Desarrollo de un método de HPLC para la determinación de aminoácidos en vinagre y su validación en muestras reales Trabajo de investigación presentado por Raquel Callejón Para optar al Diploma de Estudios Avanzados del Programa de Doctorado en Enología ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1.1. EL VINAGRE 1.1.1. Tipos de vinagre 1.1.2. Historia 1.1.3. Las bacterias acéticas 1.1.4. Métodos de elaboración de vinagre 1.1.4.1. Métodos tradicionales de acetificación con cultivo superficial 1.1.4.2. Métodos de acetificación con cultivo sumergido DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN PRODUCTOS DERIVADOS DE LA UVA 1.2.1. Aplicaciones del análisis de aminoácidos en enología 1.2.2. Métodos de análisis de aminoácidos 1.2.3. Derivatización de aminoácidos 1.2.4. Elección del método óptimo 1 1 1 2 2 6 6 11 1.2. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 13 13 16 19 30 31 2.1. MATERIAL 2.1.1. Muestras 2.1.2. Reactivos 2.1.3. Instrumentación Cromatógrafo líquido de alta eficacia 2.1.3.1. 2.1.3.2. Instrumentación y material 31 31 32 34 34 34 2.2. MÉTODOS 2.2.1. Preparación de las fases móviles 2.2.2. Condiciones cromatográficas 2.2.3. Preparación de patrones 2.2.4. Preparación de muestras 2.2.5. Reacción de derivatización 2.2.6. Identificación 2.2.7. Cuantificación 2.2.8. Límites de detección y cuantificación 2.2.9. Estudios de precisión 2.2.10. Estudios de recuperación 2.2.11. Estudios de dilución de las muestras 35 35 35 36 38 38 39 40 41 42 43 44 2.3. 44 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS 45 45 3.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO 3.2.1. Especificidad o selectividad 3.2.2. Linealidad 3.2.3. Exactitud 3.2.4. Límites de detección y cuantificación 3.2.5. Estudios de precisión 3.3. ELECCIÓN DE LA DILUCIÓN ÓPTIMA DE LAS MUESTRAS 46 46 47 48 51 51 53 3.4. APLICACIÓN DEL MÉTODO A MUESTRAS DE VINAGRE 54 3.4.1. Consumo de nitrógeno total 55 3.4.2. Evolución en el perfil de aminoácidos libres y amonio 57 4. CONCLUSIONES 5. BIBLIOGRAFÍA 6. ANEXO 62 64 71 Introducción 1. INTRODUCCIÓN 1.1. EL VINAGRE Según la Reglamentación Técnico Sanitaria correspondiente (Presidencia del Gobierno, 1993) con la denominación genérica de vinagre se designa: “el líquido apto para el consumo humano resultante de la doble fermentación, alcohólica y acética de productos de origen agrario que contengan azúcares o sustancias amiláceas, con una riqueza mínima de 50 g/L”. Se entiende por grado de acidez de los vinagres su acidez total expresada en gramos de ácido acético por 100 mL, a 20ºC. El contenido permitido por la norma para los vinagres, expresado en ácido acético, no será inferior a 50 g/L; excepto para el vinagre de vino, que será, al menos, de 60 g/L. 1.1.1. Tipos de vinagre Cualquier sustrato azucarado o amiláceo puede ser utilizado en la elaboración de vinagres. Asimismo los métodos de elaboración serán diferentes. Por tanto, los vinagres se pueden clasificar en función del tipo de sustrato empleado o del método usado en su elaboración. Según la materia prima originaria se establecen los siguientes tipos (Presidencia del Gobierno, 1993): - - - Vinagre de vino: Es el producto obtenido exclusivamente por fermentación acética de vino. Vinagre de frutas: Es el producto obtenido a partir de frutas o bayas. Vinagre de alcohol: Es el producto obtenido por la fermentación acética de alcohol destilado de origen agrario. Vinagre de cereales: Es el producto obtenido sin destilación intermedia por el procedimiento de doble fermentación alcohólica y acética, de cualquier cereal en grano, cuyo almidón se ha desdoblado en azúcares mediante un procedimiento distinto de la diastasa de la cebada malteada. Vinagre de malta: Es el producto obtenido sin destilación intermedia por el procedimiento de doble fermentación alcohólica y acética a partir de la cebada malteada, con o sin adición de grano, cuyo almidón se ha desdoblado en azúcares mediante la diastasa de la cebada malteada. Vinagre de miel: Es el producto obtenido a partir de la miel. Vinagre de suero de leche: Es el producto obtenido a partir de suero de leche. 1 Introducción 1.1.2. Historia El vinagre ha formado parte de la alimentación humana desde la antigüedad más remota como condimento y conservador de alimentos, así como base de remedios sencillos para hombres y animales. La fermentación alcohólica seguida de la acética se produce espontáneamente sobre cualquier sustrato azucarado expuesto al polvo y a los insectos que transportan levaduras y bacterias. Duddington (1961) afirma que la elaboración de vino es un arte que data al menos de hace unos 10.000 años, por lo que podemos suponer la existencia del vinagre desde este tiempo. Las referencias más antiguas al uso del vinagre se hallan en la cultura babilónica (5000 a.C.) sobre la obtención de vinagre de dátiles. En 1732, el holandés Boerhaave hace notar que la llamada “madre del vinagre” es un organismo vivo, aunque sin precisar su papel en la acetificación. Lavoisier demuestra que la acetificación consiste en la oxidación de etanol, pero sin sospechar la existencia de bacterias acéticas. Persono, (1822) describe las películas grasas que se forman en la superficie del vino, la cerveza o el vinagre como sustancias de naturaleza vegetal, y en la “Micología europea” añade nuevas especies de Micoderma: ollare, mesentericum, lagenoe y pergameneum. También Chaptal había observado que la producción de vinagre va bien cuando en la superficie del vino aparecen las llamadas “flores de vino”, cuya aparición anuncia y precede a la acetificación, pero sobre esto Berzelius advertía que en todas las materias orgánicas en descomposición, expuestas al aire aparece el mismo tipo de vegetación. La acetificación también llega a formar parte de la controversia entre químicos como Berzelius y Liebig quienes mantienen que el proceso era puramente químico (Berzelius 1829-1833) y aquellos que afirmaban que en dicha transformación intervenía un “ser organizado”. En cuanto a la ”madre del vinagre”, Kützing observó que la débil película que recubre la superficie del líquido acidificado está formada por glóbulos seis veces más pequeños que los de las levaduras; se trataba de bacterias acéticas que fueron observadas al microscopio por primera vez por Kützing (1837) por lo que, en las primeras clasificaciones taxonómicas de estos microorganismos, se denominó Acetobacter kützingianum a una especie de ellos (Llaguno, 1991). Pasteur publicó en el año 1864 una amplia memoria sobre la fermentación acética “Études sur le vinaigre, sa fabrication, ses maladies, mohines de les prévenir” que recoge la conferencia que pronunció en Orleáns en 1867. Pasteur afirma que siempre que el vino se transforma en vinagre, es debido a la acción de un velo de Micoderma aceti desarrollado en su superficie. 1.1.3. Las bacterias acéticas Las bacterias acéticas fueron observadas por primera vez al microscopio por Kützing en 1837. Estas bacterias constituyen un grupo ecológico que comprende bacterias gram-negativas (gram-positivas en cultivos viejos), aerobias estrictas y muy sensibles al SO2. Son catalasa positiva y oxidasa negativa, pueden presentar pigmentación en cultivos sólidos y producir diferentes tipos de polisacáridos (De Ley et al., 1984). 2 Introducción Al microscopio óptico las bacterias acéticas se presentan como pequeñas células cilíndricas, frecuentemente en parejas cocobacilares, cortas y algo gruesas, alineadas o en cadenas, y a menudo agrupadas en forma de ocho. Constituyen un grupo de morfología variable, que se presentan en forma elipsoidal o de bastoncillos (Suárez e Iñigo, 1990). Las bacterias acéticas crecen en medios azucarados y alcoholizados, ligeramente ácidos como flores, frutas, cerveza, vino, sidra, vinagre, zumos de fruta agrios y miel. En estos sustratos, las bacterias acéticas oxidan los azúcares y los alcoholes, produciendo una acumulación de ácidos orgánicos como producto final. Cuando el sustrato es etanol, producen ácido acético, lo que ha originado el nombre que reciben estas bacterias. La oxidación del etanol tiene lugar en dos pasos. En el primero, el etanol es oxidado a acetaldehído y en el segundo el acetaldehído es oxidado a acetato. En ambas reacciones, los electrones son transferidos y el último aceptor es el oxígeno (Figura 1.1). Esta oxidación de etanol a ácido acético es la característica mejor conocida de la bacteria acética, pero estas bacterias también pueden oxidar glucosa a ácido glucónico, etc. Algunas de estas transformaciones resultan interesantes desde el punto de vista de la biotecnología. La aplicación industrial mejor conocida de las bacterias acéticas es la producción de vinagre pero también se usan para producir sorbosa, sorbitol y celulosa. Etanol 2H NAD+ Cit Cit O2 Acetaldehído 2H Acetato CAT: ciclo de los ácidos tricarboxílicos CR: cadena respiratoria CAT 1/2 O2 CR CO2 H2 O Figura 1.1. Proceso de oxidación del etanol. Las primeras clasificaciones de bacterias acéticas se hicieron atendiendo exclusivamente a criterios morfológicos. Visser`t Hooft (1925) toma en consideración también su fisiología, y más tarde Asai (1968) clasifica las bacterias acéticas según su capacidad para metabolizar la glucosa y el ácido acético. Frateur (1950) propone un sistema de clasificación del género Acetobacter en cuatro grupos, basado en los caracteres bioquímicos siguientes: producción de catalasa, oxidación de acetato y lactato a carbonato, formación de compuestos cetónicos, producción de ácido glucónico y capacidad para crecer en un medio con alcohol y sales de amonio como única fuente de nitrógeno (medio de Hoyer). Propuso los siguientes grupos: Acetobacter peroxydans, Acetobacter mesoxydans, Acetobacter oxydans y Acetobacter suboxydans. El nombre de 3 Introducción cada grupo alude fundamentalmente a su capacidad para oxidar el etanol a ácido acético. Durante largo tiempo se aceptó que las bacterias acéticas móviles, pertenecientes al género Acetobacter, tenían flagelos polares monotricos, y dicho género estaba incluido por lo tanto en la familia Pseudomonodaceae. Sin embargo, Leifson (1954) descubrió que 30 cepas de Acetobacter no mostraban este tipo de flagelos, poniendo de manifiesto otro tipo de disposición de flagelos: flagelación perítrica. Propuso entonces separar Acetobacter en dos géneros: Acetobacter y Acetomonas género nov., incluyendo en este último las especies con flagelos polares multitricos y las no flageladas, todas incapaces de oxidar el acetato y el lactato a CO2 y H2O. Según la clasificación recogida en el manual de Bergey, en su 8ª edición (1974), las bacterias acéticas pertenecen al orden Pseudomonodales, familia Pseudomonodaceae, incluyendo en esta última dos géneros distintos al género Pseudomonas (sobre todo por su capacidad de crecimiento a pH inferior a 4.5): el género Gluconobacter y el género Acetobacter, que incluye a su vez tres especies importantes: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus y Acetobacter peroxydans. El género Acetobacter puede variar en su forma de elipsoide a barra derecha, o ligeramente curva, 0.6-0.8 µm x 1.0-1.4 µm. Se encuentran no agrupadas, en pares o formando cadenas. Las células pueden ser móviles o no. Si son móviles, los flagelos son peritricos o laterales, oxida acetato y lactato a CO2 y H2O. El pH óptimo para el crecimiento es de 5.4-6.3 (De Ley et al., 1984). Sin embargo, estas bacterias pueden crecer a pH bajos, entre 3-4. El género Gluconobacter es capaz de producir grandes cantidades de ácido glucónico a partir de glucosa, tiene incapacidad de formar películas en medios líquidos y pobre crecimiento en sustratos que contienen etanol. Además, es incapaz de oxidar el acetato. En una serie de trabajos publicados por diversos autores, principalmente Shinwell y Carr (1960), se pone de manifiesto la clara tendencia de las especies de Acetobacter a dar cepas mutantes, originándose especies distintas a las ya existentes. Carr (1968) publicó un trabajo en el que pone de manifiesto las observaciones hechas por Shimwell, y afirma que en general, las bacterias acéticas no son genéticamente estables, aunque unas especies sean más estables que otras. La taxonomía tradicional de los microorganismos, basada fundamentalmente en criterios morfológicos y fisiológicos, se ha visto sometida a continuas reordenaciones y cambios. Esto se ha debido fundamentalmente a la aplicación de técnicas moleculares muy potentes al estudio taxonómico como son la hibridación ADN-ADN, la secuenciación de diferentes regiones del genoma bacteriano, etc. La familia Acetobacteriaceae no ha sido una excepción a este proceso de reordenación de géneros y especies. En el año 1997, a los dos géneros mencionados, Acetobacter y Gluconobacter, hay que sumarle la definición de dos nuevos géneros de bacterias acéticas: Gluconoacetobacter y Acidomonas (Yamada et al.,1997); y en los dos últimos años se han definido otros dos nuevos géneros más: Asaia (Yamaguchi y Ninomiya, 2000) y Kozakia (Lisdiyanti et al., 2002). Por tanto, en estos momentos, la familia Acetobacteriaceae está formada por 6 géneros y 34 especies de bacterias acéticas (Tabla 1.1). Acetobacter y 4 Introducción Gluconoacetobacter, con 14 y 11 especies respectivamente, son los géneros donde existe una mayor diversidad de especies (Guillamón et al., 2003). El conocer qué cepas y bacterias acéticas están implicadas en la transformación de etanol en ácido acético es de gran importancia por su repercusión y aplicación a la producción industrial. En general, la producción de vinagres sólo se ha asociado con las especies: A. aceti, A. pasteurianus, Ga. europaeus Gax. No obstante, es probable que la especie G. oxydans se encuentre asociada a la producción de “condimentos alimentarios” que parten directamente de mosto para la producción de acético, como sería el “Aceto Balsamico Tradizionale” (Guillamón et al., 2003). Tabla 1.1. Géneros y especies de bacterias acéticas descritos según Yamada, 2003. Acetobacter Gluconoacetobacter Gluconobacter A. aceti A. pasteurianus A. Pomorum A. peroxydans A. indonesiensis A. tropicalis A. syzygii A. cibinongensis A. orientalis A. orleanensis A. lovaniensis A. estunensis A. malorum A.cerevisiae Ga. Liquefaciens Ga. diazotrophicus Ga. xylinus Ga. hansenii Ga. obodiens Ga. intermedius Ga. sacchari Ga. entanii Ga. johannae Ga. azotocaptans Ga. europaeus G. oxydans G. frateurii G. assaii Acidomonas Asaia Kozakia Ac. methanolica A. bogorensis A. siamensis A. indonesiensis A. krungthepensis K. baliensis La microbiología del proceso no se comprende todavía en su totalidad (Giudici, 2003). En el caso de las bacterias acéticas, se están desarrollando nuevas líneas de investigación centradas en la búsqueda de técnicas de identificación rápida que además pueden aplicarse a una correcta clasificación de las mismas. Mediante la aplicación de las distintas técnicas de biología molecular se pretende alcanzar el objetivo de identificar las bacterias viables responsables del proceso sin necesidad de que sean previamente cultivadas. Como técnicas específicas para la cuantificación e identificación de la bacteria en el proceso de acetificación se aplican en la actualidad las siguientes: 5 Introducción • PCR cuantitativa: Esta técnica ya ha sido aplicada para la cuantificación del número total de bacterias (mediante el uso de cebadores universales) en una muestra biológica (Franke et al., 2000). En el caso de bacterias acéticas se podrían utilizar cebadores universales de bacterias acéticas diseñados ya para los métodos de identificación (Ruiz et al., 2000), así como cebadores particulares de especie, lo que permitiría una segunda cuantificación a nivel de especie. • Sistemas basados en el uso de marcadores fluorescentes, como epifluorescencia y FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation). La primera de ellas ha sido utilizada para la cuantificación de bacterias acéticas totales (Mesa et al., 2003). La técnica de FISH podría permitir la identificación de bacterias acéticas a nivel de especie lo que sería de gran utilidad y posiblemente complementaria de la PCR cuantitativa (Franke et al., 1999). 1.1.4. Métodos de elaboración de vinagre En el mercado existen dos tipos de vinagres. El primero se obtiene como producto de la fermentación o acetificación con cultivo superficial, las bacterias acéticas se encuentran en contacto directo con oxígeno gaseoso, situadas bien en la interfase líquido/gas o bien fijadas a soportes de materiales tales como virutas, elaborándose así la mayoría de los vinagres tradicionales. El segundo tipo se elabora por la acetificación o fermentación con cultivo sumergido, donde las bacterias acéticas están sumergidas libremente en el seno del líquido a fermentar, en el que constantemente se introduce aire, (solo o enriquecido con oxígeno), en condiciones que permitan la máxima transferencia posible desde la fase gaseosa a la fase líquida. Así se obtienen de forma rápida los vinagres comerciales actuales de menor precio. El vinagre de vino, se produce en los países mediterráneos de forma mayoritaria en biorreactores y con cultivo sumergido, que puede después envejecerse o no en madera. Los métodos tradicionales, lentos, con cultivo superficial se llevan a cabo en toneles de madera de diferente capacidad y suponen un menor volumen de producción (Garcia-Parrilla et al., 1998). 1.1.4.1. Métodos tradicionales de acetificación con cultivo superficial a) Método de Orleáns Es uno de los métodos más antiguos para fabricar vinagres. Emplea toneles de aproximadamente 250-300 litros de capacidad, que se colocan tumbados en filas horizontales y superpuestas, provistos de 2 agujeros de aproximadamente 5 cm en cada extremo de los fondos de cada barril a 2/3 de la altura del fondo, que se rellenan con 6 Introducción estopa para evitar la entrada de las moscas del vinagre, pero que dejan pasar aire (Figura 1.2). Figura 1.2. Pilas de botas para la acetificación en una fábrica de vinagre por el método de Orleáns. Además, en el lateral superior se hace otro orificio que se tapa con un tapón de corcho por donde penetra un tubo de vidrio, recto, que llega casi hasta el fondo del líquido permitiendo renovar el sustrato sin alterar el velo bacteriano situado en la superficie (Figura 1.3). Se trata de un procedimiento estático donde el líquido a acetificar es una mezcla de vino de bajo grado alcohólico con un 20% de vinagre turbio. Los rendimientos de la transformación de etanol en acético son bajos y el proceso dura de 8 a 10 días una vez comenzada la acetificación, la velocidad depende de la temperatura, ya que la temperatura de 30 ºC es la óptima para el crecimiento de la bacteria acética. 7 Introducción Embudo cubierto de gasa Orificio tapado con algodón Entrada de aire cubierta con gasa Orificio de observación Indicador de nivel Grifo Figura 1.3. Acetificación por el método de Orleáns (Adams, 1980). b) Método Luxemburgués El fundamento de este método y su diferencia fundamental con el método de Orleáns estriba en emplear virutas de haya que periódicamente quedan sumergidas en el líquido que está acetificándose. Así se consigue aumentar la superficie de acetificación de la bacteria y mejorar la transferencia de oxígeno, por lo que aumenta la velocidad de acetificación. La cuba giratoria más elemental (Figura 1.4) se prepara con un orificio grande en el centro de uno de los fondos, para procurar la entrada de aire. En uno de los costados de esta cuba, en la parte más alejada de la abertura, se practica un orificio estrecho, que puede obturarse con un tapón; es una canilla de madera o vidrio para vaciado del envase. El tonel está dividido en dos partes desiguales por un falso fondo, agujereado, con numerosos y finos orificios. La parte menor del tonel está llena de virutas de haya. En este compartimento penetra un largo termómetro para controlar la temperatura, aspecto muy interesante para todo método rápido o semirrápido. Se obtienen cantidades de vinagre, que pueden llegar como máximo, cada cuarenta y ocho horas, a la cuarta parte del contenido de un tonel. El vinagre elaborado, que se extrae de las cubas, se sustituye por porciones iguales de vino, continuando la elaboración indefinidamente (Xandri-Tagüeña, 1977). 8 Introducción Figura 1.4. Cuba rotatoria del método Luxemburgués. c) Método de Schüzenbach o Método Alemán Se emplean toneles o generadores verticales de encina con doble fondo (Figura 1.5). Sobre el primero, agujereado, se colocan una serie de capas de virutas de madera de haya, impregnadas de vinagre de buena calidad. Sobre el borde superior lleva un diafragma perforado, con los orificios obturados con algodón. Al pasar el vino por el diafragma, burbujea aire que existe entre las virutas. El vinagre se extrae por la parte inferior. Se pueden emplear barriles de roble giratorios, parcialmente llenos de virutas, consiguiéndose así una mejor aireación. Las ventajas que se destacan de este proceso son la regulación de oxígeno y su uso para la producción continua de vinagre. El vinagre obtenido con el método de cultivo superficial tiene el aroma y el gusto propio de la lentitud de la acetificación que se ve favorecido por el simultáneo envejecimiento (Llaguno y Polo, 1991a). 9 Introducción X Y X Y Figura 1.5. Esquema de un generador vertical, para la producción de vinagres vínicos. Los principales inconvenientes de los métodos de acetificación en cultivo superficial que emplean las virutas como soporte son: - - Acumulación de bacterias muertas sobre las virutas (debido a falta de aireación o aumentos de temperaturas). Desarrollo de bacterias productoras de celulosa. La infección por anguílulas (pequeños nematodos) que son imposibles de combatir una vez que se desarrollan. Aumentos de temperatura difícilmente controlables, pérdidas de alcohol por evaporación en la corriente ascendente de aire caliente, con bajada del rendimiento. Necesidad de gran espacio (generadores de relleno). 10 Introducción Entre los vinagres artesanales producidos por fermentación con cultivo superficial con denominación de origen y reconocimiento internacional destacan el “Aceto Balsámico Tradicionale“ de la ciudad italiana de Módena y el no menos prestigioso “Vinagre de Jerez”. 1.1.4.2. Métodos de acetificación con cultivo sumergido Se entiende por fermentación sumergida aquella en la que no se utiliza material poroso o soporte, sino que se hacen circular pequeñas burbujas de aire a través de la biomasa, con lo que se favorece el proceso fermentativo. Emplea toneles de madera o tanques acero inoxidable quedando siempre una parte del vinagre de la operación anterior como inóculo para iniciar el ciclo siguiente. Se llena con el vino, y se introduce posteriormente una fuerte corriente de aire. La acetificación es muy rápida. Este proceso se utiliza ampliamente en la actualidad. Los rendimientos de la transformación del alcohol en ácido acético (hasta el 94%) resultan ser muy elevados. La velocidad a la que se desarrolla el proceso es mayor (25-30 horas), así como la uniformidad del producto y, sobre todo, se puede lograr la acetificación de iguales volúmenes de alcohol en mucho menor volumen de instalación, con el consiguiente ahorro de espacio. Se puede trabajar con dispositivos automáticos que no sólo regulen el control de la aireación, sino también los ciclos de carga y descarga (Llaguno y Polo, 1991a). Modelos Frings En 1878, Heinrich Frings fundó en Aquisgrán una sociedad productora de vinagre, que más tarde, en 1950, incorpora las patentes de invención resultantes de la investigación del proceso de fermentación sumergida, alcanzando un alto grado de desarrollo. Nació así el Acetator Frings, base de la biotecnología vinagrera actual. A partir de las investigaciones de Hromatka y Ebner (1949), en los años 40 fue construido el “Acetator Frings” (Figura 1.6) que se mantiene funcionando, con algunas modificaciones, en gran parte de las industrias vinagreras actuales y en el que se elabora la mayor parte de la producción. 11 Introducción Figura 1.6. Acetator Frings en acero inoxidable A, bomba de carga; B, aireador y motor; C, dispositivo para determinación de alcohol residual; D, válvula entrada agua refrigeración; E, termostato reguladora ; F, rotámetro; G, serpentín de refrigeración; H, entrada de aire; I, salida de gases; J, dispositivo antiespuma. El fundamento es la presencia de cultivo sumergido en el seno del líquido a acetificar, que se satura constantemente de pequeñas burbujas de aire. Una mayor población bacteriana así como la disponibilidad de oxígeno para los microorganismos permiten obtener un mayor rendimiento de la transformación de etanol en ácido acético (del 94%) y una mayor velocidad del proceso (25-30 horas). Este procedimiento requiere la estricta vigilancia de tres parámetros: la temperatura, la presión parcial de oxígeno y los ciclos de carga y descarga. La bacteria acética es viable entre 28-33ºC, pero la velocidad de fermentación varía en función de la temperatura. La temperatura de la fermentación debe estar comprendida dentro del intervalo entre 30-31ºC (Ormaechea, 1991) que es la temperatura óptima para obtener un mayor rendimiento. Es obvio que la oxidación de etanol a ácido acético es una reacción exotérmica que puede producir alrededor de 8.4 MJ por cada litro de etanol que se oxida (Adams, 1985) elevando la temperatura del depósito. Por otra parte, cuando la temperatura es elevada aumentan las pérdidas de alcohol y productos volátiles y, en menor cuantía, de ácido acético, pero quizás lo más importante, es que puede ocurrir la parada del proceso por la muerte de bacterias. Un elevado suministro de aire puede causar el fenómeno de sobreoxidación y arrastre de los componentes volátiles y, por otro lado, su carencia puede paralizar la acetificación dado el carácter aerobio de las bacterias acéticas. Además de la cantidad de aire, se ha de tener en cuenta su calidad y pureza, ya que las bacterias acéticas son sensibles a los contaminantes de este. Todos los parámetros están interrelacionados en la acetificación; el etanol no debe llegar a agotarse totalmente ya que las bacterias acéticas mueren rápidamente y se pierde el cultivo. Por ello en este tipo de sistema de producción de vinagre se suele 12 Introducción llevar a cabo la acetificación de forma discontinua realizándose ciclos de descargacarga. Así se impide que las bacterias acéticas metabolicen el ácido acético formado convirtiéndolo en CO2 y agua. Se descarga aproximadamente el 40-45% del volumen de líquido, que se repone con nueva materia prima suministrándole sustrato a la bacteria. Por eso, se puede trabajar de forma automatizada con dispositivos que regulen el control de la temperatura y de la aireación, así como los ciclos de carga y descarga. El acetificador está constituido por un depósito de acero inoxidable de capacidad entre 100 y 300 HL. Los conductos están rodeados por un intercambiador de calor de agua para disipar el calor producido en el proceso y mantener la temperatura a 30ºC. Para evitar las pérdidas de compuestos volátiles se ha desarrollado un sistema cerrado (Cantero et al., 1996), mejorando sensiblemente los resultados del proceso fermentativo. El fermentador consta de un sistema de recirculación de aire y un sistema de control automatizado que inyecta oxígeno en dicha corriente a medida que éste es consumido por la biomasa. Se alcanzan así rendimientos cercanos al 100% (Gómez et al., 1993). Los aminoácidos libres presentes en el medio son las principales fuentes de nitrógeno para las bacterias acéticas. Ya que el sustrato para la fermentación acética proviene de una fermentación previa realizada por levaduras (Ciani et al., 1998) resulta importante asegurar que dicho sustrato posea suficiente nitrógeno disponible para las bacterias. 1.2. DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN PRODUCTOS DERIVADOS DE LA UVA 1.2.1. Aplicaciones del análisis de aminoácidos en enología El análisis de aminoácidos encuentra aplicación en muchos campos de investigación siendo uno de los más importantes la estimación del valor nutritivo de alimentos para humanos y para animales. La elevada demanda de información relacionada con el valor nutritivo ha dado lugar al desarrollo de métodos precisos para aminoácidos. Además, es creciente el número de aplicaciones como la detección de posibles adulteraciones en alimentos y bebidas o la determinación de aminoácidos, péptidos o derivados potencialmente tóxicos producidos por las nuevas técnicas de procesado de alimentos (White yHart, 1992b). Ya en 1958, Stein y Moore aplican la cromatografía de líquidos para determinar aminoácidos utilizando una columna de intercambio iónico y reacción postcolumna con ninhidrina. La importancia del análisis de aminoácidos no ha dejado de crecer desde entonces, tanto desde el punto de vista clínico como farmacéutico y alimentario. Es conocida la importancia de los aminoácidos del mosto como nutrientes para el desarrollo de las levaduras que realizan la fermentación alcohólica, así como el papel que se les atribuye como precursores de los compuestos del aroma. Por otra parte, la composición en aminoácidos del mosto está muy relacionada con la madurez de las uvas y con la fertilización del terreno, por lo que son muchos los laboratorios interesados en el análisis de estos compuestos (Cáceres et al., 1986). Los aminoácidos libres representan la parte más importante del nitrógeno total en los mostos y vinos, 13 Introducción aproximadamente entre el 30 y 40 % (Hérberger et al., 2003). Estos aminoácidos tienen varios orígenes. Algunos proceden de la uva y pueden ser metabolizados parcial o totalmente por levaduras al final de la fermentación o liberados de las levaduras muertas y otros son producidos por la degradación enzimática de las proteínas de la uva. El contenido de aminoácidos de las uvas depende de varios factores como fertilización, condiciones climáticas y duración de la maceración de la piel en el mosto (Soufleros et al., 2003). Por tanto, la composición de aminoácidos es de gran importancia en la producción de vino (Kosir y Kidric, 2001 ). Muchos aminoácidos experimentan una serie de biotransformaciones, dando lugar a alcoholes de alto peso molecular, aldehídos, ésteres y ácidos cetónicos, los cuales tienen un gran impacto en las propiedades organolépticas del vino. Por este motivo a los aminoácidos se les atribuye el papel de precursores del aroma (Soufleros et al., 2003). A pesar de los diversos factores que afectan a los aminoácidos presentes en el vino, muchos investigadores los han empleado para la diferenciación del producto (Csomos y Simon-Sarkadi, 2001). Con dicho fin, así como para establecer la autenticidad del vino, se han aplicado diferentes procedimientos quimiométricos: análisis de cluster, análisis de componentes principales y análisis discriminante. Hérberger et al. (2003) encontraron que la aplicación de técnicas quimiométricas al contenido de aminoácidos y aminas biógenas resultó ser una buena herramienta para clasificar vinos húngaros en función de la tecnología de elaboración empleada, sin embargo, la diferenciación de las mismas según su origen geográfico, variedad y cosecha no fue del todo satisfactoria. Asimismo, Soufleros et al. (2003) estudiaron el perfil de aminoácidos de vinos blancos griegos procedentes de siete variedades de uva, seis regiones geográficas, y tres vendimias y aplicando el análisis discriminante los clasificaron en función de dichas variables (variedad, origen geográfico y vendimia). Brescia et al. (2002) diferenciaron vinos procedentes de pequeñas áreas de producción de la misma región aplicando estadística multivariante a las determinaciones de aminoácidos por resonancia magnética nuclear (RMN). Con esto se consiguió un método útil para la protección de la denominación de origen controlada (DOC) contra la adulteración. Por otro lado, ya que las levaduras juegan un importante papel en el contenido de aminoácidos en el vino, otra de las aplicaciones ha sido el estudio de la influencia de diferentes cepas de levadura sobre los cambios que sufren los aminoácidos, péptidos y proteínas durante el envejecimiento del cava (Martínez-Rodríguez et al., 2002). En este estudio se utilizó el mismo vino base y cinco cepas de levaduras. Con los datos obtenidos se dedujo que los cambios que se producen en el proceso de envejecimiento del cava ocurren en al menos cuatro fases claramente diferenciadas y además se observó que el empleo de una cepa de levadura u otra influye en el contenido de aminoácidos libres y péptidos. Pérez-Coello et al. (1999) analizaron 15 vinos elaborados en La Mancha con varias cepas de Saccharomyces cerevisiae, utilizando la composición volátil y el perfil 14 Introducción de aminoácidos con el objeto de determinar la cepa más adecuada para inocular los mostos de esta región. En otros trabajos se adicionó amonio y aminoácidos a los mostos para estudiar su efecto en la composición aromática y en las propiedades sensoriales de los vinos obtenidos (Hernández-Orte et al., 2002; 2005; 2006). A pesar de que el factor determinante de la composición volátil de los vinos es la cepa de levadura, la adición de nitrógeno a los mostos también influye, reduciendo el contenido de β-feniletanol, metionol e isoamilalcohol y aumentando el ácido propiónico. Además, se observó que los vinos que habían sido enriquecidos con amonio eran más ricos en lactato de etilo y cis-3-hexenol mientras que los vinos enriquecidos con aminoácidos eran más ricos en γbutirolactona e isobutanol. Desde el punto de vista sensorial, la adición de amonio dio lugar a un descenso en notas sulfhídricas y a un incremento en olor cítrico. Por otro lado, se observó que las fermentaciones son mucho más rápidas en los mostos enriquecidos (Hernández-Orte et al., 2005). En el campo de los vinagres el análisis de aminoácidos se ha dirigido a la caracterización de vinagres de vino (Kutlán y Molnár-Perl, 2003) y a las transformaciones químicas y bioquímicas que se producen en los vinagres de Jerez durante las diferentes fases de envejecimiento (Palacios et al., 2002). La formación de vinagre implica esencialmente la conversión del etanol en ácido acético. Los microorganismos responsables de dicha transformación son bacterias acéticas pertenecientes a los géneros Acetobacter y Gluconobacter y los aminoácidos presentes en el medio constituyen la principal fuente de nitrógeno para estas bacterias. Debido a que el sustrato inicial procede de una fermentación previa realizada por levaduras, es esencial asegurarse de que haya una cantidad adecuada de nitrógeno para que se lleve a cabo la fermentación acética (Valero et al., 2005). Además, se han desarrollado métodos para la determinación conjunta de aminoácidos y otras sustancias de interés como las aminas biógenas y poliaminas en vinos y en vinagres (Bauza et al., 1995; Herbert et al., 2000; Kutlán y Molnár-Perl., 2003; Lozanov et al., 2004). Las aminas biógenas son compuestos que afectan a la salud y pueden ser indicadores de unas condiciones de producción antihigiénica, formándose a partir de ciertos aminoácidos por descarboxilación. Sin embargo, la cuantificación rutinaria de estas sustancias no se emplea en el control cualitativo de los vinos debido principalmente a las dificultades del análisis. De ahí la importancia de desarrollar métodos sencillos que permitan determinar simultáneamente las aminas biógenas y aminoácidos en vinos o en vinagres. Las poliaminas, por el contrario, tienen múltiples funciones en los organismos vivos, tales como factores de crecimiento, antioxidantes, estabilizadores de ADN y ARN, reguladores metabólicos, nutrientes y segundos mensajeros. Los estudios de racemización constituyen otra área en el análisis de los aminoácidos. Los L-aminoácidos de las proteínas de los alimentos se isomerizan parcialmente a D-isómeros por tratamiento alcalino o por calor. Este tratamiento puede afectar al valor nutritivo y seguridad de los alimentos, ya que la mayoría de los Daminoácidos no pueden ser utilizados por los humanos y algunos son tóxicos. Los isómeros tienen idénticas propiedades químicas y por tanto, deben ser convertidos en dipéptidos diastereométricos mediante una reacción con un agente quiral antes de la 15 Introducción cromatografía. Alternativamente, se puede emplear una fase estacionaria o fase móvil quiral. Para conseguir la separación en un solo cromatograma de todos los aminoácidos en sus formas D y L, es necesario utilizar columnas largas y tiempos de análisis de incluso horas. Se han propuesto diferentes métodos para la determinación aminoácidos enantiómeros y aminas quirales tanto en vinos, vinagres, como en alimentos, cada uno de ellos con sus ventajas e inconvenientes (Brüeckner et al., 1995; Jin et al., 1999; Voss y Galensa, 2000; Toyo´oka et al., 2001; Abe et al., 2002; Erbe y Brüeckner, 1998 ). 1.2.2. Métodos de análisis de aminoácidos Durante los últimos años, la evolución del análisis instrumental ha permitido la detección y cuantificación de un gran número de aminoácidos con gran precisión y sensibilidad. La determinación de aminoácidos en muestras de mostos, vinos y vinagres debe permitir: la detección de aminoácidos primarios y secundarios, como la prolina, que es el aminoácido más abundante de los vinos; un análisis exacto de la arginina, debido a la implicación toxicológica de este compuesto en reacciones posteriores que dan lugar a la formación de etilcarbamato y urea; bajos límites de detección para todos los aminoácidos; un tiempo de análisis corto, con objeto de poder tener un análisis rutinario para la certificación del vino o del vinagre; y la habilidad de crear una base de datos con las características de productos químicos para ayudar a la identificación de adulteraciones (Herbert et al., 2000). Existen diferentes técnicas empleadas en el análisis de aminoácidos en vinos, aunque son tres las que se usan con mayor frecuencia: cromatografía de intercambio iónico con derivatización postcolumna empleando ninhidrina como agente derivatizante y detección por ultravioleta (UV); separación de derivados volátiles de aminoácidos por cromatografía gaseosa (CG) y detección por espectrometría de masas (EM) y separación de aminoácidos derivados por cromatografía de líquidos (CL) y su detección por fluorescencia. La resonancia magnética nuclear (RMN) y la electroforesis capilar (EC) son otras de las técnicas usadas en el análisis de aminoácidos (Herbert et al., 2000). a) Separación por cromatografía líquida de intercambio iónico Las resinas de intercambio iónico son polímeros sulfonados con partículas de 5 a 10 micras de diámetro. El mecanismo de separación está basado en la interacción iónica con un soporte fuertemente ácido, aunque no se pueden excluir una interacción secundaria con el polímero que constituye la base del intercambiador. En primer lugar eluyen los aminoácidos ácidos, seguidos por los hidroxilados, luego los neutros y por último los básicos (Cáceres et al., 1986). Actualmente las columnas son muy eficaces, con lo que los tiempos de análisis son más cortos, pero son bastante caras. Tradicionalmente el análisis de aminoácidos se ha llevado a cabo mediante cromatografía de intercambio catiónico, donde los aminoácidos se separaban y posteriormente reaccionaban con ninhidrina en un sistema de derivatización 16 Introducción postcolumna. Finalmente se detectaban por absorbancia en la región del UV-visible a una o dos longitudes de onda. Aunque ha demostrado tener buena fiabilidad y excelente poder de resolución, los tiempos de análisis son demasiado largos, la sensibilidad es limitada, pueden resultar picos demasiado anchos y los sistemas de derivatización postcolumna resultan difíciles de manejar y mantener. Por otro lado, aunque este método da buenos resultados requiere una larga preparación de las muestras, y su aplicación en vinos no permite la cuantificación de la cisteína, la cual es un precursor de los tioles característicos de la variedad Sauvignon (Pripis-Nicolau et al., 2001), entre otras. Además tiene problemas con las interferencias de la matriz y con los límites de detección (Herbert et al., 2000). De todos modos, esta técnica se ha empleado extensamente en la caracterización de vinos en función del contenido de aminoácidos (Csomos y Simone, 2002). b) Separación por cromatografía de líquidos en fase reversa La mayor parte de los trabajos realizados sobre análisis de aminoácidos por cromatografía de líquidos (CL) se ha llevado a cabo en columnas de fase reversa que tienen como fase estacionaria sílice, a la que se unen grupos C-8 o C-18. Estas columnas, empaquetadas con partículas de sílice muy pequeñas (3-10 µm) y de pequeño diámetro (2-5 mm), están sometidas a una alta presión con una velocidad de flujo de las fases móviles muy controlada. Las fases móviles más utilizadas en fase reversa son mezclas de agua y un disolvente orgánico (metanol, acetonitrilo, o tetrahidrofurano, normalmente). Cuando la muestra tiene sustancias que contienen grupos ácidos o básicos débiles, como son los aminoácidos, se recurre al control del pH de la fase móvil mediante un tampón (Cáceres et al., 1986). La cromatografía en fase reversa utiliza las propiedades de solubilidad de la muestra para distribuirla entre un solvente hidrofílico y otro lipofílico. La distribución de los componentes de la muestra entre las dos fases va a depender de sus respectivas características de solubilidad. Los componentes menos hidrofóbicos se asociarán primeramente con la fase hidrofílica, y los componentes más hidrofóbicos se encontrarán en la fase lipofílica. El proceso entero depende del poder extractivo de la fase hidrofílica. En fase reversa, las partículas de sílice cubiertas con cadenas hidrocarbonadas representan la fase lipofílica, mientras que la mezcla acuosa de un solvente orgánico que rodea las partículas representa la fase hidrofílica. Puesto que el conjunto de los aminoácidos muestra una amplia gama de polaridades, para resolverlos en un solo cromatograma es preciso ir variando la composición de la fase móvil a lo largo de la separación, aumentando su poder de elución; de esta forma, mediante el empleo de un gradiente de polaridad, se consigue separar todos los compuestos en un tiempo razonable, lo que sería imposible de conseguir con una elución isocrática (Cáceres et al., 1986). Esta técnica tiene muchas aplicaciones como por ejemplo la caracterización de vinos (Soufleros et al., 2003) y diferenciación de vinagres en función de la composición en aminoácidos (Valero et al.,2005); el estudio de la evolución de los aminoácidos en el proceso de elaboración del vino (Martínez-Rodríguez et al.,2002); relación del 17 Introducción contenido en aminoácidos con los compuesto volátiles en el vino (Pozo-Bayón et al., 2005) y la determinación simultánea de aminas biógenas y aminoácidos en vinos y en vinagres (Krause et al. 1995; Lozanov et al., 2004; Kutlán y Molnár-Perl, 2003). Además, la cromatografía de líquidos se ha utilizado para determinar los isómeros L y D de los aminoácidos en vinos (Brüeckner et al., 1995; Jin et al., 1999; Voss y Galensa, 2000; Toyo´oka et al., 2000). Los isómeros tienen idénticas propiedades químicas y por tanto, deben ser convertidos en dipéptidos diastereométricos mediante una reacción con un agente quiral antes de la cromatografía. Alternativamente, se puede emplear una fase estacionaria o fase móvil quiral. c) Cromatografía de gases (CG) La cromatografía de gases capilar constituye otra alternativa para el análisis de aminoácidos. Esta técnica es rápida, y tiene un alto poder de resolución y sensibilidad, pero se necesita gran experiencia. Además, como los aminoácidos libres no son suficientemente volátiles necesitan ser convertidos en derivados volátiles para poder determinarlos. Los ésteres de aminoácidos acilados son la clase más frecuente de derivados para el análisis de aminoácidos por CG. La principal desventaja de la cromatografía de gases parece ser el procedimiento de la derivatización, debido a la complejidad de las reacciones y los tipos de reactivos usados. La velocidad de derivatización difiere de un aminoácido a otro y la reproducción estricta de las condiciones de reacción es esencial para todas las muestras. Además, la mayoría de los derivados de aminoácidos volátiles se pueden perder también durante la concentración de la muestra. Por otro lado esta técnica requiere una minuciosa extracción y preconcentración de la muestra, por lo que se deben tener en cuenta a la hora de asegurar la fiabilidad de los resultados finales (Herbert et al., 2000). Se ha comparado la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de gases en cuanto a la precisión. Ninguno de los métodos fue claramente superior. La CG resultó tener una menor varianza intralaboratorio excepto para la histidina y la arginina. También se ha comparado la CG y CL. Considerando muchos factores como la facilidad de la derivatización y la duración del tiempo de análisis el método de elección fue la CL. Aunque la CG tiene ventajas (velocidad y sensibilidad) la mayoría de los análisis de aminoácidos todavía se llevan a cabo por la clásica cromatografía de intercambio iónico o por la cromatografía de líquidos en fase reversa. Muchos autores la han aplicado para la determinación de D-aminoácidos y separación de enantiómeros tanto en vinos (Abe et al., 2002) como en vinagres ( Erbe y Brüeckner, 1998). d) Electroforesis capilar La técnica de electroforesis capilar (EC) se ha usado para separar y detectar aminoácidos, péptidos y proteínas. La EC permite el análisis de muestras extremadamente pequeñas, y por lo tanto se requieren detectores de alta sensibilidad. Estos detectores incluyen fluorescencia inducida por láser, la cual tiene unos límites de detección del orden de 10-20 moles para 18 Introducción la separación por electroforesis capilar de zona de aminoácidos derivatizados con isotiocianato de fluoresceína. Un inconveniente de esta técnica es el consumo de tiempo que conlleva la preparación de las muestras, ya que requieren un proceso de derivatización y preconcentración previo a su análisis (Kosir y Kidric, 2002). Así mismo, se puede aplicar la EC con un detector de fluorescencia inducida por láser para reacciones postcolumna usando como agentes derivatizantes el o-ptaldehido y el naptaneno-2,3-dicarboxialdehido (Male y Luong, 2001; Kilgore y Smith, 2003). El análisis por electroforesis capilar de zona de aminoácidos seleccionados tiene unos límites de detección extremadamente bajos. En la práctica, no se precisan límites de detección tan bajos en el análisis rutinario de aminoácidos en alimentos. Sin embargo, podrían producirse nuevos compuestos en métodos de procesado de alimentos del futuro en unos niveles suficientemente bajos como para poder recomendar la aplicación de esta técnica. e) Resonancia magnética nuclear La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se ha aplicado ampliamente en el campo del análisis químico de alimentos ya que es una técnica no destructiva, sensible y capaz de detectar simultáneamente un gran número de compuestos, concretamente aminoácidos, en mezclas complejas como es el caso del vino ( Kosir y Kidric, 2001; 2002). Aunque la cromatografía de líquidos y la electroforesis capilar son más sensibles, requieren una preparación de las muestras antes del análisis. Normalmente, la separación, derivatización y preconcentración en el caso de compuestos presentes en bajas concentraciones, son pasos imprescindibles en el procedimiento. Por el contrario, la preparación de muestra para la resonancia magnética nuclear es más simple y consume menos tiempo. Otra gran ventaja de esta técnica es la posibilidad de detectar la resonancia magnética de diferentes núcleos presentes en una molécula en diferentes ambientes electrónicos y espaciales. Esta técnica ha sido empleada, obteniéndose muy buenos resultados, en la caracterización de la autenticidad del vino, determinación del origen geográfico y año de producción (Brescia et al., 2002). 1.2.3. Derivatización de aminoácidos Los aminoácidos pueden ser detectados directamente en el ultravioleta, ya que absorben a una longitud de onda entre 190-210 nm. Sin embargo, en esta región del espectro también absorben la mayoría de los disolventes y otros componentes de las muestras, por lo que normalmente se recurre a la formación de derivados detectables a otras longitudes de onda o fluorescentes (Cáceres et al., 1986). 19 Introducción La derivatización puede llevarse a cabo antes de la separación cromatográfica (precolumna), inmediatamente después de la elución (postcolumna) o, menos frecuente, en la misma columna. Cada forma de obtener el derivado presenta ventajas e inconvenientes (Tabla 1.2). En la derivatización postcolumna la separación de aminoácidos no derivatizados se lleva a cabo con una resina de intercambio catiónico con un gradiente de tampones acídicos. Después de la separación se convierten en derivados de ninhidrina coloreados para la detección colorimétrica, o en derivados de ortoftaldehído para la detección por fluorescencia. Tabla 1.2. Ventajas e inconvenientes de la derivatización precolumna y postcolumna (Cáceres et al., 1986) Derivatización Ventajas Inconvenientes -Presencia de interferencias debidas al exceso de reactivo o a productos de degradación. Postcolumna -Es posible utilizar varios sistemas de detección y eluir los compuestos de la -Pérdida de resolución producida por el columna detectándolos por métodos no ensanchamiento de la banda cromatográfica en el reactor donde se produce la reacción. destructivos antes de derivatizarlos. -La reacción es reproducible sin -No se pueden utilizar tiempos de retención muy largos. necesidad de formar un único derivado. -Puede resultar un método caro debido a las modificaciones que hay que realizar en el equipo instrumental para llevar a cabo la reacción. -La única limitación a las condiciones de -Presencia de picos interferentes en los la reacción es que se complete en un cromatogramas debidos al mismo reactivo, a periodo de tiempo razonable y que sea productos de reacción o de degradación o a cuantitativa. impurezas de los reactivos. Precolumna -La reacción se puede desarrollar en un -Conviene eliminar el exceso de reactivo, disolvente no compatible con la fase disolvente u otros componentes de la mezcla de móvil utilizada en la separación reacción antes de la inyección en el cromatógrafo. cromatográfica. - Una parte sustancial de todos los derivados será -Se pueden separar los productos idéntica. Pequeñas diferencias de la cadena lateral secundarios formados, en la misma de los aminoácidos tendrán un efecto menor en el columna o antes de la separación comportamiento cromatográfico de los derivados, cromatográfica. dando una separación más dificultosa. Aunque la derivatización precolumna ofrece más ventajas, los métodos tradicionales postcolumna no se han eliminado totalmente. 20 Introducción Los agentes derivatizantes más utilizados en el análisis de aminoácidos son: a) Ninhidrina La ninhidrina se utiliza para la determinación de los aminoácidos tras su separación en su forma natural por cromatografía de intercambio iónico. Por tanto, la derivatización con ninhidrina es exclusivamente postcolumna (White y Hart, 1992a). La reacción de la ninhidrina con los aminoácidos es muy sensible, llegándose a detectar cantidades inferiores a un picomol pero raramente reproducibles por debajo de 100 picomoles. Esta limitación la hace inadecuada para muchas de las aplicaciones demandadas actualmente. La sensibilidad de la ninhidrina depende de una serie de factores: es muy sensible a la luz, al oxígeno atmosférico, a cambios de temperatura y de pH. Con los aminoácidos primarios forma un complejo morado (Ruhemann´s purple) que absorbe a una λ de 570 nm, y con los aminoácidos secundarios, prolina e hidroxiprolina, forma un complejo amarillo que absorbe a 440 nm. Cuando empieza a oxidarse el reactivo, su color no se desarrolla bien a 570 nm pero la absorción a 440 permanece constante. Por eso cuando la altura de la prolina a 440 nm es igual a la altura del ácido glutámino a 570 nm indica la degradación del reactivo. Algunos autores han aplicado esta técnica para la caracterización de vinos en función del contenido de aminoácidos (Herberger et al., 2003). b) Cloruro de dansilo El cloruro de dansilo (DNS-Cl) es un reactivo fluorogénico de derivatización precolumna que permite la determinación de aminas primarias y secundarias. La dansilación se ha usado como un método para la determinación de aminoácidos libres, tanto los procedentes de la hidrólisis de proteínas como los aminoácidos terminales de proteínas y péptidos. Los derivados son detectables por fluorescencia (λex 360 nm; λem 470) o por ultravioleta (254 nm) y los niveles de detección están en el orden de picomoles o fentomoles dependiendo de la sensibilidad del detector (White y Hart, 1992a). La reacción de los aminoácidos con el cloruro de dansilo transcurre en condiciones óptimas entre 35-50 minutos en medio básico, a temperatura ambiente y en la oscuridad. Además de los dansilaminoácidos se forma como producto secundario el ácido dansilsulfónico. Por otro lado, el exceso de cloruro de dansilo reacciona con los dansilaminoácidos formando dansilamida. La formación de la dansilamida era una inevitable limitación del método y la cantidad formada depende de la concentración de aminoácidos y del exceso de cloruro de dansilo. Conviene, pues, reducir en lo posible la aparición de tales productos secundarios (Cáceres et al., 1986). 21 Introducción Los derivados son relativamente estables a la hidrólisis lo que no ocurre con el reactivo. Hay que evitar, sin embargo, la exposición a la luz por ser fotosensibles. Los dansilaminoácidos son estables al menos 7 días si se mantienen a –4 ºC. Esta técnica se utiliza generalmente en derivatización precolumna. Numerosos autores lo han empleado para la determinación de aminoácidos en mostos de uva, vinos y vinagres (Botella et al., 1990; Valero et al., 2005). La mayoría de aminoácidos dan monodansil derivados, excepto lisina, ornitina, histidina, tirosina y cisteína que forman didansil derivados. Este método ofrece una buena reproducibilidad para la mayoría de los aminoácidos excepto para la histidina debido a la baja respuesta relativa de fluorescencia del derivado didansilado y por la formación de dos dansil derivados (White y Hart, 1992a). c) Cloruro de dabsilo Los derivados obtenidos con el cloruro de dabsilo tienen una absorción máxima a 420 nm (región visible), son altamente estables y son rápidamente separados y detectados a niveles de picomoles. Los derivados se mantienen perfectamente estables durante cuatro semanas a temperatura ambiente. Una limitación del método es que la presencia de una excesiva cantidad de sal, urea, fosfato, o bicarbonato amónico alterará el pH del tampón e interferirá en la reacción de dabsilación. Para un análisis cuantitativo de muestras desconocidas, los estándares de aminoácidos dabsilados tienen que obtenerse de una mezcla de estándares de aminoácidos hidrolizada y dabsilada en paralelo en las mismas condiciones que las muestras (White y Hart, 1992a) Krause et al. (1995) propusieron el uso del cloruro de dabsilo como un método alternativo al análisis convencional de aminoácidos y aminas biógenas en alimentos y muestras biológicas, logrando separar más de cuarenta compuestos simultáneamente. d) Dinitrofluorobenceno El dinitrofluorobenceno (DNFB) es un agente de derivatización precolumna que se utiliza para la caracterización de aminoácidos terminales de cadenas peptídicas (Cáceres et al., 1986). Este agente reacciona con los aminoácidos primarios y secundarios formando compuestos que muestran fluorescencia a 365 nm. La reacción se lleva a cabo a 50 ºC durante 30 minutos. Los derivados son estables durante 48 horas si se protegen de la luz. 22 Introducción Con este reactivo se pueden detectar pequeñas cantidades de aminoácidos, del orden de picomoles, y es muy adecuado para determinar aminoácidos que otros reactivos resuelven peor. Uno de los inconvenientes de este método está en que destruye los péptidos (White y Hart, 1992a). e) Fenilisotiocianato El agente derivatizante fenilisotiocianato se ha utilizado durante más de 30 años en el método de la degradación de Edman para secuenciar proteínas y péptidos. Este agente reacciona con los aminoácidos libres produciendo feniltiocarbamil aminoácidos (Cáceres et al., 1986). Se ha empleado, asimismo, para determinar aminoácidos en zumos de naranja (Naulet et al., 1997), vinos ( Botella et al., 1990; Lehtonen et al., 1996; Puig-Deu y Buxaderas, 1994; Hernández-Orte et al., 1999; Fox et al., 2001) y vinagres (Palacios et al., 2002). Hay que señalar que se consigue la cuantificación de los aminoácidos secundarios prolina e hidroxiprolina. A diferencia de la ninhidrina y ortoftaldehído, los derivados feniltiocarbamil de la prolina y la hidroxiprolina tienen aproximadamente la misma respuesta molar que los otros aminoácidos. La selectividad es adecuada y no hay evidencia de formación de derivados disustituidos con tirosina o histidina. Sólo lisina y cistina reaccionan con dos moléculas del agente. En condiciones suaves, la reacción se completa en menos de diez minutos, y como el reactivo es volátil, se puede usar en exceso. Este exceso se elimina a baja presión. Las muestras secas pueden ser almacenadas a –20 ºC, y resultan estables durante 4 semanas. Debido a que los derivados no son fluorescentes, la técnica está limitada a la detección por UV, la cual se lleva a cabo a 254nm (λmáx = 269 nm). Esta técnica no es tan sensible como las que utilizan reactivos fluorescentes, pero la alta absorción en el UV de los derivados hace que puedan ser detectados a niveles de picomoles, los cuales representan los niveles prácticos de sensibilidad para muestras reales. El límite de sensibilidad es 50 picomoles en una relación señal / ruido de 2.5, la cual es 50 veces menos sensible que la detección de los derivados de ortoftaldehído y 9-fluorenilmetil cloroformato. f) Ortoftaldehido El ortoftaldehido (OPA), fue introducido en 1971 y es el agente de derivatización más comúnmente usado en cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa para la determinación de aminoácidos. Se ha aplicado a vinos (Pozo-Bayón et al., 2005; Soufleros et al., 2003; Lehtonen et al., 1996) y vinagres (Kutlán y MolnárPerl, 2003). Otra de las aplicaciones de este reactivo ha sido la determinación de aminoácidos enantiómeros en alimentos y bebidas (Brüeckner et al., 1995). El OPA es un reactivo que no tiene fluorescencia natural, la desarrolla al reaccionar con funciones amino primarias. La reacción tiene lugar en medio acuoso a pH fuertemente alcalino en presencia de un agente reductor como el 2-mercapto-etanol, 23 Introducción 3-mercapto-1-propanol o etanotiol. El derivado isoindólico formado es inestable y debe ser estabilizado por acidificación. La reacción se completa totalmente en 1 ó 2 minutos a temperatura ambiente (Cáceres et al., 1986). Este reactivo se puede emplear tanto para la derivatización postcolumna como para la precolumna. No es necesario eliminar el exceso de OPA antes de inyectar la muestra ya que el reactivo por sí mismo no interfiere en la separación o detección. Sin embargo, como los derivados OPA-aminoácidos son inestables, para conseguir unos resultados reproducibles es esencial una completa automatización de la reacción precolumna controlando de manera muy precisa el tiempo de reacción. El límite de detección con este reactivo está en el rango de los fentomoles, lo que demuestra que esta técnica es diez veces más sensible que la reacción con ninhidrina. Por otro lado, el OPA no reacciona con grupos amino secundarios, por tanto, si queremos determinar prolina e hidroxiprolina simultáneamente con el resto de los aminoácidos, hay que recurrir a una oxidación con hipoclorito sódico que rompe el anillo y los convierte en aminoácidos primarios. Otra alternativa es utilizar OPA con otro agente que permita derivatizar los aminoácidos secundarios. Algunos autores usaron una doble derivatización con ortoftaldehído y 9-fluorenilmetil cloroformato para determinar los aminoácidos primarios y secundarios en mostos y vinos (Herbert et al., 2000; Martínez-Rodríguez et al., 2002). Pripis-Nicolau et al. (2001) desarrollaron un método para determinar la cisteína y otros aminoácidos en mostos y vinos utilizando una derivatización previa con ácido iodoacético (IDA) seguida de otra con OPA. Otro inconveniente de este reactivo es la débil respuesta de la lisina, que puede ser debida a la presencia de dos estructuras isoindólicas fluorescentes que interaccionan. La cisteína es también un aminoácido que presenta una débil respuesta debido probablemente a la fácil descomposición del derivado. La solución que proponen algunos autores es realizar una oxidación previa con ácido peroxifórmico o una carboximetilación y detectar el aminoácido como ácido cistéico o carboximetilcisteína (Cáceres et al., 1986). Los derivados también se pueden detectar en ultravioleta a 330 nm, pero para una mayor sensibilidad, se utiliza con preferencia la detección por fluorescencia, cuya emisión se mide a una λ de 430 nm. g) 9-Fluorenilmetil cloroformato Se ha demostrado que el 9-fluorenilmetil cloroformato (FMOC-CL) es adecuado para la detección por fluorescencia de aminoácidos primarios y secundarios. Este reactivo da lugar a derivados estables y altamente fluorescentes (Bauza et al., 1995). A diferencia de los otros derivatizantes precolumna que producen derivados fluorescentes, el FMOC-CL es por sí mismo fluorescente. FMOC y los productos obtenidos de su hidrólisis pueden interferir en la cuantificación de los aminoácidos derivados, sin embargo, esta propiedad no tiene por qué ser un factor limitante, ya que el exceso de reactivo y los productos fluorescentes formados en reacciones laterales se 24 Introducción pueden eliminar sin que se pierdan los aminoácidos derivados mediante una extracción líquido-líquido. Otra método alternativo para evitar la interferencia del FMOC-OH es que el exceso de FMOC reaccione con una amina muy hidrofóbica para formar un derivado que eluya después de los picos de interés (White y Hart, 1992a). Este agente derivatizante se ha empleado para determinar aminas biógenas y sus aminoácidos precursores en vinos (Bauza et al., 1995; Lehtonen et al., 1996) y en alimentos (Kirschbaum et al., 1994). h) Etoximetilenmalonato de dietilo El etoximetilenmalonato de dietilo (EMMDE), es otro agente de derivatización precolumna capaz de reaccionar con aminoácidos primarios y secundarios dando lugar a derivados detectables en la región UV-visible. Este agente se ha aplicado para determinar el contenido de aminoácidos en muestras de vino (Chichón et al., 2001) y posteriormente en diferentes tipos de mieles españolas (Hermosín et al.,2003). En este último trabajo de investigación, se examinó la información obtenida para establecer si la composición de aminoácidos libres de una miel podía explicar sus orígenes botánicos. Más recientemente, Hermosín et al. (2006) han desarrollado un método para el análisis conjunto de aminas biógenas, aminoácidos e ión amonio en vinos. Este método consiste en la separación mediante CL en fase reversa de las aminoenonas formadas por reacción de los aminoácidos, las aminas biógenas y el ión amonio con el agente prederivatizante etoximetilenmalonato de dietilo (EMMDE). La reacción de derivatización se realiza en medio metanólico básico, durante 30 minutos. Posteriormente, la muestra se calienta 2 horas a 70ºC para la completa degradación del exceso de reactivo y de sus productos secundarios de reacción. La mayoría de los derivados obtenidos son perfectamente estables, al menos durante la primera semana, excepto prolina e hidroxiprolina, por lo que de ser necesaria su cuantificación, el análisis debería realizarse en las 24 horas siguientes a la reacción de derivatización. Este es uno de los inconvenientes del método. Sus ventajas son: derivatización directa sin preparación previa; cuantificación simultánea de 24 aminoácidos (incluida prolina), 9 aminas biógenas y el ión amonio; empleo del detector UV-Visible, el más habitual en cualquier laboratorio y no interferencia en el cromatograma del exceso de agente derivatizante. Los límites de detección están por debajo de 0.4 mg/L entre los aminoácidos, y de 0.07 mg/L entre las aminas biógenas. Con otros agentes se han conseguido límites de detección más bajos por lo que este reactivo se debe usar cuando no se requiera una sensibilidad por debajo de picomoles. Otro inconveniente es el tiempo de derivatización, ya que con otros agentes se consiguen procesos de derivatización más cortos (Alaiz et al., 1992). 25 Introducción i) 6-Aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato El 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) es un agente para la derivatización de grupos aminos, específicamente diseñado para el análisis de aminoácidos, con la idea de simplificar la reacción de derivatización, aumentar los rendimientos de la reacción e incrementar la sensibilidad y selectividad de los derivados formados cuando se trabaja con detección por fluorescencia (Cohen y Michaud, 1993; Cohen y Antonis, 1994; Wandelen y Cohen, 1997). Hernández–Orte et al. (2003) optimizaron las condiciones de separación propuestas por Cohen y Michaud (1993) para conseguir una cuantificación simultánea de los aminoácidos libres de los mostos y vinos sin problemas de interferencia debidos al contenido de azúcar. Este compuesto reacciona rápidamente con los aminoácidos primarios y secundarios formando productos altamente estables con una fuerte fluorescencia a 395 nm (Figura 1.7). Los derivados que resultan son estables a temperatura ambiente durante, al menos, una semana y se separan fácilmente por CL en fase reversa utilizando una columna de C18. H O N O R1 + N HN O R2 N O AQC Aminoácido 1º y 2º R1 H N HO N O O N + R2 O N Aminoácido derivatizado NHS Figura 1.7. Reacción de derivatización del AQC El exceso del reactivo se hidroliza durante la reacción para formar 6aminoquinolina (AMQ) (Figura 1.8), cuyas características espectrales son netamente diferentes a cualesquiera de los aminoácidos derivatizados. Ello permite programar una longitud de onda que maximice la respuesta de emisión de los derivados y reduzca al mínimo la respuesta del AMQ. En esta hidrólisis del reactivo también se forma N- 26 Introducción hidroxisuccinimida (NHS) y dióxido de carbono pero éstos no interfieren en el análisis cromatográfico. La destrucción de exceso del reactivo es completa en un minuto. O NH O + N H2O O N O AQC O NH2 + HO N + CO2 N O AMQ NHS Figura 1.8. Hidrólisis del exceso de AQC El protocolo de derivatización, agregado del reactivo y calefacción de la muestra previamente tamponada, es simple y directo. Los derivados de los aminoácidos se inyectan directamente sin preparación adicional de la muestra, mientras que las sales (presentes en la muestra) prácticamente no causan interferencias en la reacción o en la reproducibilidad de los resultados (Wandelen y Cohen, 1997). Este método ha sido optimizado para su uso con un detector de fluorescencia con el fin de lograr límites de detección de 50-300 fentomoles para los aminoácidos existentes en péptidos e hidrolizados de proteínas (Hernández-Orte et al., 2003). Utilizando un detector de UV, a 250 nm, el AMQ absorbe alrededor de 200 veces más que cualquiera de los aminoácidos derivatizados y esto puede ocasionar dificultades en la cuantificación del ácido aspártico, que es el primero de los aminoácidos en eluir. Esto no ocurre cuando la detección se lleva a cabo por fluorescencia, ya que la señal del AMQ es mucho menor a la obtenida en el UV. Otra característica del AMQ es que su tiempo de retención puede variar dependiendo del pH de la fase móvil. La presencia de dos grupos fluorescentes en una misma molécula puede disminuir considerablemente su fluorescencia debido a un fenómeno conocido como "quenching interno". Este efecto se observa muy débilmente en el caso de la molécula 27 Introducción de lisina, pero es bien notorio con el triptófano. En este caso la sensibilidad del método se ve ampliamente favorecida por el uso de un detector UV. Tanto el análisis de muestras con triptofano, como el análisis de aminoácidos libres en una solución intravenosa, puede ser eficazmente realizado usando ambos detectores en serie, primero el de fluorescencia para la mayoría de los aminoácidos y luego el detector UV para el triptofano. Este reactivo también se ha utilizado como una alternativa al reactivo de derivatización más común, OPA, para determinar aminas biogénicas en vinos (Busto et al., 1996) y para estudiar la evolución de los aminoácidos y péptidos durante la fermentación alcohólica y autolisis de los vinos (Alexandre et al., 2001). En la siguiente tabla se muestra un resumen de los agentes empleados en la derivatización de los aminoácidos con sus ventajas e inconvenientes. Tabla 1.3. Agentes empleados en la derivatización de aminoácidos Reactivo Ninhid rinaa DNSCla b DABS-CL DNFB a Derivatiz. Postcolumna Precolumna y Postcolumna Precolumna Precolumna Mec separación Intercambio iónico Tipo detec. -Reaciona con aa primarios y secundarios UV -Capaz de detectar picomoles Fluorescencia Fase reversa UV Fase reversa Fase reversa Aplicado en muestras de vino b Ventajas Visible Fluorescencia -Reacciona con aa primarios y secundarios -Capaz de detectar picomoles o fentomoles -Derivados estables a la hidrólisis -Buena reproducibilidad para todos aa menos para His -Muy adecuado para determinar Cys -Reacciona con aa primarios y secundarios. -Derivados muy estables (4 semanas a Tª ambiente) -Capaz de detectar picomoles -Reacciona con aa primarios y secundarios -Capaz de detectar bajos niveles de picomoles -Determina aa que otros agentes resuelven peor Inconvenientes -No reproducible en cantidades menores a 100 picomoles -Problemas de interferencias con la matriz -Sensible a la luz, O2, cambios Tª y pH -El exceso de reactivo interfiere en el cromatog. -Los derivados son fotosensibles -Reacción lenta -His forma picos múltiples -No es específico y reacciona con otros compuestos -El exceso de reactivo interfiere en el cromatog. -Las sales y detergentes presentes en las muestras interfieren -Produce múltiples derivados -Los derivados son fotosensibles -Reacción muy lenta. -Método destructivo para péptidos Aplicado en muestras de vinagre 28 Introducción Tabla 1.3. Agentes empleados en la derivatización de aminoácidos (Continuación) Reactivo Derivatiz. Mec separación PITCa b Precolumna Fase reversa OPAa b Precolumna y Postcolumna Fase reversa y Cromatg. Intercambio iónico Precolumna Fase reversa FMOCa EMMDE Precolumna Tipo detec. UV Fluorescencia UV Fluorescencia Fase reversa UV-Visible Fluorescencia AQCa Precolumna Fase reversa UV a Aplicado en muestras de vino b Ventajas Inconvenientes -Problemas de interferencias con la -Reacciona con aa matriz en el análisis de primarios y secundarios. mostos -Determina Prolina e -No adecuado para su Hidroxiprolina con una automatozación sensibilidad de picomoles -Sensibilidad menor a -Reacción rápida otros métodos (50 veces -Forma derivados más menor que OPA y estables que otros FMOC) reactivos -El reactivo se puede usar -El proceso es lento en exceso porque no porque necesita un paso interfiere de evaporación a sequedad -Los derivados son inestables -El reactivo se puede usar -No reacciona con aa en exceso porque no secundarios (prolina) interfiere -Necesita una completa -Reacción rápida automatización de la -Derivados altamente reacción fluorescentes -Respuesta de la -10 veces más sensible Lys,Hidroxilisina y Cys que reacción con baja Ninhidrina -Derivados se descomponen -Reacciona con aa -Produce múltiples primarios y secundarios derivados -Reacción rápida (30 -El reactivo es por sí segundos) mismo fluorescente e -Derivados estables y interfiere en el cromatog. altamente fluorescentes -El Proceso de derivatiz. -Muy sensible es lento ya que se tiene que eliminar el reactivo -Reacciona con aminoácidos primarios y secundarios -Derivatización directa sin previa preparación -El exceso de reactivo no interfiere -Sensibilidad de picomoles -El exceso de reactivo no interfiere -Reacciona con aa primarios y secundarios -Derivados estables y altamente fluorescentes -Muy sensible (50-300 fentomoles) -Reacción rápida -Derivados se inyectan sin previa preparación de la muestra -Las sales y detergentes de muestras no interfieren -Proceso de derivatización lento -Inestablilidad de los derivados de prolina e hidroxiprolina -No sensible a niveles inferiores a picomoles -Lys y Trp muestran una menor fluorescencia por el llamado “quenching interno” -Si el amonio no se derivatiza totalmente, el exceso de éste puede distorsionar el análisis de Arg y Thr Aplicado en muestras de vinagre 29 Introducción Aunque la derivatización precolumna ofrece más ventajas, ninguno de los agentes prederivatizantes estudiados se considera el agente universal ya que ninguno cumple todos los requisitos: • Reaccionar rápidamente bajo condiciones suaves para obtener el derivado de forma cuantitativa. • Reaccionar con aminoácidos primarios y secundarios. • Los derivados deberían ser estables durante varios días, preferiblemente a temperatura ambiente para permitir el análisis automatizado de múltiples muestras. • Respuesta lineal en los niveles de concentración típicos de la mayoría de las aplicaciones. • El exceso de reactivo o productos secundarios no deberían interferir en el análisis de aminoácidos. 1.2.4. Elección del método óptimo Cada uno de los métodos tiene sus propias ventajas e inconvenientes. El criterio predominante que influirá en la selección de la derivatización y en los procedimientos de CL son la resolución, la sensibilidad y la velocidad. Hasta ahora los agentes derivatizantes que se han aplicado para la determinación de aminoácidos en vinagres ha sido cloruro de dansilo, fenilisotiocianato y ortoftaldehído. El ortoftaldehído es el más utilizado para la determinación de aminoácidos tanto en muestras de vino como de vinagre, sin embargo, lo descartamos ya que no reacciona con la prolina, que es uno de los aminoácidos más abundantes en las muestras de vinagre. Además, los derivados que se obtienen son inestables. Los otros dos agentes (cloruro de dansilo y fenilisotiocianato), también se descartaron ya que se ha visto que dan problemas de interferencias con la matriz y el proceso de derivatización es lento. Otro de los motivos por lo que se descartó el cloruro de dansilo fue la fotosensibilidad de los derivados. Por otro lado, el etoximetilenmalonato de dietilo, a pesar de sus numerosas ventajas también se descartó por tener un proceso de derivatización más largo y por la inestabilidad que presentan los derivados de la prolina. Los restantes reactivos derivatizantes, también mostraban problemas en cuanto a la estabilidad de los derivados y a la interferencia del exceso de reactivo en el cromatograma. En este trabajo de investigación, se propone la utilización del método empleado por Hernández-Orte et al., (2003) para aplicarlo a la determinación de aminoácidos en muestras de vinagre de vino y para el seguimiento del proceso de acetificación. Los aminoácidos de separan mediante CL tras una previa derivatización con el agente AQC y se determinan por fluorescencia. La validación de este método para vinagres comprende la determinación de los parámetros analíticos: selectividad, exactitud, precisión, linealidad, sensibilidad y límites de detección y cuantificación. 30 Materiales y Métodos 2. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. MATERIAL 2.1.1 Muestras La determinación se llevó a cabo en un total de 36 muestras de vinagres de vino o de vinos en proceso de acetificación (Tabla 2.1), que se obtuvieron a partir de dos sustratos vínicos distintos. La acetificación de los mismos se llevó a cabo mediante cultivo superficial (método de Orleáns) utilizando barricas de diferentes tipos de maderas. La codificación empleada para identificar las muestras de vinagre es de la forma XYZn. X indica el vino del que proviene el vinagre, por tanto, tomará los dos posibles valores: - F, vino tinto procedente del sur de Francia cuyas características aparecen en la Tabla 2.1., con elevado azúcar residual. - T, vino tinto de la denominación de origen Priorato cuyas características aparecen en la misma Tabla. Se han seguido seis acetificaciones por cada sustrato que se indican con los dígitos YZ. Las acetificaciones de cada sustrato se llevaron a cabo en seis barricas de 60 L de capacidad que se llenaron con un total de 40 L. Estas barricas presentan diferencias en cuanto a sus características de madera (indicado con la letra Y) y tonelería (indicado con la letra Z). Las acetificaciones duraron entre 1.5 - 2.5 meses para las muestras del sustrato vínico F y entre 5 - 9 meses para las del sustrato vínico T. n indica el momento de la toma de muestra durante el proceso de acetificación, tomando 3 posibles valores: i si se encuentra al inicio (0.37 – 0.62 grados acéticos) m si se encuentra a mitad del proceso de fermentación (3.5 – 4 grados acéticos) f si se encuentra al final del proceso de fermentación (5.5 – 6 grados acéticos) 31 Materiales y Métodos Tabla 2.1. Muestras estudiadas en la presente memoria Puntos de muestreo durante la acetificación Vino de partida Madera Inicio Sustrato F Grado alcohólico: 9.2 Grado acético: 0.9 Sustrato T Grado alcohólico: 11.3 Grado acético: 0.9 AL BL CK CL CM DL AL BL CL DK DL DM FALi FBLi FCKi FCLi FCMi FDLi TALi TBLi TCLi TDKi TDLi TDMi Mitad FALm FBLm FCKm FCLm FCMm FDLm TALm TBLm TCLm TDKm TDLm TDMm Final FALf FBLf FCKf FCLf FCMf FDLf TALf TBLf TCLf TDKf TDLf TDMf 2.1.2. Reactivos a) Reactivo empleado para la reacción de derivatización Kit “AccQ-Fluor”, constituido por 6-Aminoquinolil-N-Hidroxisuccinimidil Carbamato (AQC), acetonitrilo para disolver el reactivo y disolución tampón de borato sódico 0.2 mM a pH 8.8. Waters WAT052880 (Milford, MA, USA). b) Sustancias patrón Se han empleado un total de 24 patrones comerciales, correspondientes a los principales aminoácidos en el vino y en vinagre, amonio y patrón interno (Tabla 2.2) 32 Materiales y Métodos Tabla 2.2. Patrones de aminoácidos Aminoácido Proveedor Referencia L-Ácido Aspártico L-Asparagina L-Serina L-Ácido Glutámico L-Histidina L-Glutamina L-Glicina L-Arginina L-Treonina L-Alanina L-Prolina Ácido γ-Aminobutírico Ácido α-Aminobutírico (PI)* L-Cisteina L-Tirosina L-Valina L-Metionina L-Ornitina monohidroclorada L-Lisina L-Isoleucina L-Leucina L-Fenilalanina L-Triptófano Sulfato Amónico Aldrich Fluka Fluka Aldrich Sigma Fluka Merck Fluka Fluka Aldrich Fluka Sigma Fluka Fluka Fluka Fluka Fluka Merck Sigma Fluka Fluka Fluka Fluka Sigma A9,310-0 11150 84960 12,843-0 H-8000 49419 1.04201 11009 89179 A2,680-2 81710 2129 07200 30089 93830 94620 64320 1.06906 L-5501 58880 61820 78020 93659 A-2939 * PI: Patrón Interno c) Otros Reactivos Para la preparación de los eluyentes se han utilizado distintos productos de calidad HPLC (Tabla 2.3). El agua desionizada fue obtenida con un sistema de purificación Milli-Q “Millipore”. Tabla 2.3. Reactivos para eluyentes 33 Materiales y Métodos Reactivo Proveedor EDTA cálcico disódico Acetato sódico trihidratado Trietilamina (TEA) Ácido fosfórico Acetonitrilo Sigma Fluka Fluka Sigma-Aldrich Merck Referencia ED2SC 71190 90335 466123 1.14291 Adicionalmente se emplearon para la preparación de las disoluciones de patrones: Ácido Clorhídrico 32% Amoniaco 25% Merck Merck 1.00319 1.05432 2.1.3. Instrumentación 2.1.3.1. Cromatógrafo líquido de alta eficacia - Equipo cromatográfico “Waters”, formado por: Inyector automático Waters 717 Bomba cuaternaria Waters 600E System Controller Horno Waters Steel Columm Heater Module Estación de datos Millennium 32 Desgasificador en línea AF Waters Detector de haz de fotodiodos Waters 996 Detector de fluorescencia Waters 474 - Columna de sílice Luna C18 en fase reversa, tamaño de partícula 5µm, 250 x 4.6 mm “Phenomenex” (Torrance, CA, USA) (Distribuida por Jasco Analítica SPAIN, Madrid). - Precolumna 4.0 mm x 3.0 mm “Phenomenex” (Torrance, CA, USA). (Distribuida por Jasco Analítica SPAIN, Madrid). - Software Millennium32 Chromatography Manager de “Waters”. 2.1.3.2. Instrumentación y material 34 Materiales y Métodos • Balanza Analítica “Mettler” con aproximación de 0.0001g • Agitadores magnéticos “Selecta-P” • Baño Ultrasonido “Selecta-P” con capacidad de 6 L • Bomba de Vacío de Membrana Vacuubrand “Schott Iberia” de 1.7 m3/h • pH-metro “Crison” GLP22 • Baño de agua termostatizado “Selecta-P” Digiterm 3000542 • Vortex “IKA” 230V, 50/60Hz • Sistema de filtración de agua Milli-Q “Millipore” • Filtros con un tamaño de poro de 045µm “Millipore” • Micropipeta digital Nichipet EX “Nichiryo” de 10 a 100µl • Micropipeta digital Nichipet EX “Nichiryo” de 100 a 1000µl • Desecador de vidrio con gel de sílice 2.2. MÉTODOS 2.2.1. Preparación de las fases móviles La disolución de acetato sódico se preparó disolviendo 19.05 g de acetato sódico trihidratado con agua Milli-Q hasta un volumen final de 1 L. Seguidamente se ajustó el pH de dicha disolución a 5.5 con una disolución de ácido fosfórico en agua al 10% (p/v). Una vez ajustado el pH se añadió 1 mL de una disolución de EDTA cálcico disódico en agua (1g/L) y 2.37 mL de trietanolamina (TEA). Finalmente se ajustó de nuevo el pH bien a 4.92 (para la preparación la fase móvil D) o a 5.15 (para la preparación de las fases B y C) con el ácido fosfórico al 10% y se añadió la correspondiente proporción de acetonitrilo (fases D, C y B). Para la fase móvil A se utilizó acetonitrilo y agua en la proporción 60:40. Todas las disoluciones fueron filtradas a través de un filtro de membrana “Millipore” con un tamaño de poro de 0.45 µm antes de ser usadas. 2.2.2. Condiciones cromatográficas 35 Materiales y Métodos Los derivados de aminoácidos se separaron empleando un gradiente cuaternario compuesto por las siguientes fases móviles: • Fase Móvil A: acetonitrilo - agua Milli-Q (60:40) • Fase Móvil B: acetato sódico pH 5.15 - acetonitrilo (80:20) • Fase Móvil C: acetato sódico pH 5.15 - acetonitrilo (96:4) • Fase Móvil D: acetato sódico pH 4.92 - acetonitrilo (96:4) Partiendo del gradiente propuesto por Hernández-Orte et al. (2003) se realizaron sucesivas pruebas de gradiente, resultando ser el más adecuado el que figura en la siguiente tabla: Tabla 2.4 . Gradiente de elución Tiempo (min) 0 20 22 25 28 44 64 84 94 %A 0 0 0 0 0 0 0 100 0 %B 0 0 0 31 34 57 100 0 0 %C 0 0 100 69 66 43 0 0 0 %D 100 100 0 0 0 0 0 0 100 Los cambios de gradiente se realizaron de manera lineal y el análisis cromatográfico se llevó a cabo a 34º C. El volumen de inyección fue de 20 µL. 2.2.3. Preparación de patrones Se prepararon disoluciones para cada uno de los patrones de aminoácidos estudiados, así como para el amonio. Las disoluciones de cada patrón se prepararon disolviendo en agua Milli-Q una cantidad correspondiente a 400 mg de patrón hasta un 36 Materiales y Métodos volumen final de 25 mL. Para algunos aminoácidos fue necesaria la adición de ácido clorhídrico o amoniaco para su completa disolución como se indica en la Tabla 2.5. Tabla 2.5. Concentraciones de las distintas disoluciones empleadas Patrones Riqueza % mg Patrón 1 (mg/L) Patrón 3 (mg/L) Aspártico (Asp) Asparagina (Asn)a Serina (Ser) Ácido Glutámico (Glu)a Histidina (His) Glutamina (Gln)a Glicina (Gly) Arginina (Arg) SulfatoAmónico (NH4+) Treonina (Thr) Alanina (Ala) Prolina (Pro) Ácido γ-Aminobutírico (GABA) Cisteina (Cys)a Tirosina (Tyr)a Valina (Val)a Metionina (Met)a Ornitina monohodroclorada (Orn) Lisina (Lys) Isoleucina (Ileu)a Leucina (Leu)a Fenilalanina (Phe) Triptófano (Trp)b 98 >99 99 99 99 >99.5 99.7 >99.5 98 >99.5 99 99 99 400 400 400 400 400 400 400 400 1498 400 400 400 400 400 400 400 400 515 400 400 400 400 400 1.568 1.584 1.584 1.584 1.584 1.592 1.595 1.592 1.600* 1.592 1.584 1.584 1.584 1.592 1.584 1.584 1.584 1.600** 1.568 1.584 1.584 1.584 1.592 333.2 330.66 265.32 368.28 388.08 366.16 189.43 437.8 45.2 298.102 222.948 289.08 259.38 455.4 293.04 374.22 332 366.52 328.68 328.68 413.82 513.42 * Concentración de amonio Concentración de ornitina ** a b >99.5 >99 >99 >99 99 98 >99 99 >99 >99.5 Se añadió ácido clorhídrico al 32% hasta disolución Se añadió amoniaco al 25%hasta disolución La preparación de la disolución del patrón interno α-aminobutírico (disolución “patrón 2”) empleada en el estudio se llevó acabo en dos pasos. En primer lugar se disolvió 26.04 mg de patrón en 50 mL de agua Milli-Q, resultando una disolución de 520 mg/L teniendo en cuenta su riqueza. En segundo lugar, se tomó 1.25 mL de la disolución anterior y se llevó a un volumen final de 10 mL con agua Milli-Q. Esta nueva disolución tiene una concentración de 64.45 mg/L de ácido α-aminobutírico. Los aminoácidos y el ión amonio son inestables en disolución a temperatura ambiente y con el tiempo se van descomponiendo. Por este motivo se deben conservar a 37 Materiales y Métodos una temperatura entre 4 y 8ºC y los más inestables (cisteina, metionina, triptófano, ornitina, tirosina y amonio) a –20ºC. A partir de las disoluciones “patrón 1” de los distintos estándares se prepararon, mediante sucesivas diluciones, la disolución “patrón 3” y la disolución “mezcla enriquecimiento”. La disolución “patrón 3”, es una mezcla de todos los aminoácidos estudiados y se empleó para preparar los diferentes niveles de concentración de la recta de calibrado. Por otro lado, la disolución “mezcla enriquecimiento” que se utilizó para realizar los estudios de recuperación se preparó añadiendo todos los aminoácidos estudiados, resultando tener una concentración final de 1 mg/L de cada uno de ellos. Debido a que los estándares de aminoácidos contienen como impureza ión amonio, se preparó, de forma independiente, una disolución con la misma concentración (1 mg/L), que sólo contenía dicho compuesto. Antes de la derivatización, se procedió del siguiente modo, tanto para disoluciones de estándares, como para muestras: - Se tomaron 50 µL de α-ABA (PI) de la disolución “Patrón 2” (64.45 mg/L), 125 µL bien de las disoluciones estándares o de las muestras diluidas y se añadió agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5 mL. A esta disolución se le denominó “mezcla prederivatización”. La mezcla prederivatización de aminoácidos usada para la selección del gradiente más adecuado contenía una concentración de 0.01 mM de PI, 0.1 mM de ornitina, 0.15 mM de triptófano y cisteina y 0.05 mM del resto de aminoácidos y amonio. 2.2.4. Preparación de muestras Las muestras de vinagre se filtraron con papel de filtro y posteriormente se diluyeron al 25% añadiendo 500 µL de la muestra a 1500 µL de agua Milli-Q. A partir de las muestras así diluidas se preparó la mezcla prederivatización correspondiente tal y como se ha explicado en el apartado anterior. 2.2.5. Reacción de derivatización La reacción de derivatización se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del kit (Cohen y Michaud, 1993). Para ello se añadieron 20 µL de la mezcla prederivatización de los estándares o de las muestras diluidas a 60 µL de una disolución tampón de borato sódico 0.2 mM a pH 8.8 y se agitó vigorosamente con un vortex durante 10 segundos. Posteriormente, a esta mezcla se le añadió 20 µL de la solución AQC agitando nuevamente otros 10 segundos y se llevó a un baño de agua a 55ºC durante 10 minutos (Figura 2.1). 38 Materiales y Métodos 60 µL tampón borato 20 µL AQC Mezcla Prederivatización Inyectan 20 µL 20 µL 55ºC-10 min Figura 2. 1. Protocolo de derivatización 2.2.6. Identificación La detección de los distintos aminoácidos y el amonio se realizó con un detector de fluorescencia usando una λex de 250 nm y una λem de 395 nm. La identificación se llevó a cabo utilizando los tiempos de retención correspondientes a los picos cromatográficos de los patrones y los tiempos de retención relativos de éstos frente al patrón interno (Tabla 2.6). Para conocer tanto los tiempos de retención como el orden de elución de los compuestos estudiados se comenzó inyectando de forma individual 0.04 nmoles del PI, 0.4 nmoles de ornitina, 0.6 nmoles de triptófano y cisteina y 0.2 nmoles del resto de aminoácidos y el amonio y finalmente se inyectó una mezcla de todos los patrones para comprobar la resolución de los picos cromatográficos. 39 Materiales y Métodos Tabla 2.6. Tiempos de retención Tiempo de retención 23.784 AMQ* * Tiempo de retención relativo 0.442 Ac Aspártico(Asp) 30.414 0.566 Asparagina (Asn) 31.566 0.588 Serina (Ser) 32.938 0.613 Ac Glutámico(Glu) 34.599 0.643 Histidina (His) 34.863 0.648 Glutamina (Gln) 35.578 0.662 Glicina (Gly) 35.914 0.668 Arginina (Arg) 38.610 0.718 + Amonio (NH4 ) 39.881 0.742 Treonina (Thr) 41.453 0.771 Alanina (Ala) 43.773 0.814 Prolina (Pro) 47.865 0.890 Ac γ-Aminobutírico (GABA) 49.809 0.925 Ácido α-Aminobutírico (PI) 53.772 1.000 Cisteina (Cys) 57.716 1.073 Tirosina (Tyr) 60.323 1.122 Valina (Val) 64.239 1.195 Metionina (Met) 65.736 1.222 Ornitina (Orn) 67.124 1.248 Lisina (Lys) 69.727 1.297 Isoleucina (Ileu) 75.565 1.405 Leucina (Leu) 76.346 1.420 Fenilalanina (Phe) 77.165 1.435 Triptófano (Trp) 77.883 1.448 AMQ: derivado de la hidrólisis del reactivo AQC que tiene lugar durante la reacción de derivatización (Figura 1.8 de “Introducción”) 2.2.7. Cuantificación La cuantificación se llevó a cabo utilizando un patrón interno. Para ello se construyeron rectas de calibrado tomando los cocientes entre las áreas de los picos de 40 Materiales y Métodos cada compuesto y la del patrón interno frente a la concentración de cada compuesto en la mezcla prederivatización. Como se señaló en el apartado 2.2.3, para realizar las rectas de calibrado de los aminoácidos se tomaron diferentes volúmenes de la mezcla “patrón 3”, cuyas concentraciones se muestran en la Tabla 3.2 del apartado 3.2.2 de “Resultados y Discusión”. Para el caso del ión amonio y debido a que los estándares de aminoácidos contienen como impureza ión amonio, se preparó de forma independiente una disolución “patrón 3” que contenía sólo dicho compuesto, a partir de la cual, tomando diferentes volúmenes, se construyó la recta de calibrado del amonio. Las rectas de calibrado se construyeron inyectando por duplicado los distintos niveles de concentración, previa derivatización también por duplicado. 2.2.8. Límites de detección y cuantificación Dado un método analítico determinado, se entiende por límite de detección (LDD) la mínima concentración o cantidad de analito presente en la muestra que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo las condiciones experimentales descritas; y por límite de cuantificación (LDC) la mínima concentración o cantidad de analito en la muestra que se puede cuantificar, bajo dichas condiciones experimentales, con una adecuada precisión y exactitud. Existen diferentes formas de determinar los límites de detección y cuantificación dependiendo si el procedimiento es no-instrumental o instrumental (ICH, 1996): • Basados en una evaluación visual • Basados en la señal/ruido • Basados en la desviación estándar de la respuesta y la pendiente • Basados en la extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero En nuestro caso, los límites de detección y cuantificación fueron determinados por el método basado en la relación señal/ruido. Este método, uno de los más conocidos y empleados, requiere que el procedimiento de análisis sea instrumental y que proporcione una señal blanco, un ruido de fondo o una línea de base, es decir una señal residual a concentración cero del analito tal como ocurre en los métodos cromatográficos. Para estimar los límites de detección y cuantificación en estos casos se han propuesto estrategias basadas en la medida de la magnitud del ruido y de la altura de los picos de los analitos. Generalmente se define el límite de detección como la concentración que origina una señal/ruido (S/R), igual a un determinado valor, que generalmente es 3. Análogamente, el límite de cuantificación corresponde a una relación S/R de 10. Así pues, en la práctica fue preciso medir la magnitud del ruido, multiplicar su valor por el factor elegido y convertirlo en una concentración mediante la recta de calibrado. Para estimar la magnitud del ruido se realizaron mediciones sobre la línea base de un cromatograma obtenido con un blanco, midiéndose su amplitud, es decir la diferencia entre el valor máximo y el mínimo. 41 Materiales y Métodos Debido a que no es posible encontrar en nuestro caso muestras “blancas”, es decir muestras de vino o vinagre sin aminoácidos, para la elaboración del blanco se realizó la reacción de derivatización sobre una disolución acuosa que contenía exclusivamente el patrón interno. 2.2.9. Estudios de precisión El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad del método de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Como consecuencia de la existencia de estos errores, los análisis efectuados sobre muestras idénticas, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a resultados idénticos. Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos, tiempo, etc.) de aquí la importancia del estudio de la precisión. La precisión es una medida del grado de separación o dispersión entre las medidas realizadas empleando un método analítico y trabajando en condiciones normales de operación. Se expresa normalmente como porcentaje de desviación estándar relativa (DER) o coeficiente de variación (CV). La precisión debe evaluarse a tres niveles: repetitividad, precisión intermedia y reproducibilidad. La repetitividad es una medida del grado de dispersión de una serie de medidas realizadas en un espacio de tiempo corto (en un mismo día). La precisión intermedia es una medida de la dispersión de los resultados obtenidos por un método analítico en un espacio de tiempo más amplio que la repetitividad, modificando ciertas condiciones de operación: diferentes días, analistas, equipos, etc. Por último, la reproducibilidad expresa la precisión entre laboratorios, formando parte de los estudios interlaboratorio. Para cumplir los objetivos marcados en el presente trabajo, la precisión fue evaluada a dos niveles: repetitividad y precisión intermedia. Se determinó tanto para el método analítico como para el proceso de derivatización. La medida de precisión, expresada como coeficiente de variación (CV), se determinó mediante la expresión: % CV = (s/x) × 100 Donde s y x representan los valores de desviación estándar y valor medio de una serie de medidas repetidas. Para los estudios de precisión se utilizó una muestra de vinagre diluida al 15% enriquecida con una concentración de 250 µg/L de cada patrón . a) Repetitividad 42 Materiales y Métodos • Repetitividad del proceso de derivatización: Para llevar a cabo la repetibilidad del proceso de derivatización se realizaron 5 derivatizaciones de la muestra diluida inyectando cada una por duplicado en la misma sesión de trabajo. • Repetitividad del método analítico: En este caso se realizaron 5 replicados de la muestra derivatizada en una única sesión de trabajo. b) Precisión intermedia • Precisión intermedia del proceso de derivatización: Para la precisión intermedia del proceso de derivatización se realizaron 5 derivatizaciones de la muestra diluida en 5 sesiones de trabajo diferentes, a lo largo de un periodo de 25 días, inyectando cada una de ellas por duplicado. • Precisión intermedia del método analítico: En el caso de la precisión intermedia del método se analizó la muestra derivatizada en 5 sesiones de trabajo a lo largo de un periodo de 7 días. 2.2.10. Estudios de recuperación La exactitud se evaluó mediante los estudios de recuperación. Para llevar a cabo dichos estudios se realizó la adición de patrones a una muestra de vinagre diluida al 15% a tres niveles de concentración: Nivel 0 = 250 µg/L, Nivel 1 = 300 µg/L, Nivel 2 = 350 µg/L. Estas concentraciones se eligieron por estar dentro del intervalo de linealidad de los distintos patrones. La adición se llevó a cabo en la mezcla prederivatización del siguiente modo: • Nivel 0: Se tomaron 125 µL de la muestra de vinagre diluida, 125 µL de la mezcla enriquecimiento y 50 µL de la disolución “patrón 2” del PI, y se diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5 mL, obteniéndose una concentración de 250 µg/L de cada patrón. (En el apartado 2.2.3 se explica como se preparó la mezcla enriquecimiento). • Nivel 1: Se tomaron 125 µL de la muestra de vinagre diluida, 250 µL de la mezcla enriquecimiento y se diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5 mL, obteniéndose una concentración de 300 µg/L de cada patrón. • Nivel 2: Se tomaron 125 µL de la muestra de vinagre diluida, 375 µL de la mezcla enriquecimiento y se diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5 mL, obteniéndose una concentración de 350 µg/L de cada patrón. Posteriormente se llevó a cabo la reacción de derivatización de los diferentes niveles por duplicado y se inyectó en el cromatógrafo 20 µl de cada duplicado. 43 Materiales y Métodos 2.2.11. Estudio de dilución de las muestras Dada la elevada sensibilidad del método fue necesario diluir las muestras. Con objeto de determinar la dilución óptima de las mismas se realizaron diferentes diluciones en agua tanto para vino como vinagre: 5, 15, 25, 35 y 50%. 2.3. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS Con objeto de establecer si existen o no diferencias significativas entre las muestras se aplicó el análisis de la varianza (ANOVA), usando el programa informático STADISTICA 99, versión 5.5. 44 Resultados y Discusión 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS Se partió de las condiciones cromatográficas recomendadas en el método original para vinos (Hernández-Orte et al., 2003): - Fases móviles: acetato sódico 0.14 M a pH 4.92 y 5.15, acetonitrilo y agua Milli-Q. Flujo: 1 mL/min. Temperatura de la columna: 34ºC. Detección: fluorescencia con λex de 250 nm y λem de 395nm. La resolución entre los picos correspondientes a la parte inicial y final del cromatograma obtenido de la disolución patrón no era satisfactoria por lo que se hicieron varias modificaciones en el gradiente hasta conseguir la mejor resolución. Las fases móviles y el gradiente definitivo aparecen en la Tabla 2.4 de “Materiales y Métodos”. El resto de las condiciones se mantuvieron igual que en el método original. En la Figura 3.1. se muestra un cromatograma de una disolución de patrones en las condiciones óptimas del método. Figura 3.1. Cromatograma de una disolución de patrones en las condiciones óptimas del método. R: AMQ (Producto de la hidrólisis del reactivo); 1: Asp; 2: Asn; 3: Ser; 4: Glu; 5: His; 6: Gln; 7: Gly; 8: Arg; 9: Amonio; 10: Thr; 11: Ala; 12: Pro; 13: GABA; 14: Cys; 15: Tyr; 16: Val; 17: Met; 18: Orn; 19: Lys; 20: Ileu; 21: Leu; 22: Phe; 23: Trp. 45 Resultados y Discusión Una vez establecidas las condiciones cromatográficas se llevó a cabo la validación del método. 3.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO La definición ISO (International Standars Organization) de validación aplicada a los métodos analíticos podría interpretarse como el proceso mediante el cual queda establecido, por estudios experimentales, que la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica requerida. Existe una gran variedad de documentación acerca de la validación de los métodos analíticos (Huber, 1998; AEFI, 2001; ICH, 1996), especialmente para métodos concretos (Filipe-Ribeiro y Mendes-Faia, 2006), y numerosas organizaciones promueven su difusión e importancia, como la AOAC (Association of Official American Chemists), EPA (Environmental Protection Agency), FDA (Food and Drug Administration), ICH (International Conference on Harmonization), USP (United States Pharmacopeia), EURACHEM (European Analytical Chemistry), etc. La validación de la metodología propuesta se realizó siguiendo las recomendaciones de la ICH y EURACHEM publicados en guías para la validación de métodos y procedimientos analíticos (EURACHEM, 1993; ICH, 1996). La validación lleva consigo la evaluación de varios parámetros del método como la selectividad, exactitud (estudios de recuperación), precisión, linealidad de la respuesta del detector frente a la concentración, sensibilidad, así como límites de detección y cuantificación (Huber, 1998). 3.2.1. Especificidad o selectividad Ambos términos se utilizan con frecuencia indistintamente, aún siendo conceptos diferentes. Para los métodos cromatográficos, la especificidad es la capacidad del método para medir con exactitud la respuesta de un analito en presencia de todos los posibles componentes de una muestra, mientras que el término selectividad se refiere a un método que proporciona respuestas para un número de entidades químicas que pueden o no ser distinguidas de otras. Si la respuesta se distingue de todas las demás, se dice que el método es selectivo. Por tanto, el término adecuado en nuestro caso es selectividad (Huber, 1998). La selectividad se determinó en un sustrato vínico y en muestras de vinagre tomándose como criterio que los picos adyacentes correspondientes a los analitos tuvieran una resolución de al menos 1.5 respecto a los picos restantes. Cuando se calcula la resolución en el sustrato vínico y vinagre todos los aminoácidos presentan resoluciones superiores a 1. En el sustrato vínico (Tabla 3.1 “Resolución A”), de todos los pares de picos, 16 tienen valores superiores a 2 y sólo tres entre 1 y 1.5 (resolución entre Ser-Glu, Glu-His y NH4+). Por otro lado, la resolución de los picos en las 46 Resultados y Discusión muestras de vinagre (Tabla 3.1 “Resolución B”) también fueron para casi todos los pares de picos superiorres a 1.5 y sólo para dos de ellos entre 1.1 y 1.5 (resolución entre Glu-His y Arg-NH4+). Tabla 3.1. Resolución de los picos cromatográficos Compuesto Asp tR (min) 30.414 Ser 32.938 Glu 34.599 His 34.863 Gly 35.914 Arg 38.610 NH4+ 39.881 Thr 41.453 Ala 43.773 Pro 47.865 GABA 49.809 AABA(PI) 53.772 Tyr 60.323 Val 64.239 Met 65.736 Orn 67.124 Lys 69.727 Ileu 75.565 Leu 76.346 Phe 77.165 Resolución A Resolución B 3.2 3.0 1,2 2,8 1,1 1.33 1,5 1,7 3,6 4,0 1,7 1,2 1,1 2,0 3,5 2,6 5,7 4,6 2,9 1,6 4,5 5,1 8,4 8.0 5,0 5,5 2,4 2,0 2.0 3,4 2,8 3,6 7,3 8,6 2,1 1,8 2,2 2.0 Resolución A: Valores de resolución calculados en el sustrato vínico diluido al 25% Resolución B: Valores de resolución calculados en muestras de vinagre diluidas al 25%. 3.2.2. Linealidad La linealidad de un procedimiento analítico se define como su capacidad (dentro de un intervalo) para obtener resultados que sean directamente proporcionales (o por 47 Resultados y Discusión medio de ecuaciones matemáticas) a la concentración (cantidad) de analito en la muestra. Para determinar la linealidad se tomó el área relativa de los picos de cada uno de los aminoácidos estudiados y amonio a diferentes niveles de concentración (entre 5 y 9), dentro del intervalo esperable en las muestras de vinagre, vino y sustratos de partida para los procesos de acetificación una vez que hayan sido diluidas convenientemente para su análisis (al 25%). Los ensayos se realizaron por duplicado. En la Tabla 3.2 aparece el intervalo de concentración lineal, los niveles de concentración, la ecuación de regresión lineal de la concentración frente a la respuesta del detector y el coeficiente de regresión lineal de cada compuesto. Se observó una adecuada linealidad obteniéndose en todos los casos unos coeficientes de correlación superiores a 0.992 en los intervalos de concentración indicados en dicha Tabla. Tabla 3.2. Rectas de calibrado de los aminoácidos y amonio determinado en vinagres Compuestos Intervaloa n* Ecuación r2 Asp 33.28 – 1663.75 7 y = 0.0003x - 0.0029 0.995 Asn 33.03 – 1651.50 7 y = 0.0003x + 0.0395 0.993 Ser 13.14 – 1313.63 7 y = 0.0004x + 0.069 0.992 Glu 18.39 – 1839.13 8 y = 0.0003x + 0.0093 0.999 His 19.40 – 1939.50 8 y = 0.0005x + 0.0325 0.997 Gln 18.27 – 1826.88 8 y = 0.0003x +0.0174 0.996 Gly 9.38 – 938.38 7 y = 0.0009x + 0.0205 0.998 Arg 21.80 – 2177.50 9 y = 0.0005x - 0.0006 0.999 NH4+ 4.5 – 112.5 5 y = 0.0035x + 0.7566 0.997 Thr 14.89 – 1489 8 y = 0.0006x + 0.0132 0.999 Ala 11.14 – 1113.63 8 y = 0.0008x + 0.0190 0.999 Pro 14.40 – 1439.13 8 y = 0.0003x - 0.0008 0.999 GABA 12.89 – 1289 9 y = 0.0007x + 0.0109 0.996 Cys 30.29 – 1514.50 8 y = 0.0001x + 0.0014 0.998 Tyr 45.30 – 2264.88 8 y = 0.0003x + 0.0060 0.999 Val 14.64 – 1464.38 8 y = 0.0009x + 0.0105 0.998 Met 18.65 – 1865.13 9 y = 0.0006x + 0.0021 0.999 Orn 16.52 – 1652 7 y = 0.0004x + 0.0225 0.998 Lys 36.55 – 1827.38 9 y = 0.0003x + 0.0104 0.999 Ileu 16.40 – 1639.75 9 y = 0.0011x + 0.0199 0.998 Leu 16.40 – 1147.82 8 y = 0.0013x - 0.0078 0.995 Phe 20.65 – 1445.41 7 y = 0.0013x + 0.0158 0.996 Trp 127.6 – 2552.8 5 y = 0.00004x + 0.0019 0.994 a Concentración en µg/L (referido a la mezcla prederivatización) * Niveles de concentración L.D.D.a L.D.C.a 25.15 16.5 14.0 13.91 35.1 26.14 6.42 45.73 5.07 0.92 0.20 36.61 10.21 17.4 33.81 17.82 26.11 24.24 14.35 7.53 16.39 32.12 110.37 53.99 33.00 28.52 35.84 70.05 52.27 14.74 62.05 16.90 2.11 9.61 64.40 21.87 34.8 55.96 25.92 39.75 60.59 43.86 14.35 31.55 83.51 280.78 3.2.3. Exactitud La exactitud de un método analítico es un parámetro que indica la cercanía de los resultados obtenidos por este método a un valor considerado como real. 48 Resultados y Discusión Existen varios procedimientos para determinar la exactitud de una metodología analítica: - Aplicación del procedimiento analítico a materiales de referencia certificados (MRC), cuya concentración de analito es conocida y comparación del valor medido con el valor certificado como real. - Comparación de los resultados obtenidos por la metodología propuesta con aquellos obtenidos mediante un método normalizado cuya trazabilidad es conocida. - Recuperación de cantidades conocidas de analito, obtenidas mediante el enriquecimiento de las muestras. La media de las réplicas indica el grado de exactitud del método. Para validar la exactitud de la propuesta metodológica, se optó, ante la ausencia de un MRC para este tipo de analitos en muestras de vinagres, por el enriquecimiento de las muestras. En nuestro caso, la recuperación media se calculó a partir de los valores obtenidos al inyectar por duplicado una muestra de vinagre diluida al 15% enriquecida con todos los patrones a tres niveles de concentración: nivel 0 (250 µg/L), nivel 1 (300 µg/L) y nivel 2 (350 µg/L). Las recuperaciones así obtenidas se presentan en la Tabla 3.3. Tabla 3.3. Ensayo de recuperación en una muestra de vinagre enriquecida con aminoácidos y amonio a tres niveles de concentración. Compuesto Asp Asn Ser Glu His Gln Gly Añadido (µ µg/L) Recuperado (%) Recuperación Media (%) 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 77.5 73.5 77.04 92.2 86.7 91.5 52.9 68.5 71.6 89.7 84.8 90.9 84.5 82.4 82.3 103.5 102.1 102.5 79.0 80.2 81.6 76.0 90.1 64.35 88.5 88.5 102.7 80.3 49 Resultados y Discusión Tabla 3.3. Ensayo de recuperación en una muestra de vinagre enriquecida con aminoácidos y amonio a tres niveles de concentración (continuación) Compuesto Arg NH4+ Thr Ala Pro GABA Cys Tyr Val Met Orn Lys Ileu Leu Phe Trp Añadido (µ µg/L) Recuperado (%) Recuperación Media (%) 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 250 300 350 85.0 75.3 83.4 82.74 86.7 90.2 92.6 87.8 89.7 91.1 78.1 92.1 86.4 73.8 87.8 106.9 105.3 106.6 52.8 46.2 59.9 90.9 91.4 93.5 89.1 85.8 84.8 91.7 91.3 90.9 69.7 83.1 86.0 84.5 85.9 90.2 88.1 86.3 88.2 78.1 82.5 84.7 86.2 92.2 94.5 68.8 88.3 82.8 81.22 86.6 90.1 87.11 82.7 106.3 53.0 91.9 86.5 91.3 79.6 86.9 87.6 81.8 91.0 80.0 50 Resultados y Discusión Según el manual de la AOAC (Huber, 1998), para concentraciones entre 1 ppm y 100 ppb las recuperaciones deben ser entre el 80 y 110%. En nuestro caso, para casi todos los aminoácidos las recuperaciones fueron superiores al 80%, y por tanto están de acuerdo con los valores propuestos por la AOAC. Únicamente serina y cisteína mostraron recuperaciones más bajas, pero, coincidiendo con Valero et al. (2005), en las muestras de vinagre este aminoácido se encuentra en pequeña concentración e incluso, no se consigue determinar. Además, en muchos trabajos de investigación se ha comprobado que la cisteína también se encuentra en muy pequeña concentración, incluso no detectable, en muestras de vino (Hernández-Orte et al., 2003; Pripis-Nicolau et al., 2001; Puig-Deu y Buxaderas, 1994; Botella et al, 1990). Sin embargo, en los vinagres de Jerez tradicionales si se ha podido determinar este aminoácido con una concentración media de 10 mg/L (Palacios et al., 2002). 3.2.4. Límites de detección y cuantificación Los límites de detección y cuantificación se determinaron según la relación señal/ruido (S/R) tal como se explicó en el apartado 2.2.8 de “Materiales y Métodos”. Los resultados obtenidos, mostrados en la Tabla 3.2, fueron una media de diez veces superiores a los obtenidos por Hernández-Orte et al. (2003) para casi todos los aminoácidos y amonio excepto para la treonina y alanina. Los límites de detección oscilaron entre 0.20(Ala)-45.73(Arg) µg/L y los límites de cuantificación entre 2.11 (Thr) –70.05 (His) µg/L, excepto para el caso del triptófano, el cual tuvo unos límites superiores (LDD: 110.37 µg/L y LDC: 280.75 µg/L). Estos valores demostraron que el método era suficientemente sensible para determinar los aminoácidos y amonio presentes en las muestras de vinagre de vino. 3.2.5. Estudios de precisión Para cumplir los objetivos marcados en el presente trabajo, la precisión fue evaluada a dos niveles: repetitividad y precisión intermedia. Se determinó tanto para el método analítico como para el proceso de derivatización. (En el apartado 2.2.9 de “Materiales y Métodos” se explica como se determinó la repetitividad y la precisión intermedia). c) Repetitividad y precisión intermedia del método analítico Los valores de repetitividad obtenidos, medidos como CV, variaron entre 0.2 para la arginina y el amonio y 11.6 para la asparagina (Tabla 3.4). Estos valores están de acuerdo con los propuestos por el manual de la AOAC (Huber, 1998), donde para concentraciones comprendidas entre 1 ppm y 100 ppb se aceptan unos coeficientes de variación entre 11 y 15%. 51 Resultados y Discusión La precisión intermedia del método analítico se realizó durante 5 sesiones de trabajo mediante la medida de la muestra derivatizada, la cual se repitió cinco veces. En la Tabla 3.4 se muestran los valores de precisión intermedia expresados como coeficiente de variación (CV). Estos valores variaron en un intervalo de entre 0.3 (leucina) y 13.9 (asparagina). Tabla 3.4. Repetitividad y precisión intermedia del método analítico Compuestos Asp Asn Ser Glu His Gln Gly Arg NH4+ Thr Ala Pro GABA Cys Tyr Val Met Orn Lys Ileu Leu Phe Trp a Repetitividad (n = 5) Mediaa C.V. (%) 350.1 3.2 142.3 11.6 207.4 1.5 522.0 1.4 297.8 2.6 270.8 1.8 324.7 0.5 545.6 0.2 222.2 0.2 311.0 2.8 395.3 1.2 639.8 1.3 333.6 6.9 132.0 5.6 330.0 2.8 306.4 2.1 240.2 2.8 260.7 0.6 392.3 1.9 262.7 1.5 315.8 1.7 349.3 4.4 172.1 1.7 Precisión Intermedia (n = 5) Mediaa C.V. (%) 402.1 8.3 142.3 13.9 294.1 0.9 532.3 3.3 283.3 1.4 281.0 0.9 416.9 3.2 526.0 2.4 178.1 0.8 472.9 0.9 467.4 2.3 691.8 2.6 297.1 1.2 188.2 4.8 375.7 2.4 325.7 0.9 225.2 3.5 292.2 1.1 361.7 3.3 266.8 0.6 320.7 0.3 363.9 1.5 170.4 1.1 Media de la concentración en µg/L (referido a la mezcla prederivatización) d) Repetitividad y precisión intermedia del proceso de derivatización En la Tabla 3.5 se muestran los valores de repetitividad y de precisión intermedia, expresados como coeficientes de variación. Los valores encontrados para la repetitividad oscilaron entre 0.1 para el amonio y 12.5 para la fenilalanina. Para la precisión intermedia del proceso de derivatización se realizaron 5 derivatizaciones de la muestra diluida en 5 sesiones de trabajo diferentes inyectando cada una de ellas por duplicado. Los valores obtenidos variaron entre 0.1 para el amonio y 12.8 para la glicina. Estos valores junto con los de la repetitividad están de acuerdo con los propuestos por Huber (1998). 52 Resultados y Discusión Tabla 3.5. Repetitividad y precisión intermedia del proceso de derivatización Compuestos Asp Asn Ser Glu His Gln Gly Arg NH4+ Thr Ala Pro GABA Cys Tyr Val Met Orn Lys Ileu Leu Phe Trp a Repetitividad (n = 5) Mediaa C.V. (%) 343.5 0.3 154.1 8.9 217.4 0.6 504.8 0.5 255.7 3.4 225.0 0.4 307.9 4.9 515.3 0.2 225.6 0.1 313.7 1.7 380.5 1.7 629.8 4.8 368.8 0.6 193.8 8.1 377.0 2.7 378.9 6.8 282.7 2.7 267.0 0.7 349.6 1.4 275.3 2.0 320.2 0.4 324.6 12.5 151.1 6.9 Precisión Intermedia (n = 5) Mediaa C.V. (%) 316.0 1.8 145.2 5.3 193.1 2.2 478.1 9.8 249.3 7.0 212.5 2.1 328.2 12.8 507.0 5.2 225.6 0.1 307.4 5.8 410.8 7.4 653.9 1.4 338.0 0.4 160.5 5.6 390.7 8.1 320.8 0.8 278.4 3.3 293.4 8.1 362.7 4.6 280.8 4.7 322.7 2.4 360.7 1.7 155.2 6.9 Media de la concentración en µg/L (referido a la mezcla prederivatización) 3.3. ELECCIÓN DE LA DILUCIÓN ÓPTIMA DE LAS MUESTRAS Dada la elevada sensibilidad del método fue necesario diluir las muestras de vinagre. Con objeto de determinar la dilución óptima de las mismas se realizaron diferentes diluciones (5, 15, 25, 35 y 50%) tanto para sustrato vínico como vinagre (apartado 2.2.10 de “Materiales y Métodos”). Para este estudio se empleó un sustrato vínico con elevada acidez volátil (0.9º acético/100 mL), el cual se utilizó posteriormente como sustrato en la acetificación de las muestras de vinagre analizadas, y un vinagre de Jerez. El sustrato vínico contenía todos los aminoácidos menos la asparagina y glutamina; y el vinagre de Jerez además de éstos carecía de cisteína y metionina. Después de valorar las concentraciones de aminoácidos y amonio esperables en las muestras de vinagre y los intervalos de linealidad de dichos compuestos en vino y en vinagre, se optó por una dilución del 25%, la cual permitirá cuantificar los aminoácidos y el amonio tanto en sustratos vínicos como en vinagres. Además comprobamos que las diluciones ensayadas mostraron una adecuada linealidad (Tabla 3.6) obteniéndose unos coeficientes de correlación aceptables. 53 Resultados y Discusión Tabla 3.6. Linealidad de las muestras diluidas Compuestos Asp Asn Ser Glu His Gln Gly Arg NH4+ Thr Ala Pro GABA Cys Tyr Val Met Orn Lys Ileu Leu Phe Trp Vino picado Intervalo r2 de dilución 25-50 % 0.991 n.d. n.d. 15-50% 0.990 15-50% 0.943 15-50% 0.874 n.d. n.d. 15-50% 0.987 15-5% 0.934 25-50% 0.877 15-50% 0.920 15-50% 0.962 15-50% 0.933 15-50% 0.932 15-50% 0.993 15-50% 0.934 15-50% 0.950 15-50% 0.983 15-50% 0.950 15-35% 1.000 15-50% 0.994 15-50% 0.992 15-50% 0.996 n.d. n.d. Vinagre de Jerez Intervalo r2 de dilución 5-50% 0.999 n.d. n.d. 5-50% 0.981 5-50% 0.999 5-50% 0.994 n.d. n.d. 5-50% 0.985 5-50% 0.999 5-50% 0.809 5-50% 0.987 5-50% 0.998 5-50% 0.999 5-50% 0.999 n.d. n.d. 5-50% 0.993 5-50% 0.990 n.d. n.d. 5-50% 0.998 5-50% 0.994 5-50% 0.993 5-50% 0.999 15-50% 0.996 15-50% 0.998 3.4. APLICACIÓN DEL MÉTODO A MUESTRAS DE VINAGRE Por último, tras la validación del método sólo queda aplicarlo a muestras reales y de características diferentes descritas en el apartado 2.1.1 de “Materiales y Métodos”. Al objeto de comprobar la validez del método y llevar a cabo un seguimiento de los aminoácidos durante los procesos de acetificación, se analizaron un total de 36 muestras de diferentes características. En el “Anexo” (Tablas de la 1 a la 12) aparecen los valores medios obtenidos en las muestras para cada aminoácido y amonio acompañados de sus desviaciones estándares. 3.4.1. Consumo de nitrógeno total El consumo de nitrógeno total en los procesos de acetificación estudiados fue evaluado considerando conjuntamente el nitrógeno aportado por los aminoácidos libres y el procedente del amonio. 54 Resultados y Discusión Al inicio de la fermentación las muestras del sustrato F tenían una cantidad de nitrógeno entre 84.7 y 120.2 mg/L, y las del sustrato T entre 174.1 y 196.5 mg/L. El descenso total del contenido de nitrógeno en todas las acetificaciones estudiadas oscila entre 7.3-52%. Las acetificaciones duraron 5-9 meses para las muestras del sustrato T y 1.5-2.5 meses para las del F, comenzando, ambas, en el mes de Agosto. Las primeras se llevaron a cabo en bodega y las del sustrato F al aire libre. En el caso del sustrato T, coincide el menor consumo con el periodo de tiempo de acetificación más corto (5 meses) y parece existir una relación entre consumo de nitrógeno y tiempo invertido en la acetificación. Comparando 4 acetificaciones en las muestras del sustrato F (Figura 3.2), los descensos oscilaban entre 17.3-33.2%. 120 N (mg/L) 100 80 I F 60 40 20 0 A B C D Figura 3.2. Descenso del contenido de nitrógeno en las muestras del sustrato F En las muestras del sustrato T (Figura 3.3) los descensos oscilaron entre 2052.0%. Todas las acetificaciones de este sustrato mostraron descensos mayores a los obtenidos en el sustrato F, probablemente debido a la mayor duración del proceso de acetificación en el sustrato T que conlleva un mayor requerimiento de nitrógeno por parte de las bacterias acéticas. 250 N (mg/L) 200 150 I 100 F 50 0 A B C D Figura 3.3. Descenso del contenido de nitrógeno en las muestras de Tarragona 55 Resultados y Discusión Comparando los dos sustratos, F y T, se observa que los descensos menores se producen en el mismo sistema de acetificación (CL). Por otro lado, en el sustrato F también se compararon las acetificaciones “CK”, “CL” y “CM” (Figura 3.4) siendo la acetificación “CK” la que presentó un mayor descenso seguido por la “CM”. Se obtuvo un descenso mucho menor en la “CL”. Podríamos decir que “CK” y “CM” se asemejan más en cuanto al consumo de nitrógeno. 200 N (mg/L) 150 I 100 E 50 0 CK CL CM Figura 3.4. Comparación de las acetificaciones “CK”, “CL” y “CM” en cuanto al descenso de nitrógeno en las muestras del sustrato F Para el sustrato T se estudiaron las acetificaciones “DK”, “DL” y “DM” (Figura 3.5) . En este caso “DK” y “DL” mostraron descensos elevados del orden del 50% y por el contrario, el descenso de “DM” fue mucho menor, siendo, además, el menor de todos los obtenidos en todas las muestras analizadas, tanto las T como las F. Por tanto, como se puede observar, las acetificaciones se completan con consumos muy diferentes de nitrógeno total en las mismas condiciones ambientales. 56 Resultados y Discusión 250 200 mg/L 150 I F 100 50 0 DK DL DM Figura 3.5. Comparación de las acetificaciones “DK”, “DL” y “DM” en cuanto al descenso de nitrógeno en las muestras del sustrato T Aplicando el tratamiento estadístico del análisis de la varianza (ANOVA) al cambio en el contenido total de nitrógeno se demostró que todos los descensos observados resultaron ser estadísticamente significativos. 3.4.2. Evolución en el perfil de aminoácidos libres y amonio En todas las muestras iniciales (F y T) el aminoácido mayoritario fue la prolina, seguido de la arginina, coincidiendo con lo observado por otros autores (Herbert et al., 2000; Soufleros et al., 2003; Hernández-Orte et al., 2003). Estos altos contenidos de prolina al inicio de la fermentación acética se deben a la dificultad con la que las levaduras metabolizan este aminoácido durante la fermentación alcohólica, por lo que las cantidades de prolina en los vinos son similares a la de los correspondientes mostos (Hernández-Orte et al., 2003). La prolina aportó en las muestras del sustrato F un 34.7% del contenido de nitrógeno inicial y en las del sustrato T un 49.9% y la arginina aportó un 20% en las muestras F y un 14% en las T (Figura 3.8). Por otro lado, en ninguna de las muestras se detectó la asparagina, glutamina, cisteína y triptófano, coincidiendo este último con lo descrito en la bibliografía (Llaguno y Polo, 1991b; Valero et al. 2005). Según lo observado por Hernández-Orte et al., (2003), durante la fermentación alcohólica de los vinos el nivel de aminoácidos decrece, llegando en algunos casos, como la cisteína, a consumirse totalmente. Durante la fermentación se produjeron modificaciones en el contenido de aminoácidos y amonio, dándose descensos importantes y en otros ligeros aumentos. De forma general, se observaron descensos estadísticamente significativos en la mayoría de los casos para: prolina, metionina, aspártico, amonio, glicina, arginina, isoleucina, tirosina y leucina. Los dos primeros, prolina y metionina, descendieron en todos las acetificaciones, siendo estos descensos estadísticamente significativos. En el caso del aspártico los descensos fueron estadísticamente significativos en 9 de las 12 acetificaciones estudiadas. Por otro lado se constataron ligeros aumentos no significativos para la serina, histidina y glutámico. En todas las acetificaciones del sustrato F (Figura 3.6) se observaron descensos estadísticamente significativos en los siguientes compuestos: prolina (descenso medio: 75%) y metionina (66%). También disminuyeron en la mayoría de los casos (siempre en las acetificaciones “AL” y “BL”): aspártico, gamma-aminobutírico, amonio, alanina, 57 Resultados y Discusión isoleucina y arginina. Por tanto, en las muestras del sustrato F el aminoácido que presenta el descenso más marcado es la prolina. Por otro lado, el ácido glutámico aumentó en todos las acetificaciones. También presentan tendencias al aumento en la mayoría de los casos la ornitina, valina, y fenilalanina. Estos aumentos no fueron estadísticamente significativos en ninguno de los casos. Para el resto de los aminoácidos no se puede indicar una tendencia clara en los procesos estudiados. 300 250 mg/L 200 I 150 F 100 50 PH E N H 4 LE U VA L M ET O R N LY S IL EU LY AR G TH R AL A PR O G AB A TY R H IS G G LU AS P SE R 0 Figura 3.6. Evolución de los aminoácidos y amonio en una muestra del sustrato F En todas las acetificaciones del sustrato T (Figura 3.7) se observaron descensos estadísticamente significativos en los mismos aminoácidos que en el sustrato anterior, prolina y metionina, y además en valina. También disminuyeron en la mayoría de los casos (siempre en las acetificaciones “AL”, “BL”, “DL” y “DK”) los aminoácidos leucina, tirosina, fenilalanina, alanina, aspártico, glicina, arginina, gammaaminobutírico e isoleucina, así como el amonio. Estos descensos producidos en los 4 procesos de acetificación fueron estadísticamente significativos salvo para la glicina. Además, en este caso, la ornitina y lisina también disminuyeron en la mayoría de los casos y al presentar contenidos iniciales bajos se llegaron a valores no detectables. En cuanto al ácido glutámico aumentó en la mayoría de las acetificaciones (12.3%), aunque también de forma no significativa como en las muestras F, y únicamente la serina, histidina y treonina no demostraron una tendencia clara en los procesos estudiados. 58 750 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 I F LE U PH E N H 4 AS P SE R G LU H IS G LY AR G TH R AL A PR O G AB A TY R VA L M ET O R N LY S IL EU mg/L Resultados y Discusión Figura 3.7. Evolución de los aminoácidos y amonio en una muestra del sustrato T Comparando la evolución de los aminoácidos y amonio en los dos tipos de muestras (F y T) podemos observar que muchos de ellos presentan la misma tendencia como el aspártico, prolina, gamma-aminobutírico, metionina, isoleucina, arginina, alanina, amonio (descienden) y glutámico (aumenta). Por otro lado, encontramos algunos aminoácidos con evoluciones diferentes como la leucina, fenilalanina, valina y glicina (en las muestras F no presentan una tendencia clara y en las T descienden mayoritariamente). En resumen, de todos los compuestos estudiados el que presenta el mayor descenso en todas las acetificaciones es la prolina. Si nos fijamos en el aporte de nitrógeno de cada aminoácido el de mayor consumo, en ambos casos, sigue siendo la prolina, observándose descensos del orden de 24.76 mg N/L en las muestras F y 43.4 mg N/L en las muestras T. Esta tendencia es contraria a la observada por otros autores (Valero et al., 2005) en cultivos sumergidos, donde la leucina es el aminoácido más consumido por las bacterias acéticas. En nuestro caso la leucina ocupó el séptimo y el noveno lugar en el orden de preferencia de las bacterias acéticas en las muestras F y T respectivamente (Figura 3.8 y 3.9). 59 Resultados y Discusión 28 1,6 24 1,4 1,0 16 0,8 12 0,6 8 0,4 Consumo de Prolina (mg N/L) 20 1,2 4 0,2 Escala Izquierda PRO LEU ILEU MET GABA NH4 ALA THR ARG GLY ASP 0 Escala Derecha Figura 3.8. Consumo de aminoácidos y amonio en función de la concentración de nitrógeno aportado en las muestras F . 5,0 50 4,5 40 3,5 3,0 30 2,5 2,0 20 1,5 1,0 10 0,5 NH4 PRO 0 Consumo de Prolina y amonio (mg N/L) 4,0 ASP GLY ARG THR ALA GABA TYR VAL MET ORN LYS ILEU LEU PHE Consumo del resto de aminoácidos (mg N/L) Consumo del resto de aminoácidos y amonio (mg N/L) 1,8 Escala Izquierda Escala Derecha Figura 3.9. Consumo de aminoácidos y amonio en función de la concentración de nitrógeno aportado en las muestras T. 60 Resultados y Discusión En los vinagres finales obtenidos el aminoácido mayoritario sigue siendo la prolina, pero ahora supone un 17% del total de aminoácidos frente al 45% que representaba en el sustrato de partida en las muestras F y un 57% frente al 62% inicial en las muestras T. Según lo descrito en la bibliografía (Valero et al., 2005; Palacios et al., 2002; Erbe y Brüeckner, 1998; Llaguno y Polo, 1991b) en todos los vinagres de vino la prolina es el aminoácido mayoritario, pudiéndose considerar la presencia de éste en el vinagre como un indicador de su procedencia vínica. A pesar de los cambios experimentados durante la acetificación el orden de abundancia del resto de aminoácidos se mantiene prácticamente igual al sustrato de partida tanto en las muestras F como en las T. 61 Conclusiones 4. CONCLUSIONES 1. Se ha adaptado y validado un método para la determinación de aminoácidos en vinagres de vino y vino en proceso de acetificación mediante Cromatografía de Líquidos empleando el agente 6-aminoquinolil-N-hidrosicuccinimidil carbamato (AQC), obteniéndose los siguientes resultados: - En cuanto a la selectividad, la resolución de los picos cromatográficos fue superior a 1.5 para la mayoría de aminoácidos. - Se obtuvo una adecuada linealidad con unos coeficientes de correlación superiores a 0.992. - El método demostró tener una alta sensibilidad, con unos límites de detección entre 0.20 (Ala) - 45.73 (Arg) µg/L y unos límites de cuantificación entre 2.11 (Thr) - 70.05 (His) µg/L, excepto para el caso del triptófano, el cual tuvo unos límites superiores (LDD: 110.37 µg/L y LDC: 280.75 µg/L). - Las recuperaciones fueron superiores al 80% para todos los aminoácidos excepto para serina y cisteína. - La precisión fue evaluada a dos niveles: repetitividad y precisión intermedia. Estos niveles se determinaron tanto para el método analítico como para el proceso de derivatización, obteniéndose en ambos casos unos coeficientes de variación acordes con los propuestos por el manual AOAC. 2. Dada la alta sensibilidad del método es necesario diluir las muestras. Después de valorar las concentraciones de aminoácidos y amonio esperables en las muestras tanto de vino como de vinagre y los intervalos de linealidad de dichos compuestos, se optó por una dilución del 25%. 3. Se han estudiado una serie de acetificaciones con cultivo superficial en madera, y en ellos se observaron descensos estadísticamente significativos del nitrógeno total. 4. En todas las muestras estudiadas, vinos y vinagres, el aminoácido más abundante es la prolina seguido de la arginina; no detectándose, por el contrario la asparagina, glutamina, cisteína y triptófano. De todos los compuestos estudiados el que las bacterias acéticas utilizan en mayor extensión es la prolina. 62 Conclusiones 5. Durante la acetificación con cultivo superficial se observaron en la mayoría de los casos descensos estadísticamente significativos para: prolina, metionina, aspártico, amonio, glicina, arginina, isoleucina, tirosina, y leucina. Los dos primeros, prolina y metionina, mostraron descensos estadísticamente significativos en todos las acetificaciones. 6. Ciertos aminoácidos como la leucina, fenilalanina, valina y glicina presentan evoluciones diferentes, ya que en las muestras F no presentan una tendencia clara y en las T descienden mayoritariamente. 7. Los cambios en la concentración de aminoácidos y amonio a lo largo de la acetificación no suponen una alteración en el orden de abundancia de los mismos en los dos tipos de sustratos. 63 Bibliografía 6. BIBLIOGRAFIA ABE, I.; MINAMI, H.; NAKAO, Y.; NAKAHARA, T. (2002). N-pivaloyl methyl ester derivatives of amino acids for separation of enantiomers by chiral-phase capillary gas chromatography. Journal of Separation Science 25, 661-664. 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Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación AL del sustrato F Muestras de Vinagre FALi a, FALm FALf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 31.705 a 0.005 25.505 0.07 18.453 b 0.005 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 14.414 a 0.022 32.083 0.024 7.123 a Glu 39.410 a 0.003 41.288 0.001 40.341 a His 14.331 a 0.011 18.358 0.013 14.034 a 0.002 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 18.506 a 0.019 23.196 0.019 13.833 a 0.009 Arg 61.062 a 0.002 55.821 0.012 53.458 b 0.006 NH4+ 11.186 a 0.085 6.499 0.065 10.612 a 0.110 Thr 12.758 a 0.005 14.267 0.005 10.533 a 0.004 Ala 32.923 a 0.010 31.355 0.000 26.912 a 0.018 Pro 291.142a 0.006 106.074 0.009 93.971 b 0.000 GABA 11.457 a 0.001 9.249 0.003 8.796 a 0.001 Cys n.d. - n.d. - n.d. - 0.006 0.001 Tyr 14.580 a b 0.002 20.756 0.005 12.361 Val 17.570 a 0.008 20.821 0.007 9.149 b 0.006 Met 2.138 a 0.000 0.936 0.001 0.548 b 0.000 Orn 5.864 a 0.007 13.187 0.026 6.675 a 0.000 Lys 25.676 a 0.002 28.113 0.000 24.770 a 0.002 Ileu 6.164 a 0.004 7.132 0.005 5.009 b 0.003 Leu 19.019 a 0.005 16.802 0.002 14.472 b 0.010 Phe 17.952 a 0.007 16.826 0.008 14.826 b 0.013 Trp n.d. - n.d. - n.d. 0.001 - b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. . 71 Anexo Tabla 2. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación BL del sustrato F Muestras de Vinagre Compuestos FBLm FBLf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 20.420 a 0.006 18.040 0.001 17.511 a 0.005 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 0.185 a 0.000 10.619 0.012 18.011 a 0.031 Glu 28.116 a 0.008 45.892 0.004 50.790 b 0.002 His 16.039 a 0.008 12.512 0.004 17.823 a 0.010 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 14.480 a 0.000 14.879 0.006 16.323 a 0.026 Arg 60.948 a 0.031 52.284 0.002 53.439 a 0.005 NH4 a, FBLi + 13.793 a 0.092 3.041 0.084 8.973 a 0.045 Thr 9.966 a 0.001 10.678 0.002 11.182 a 0.005 Ala 33.442 a 0.006 26.546 0.007 27.458 a 0.020 Pro 255.196 a 0.043 95.429 0.004 68.596 b 0.000 GABA 14.201 a 0.000 9.353 0.001 11.334 a 0.024 Cys n.d. - n.d. - n.d. - Tyr 10.873 a 0.000 13.845 0.001 13.470 a 0.010 Val 9.035 a 0.000 8.895 0.002 11.876a 0.021 Met 1.726 a 0.000 0.619 0.000 0.544 b 0.001 Orn 3.346 a 0.003 3.971 0.001 6.915 a 0.016 Lys 26.602 a 0.006 24.768 0.001 25.337 a 0.000 Ileu 6.197 a 0.009 5.479 0.001 5.071 a 0.011 Leu 14.914 a 0.005 14.720 0.006 15.088 a 0.008 Phe 14.211 a 0.002 14.303 0.004 15.856 a 0.017 Trp n.d. - n.d. - n.d. - b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 72 Anexo Tabla 3. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CK del sustrato F Muestras de Vinagre Compuestos FCKi FCKm FCKf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 31.131 a 0.004 21.251 0.005 11.515 b 0.001 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 7.462 a 0.012 3.067 0.005 7.018 a 0.006 Glu 57.938 a 0.001 43.779 0.003 32.631 b 0.005 His 14.526 a 0.004 16.590 0.006 15.248 a 0.007 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 18.322 a 0.016 20.684 0.013 13.984 a 0.001 Arg 66.751 a 0.001 58.193 0.002 51.327 b 0.002 a 0.001 10.105 0.005 3.933 Thr 13.030 a 0.003 11.235 0.000 12.627 a 0.001 Ala 30.533 a 0.004 32.431 0.012 21.793 b 0.006 Pro 308.428a 0.000 129.703 0.003 76.723 b 0.007 GABA 15.884 a 0.003 9.130 0.009 7.872 b 0.001 Cys n.d. .- n.d. -. n.d - Tyr 19.493 a 0.003 16.435 0.005 15.420 a 0.004 Val 16.963 a 0.000 8.722 0.005 16.754 a 0.015 Met 2.115 a 0.001 0.688 0.001 0.400 b 0.000 Orn 4.824 a 0.004 4.103 0.004 4.667 a 0.004 Lys 28.904 a 0.008 27.071 0.002 27.387 a 0.001 Ileu 7.168 a 0.002 6.167 0.000 5.44 b 0.002 Leu 20.219 a 0.001 16.507 0.003 14.387 b 0.003 Phe 19.754 a 0.002 16.00 0.004 15.359 b 0.002 Trp n.d. - n.d. - n.d. - NH4 + 26.605 b 0.023 a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 73 Anexo Tabla 4. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CL del sustrato F Muestras de Vinagre Compuestos a, FCLi FCLm FCLf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 23.048 a 0.006 30.061 0.001 17.526 a 0.007 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 7.793 a 0.048 13.200 0.022 23.295 a 0.026 b 0.006 Glu 28.131 a 0.011 46.165 0.008 42.135 His 10.679 a 0.031 13.937 0.002 17.289 a 0.007 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 18.128 a 0.045 17.253 0.012 19.007 a 0.014 Arg 54.858 a 0.002 58.911 0.000 55.428 a 0.004 NH4+ 4.457 a 0.107 0.0222 10.245 a 0.034 Thr 11.722 a 0.012 14.290 0.007 12.706 a 0.005 Ala 24.496 a 0.029 25.195 0.030 29.126 a 0.008 Pro 267.840 a 0.012 135.289 0.002 43.500 b 0.010 GABA 12.807 a 0.003 4.858 0.002 9.207 b 0.003 Cys n.d - n.d. - n.d. - Tyr 11.966 a 0.003 20.093 0.002 16.372 b 0.003 Val 13.260 a 0.010 16.613 0.010 18.932 b 0.003 Met 1.864 a 0.001 0.413 0.001 0.700 b 0.000 Orn 5.624 a 0.016 6.945 0.003 10.170 a 0.012 Lys 22.475 a 0.002 29.124 0.003 24.974 b 0.002 Ileu 4.656 a 0.004 6.263 0.007 6.084 b 0.005 Leu 15.953 a 0.011 16.016 0.006 16.550a 0.010 Phe 14.751 a 0.000 16.289 0.015 17.483 b 0.014 Trp n.d. - n.d. - n.d. - 10.354 b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 74 Anexo Tabla 5. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CM del sustrato F Muestras de Vinagre Compuestos FCMi FCMm FCMf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 34.247 a 0.010 19.278 0.006 14.550 b 0.001 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 20.107 a 0.084 13.711 0.012 13.325 a 0.008 Glu 55.358 a 0.010 48.535 0.001 37.503 b 0.004 His 19.543 a 0.039 13.996 0.005 14.478 a 0.002 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 21.538 a 0.020 15.920 0.006 16.024 b 0.001 Arg 68.109 a 0.022 51.877 0.003 54.681 b 0.002 a 0.010 a 0.232 1.616 0.013 12.754 Thr 14.308 a 0.021 10.496 0.001 11.957 a 0.004 Ala 29.555 a 0.001 27.866 0.002 27.222 b 0.003 Pro 295.392a 0.151 109.143 0.004 75.687 b 0.017 GABA 15.275 a 0.034 9.684 0.004 7.560 a 0.015 Cys n.d. - n.d. - n.d. - Tyr 18.329 a 0.004 16.771 0.002 15.234 a 0.011 Val 16.920 a 0.000 8.093 0.005 8.294 b 0.005 Met 1.359 a 0.001 0.630 0.000 0.538 b 0.000 Orn 6.565 a 0.008 5.626 0.002 4.648 a 0.004 Lys 28.522 a 0.003 24.860 0.001 26.388 a 0.002 Ileu 7.144 a 0.005 5.212 0.008 5.092 b 0.001 Leu 19.307 a 0.187 14.672 0.004 14.596 a 0.019 Phe 18.376 a 0.018 14.492 0.009 14.857 a 0.014 Trp n.d. - n.d. - n.d. - NH4 + 27.453 a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 75 Anexo Tabla 6. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DL del sustrato F Muestras de Vinagre Compuestos a, FDLi FDLm FDLf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 35.109 a 0.003 15.363 0.006 21.423 b 0.007 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 24.576 a 0.008 8.935 0.010 17.948 a 0.026 Glu 44.096 a 0.004 46.734 0.010 48.882 a 0.011 His 18.373 a 0.004 14.342 0.003 16.089 a 0.010 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 21.926 a 0.013 14.936 0.008 16.581 a 0.021 Arg 60.534 a 0.039 53.728 0.006 55.312 a 0.013 NH4+ 12.993 a 0.126 0.467 0.015 10.381 a 0.158 Thr 14.098 a 0.005 12.091 0.004 12.345 a 0.005 Ala 34.005 a 0.002 27.077 0.006 28.665 a 0.035 Pro 277.259 a 0.089 116.911 0.011 70.918 b 0.009 GABA 4.276 a 0.047 10.152 0.002 9.058 a 0.025 Cys n.d. - n.d. n.d. - Tyr 18.484 Val a a 0.017 0.001 13.197 0.003 17.544 9.205 a 0.002 18.435 0.008 15.132 a 0.087 Met 1.494 a 0.001 0.742 0.000 0.624 b 0.001 Orn 7.794 a 0.011 3.736 0.003 6.292 a 0.009 Lys 25.744 a 0.005 25.189 0.004 28.442 a 0.003 Ileu 6.544 a 0.004 5.696 0.001 6.009 a 0.006 Leu 17.600 a 0.017 15.849 0.010 15.611 a 0.017 Phe 16.041 a 0.023 15.666 0.004 16.239 a 0.028 Trp n.d. - n.d. - n.d. - b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 76 Anexo Tabla 7. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación AL del sustrato T Muestras de Vinagre Compuestos TALi TALm TALf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 31.030 a 0.004 27.470 0.007 25.415 b 0.001 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 9.631 a 0.000 14.840 0.005 16.498 a 0.020 Glu 49.670 a 0.009 69.961 0.003 54.763 a 0.000 His n.d. a - 0.730 0.001 2.698 b 0.003 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 25.869 a 0.005 27.818 0.007 21.231 a 0.022 Arg 79.238 a 0.002 90.209 0.002 70.799 b 0.001 b 0.111 a 0.025 12.218 0.009 10.838 Thr 12.087 a 0.003 17.073 0.004 13.558 a 0.006 Ala 54.073 a 0.008 56.284 0.001 41.633 b 0.015 Pro 728.950a 0.053 637.734 0.006 394.449 b 0.003 GABA 24.790 a 0.001 31.422 0.002 23.826 a 0.009 Cys n.d. - n.d. - n.d. - Tyr 11.417 a 0.001 13.219 0.003 0.931 b 0.000 Val 20.441 a 0.007 30.847 0.003 2.983 b 0.003 Met 1.355 a 0.000 0.594 0.000 0.109 b 0.000 Orn 11.218 a 0.002 12.323 0.003 n.d. b - Lys 22.446 a 0.001 30.876 0.003 6.898 b 0.004 Ileu 8.081 a 0.001 8.356 0.003 5.029 b 0.006 Leu 16.418 a 0.006 18.080 0.003 2.914 b 0.009 Phe 18.584 a 0.007 17.521 0.015 8.628 b 0.002 Trp n.d. - n.d. - n.d. - NH4 + 24.501 a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 77 Anexo Tabla 8. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación BL del sustrato T Muestras de Vinagre Compuestos a, TBLi TBLm TBLf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 33.015 a 0.009 30.394± 0.003 22.775 b 0.000 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 19.481 a 0.003 26.047 0.001 13.364 b 0.008 Glu 45.175 a 0.004 63.250 0.001 45.655 a 0.001 His 7.051 a 0.001 2.030 0.002 0.897 b 0.001 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 28.568 a 0.011 20.705 b 0.005 24.056 0.015 Arg 82.489 a 0.012 85.936 0.009 60.430 b 0.004 NH4+ 24.443 a 0.074 14.494 0.018 7.537 b 0.036 Thr 16.496 a 0.004 14.301 0.004 11.663 b 0.006 Ala 55.540 a 0.018 53.924 0.028 31.300 b 0.015 Pro 742.528 a 0.005 607.089 0.014 388.140 b 0.004 GABA 25.932 a 0.001 27.679 0.000 22.770 b 0.000 Cys n.d. - n.d. - n.d. - Tyr 12.432 a 0.000 11.214 0.002 1.554 b 0.000 Val 22.184 a 0.006 29.129 0.018 2.570 b 0.001 Met 1.527 a 0.000 0.432 0.000 0.801 b 0.000 Orn 13.107 a 0.005 9.254 0.003 n.d. b - Lys 24.822 a 0.002 27.764 0.007 n.d. b - Ileu 6.454 a 0.000 7.089 0.004 3.381 b 0.002 Leu 15.731 a 0.004 17.377 0.016 2.141 b 0.000 Phe 14.668 a 0.006 15.649 0.012 7.610 b 0.002 Trp n.d. - n.d. - n.d. - b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 78 Anexo Tabla 9. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CL del sustrato T Muestras de Vinagre Compuestos TCLi TCLm TCLf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 33.036 a 0.005 28.329 0.002 25.747 b 0.002 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 4.8780 a 0.016 14.844 0.001 16.339 a 0.009 Glu 49.660 a 0.009 66.814 0.008 62.289 a 0.000 His n.d. a - 6.539 0.001 4.429 b 0.009 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 29.385 a 0.048 25.358 0.001 24.734 a 0.006 Arg 88.670 a 0.014 87.641 0.011 83.155 a 0.001 a 0.131 a 0.207 27.347 0.015 33.286 Thr 14.638 a 0.019 16.673 0.005 16.130 a 0.004 Ala 59.597 a 0.023 53.351 0.005 49.970 b 0.003 Pro 819.126a 0.021 571.705 0.021 479.010 b 0.012 GABA 29.373 a 0.010 32.894 0.004 31.798 a 0.009 Cys n.d. - n.d. - n.d. - Tyr 14.070 a 0.011 14.446 0.001 12.945 a 0.001 Val 23.190 a 0.005 19.809 0.003 18.819 b 0.007 Met 1.834 a 0.001 0.348 0.000 0.191 b 0.000 Orn 10.813 a 0.003 13.057 0.001 12.107 a 0.001 Lys 26.074 a 0.003 34.846 0.007 30.860 b 0.001 Ileu 7.457 a 0.025 9.473 0.003 8.107 a 0.001 Leu 17.694 a 0.032 18.176 0.001 16.258 a 0.001 Phe 17.632 a 0.050 17.433 0.009 15.977 a 0.006 Trp n.d. - n.d. - n.d. - NH4 + 30.982 a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 79 Anexo Tabla 10. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DK del sustrato T Muestras de Vinagre Compuestos TDKm TDKf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 34.046 a 0.002 27.056 0.001 17.381 b 0.002 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 15.141 a 0.003 15.209 0.004 27.169 b 0.008 Glu 48.415 a 0.003 65.308 0.001 50.691 a 0.010 His 0.347 a 0.001 1.760 0.001 3.330 b 0.001 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 30.413 a 0.018 26.557 0.008 18.860 b 0.007 Arg 81.165 a 0.002 85.273 0.001 60.694 b 0.008 b 0.081 a 0.009 18.948 0.078 15.076 Thr 15.013 a 0.006 16.410 0.004 11.479 b 0.004 Ala 55.681 a 0.027 53.389 0.002 29.853 b 0.003 Pro 752.184 a 0.015 598.532 0.008 338.283 b 0.010 GABA 26.218 a 0.003 33.611 0.002 24.119 b 0.005 Cys n.d. - n.d. - n.d. - Tyr 12.042 a 0.006 12.394 0.000 1.762 b 0.000 Val 22.473 a 0.009 19.967 0.008 2.228 b 0.001 Met 1.641 a 0.001 0.297 0.000 0.889 b 0.000 Orn 15.462 a 0.002 12.411 0.003 n.d. b - Lys 24.722 a 0.004 31.618 0.001 n.d. b - Ileu 15.283 a 0.005 7.941 0.003 3.407 b 0.002 Leu 16.446 a 0.004 16.086 0.000 1.974 b 0.000 Phe 15.491 a 0.003 16.128 0.002 8.018 b 0.006 Trp n.d. - n.d. - n.d. - NH4 a, TDKi + 40.053 b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 80 Anexo Tabla 11. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DL del sustrato T Muestras de Vinagre Compuestos TDLi TDLm TDLf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 32.034 a 0.005 26.178 0.000 23.099 b 0.004 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 20.367 a 0.007 16.137 0.001 19.125 a 0.004 Glu 54.366 a 0.007 66.096 0.002 50.498 a 0.004 His 1.062 a 0.002 n.d. - 0.773 a 0.002 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 31.229 a 0.004 25.666 0.013 19.559 b 0.012 Arg 82.325 a 0.007 84.161 0.000 60.229 b 0.004 a 0.016 12.537 0.021 5.400 Thr 14.941 a 0.003 16.033 0.003 12.777 b 0.001 Ala 59.555 a 0.010 53.548 0.008 29.828 b 0.003 Pro 756.355a 0.023 603.600 0.016 357.264 b 0.020 GABA 26.839 a 0.005 34.518 0.003 25.457 a 0.001 Cys n.d. - n.d. - n.d. - Tyr 11.472 a 0.000 12.451 0.007 1.799 b 0.000 Val 22.444 a 0.014 19.325 0.005 2.519 b 0.000 Met 1.522 a 0.000 0.308 0.000 0.681 b 0.000 Orn 17.227 a 0.003 10.043 0.000 n.d. b - Lys 25.292 a 0.005 29.249 0.007 n.d. b - Ileu 6.893 a 0.005 7.690 0.002 3.584 b 0.001 Leu 16.111 a 0.002 15.866 0.003 2.203 b 0.001 Phe 14.710 a 0.010 15.712 0.001 7.518 b 0.007 Trp n.d. - n.d. - n.d. - NH4 + 29.494 b 0.026 a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 81 Anexo Tabla 12. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DM del sustrato T Muestras de Vinagre Compuestos a, TDMi TDMm TDMf mg/L DE mg/L DE mg/L DE Asp 26.645 a 0.000 23.700 0.001 31.105 a 0.006 Asn n.d. - n.d. - n.d. - Ser 13.365 a 0.001 10.999 0.001 25.451 b 0.004 Glu 38.728 a b 0.001 His 0.001 59.270 0.005 70.921 n.d. - n.d. - 3.035 b 0.003 Gln n.d. - n.d. - n.d. - Gly 20.938 a 0.009 23.186 0.001 29.430 b 0.022 Arg 59.825 a 0.002 77.415 0.003 83.153 b 0.007 NH4+ 75.913 a 0.037 38.912 0.060 33.363 b 0.055 Thr 13.244 a 0.003 14.414 0.000 17.827 b 0.004 Ala 41.816 a 0.001 48.959 0.003 54.240 b 0.004 Pro 552.473 a 0.006 550.465 0.005 489.257 b 0.000 GABA 22.115 a 0.005 31.632 0.001 34.389 b 0.002 Cys n.d. - n.d. - n.d. - Tyr 8.002 a 0.000 11.289 0.001 12.912 b 0.004 Val 9.623 a 0.001 16.983 0.001 29.740 b 0.000 Met 14.522 a 0.003 0.950 0.000 0.145 b 0.000 Orn 6.925 a 0.000 10.224 0.000 17.252 b 0.007 Lys 13.837 a 0.004 26.563 0.001 31.713 b 0.002 Ileu 3.461 a 0.003 6.968 0.000 8.619 b 0.003 Leu 11.803 a 0.002 14.438 0.000 16.377 b 0.013 Phe 11.113 a 0.001 14.635 0.001 16.063 b 0.020 Trp n.d. - n.d. - n.d. - b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 82