.
Para la precisión intermedia del proceso de derivatización se realizaron 5
derivatizaciones de la muestra diluida en 5 sesiones de trabajo diferentes inyectando
cada una de ellas por duplicado. Los valores obtenidos variaron entre 0.1 para el amonio
y 12.8 para la glicina. Estos valores junto con los de la repetitividad están de acuerdo
con los propuestos por Huber (1998).
52
Resultados y Discusión
Tabla 3.5. Repetitividad y precisión intermedia del proceso de derivatización
Compuestos
Asp
Asn
Ser
Glu
His
Gln
Gly
Arg
NH4+
Thr
Ala
Pro
GABA
Cys
Tyr
Val
Met
Orn
Lys
Ileu
Leu
Phe
Trp
a
Repetitividad
(n = 5)
Mediaa
C.V. (%)
343.5
0.3
154.1
8.9
217.4
0.6
504.8
0.5
255.7
3.4
225.0
0.4
307.9
4.9
515.3
0.2
225.6
0.1
313.7
1.7
380.5
1.7
629.8
4.8
368.8
0.6
193.8
8.1
377.0
2.7
378.9
6.8
282.7
2.7
267.0
0.7
349.6
1.4
275.3
2.0
320.2
0.4
324.6
12.5
151.1
6.9
Precisión Intermedia
(n = 5)
Mediaa
C.V. (%)
316.0
1.8
145.2
5.3
193.1
2.2
478.1
9.8
249.3
7.0
212.5
2.1
328.2
12.8
507.0
5.2
225.6
0.1
307.4
5.8
410.8
7.4
653.9
1.4
338.0
0.4
160.5
5.6
390.7
8.1
320.8
0.8
278.4
3.3
293.4
8.1
362.7
4.6
280.8
4.7
322.7
2.4
360.7
1.7
155.2
6.9
Media de la concentración en µg/L (referido a la mezcla prederivatización)
3.3. ELECCIÓN DE LA DILUCIÓN ÓPTIMA DE LAS MUESTRAS
Dada la elevada sensibilidad del método fue necesario diluir las muestras de
vinagre. Con objeto de determinar la dilución óptima de las mismas se realizaron
diferentes diluciones (5, 15, 25, 35 y 50%) tanto para sustrato vínico como vinagre
(apartado 2.2.10 de “Materiales y Métodos”).
Para este estudio se empleó un sustrato vínico con elevada acidez volátil (0.9º
acético/100 mL), el cual se utilizó posteriormente como sustrato en la acetificación de
las muestras de vinagre analizadas, y un vinagre de Jerez.
El sustrato vínico contenía todos los aminoácidos menos la asparagina y
glutamina; y el vinagre de Jerez además de éstos carecía de cisteína y metionina.
Después de valorar las concentraciones de aminoácidos y amonio esperables en
las muestras de vinagre y los intervalos de linealidad de dichos compuestos en vino y en
vinagre, se optó por una dilución del 25%, la cual permitirá cuantificar los aminoácidos
y el amonio tanto en sustratos vínicos como en vinagres. Además comprobamos que las
diluciones ensayadas mostraron una adecuada linealidad (Tabla 3.6) obteniéndose unos
coeficientes de correlación aceptables.
53
Resultados y Discusión
Tabla 3.6. Linealidad de las muestras diluidas
Compuestos
Asp
Asn
Ser
Glu
His
Gln
Gly
Arg
NH4+
Thr
Ala
Pro
GABA
Cys
Tyr
Val
Met
Orn
Lys
Ileu
Leu
Phe
Trp
Vino picado
Intervalo
r2
de dilución
25-50 %
0.991
n.d.
n.d.
15-50%
0.990
15-50%
0.943
15-50%
0.874
n.d.
n.d.
15-50%
0.987
15-5%
0.934
25-50%
0.877
15-50%
0.920
15-50%
0.962
15-50%
0.933
15-50%
0.932
15-50%
0.993
15-50%
0.934
15-50%
0.950
15-50%
0.983
15-50%
0.950
15-35%
1.000
15-50%
0.994
15-50%
0.992
15-50%
0.996
n.d.
n.d.
Vinagre de Jerez
Intervalo
r2
de dilución
5-50%
0.999
n.d.
n.d.
5-50%
0.981
5-50%
0.999
5-50%
0.994
n.d.
n.d.
5-50%
0.985
5-50%
0.999
5-50%
0.809
5-50%
0.987
5-50%
0.998
5-50%
0.999
5-50%
0.999
n.d.
n.d.
5-50%
0.993
5-50%
0.990
n.d.
n.d.
5-50%
0.998
5-50%
0.994
5-50%
0.993
5-50%
0.999
15-50%
0.996
15-50%
0.998
3.4. APLICACIÓN DEL MÉTODO A MUESTRAS DE VINAGRE
Por último, tras la validación del método sólo queda aplicarlo a muestras reales y de características
diferentes descritas en el apartado 2.1.1 de “Materiales y Métodos”.
Al objeto de comprobar la validez del método y llevar a cabo un seguimiento de los aminoácidos durante
los procesos de acetificación, se analizaron un total de 36 muestras de diferentes características.
En el “Anexo” (Tablas de la 1 a la 12) aparecen los valores medios obtenidos en las muestras para cada
aminoácido y amonio acompañados de sus desviaciones estándares.
3.4.1. Consumo de nitrógeno total
El consumo de nitrógeno total en los procesos de acetificación estudiados fue
evaluado considerando conjuntamente el nitrógeno aportado por los aminoácidos libres
y el procedente del amonio.
54
Resultados y Discusión
Al inicio de la fermentación las muestras del sustrato F tenían una cantidad de
nitrógeno entre 84.7 y 120.2 mg/L, y las del sustrato T entre 174.1 y 196.5 mg/L. El
descenso total del contenido de nitrógeno en todas las acetificaciones estudiadas oscila
entre 7.3-52%. Las acetificaciones duraron 5-9 meses para las muestras del sustrato T y
1.5-2.5 meses para las del F, comenzando, ambas, en el mes de Agosto. Las primeras se
llevaron a cabo en bodega y las del sustrato F al aire libre. En el caso del sustrato T,
coincide el menor consumo con el periodo de tiempo de acetificación más corto (5
meses) y parece existir una relación entre consumo de nitrógeno y tiempo invertido en
la acetificación.
Comparando 4 acetificaciones en las muestras del sustrato F (Figura 3.2), los
descensos oscilaban entre 17.3-33.2%.
120
N (mg/L)
100
80
I
F
60
40
20
0
A
B
C
D
Figura 3.2. Descenso del contenido de nitrógeno en las muestras del sustrato F
En las muestras del sustrato T (Figura 3.3) los descensos oscilaron entre 2052.0%. Todas las acetificaciones de este sustrato mostraron descensos mayores a los
obtenidos en el sustrato F, probablemente debido a la mayor duración del proceso de
acetificación en el sustrato T que conlleva un mayor requerimiento de nitrógeno por
parte de las bacterias acéticas.
250
N (mg/L)
200
150
I
100
F
50
0
A
B
C
D
Figura 3.3. Descenso del contenido de nitrógeno en las muestras de Tarragona
55
Resultados y Discusión
Comparando los dos sustratos, F y T, se observa que los descensos menores se
producen en el mismo sistema de acetificación (CL).
Por otro lado, en el sustrato F también se compararon las acetificaciones “CK”,
“CL” y “CM” (Figura 3.4) siendo la acetificación “CK” la que presentó un mayor
descenso seguido por la “CM”. Se obtuvo un descenso mucho menor en la “CL”.
Podríamos decir que “CK” y “CM” se asemejan más en cuanto al consumo de
nitrógeno.
200
N (mg/L)
150
I
100
E
50
0
CK
CL
CM
Figura 3.4. Comparación de las acetificaciones “CK”, “CL” y “CM” en cuanto al descenso de
nitrógeno en las muestras del sustrato F
Para el sustrato T se estudiaron las acetificaciones “DK”, “DL” y “DM”
(Figura 3.5) . En este caso “DK” y “DL” mostraron descensos elevados del orden del
50% y por el contrario, el descenso de “DM” fue mucho menor, siendo, además, el
menor de todos los obtenidos en todas las muestras analizadas, tanto las T como las F.
Por tanto, como se puede observar, las acetificaciones se completan con
consumos muy diferentes de nitrógeno total en las mismas condiciones ambientales.
56
Resultados y Discusión
250
200
mg/L
150
I
F
100
50
0
DK
DL
DM
Figura 3.5. Comparación de las acetificaciones “DK”, “DL” y “DM” en cuanto al descenso de
nitrógeno en las muestras del sustrato T
Aplicando el tratamiento estadístico del análisis de la varianza (ANOVA) al
cambio en el contenido total de nitrógeno se demostró que todos los descensos
observados resultaron ser estadísticamente significativos.
3.4.2. Evolución en el perfil de aminoácidos libres y amonio
En todas las muestras iniciales (F y T) el aminoácido mayoritario fue la prolina, seguido de la arginina,
coincidiendo con lo observado por otros autores (Herbert et al., 2000; Soufleros et al., 2003; Hernández-Orte et al.,
2003). Estos altos contenidos de prolina al inicio de la fermentación acética se deben a la dificultad con la que las
levaduras metabolizan este aminoácido durante la fermentación alcohólica, por lo que las cantidades de prolina en los
vinos son similares a la de los correspondientes mostos (Hernández-Orte et al., 2003).
La prolina aportó en las muestras del sustrato F un 34.7% del contenido de nitrógeno inicial y en las del
sustrato T un 49.9% y la arginina aportó un 20% en las muestras F y un 14% en las T (Figura 3.8). Por otro lado, en
ninguna de las muestras se detectó la asparagina, glutamina, cisteína y triptófano, coincidiendo este último con lo
descrito en la bibliografía (Llaguno y Polo, 1991b; Valero et al. 2005). Según lo observado por Hernández-Orte et
al., (2003), durante la fermentación alcohólica de los vinos el nivel de aminoácidos decrece, llegando en algunos
casos, como la cisteína, a consumirse totalmente.
Durante la fermentación se produjeron modificaciones en el contenido de
aminoácidos y amonio, dándose descensos importantes y en otros ligeros aumentos. De
forma general, se observaron descensos estadísticamente significativos en la mayoría de
los casos para: prolina, metionina, aspártico, amonio, glicina, arginina, isoleucina,
tirosina y leucina. Los dos primeros, prolina y metionina, descendieron en todos las
acetificaciones, siendo estos descensos estadísticamente significativos. En el caso del
aspártico los descensos fueron estadísticamente significativos en 9 de las 12
acetificaciones estudiadas. Por otro lado se constataron ligeros aumentos no
significativos para la serina, histidina y glutámico.
En todas las acetificaciones del sustrato F (Figura 3.6) se observaron descensos
estadísticamente significativos en los siguientes compuestos: prolina (descenso medio:
75%) y metionina (66%). También disminuyeron en la mayoría de los casos (siempre en
las acetificaciones “AL” y “BL”): aspártico, gamma-aminobutírico, amonio, alanina,
57
Resultados y Discusión
isoleucina y arginina. Por tanto, en las muestras del sustrato F el aminoácido que
presenta el descenso más marcado es la prolina.
Por otro lado, el ácido glutámico aumentó en todos las acetificaciones. También
presentan tendencias al aumento en la mayoría de los casos la ornitina, valina, y
fenilalanina. Estos aumentos no fueron estadísticamente significativos en ninguno de los
casos. Para el resto de los aminoácidos no se puede indicar una tendencia clara en los
procesos estudiados.
300
250
mg/L
200
I
150
F
100
50
PH
E
N
H
4
LE
U
VA
L
M
ET
O
R
N
LY
S
IL
EU
LY
AR
G
TH
R
AL
A
PR
O
G
AB
A
TY
R
H
IS
G
G
LU
AS
P
SE
R
0
Figura 3.6. Evolución de los aminoácidos y amonio en una muestra del sustrato F
En todas las acetificaciones del sustrato T (Figura 3.7) se observaron descensos
estadísticamente significativos en los mismos aminoácidos que en el sustrato anterior,
prolina y metionina, y además en valina. También disminuyeron en la mayoría de los
casos (siempre en las acetificaciones “AL”, “BL”, “DL” y “DK”) los aminoácidos
leucina, tirosina, fenilalanina, alanina, aspártico, glicina, arginina, gammaaminobutírico e isoleucina, así como el amonio. Estos descensos producidos en los 4
procesos de acetificación fueron estadísticamente significativos salvo para la glicina.
Además, en este caso, la ornitina y lisina también disminuyeron en la mayoría de los
casos y al presentar contenidos iniciales bajos se llegaron a valores no detectables.
En cuanto al ácido glutámico aumentó en la mayoría de las acetificaciones
(12.3%), aunque también de forma no significativa como en las muestras F, y
únicamente la serina, histidina y treonina no demostraron una tendencia clara en los
procesos estudiados.
58
750
700
650
600
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
I
F
LE
U
PH
E
N
H
4
AS
P
SE
R
G
LU
H
IS
G
LY
AR
G
TH
R
AL
A
PR
O
G
AB
A
TY
R
VA
L
M
ET
O
R
N
LY
S
IL
EU
mg/L
Resultados y Discusión
Figura 3.7. Evolución de los aminoácidos y amonio en una muestra del sustrato T
Comparando la evolución de los aminoácidos y amonio en los dos tipos de
muestras (F y T) podemos observar que muchos de ellos presentan la misma tendencia
como el aspártico, prolina, gamma-aminobutírico, metionina, isoleucina, arginina,
alanina, amonio (descienden) y glutámico (aumenta).
Por otro lado, encontramos algunos aminoácidos con evoluciones diferentes
como la leucina, fenilalanina, valina y glicina (en las muestras F no presentan una
tendencia clara y en las T descienden mayoritariamente).
En resumen, de todos los compuestos estudiados el que presenta el mayor
descenso en todas las acetificaciones es la prolina. Si nos fijamos en el aporte de
nitrógeno de cada aminoácido el de mayor consumo, en ambos casos, sigue siendo la
prolina, observándose descensos del orden de 24.76 mg N/L en las muestras F y 43.4
mg N/L en las muestras T. Esta tendencia es contraria a la observada por otros autores
(Valero et al., 2005) en cultivos sumergidos, donde la leucina es el aminoácido más
consumido por las bacterias acéticas. En nuestro caso la leucina ocupó el séptimo y el
noveno lugar en el orden de preferencia de las bacterias acéticas en las muestras F y T
respectivamente (Figura 3.8 y 3.9).
59
Resultados y Discusión
28
1,6
24
1,4
1,0
16
0,8
12
0,6
8
0,4
Consumo de Prolina (mg N/L)
20
1,2
4
0,2
Escala Izquierda
PRO
LEU
ILEU
MET
GABA
NH4
ALA
THR
ARG
GLY
ASP
0
Escala Derecha
Figura 3.8. Consumo de aminoácidos y amonio en función de la concentración de nitrógeno
aportado en las muestras F .
5,0
50
4,5
40
3,5
3,0
30
2,5
2,0
20
1,5
1,0
10
0,5
NH4
PRO
0
Consumo de Prolina y amonio (mg N/L)
4,0
ASP
GLY
ARG
THR
ALA
GABA
TYR
VAL
MET
ORN
LYS
ILEU
LEU
PHE
Consumo del resto de aminoácidos (mg N/L)
Consumo del resto de aminoácidos y amonio (mg N/L)
1,8
Escala Izquierda
Escala Derecha
Figura 3.9. Consumo de aminoácidos y amonio en función de la concentración de nitrógeno
aportado en las muestras T.
60
Resultados y Discusión
En los vinagres finales obtenidos el aminoácido mayoritario sigue siendo la
prolina, pero ahora supone un 17% del total de aminoácidos frente al 45% que
representaba en el sustrato de partida en las muestras F y un 57% frente al 62% inicial
en las muestras T. Según lo descrito en la bibliografía (Valero et al., 2005; Palacios et
al., 2002; Erbe y Brüeckner, 1998; Llaguno y Polo, 1991b) en todos los vinagres de
vino la prolina es el aminoácido mayoritario, pudiéndose considerar la presencia de éste
en el vinagre como un indicador de su procedencia vínica.
A pesar de los cambios experimentados durante la acetificación el orden de
abundancia del resto de aminoácidos se mantiene prácticamente igual al sustrato de
partida tanto en las muestras F como en las T.
61
Conclusiones
4. CONCLUSIONES
1. Se ha adaptado y validado un método para la determinación de aminoácidos en
vinagres de vino y vino en proceso de acetificación mediante Cromatografía de
Líquidos empleando el agente 6-aminoquinolil-N-hidrosicuccinimidil carbamato
(AQC), obteniéndose los siguientes resultados:
-
En cuanto a la selectividad, la resolución de los picos cromatográficos
fue superior a 1.5 para la mayoría de aminoácidos.
-
Se obtuvo una adecuada linealidad con unos coeficientes de correlación
superiores a 0.992.
-
El método demostró tener una alta sensibilidad, con unos límites de
detección entre 0.20 (Ala) - 45.73 (Arg) µg/L y unos límites de
cuantificación entre 2.11 (Thr) - 70.05 (His) µg/L, excepto para el caso
del triptófano, el cual tuvo unos límites superiores (LDD: 110.37 µg/L y
LDC: 280.75 µg/L).
-
Las recuperaciones fueron superiores al 80% para todos los aminoácidos
excepto para serina y cisteína.
-
La precisión fue evaluada a dos niveles: repetitividad y precisión
intermedia. Estos niveles se determinaron tanto para el método analítico
como para el proceso de derivatización, obteniéndose en ambos casos
unos coeficientes de variación acordes con los propuestos por el manual
AOAC.
2. Dada la alta sensibilidad del método es necesario diluir las muestras. Después de
valorar las concentraciones de aminoácidos y amonio esperables en las muestras
tanto de vino como de vinagre y los intervalos de linealidad de dichos
compuestos, se optó por una dilución del 25%.
3. Se han estudiado una serie de acetificaciones con cultivo superficial en madera,
y en ellos se observaron descensos estadísticamente significativos del nitrógeno
total.
4. En todas las muestras estudiadas, vinos y vinagres, el aminoácido más
abundante es la prolina seguido de la arginina; no detectándose, por el contrario
la asparagina, glutamina, cisteína y triptófano. De todos los compuestos
estudiados el que las bacterias acéticas utilizan en mayor extensión es la prolina.
62
Conclusiones
5. Durante la acetificación con cultivo superficial se observaron en la mayoría de
los casos descensos estadísticamente significativos para: prolina, metionina,
aspártico, amonio, glicina, arginina, isoleucina, tirosina, y leucina. Los dos
primeros, prolina y metionina, mostraron descensos estadísticamente
significativos en todos las acetificaciones.
6. Ciertos aminoácidos como la leucina, fenilalanina, valina y glicina presentan
evoluciones diferentes, ya que en las muestras F no presentan una tendencia
clara y en las T descienden mayoritariamente.
7. Los cambios en la concentración de aminoácidos y amonio a lo largo de la
acetificación no suponen una alteración en el orden de abundancia de los
mismos en los dos tipos de sustratos.
63
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YAMADA, Y; HOCINO, K.I; ISHIKAWA, T. (1997). The phylogeny of acetic acid bacteria
based on the partial sequences of 16S ribosomal RNA: The elevation of the subgenus
Gluconoacetobacter to the generic level. Biosci. Biotechem. 61, 1244-1251.
70
Anexo
Tabla 1. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación AL del sustrato F
Muestras de Vinagre
FALi
a,
FALm
FALf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
31.705 a
0.005
25.505
0.07
18.453 b
0.005
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
14.414 a
0.022
32.083
0.024
7.123 a
Glu
39.410
a
0.003
41.288
0.001
40.341
a
His
14.331 a
0.011
18.358
0.013
14.034 a
0.002
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
18.506 a
0.019
23.196
0.019
13.833 a
0.009
Arg
61.062 a
0.002
55.821
0.012
53.458 b
0.006
NH4+
11.186 a
0.085
6.499
0.065
10.612 a
0.110
Thr
12.758 a
0.005
14.267
0.005
10.533 a
0.004
Ala
32.923 a
0.010
31.355
0.000
26.912 a
0.018
Pro
291.142a
0.006
106.074
0.009
93.971 b
0.000
GABA
11.457 a
0.001
9.249
0.003
8.796 a
0.001
Cys
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
0.006
0.001
Tyr
14.580
a
b
0.002
20.756
0.005
12.361
Val
17.570 a
0.008
20.821
0.007
9.149 b
0.006
Met
2.138 a
0.000
0.936
0.001
0.548 b
0.000
Orn
5.864 a
0.007
13.187
0.026
6.675 a
0.000
Lys
25.676 a
0.002
28.113
0.000
24.770 a
0.002
Ileu
6.164 a
0.004
7.132
0.005
5.009 b
0.003
Leu
19.019 a
0.005
16.802
0.002
14.472 b
0.010
Phe
17.952 a
0.007
16.826
0.008
14.826 b
0.013
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
0.001
-
b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
.
71
Anexo
Tabla 2. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación BL del sustrato F
Muestras de Vinagre
Compuestos
FBLm
FBLf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
20.420 a
0.006
18.040
0.001
17.511 a
0.005
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
0.185 a
0.000
10.619
0.012
18.011 a
0.031
Glu
28.116 a
0.008
45.892
0.004
50.790 b
0.002
His
16.039 a
0.008
12.512
0.004
17.823 a
0.010
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
14.480 a
0.000
14.879
0.006
16.323 a
0.026
Arg
60.948 a
0.031
52.284
0.002
53.439 a
0.005
NH4
a,
FBLi
+
13.793
a
0.092
3.041
0.084
8.973
a
0.045
Thr
9.966 a
0.001
10.678
0.002
11.182 a
0.005
Ala
33.442 a
0.006
26.546
0.007
27.458 a
0.020
Pro
255.196 a
0.043
95.429
0.004
68.596 b
0.000
GABA
14.201 a
0.000
9.353
0.001
11.334 a
0.024
Cys
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Tyr
10.873 a
0.000
13.845
0.001
13.470 a
0.010
Val
9.035 a
0.000
8.895
0.002
11.876a
0.021
Met
1.726 a
0.000
0.619
0.000
0.544 b
0.001
Orn
3.346 a
0.003
3.971
0.001
6.915 a
0.016
Lys
26.602 a
0.006
24.768
0.001
25.337 a
0.000
Ileu
6.197 a
0.009
5.479
0.001
5.071 a
0.011
Leu
14.914 a
0.005
14.720
0.006
15.088 a
0.008
Phe
14.211 a
0.002
14.303
0.004
15.856 a
0.017
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
72
Anexo
Tabla 3. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CK del sustrato F
Muestras de Vinagre
Compuestos
FCKi
FCKm
FCKf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
31.131 a
0.004
21.251
0.005
11.515 b
0.001
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
7.462 a
0.012
3.067
0.005
7.018 a
0.006
Glu
57.938 a
0.001
43.779
0.003
32.631 b
0.005
His
14.526 a
0.004
16.590
0.006
15.248 a
0.007
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
18.322 a
0.016
20.684
0.013
13.984 a
0.001
Arg
66.751 a
0.001
58.193
0.002
51.327 b
0.002
a
0.001
10.105
0.005
3.933
Thr
13.030 a
0.003
11.235
0.000
12.627 a
0.001
Ala
30.533 a
0.004
32.431
0.012
21.793 b
0.006
Pro
308.428a
0.000
129.703
0.003
76.723 b
0.007
GABA
15.884 a
0.003
9.130
0.009
7.872 b
0.001
Cys
n.d.
.-
n.d.
-.
n.d
-
Tyr
19.493 a
0.003
16.435
0.005
15.420 a
0.004
Val
16.963 a
0.000
8.722
0.005
16.754 a
0.015
Met
2.115 a
0.001
0.688
0.001
0.400 b
0.000
Orn
4.824 a
0.004
4.103
0.004
4.667 a
0.004
Lys
28.904 a
0.008
27.071
0.002
27.387 a
0.001
Ileu
7.168 a
0.002
6.167
0.000
5.44 b
0.002
Leu
20.219 a
0.001
16.507
0.003
14.387 b
0.003
Phe
19.754 a
0.002
16.00
0.004
15.359 b
0.002
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
NH4
+
26.605
b
0.023
a, b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
73
Anexo
Tabla 4. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CL del sustrato F
Muestras de Vinagre
Compuestos
a,
FCLi
FCLm
FCLf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
23.048 a
0.006
30.061
0.001
17.526 a
0.007
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
7.793 a
0.048
13.200
0.022
23.295 a
0.026
b
0.006
Glu
28.131
a
0.011
46.165
0.008
42.135
His
10.679 a
0.031
13.937
0.002
17.289 a
0.007
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
18.128 a
0.045
17.253
0.012
19.007 a
0.014
Arg
54.858 a
0.002
58.911
0.000
55.428 a
0.004
NH4+
4.457 a
0.107
0.0222
10.245 a
0.034
Thr
11.722 a
0.012
14.290
0.007
12.706 a
0.005
Ala
24.496 a
0.029
25.195
0.030
29.126 a
0.008
Pro
267.840 a
0.012
135.289
0.002
43.500 b
0.010
GABA
12.807 a
0.003
4.858
0.002
9.207 b
0.003
Cys
n.d
-
n.d.
-
n.d.
-
Tyr
11.966 a
0.003
20.093
0.002
16.372 b
0.003
Val
13.260 a
0.010
16.613
0.010
18.932 b
0.003
Met
1.864 a
0.001
0.413
0.001
0.700 b
0.000
Orn
5.624 a
0.016
6.945
0.003
10.170 a
0.012
Lys
22.475 a
0.002
29.124
0.003
24.974 b
0.002
Ileu
4.656 a
0.004
6.263
0.007
6.084 b
0.005
Leu
15.953 a
0.011
16.016
0.006
16.550a
0.010
Phe
14.751 a
0.000
16.289
0.015
17.483 b
0.014
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
10.354
b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
74
Anexo
Tabla 5. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CM del sustrato F
Muestras de Vinagre
Compuestos
FCMi
FCMm
FCMf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
34.247 a
0.010
19.278
0.006
14.550 b
0.001
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
20.107 a
0.084
13.711
0.012
13.325 a
0.008
Glu
55.358 a
0.010
48.535
0.001
37.503 b
0.004
His
19.543 a
0.039
13.996
0.005
14.478 a
0.002
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
21.538 a
0.020
15.920
0.006
16.024 b
0.001
Arg
68.109 a
0.022
51.877
0.003
54.681 b
0.002
a
0.010
a
0.232
1.616
0.013
12.754
Thr
14.308 a
0.021
10.496
0.001
11.957 a
0.004
Ala
29.555 a
0.001
27.866
0.002
27.222 b
0.003
Pro
295.392a
0.151
109.143
0.004
75.687 b
0.017
GABA
15.275 a
0.034
9.684
0.004
7.560 a
0.015
Cys
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Tyr
18.329 a
0.004
16.771
0.002
15.234 a
0.011
Val
16.920 a
0.000
8.093
0.005
8.294 b
0.005
Met
1.359 a
0.001
0.630
0.000
0.538 b
0.000
Orn
6.565 a
0.008
5.626
0.002
4.648 a
0.004
Lys
28.522 a
0.003
24.860
0.001
26.388 a
0.002
Ileu
7.144 a
0.005
5.212
0.008
5.092 b
0.001
Leu
19.307 a
0.187
14.672
0.004
14.596 a
0.019
Phe
18.376 a
0.018
14.492
0.009
14.857 a
0.014
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
NH4
+
27.453
a, b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
75
Anexo
Tabla 6. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DL del sustrato F
Muestras de Vinagre
Compuestos
a,
FDLi
FDLm
FDLf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
35.109 a
0.003
15.363
0.006
21.423 b
0.007
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
24.576 a
0.008
8.935
0.010
17.948 a
0.026
Glu
44.096
a
0.004
46.734
0.010
48.882
a
0.011
His
18.373 a
0.004
14.342
0.003
16.089 a
0.010
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
21.926 a
0.013
14.936
0.008
16.581 a
0.021
Arg
60.534 a
0.039
53.728
0.006
55.312 a
0.013
NH4+
12.993 a
0.126
0.467
0.015
10.381 a
0.158
Thr
14.098 a
0.005
12.091
0.004
12.345 a
0.005
Ala
34.005 a
0.002
27.077
0.006
28.665 a
0.035
Pro
277.259 a
0.089
116.911
0.011
70.918 b
0.009
GABA
4.276 a
0.047
10.152
0.002
9.058 a
0.025
Cys
n.d.
-
n.d.
n.d.
-
Tyr
18.484
Val
a
a
0.017
0.001
13.197
0.003
17.544
9.205 a
0.002
18.435
0.008
15.132 a
0.087
Met
1.494 a
0.001
0.742
0.000
0.624 b
0.001
Orn
7.794 a
0.011
3.736
0.003
6.292 a
0.009
Lys
25.744 a
0.005
25.189
0.004
28.442 a
0.003
Ileu
6.544 a
0.004
5.696
0.001
6.009 a
0.006
Leu
17.600 a
0.017
15.849
0.010
15.611 a
0.017
Phe
16.041 a
0.023
15.666
0.004
16.239 a
0.028
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
76
Anexo
Tabla 7. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación AL del sustrato T
Muestras de Vinagre
Compuestos
TALi
TALm
TALf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
31.030 a
0.004
27.470
0.007
25.415 b
0.001
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
9.631 a
0.000
14.840
0.005
16.498 a
0.020
Glu
49.670 a
0.009
69.961
0.003
54.763 a
0.000
His
n.d. a
-
0.730
0.001
2.698 b
0.003
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
25.869 a
0.005
27.818
0.007
21.231 a
0.022
Arg
79.238 a
0.002
90.209
0.002
70.799 b
0.001
b
0.111
a
0.025
12.218
0.009
10.838
Thr
12.087 a
0.003
17.073
0.004
13.558 a
0.006
Ala
54.073 a
0.008
56.284
0.001
41.633 b
0.015
Pro
728.950a
0.053
637.734
0.006
394.449 b
0.003
GABA
24.790 a
0.001
31.422
0.002
23.826 a
0.009
Cys
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Tyr
11.417 a
0.001
13.219
0.003
0.931 b
0.000
Val
20.441 a
0.007
30.847
0.003
2.983 b
0.003
Met
1.355 a
0.000
0.594
0.000
0.109 b
0.000
Orn
11.218 a
0.002
12.323
0.003
n.d. b
-
Lys
22.446 a
0.001
30.876
0.003
6.898 b
0.004
Ileu
8.081 a
0.001
8.356
0.003
5.029 b
0.006
Leu
16.418 a
0.006
18.080
0.003
2.914 b
0.009
Phe
18.584 a
0.007
17.521
0.015
8.628 b
0.002
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
NH4
+
24.501
a, b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
77
Anexo
Tabla 8. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación BL del sustrato T
Muestras de Vinagre
Compuestos
a,
TBLi
TBLm
TBLf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
33.015 a
0.009
30.394±
0.003
22.775 b
0.000
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
19.481 a
0.003
26.047
0.001
13.364 b
0.008
Glu
45.175 a
0.004
63.250
0.001
45.655 a
0.001
His
7.051 a
0.001
2.030
0.002
0.897 b
0.001
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
28.568
a
0.011
20.705
b
0.005
24.056
0.015
Arg
82.489 a
0.012
85.936
0.009
60.430 b
0.004
NH4+
24.443 a
0.074
14.494
0.018
7.537 b
0.036
Thr
16.496 a
0.004
14.301
0.004
11.663 b
0.006
Ala
55.540 a
0.018
53.924
0.028
31.300 b
0.015
Pro
742.528 a
0.005
607.089
0.014
388.140 b
0.004
GABA
25.932 a
0.001
27.679
0.000
22.770 b
0.000
Cys
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Tyr
12.432 a
0.000
11.214
0.002
1.554 b
0.000
Val
22.184 a
0.006
29.129
0.018
2.570 b
0.001
Met
1.527 a
0.000
0.432
0.000
0.801 b
0.000
Orn
13.107 a
0.005
9.254
0.003
n.d. b
-
Lys
24.822 a
0.002
27.764
0.007
n.d. b
-
Ileu
6.454 a
0.000
7.089
0.004
3.381 b
0.002
Leu
15.731 a
0.004
17.377
0.016
2.141 b
0.000
Phe
14.668 a
0.006
15.649
0.012
7.610 b
0.002
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
78
Anexo
Tabla 9. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CL del sustrato T
Muestras de Vinagre
Compuestos
TCLi
TCLm
TCLf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
33.036 a
0.005
28.329
0.002
25.747 b
0.002
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
4.8780 a
0.016
14.844
0.001
16.339 a
0.009
Glu
49.660 a
0.009
66.814
0.008
62.289 a
0.000
His
n.d. a
-
6.539
0.001
4.429 b
0.009
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
29.385 a
0.048
25.358
0.001
24.734 a
0.006
Arg
88.670 a
0.014
87.641
0.011
83.155 a
0.001
a
0.131
a
0.207
27.347
0.015
33.286
Thr
14.638 a
0.019
16.673
0.005
16.130 a
0.004
Ala
59.597 a
0.023
53.351
0.005
49.970 b
0.003
Pro
819.126a
0.021
571.705
0.021
479.010 b
0.012
GABA
29.373 a
0.010
32.894
0.004
31.798 a
0.009
Cys
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Tyr
14.070 a
0.011
14.446
0.001
12.945 a
0.001
Val
23.190 a
0.005
19.809
0.003
18.819 b
0.007
Met
1.834 a
0.001
0.348
0.000
0.191 b
0.000
Orn
10.813 a
0.003
13.057
0.001
12.107 a
0.001
Lys
26.074 a
0.003
34.846
0.007
30.860 b
0.001
Ileu
7.457 a
0.025
9.473
0.003
8.107 a
0.001
Leu
17.694 a
0.032
18.176
0.001
16.258 a
0.001
Phe
17.632 a
0.050
17.433
0.009
15.977 a
0.006
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
NH4
+
30.982
a, b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
79
Anexo
Tabla 10. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DK del sustrato T
Muestras de Vinagre
Compuestos
TDKm
TDKf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
34.046 a
0.002
27.056
0.001
17.381 b
0.002
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
15.141 a
0.003
15.209
0.004
27.169 b
0.008
Glu
48.415 a
0.003
65.308
0.001
50.691 a
0.010
His
0.347 a
0.001
1.760
0.001
3.330 b
0.001
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
30.413 a
0.018
26.557
0.008
18.860 b
0.007
Arg
81.165 a
0.002
85.273
0.001
60.694 b
0.008
b
0.081
a
0.009
18.948
0.078
15.076
Thr
15.013 a
0.006
16.410
0.004
11.479 b
0.004
Ala
55.681 a
0.027
53.389
0.002
29.853 b
0.003
Pro
752.184 a
0.015
598.532
0.008
338.283 b
0.010
GABA
26.218 a
0.003
33.611
0.002
24.119 b
0.005
Cys
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Tyr
12.042 a
0.006
12.394
0.000
1.762 b
0.000
Val
22.473 a
0.009
19.967
0.008
2.228 b
0.001
Met
1.641 a
0.001
0.297
0.000
0.889 b
0.000
Orn
15.462 a
0.002
12.411
0.003
n.d. b
-
Lys
24.722 a
0.004
31.618
0.001
n.d. b
-
Ileu
15.283 a
0.005
7.941
0.003
3.407 b
0.002
Leu
16.446 a
0.004
16.086
0.000
1.974 b
0.000
Phe
15.491 a
0.003
16.128
0.002
8.018 b
0.006
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
NH4
a,
TDKi
+
40.053
b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
80
Anexo
Tabla 11. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DL del sustrato T
Muestras de Vinagre
Compuestos
TDLi
TDLm
TDLf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
32.034 a
0.005
26.178
0.000
23.099 b
0.004
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
20.367 a
0.007
16.137
0.001
19.125 a
0.004
Glu
54.366 a
0.007
66.096
0.002
50.498 a
0.004
His
1.062 a
0.002
n.d.
-
0.773 a
0.002
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
31.229 a
0.004
25.666
0.013
19.559 b
0.012
Arg
82.325 a
0.007
84.161
0.000
60.229 b
0.004
a
0.016
12.537
0.021
5.400
Thr
14.941 a
0.003
16.033
0.003
12.777 b
0.001
Ala
59.555 a
0.010
53.548
0.008
29.828 b
0.003
Pro
756.355a
0.023
603.600
0.016
357.264 b
0.020
GABA
26.839 a
0.005
34.518
0.003
25.457 a
0.001
Cys
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Tyr
11.472 a
0.000
12.451
0.007
1.799 b
0.000
Val
22.444 a
0.014
19.325
0.005
2.519 b
0.000
Met
1.522 a
0.000
0.308
0.000
0.681 b
0.000
Orn
17.227 a
0.003
10.043
0.000
n.d. b
-
Lys
25.292 a
0.005
29.249
0.007
n.d. b
-
Ileu
6.893 a
0.005
7.690
0.002
3.584 b
0.001
Leu
16.111 a
0.002
15.866
0.003
2.203 b
0.001
Phe
14.710 a
0.010
15.712
0.001
7.518 b
0.007
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
NH4
+
29.494
b
0.026
a, b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
81
Anexo
Tabla 12. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DM del sustrato T
Muestras de Vinagre
Compuestos
a,
TDMi
TDMm
TDMf
mg/L
DE
mg/L
DE
mg/L
DE
Asp
26.645 a
0.000
23.700
0.001
31.105 a
0.006
Asn
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Ser
13.365 a
0.001
10.999
0.001
25.451 b
0.004
Glu
38.728
a
b
0.001
His
0.001
59.270
0.005
70.921
n.d.
-
n.d.
-
3.035 b
0.003
Gln
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Gly
20.938 a
0.009
23.186
0.001
29.430 b
0.022
Arg
59.825 a
0.002
77.415
0.003
83.153 b
0.007
NH4+
75.913 a
0.037
38.912
0.060
33.363 b
0.055
Thr
13.244 a
0.003
14.414
0.000
17.827 b
0.004
Ala
41.816 a
0.001
48.959
0.003
54.240 b
0.004
Pro
552.473 a
0.006
550.465
0.005
489.257 b
0.000
GABA
22.115 a
0.005
31.632
0.001
34.389 b
0.002
Cys
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
Tyr
8.002 a
0.000
11.289
0.001
12.912 b
0.004
Val
9.623 a
0.001
16.983
0.001
29.740 b
0.000
Met
14.522 a
0.003
0.950
0.000
0.145 b
0.000
Orn
6.925 a
0.000
10.224
0.000
17.252 b
0.007
Lys
13.837 a
0.004
26.563
0.001
31.713 b
0.002
Ileu
3.461 a
0.003
6.968
0.000
8.619 b
0.003
Leu
11.803 a
0.002
14.438
0.000
16.377 b
0.013
Phe
11.113 a
0.001
14.635
0.001
16.063 b
0.020
Trp
n.d.
-
n.d.
-
n.d.
-
b
Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado.
82