Genomic Libraries, Yacs, BACs PACs. Physical maps

Genomic Libraries, Yacs,
BACs PACs. Physical maps,
fingerprint and Sequencing
strategies
Gisella Orjeda
Yeast artificial chromosomes
(YACs)
●
Son vectores de DNA lineares que contienen
los elementos esenciales de los cromosomas
de la levadura (Hieter et al. 1990; Burke and Olsen 1991).
Cuando se introducen en una célula de
levadura, los YACs se replican y segregan
junto con el complemento cromosómico
habitual. Durante la meiosis el YAC se
apareará, y hará sinapsis con cualquier YAC
homólogo si estuviera presente (Shero et al. 1991).
YACs
Cen and Tel sequences
ARS secuencia de replicación
autónoma
•Carry >450Kb
•Comportamiento como
cromosomas
Problemas:
Quimeras
Co-cloning: un YAC
contiene DNA de dos lugares
del genoma
10 % clones
Contienen mas de un YAC
Examples
Alpert, Kevin B. and Tanksley, Steven D. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 15503-15507
●
Desafortunadamente, las genotecas YAC son
difíciles de construir, tamizar y analizar y los
insertos usualmente son quiméricos (Green
et al. 1991 ), tienen re-arreglos o deleciones
internas.
Cosmids and PACs
• Cosmids 35-45 kb
• Híbridos entre λ
phage DNA y
plásmidos
bacterianos
•PACs se derivan del fago
P1 que tiene un genoma
mas grande que λ.
•80-100 Kb
The ideal cosmid
Multiple cloning site
Rare cutters Not1 SfiI
Promotores de los fagos
sp6 and T7
Two antibiotic resistance
¿ Qué son los BACs ?
• Bacterial Artificial
chromosome
• Derivados del
plásmido F
• Pueden llevar
insertos entre 150300 kb
Figure 1 Sizing of tomato BAC inserts
Figure 1 Sizing of tomato BAC inserts. An ethidium bromidestained gel of plasmid DNA digested with NotI enzyme to release
the tomato genomic inserts from the 7.4-kb pBeloBAC11 vector.
Lanes 1 and 30 contain mid-range PFGE size markers (New
England Biolabs).
Muhammad A. Budiman et al. Genome Res. 2000; 10: 129-136
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Los BAC’s se han convertido en una
herramienta básica para hacer mapas físicos,
clonamiento posicional y secuenciamiento
genómico
Estrategias de secuenciación
●
●
Map based sequencing usando sequence
TAG connectors (STC)
Shotgun sequencing
Map based sequencing
Que es un contig?
Coulson, A.R., Sulston, J.E., Brenner,
S. and Karn, J., Proc. Natl. Acad. Sc. 83, 7821-7825, (1986)
Sets of overlapping fingerprint clones used in physical mapping
Principio del fingerprint
• Cuantas más bandas
compartan dos
segmentos de ADN
la superposición
entre ellos será
mayor.
Figure 1 Schematic illustration of the role played by fingerprinting in the construction of
sequence-ready contigs
Marco A. Marra et al. Genome Res. 1997; 7: 1072-1084
www.sanger.ac.uk/Software/Image
IMAGE
FPC takes as input a set of clones and their restriction fragments (called Bands) and
assembles the clones into contigs.
Shotgun
2kb
10 kb
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