PRODUCCION DE ANIMALES TRANSGENICOS G

Animales transgénicos
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PRODUCCION DE ANIMALES TRANSGENICOS
G. Brem, U. Berg & H.D. Reichenbach
Introducción
En genética molecular moderna se desarrollaron métodos adecuados que permiten trabajar específicay repetidamente con ADN, como portador de la información genética. Esas técnicas de genética
molecular abren en la producción animal nuevas perspectivas, dado que es posible por primera vez
trabajar directamente a nivel génico, ello significa la posibilidad de aislar, secuenciar, recombinar y
transferir genes individuales. El espectro de aplicaciones de esas técnicas no está desarrollado
ampliamente. Sin embargo es posible pronosticar que el futuro de la producción animal será afectado
directamente y que los métodos de la producción animal convencional serán complementados y
posiblemente también parcialmente reemplazados (ver capítulo XIX).
Transferencia de genes significa transferencia e integración del ADN recombinado in vitro y su
estructura acoplada al genoma del receptor. Si la estructura de ADN se integra en el genoma del
receptor, éste se denomina transgénico. El producto de ese transgen, una proteína codificada por el
ADN transferido, es el producto transgénico. Con la ayuda de la transferencia de genes se pretende
lograr que una determinada cualidad en el organismo receptor sea modificada o una nueva sea
incorporada. Además se espera que el transgen integrado en el genoma sea transmitido a la herencia a
fin de establecer una línea transgénica.
En la extensa definición original sólo se habla de animales transgénicos cuando se comprueba que el
transgen se hereda en forma estable y se exprime. Pero en la actualidad se ha establecido en el
lenguaje cotidiano emplear el término: animal transgénico a partir del momento en el cual se puede
comprobar la presencia del nuevo gen en un individuo, al cual se ha practicado la transferencia génica.
Por otra parte en producción animal la transferencia de genes es sólo interesante cuando la estructura
génica es transmitida a la descendencia, de forma tal de establecer líneas transgénicas en la población.
El ADN recombinado en las estructuras génicas puede tener origen en los más variados organismos
donantes, debido a la uniformidad en la estructura básica de la doble cadena de ADN. Junto con el ADN
procariótico de origen viral o bacteriano el ADN de los organismos eucarióticos representa una fuente
inagotable para la transferencia génica.
No debe olvidarse, sin embargo, que especialmente para la expresión de transgénicos pueden
establecerse fuertes interacciones dependientes del origen y del receptor del ADN. Fue observado, por
ejemplo, que la expresión de las estructuras génicas que contienen aún componentes procarióticos,
puede ser reducida o incluso suprimida en animales mamíferos. Además se ha observado que es de
gran importancia para la expresión si los componentes estructurales del gen son de origen genómico o
provienen del ADNc. De esa forma puede observarse que de los trangenes que contienen intrones se
produce en promedio 10-100 veces más ARNm que de transgenes que contienen solamente ADNc
(BRINSTER y col., 1988).
A continuación se hará referencia exclusivamente a la producción de bovinos y otros animales
transgénicos de interés productivo y no a la transformación genética de células procarióticas o
eucarióticas. Con la producción de un organismo transgénico se pretende que el transgen esté presente
en todas las células somáticas y sobre todo también en las células reproductivas del animal. Dado que
no existe hasta el momento método alguno que permita transformar en forma completa un organismo ya
formado genéticamente, se practica la transferencia génica tan temprano en el desarrollo del animal
como es posible. El momento más apropiado es el estado embrionario temprano, es decir el estadio
unicelular (ovocito fecundado = cigoto), con poco número de células (blastómeros) o en los estadios de
mórula o blastocisto como máximo. Ello significa que los métodos de obtención, manipulación y
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transferencia de esos estadios tempranos deben estar establecidos y disponibles en las especies
mamíferas.
Se disponen en la actualidad de varios métodos prometedores de transferencia génica. Los tres más
importantes son:
- La microinyección de ADN en el pronúcleo del cigoto
- La transferencia de ADN a través de vectores retrovirales
- Producción de quimeras transgénicas a partir de células y embriones transformadas genéticamente.
La técnica más empleada en la actualidad es sin dudas la microinyección de ADN. a pesar de que las
otras dos cuentan, junto a algunas limitaciones, con una serie de ventajas no despreciables.
Lamentablemente la técnica que emplea células embrionales primordiales no fue desarrollada aún y la
aplicación de vectores retrovirales lo es en forma muy incompleta como para ser utilizadas en los
animales domésticos.
El camino más próximo para la transferencia de ADN en el núcleo celular es la microinyección directa
de una solución de ADN en el citoplasma del núcleo o en el pronúcleo (foto 1). GORDON y col. (1980)
indicaron por primera vez que la microinyección de una solución de ADN en el pronúcleo es un camino
practicable para la transferencia génica en mamíferos. Después de la microinyección de ADN clonado
en el pronúcleo de ovocitos fertilizados de ratón fue posible encontrar esas secuencias virales en partes
desarrolladas de los fetos. Poco tiempo después se indicó, en otros trabajos, que genes eucarióticos
intactos podían incorporarse a los fetos. Fue posible establecer también la presencia del transgen en
animales adultos como así también la transmisión a la descendencia.
En la actualidad la técnica de producción de ratones transgénicos fue introducida con éxito en muchos
laboratorios y se pusieron en práctica estudios para determinar la regulación de la expresión génica y el
efecto biológico del gen. Como ya fue mencionado, la microinyección de ADN en el pronúcleo de
cigotos o en los núcleos de embriones bicelulares es el método de elección para la transferencia génica
en los animales domésticos. La amplia experiencia obtenida en experimentos con ratones constituyó sin
duda una base adecuada para el desarrollo de la técnica en los animales de interés zootécnico. Debe
aclararse, sin embargo, que debido al desigual desarrollo embrionario temprano y especialmente a la
diferente morfología de los embriones de animales domésticos se produjeron algunos problemas. Por
ejemplo, las estructuras nucleares de las especies bovina, porcina y hasta cierto grado de la ovina y
caprina no pueden ser observadas con el microscopio o sólo con dificultad debido a los gránulos
citoplasmáticos oscuros. Para la observación del núcleo los embriones ovinos requieren un microscopio
de interferencia según NOMARSKI, los embriones bovinos y porcinos deben ser centrifugados para
exponer el núcleo. Tampoco se contaba con suficientes conocimientos prácticos sobre como se debía
establecer el tiempo óptimo para la obtención, microinyección y transferencia de los embriones para
contar con las mejores posibilidades en el éxito de la transferencia génica.
La producción de mamíferos transgénicos puede dividirse básicamente en 6 fases:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Clonado de las estructuras génicas y producción de la solución inyectable de ADN.
Preparación de los animales donantes y obtención de los ovocitos o embriones.
Exposición de los pronúcleos y microinyección del ADN.
Transferencia de los embriones inyectados al oviducto o, después de un cultivo temporal, al útero
de receptoras.
Comprobación de la integración en los animales nacidos y, si es posible, primeras evaluaciones de
la expresión del transgen en los niveles de trascripción (ARN) y translación (proteína).
Producción de descendencia transgénica por medio de métodos convencionales y evaluación de
eventuales mutaciones presentes a través de la formación de líneas homocigotas (test de
homocigosis).
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Hasta el momento se sabe que, en principio, toda molécula de ADN puede microinyectarse en el
genoma de un mamífero. El largo del fragmento de ADN a introducir por medio de los vectores de
clonado no debe superar el límite máximo de 50 kb (clones cosmidios). En otros numerosos
experimentos de transferencia génica se demostró que es posible alcanzar fragmentos mucho más
largos. De esta forma no es raro observar, en animales transgénicos, fragmentos de varios 100 kb o
aún más de 1 000 kb de largo, como consecuencia de la concatemerización de los fragmentos
inyectados.
Evidentemente la inyección de ADN lineal conduce a tasas superiores de integración. En cambio
moléculas con forma de espiral o "supercoiled" parecen integrarse con una frecuencia
significativamente menor (BRINSTER y col., 1985). También es mejor cuando los fragmentos de ADN
no son cortados romos ("blunt") sino cuando conservan terminales sobresalientes.
Las soluciones de ADN para microinyección deben estar absolutamente libre de partículas
contaminantes, para evitar el taponado de la pipeta de microinyección o la lesión de los cigotos
inyectados. Ello establece que todas las soluciones deben ser filtradas (filtros de 0,2 µm) y que todos
los recipientes, con los cuales el ADN toma contacto deben ser enjuagados previamente con agua
filtrada. Sólo en casos aislados se inyecta la totalidad del vector, dado que ADN procariótico puede
provocar problemas de expresión. Después de la restricción el vector y el ADN de inserción son
separados, en la regla, por medio de electroforesis. El fragmento deseado es aislado del gel, lavado y
colocado en una solución buffer. Inmediatamente después se establece la concentración de ADN de tal
manera que por cada pl (10-12) estén contenidos, según la aplicación, varios cientos de copias de la
estructura génica. En fragmentos de ADN un largo de 5-8 kb corresponde a una concentración de 1-2
µg de ADN/ml. No fue encontrada una correlación entre cantidad del ADN inyectado y el número de
copias integradas. La solución preparada de ADN se fracciona y conserva por medio de congelación
(BRENIG, 1987).
La frecuencia de integración en la producción de mamíferos transgénicos es influenciada por: la pureza,
la forma, el tipo de terminales, la concentración y la solución buffer del ADN. De ello se concluye que ya
durante la preparación de la solución de inyección del gen, se establecen importantes condiciones para
el éxito de la transferencia génica.
Recolección de los embriones
Los animales donantes son tratados con gonadotrofinas, con diferentes programas de superovulación
según la especie, inseminados o servidos dos veces. La obtención de los cigotos se lleva a cabo a
través del lavaje del oviducto en un lapso de 12-24h después de la inseminación. El lavaje de oviducto
puede llevarse a cabo mediante cirugía con el animal en narcosis o después del sacrificio. Debe tenerse
especial cuidado, que el oviducto sea seccionado del cuerpo del animal dentro de los 15 min de
desangrado. Los oviductos son lavados con una solución de PBS. Con ayuda de una lupa
estereoscópica se aíslan los ovocitos o embriones de la solución obtenida del lavaje y se colocan en
medio fresco. Las células del cumulus, que eventualmente pudiesen quedar adheridas, pueden
eliminarse con un tratamiento de hialuronidasa o por medio de pipeteo. Los embriones son cultivados in
vitro hasta el momento de la inyección.
La eficacia de los programas de transferencia génica con animales domésticos es, en promedio,
claramente menor que con el ratón. Como se puede observar en la tabla 1 ello se debe al bajo número
de cigotos que pueden inyectarse por donante, a las bajas tasas de preñez y sobrevivencia embrionaria
y a la menor frecuencia de integración. Para la producción de un animal transgénico se deben emplear,
en general, más donantes y receptoras de animales de interés zootécnico que con ratones o conejos.
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Microinyección de ADN
Para la microinyección es necesario contar con una mesa de trabajo estable. El lugar de trabajo
comprende un microscopio invertido, dos micromanipuladores para las pipetas de sostén y de
inyección y un aparato de inyección. La presión de inyección puede ser regulada con ayuda del aparato
de inyección accionado por medio de un pedal. Sobre la platina del microscopio se encuentra una
cámara de inyección que contiene el medio y los embriones a tratar. Los embriones bovinos y porcinos
son centrifugados 3 min a 15 000 g (WALL y col., 1985). A través de la centrifugación se desplazan los
gránulos citoplasmáticos oscuros hacia un polo, los núcleos y pronúcleos se hacen visibles en el medio
del embrión.
Tabla 1: tasas de éxito en programas de transferencia génica en diferentes animales de
experimentación e interés productivo
Especie
murina
leporina
porcina
ovina
bovina
Embriones inyectados por
donante (S)
15
20
20
4
7
Número de receptoras por
cada donante (E)
2
2
2
1,5
1
% Preñez
60
50
50
40
30
10-20
10
5-8
15
10
% de integración (animales
transgénicos/ animales
nacidos)
15
10
10-15
5-10
5-10
% Animales
transgénicos/embriones
inyecta-dos y transferidos
2
1
0,5
0,5-1
0,5
Número de animales
necesarios (S+E) por
c/animal transgénico
10
15
20
40
40
% Animales nacidos/
embriones inyectados
A pesar de ese tratamiento la inyección de esos embriones es más difícil que la de embriones de ratón
o conejo.
Para la inyección se fija el embrión mediante vacío a la pipeta de sostén de tal forma que el (pro-)
núcleo se haga bien visible. La pipeta de inyección tiene un diámetro de 1 a 2 µm y es llenada con la
solución de ADN. Para la inyección, la pipeta es introducida por medio del micromanipulador a través de
la zona pelúcida, la membrana celular y (pro-) nuclear. La inyección con un volumen de 1-2 pl de la
solución de ADN aumenta el volumen del núcleo más del 50%.
Transferencia de los embriones
Después de un cultivo temporal, los embriones inyectados son transferidos mediante cirugía a oviductos
de receptoras sincronizadas. La sincronización de las receptoras se lleva a cabo a través de un
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tratamiento hormonal específico de especie. Antes de la transferencia de los embriones tratados se
controla la reacción ovárica de la hembra receptora. Sólo son empleadas aquellas receptoras que
respondieron al tratamiento hormonal con el número adecuado de folículos, que depende de la especie
tratada.
En la especie bovina se procede a cultivar los embriones in vivo o in vitro durante varios días, a fin de
evitar la trabajosa intervención de la transferencia al oviducto (BERG y BREM, 1989). La finalidad es
cultivar los embriones de una o dos células hasta el estadio de mórula y transferir éstas directamente en
el útero de las receptoras. Para el conejo, cerdo, oveja y cabra el cultivo intermedio no es necesario,
dado que en esas especies incluso la transferencia uterina se lleva a cabo mediante cirugía.
Comprobación de la integración y la expresión
Después de la transferencia génica sólo es posible en casos aislados determinar la integración del gen
a través de cambios de fenotipo en los animales nacidos. Incluso aún cuando la estructura génica
empleada permita esperar algún efecto, debe llevarse a cabo la comprobación de la integración del gen
presente independientemente del fenotipo. Ello se debe a que la estructura génica integrada no siempre
se exprime en los animales positivos. Para la comprobación de la integración génica se disponen de
varios métodos. El material de evaluación lo constituyen células con núcleo, que se toman de los
órganos o fluidos corporales. Normalmente se toman las pruebas del tejido de la punta de la cola o de la
sangre. De ellas se aisla el ADN, que no requiere que sea especialmente de alto peso molecular, como
lo es en el caso de los bancos de reservas genómicas.
La lisis completa del tejido se logra a través de un tratamiento con proteinasa K-buffer a 55 C. La
extracción se logra con cloroformo fenolado. Con acetato de Na y etanol se provoca la precipitación que
aumenta con la centrifugación. Inmediatamente después se determina la concentración con ayuda de
un espectrofotómetro, a partir de alícuotas diluidas.
La exacta y más segura comprobación de la integración de las estructuras génicas se puede llevar a
cabo por medio del método Southern-Blot. Aproximadamente 20-30 µg de ADN genómico de alto peso
molecular es hidrolizado completamente con enzimas de restricción adecuadas. Después de la división,
la mezcla de fragmentos de ADN es separada electroforéticamente en gel-agarosa horizontal. Un
marcador aplicado al mismo tiempo permitirá la determinación del tamaño de los diferentes fragmentos
de ADN. Los fragmentos separados son transportados a filtros de celulosa o a membranas de Nylon
según el método de SOUTHERN (1975). El ADN, separado en el gel de agarosa, es transportado después de la desnaturalización alcalina- a la nitrocelulosa o membrana de nylon que se encuentran
directamente sobre agar por medio de capilaridad con ayuda de un buffer de transferencia. Con ADN
genómico, el Blot puede terminar al cabo de 10-16 h. El tiempo de transferencia de ADN puede
reducirse a menos de una hora con aparatos de vacío o de electro-Blotting. En un método rápido de
evaluación de un número grande de pruebas de ADN se transporta una alícuota de ADN
desnaturalizado y lavado en forma grosera, a una membrana soporte bajo presión negativa e
inmediatamente después se híbrida con una prueba marcada radioactivamente. Con el método descrito
por BRENIG y col. (1989) puede comprobarse la estructura génica en el ADN del animal hospedador en
25-30 h. Con el reemplazo de la marcación radioactiva por un método de luminiscencia química puede
ahorrarse más tiempo.
Después de la desnaturalización y neutralización se continúa la transferencia de los fragmentos
separados del gel al filtro de nitrocelulosa. Los fragmentos de ADN utilizados en la prueba son
marcados radioactivamente. Ello puede llevarse a cabo mediante translación "nick" u oligopriming.
Los filtros de nitrocelulosa son pre-hibridizados con ADN no específico e hibridizados posteriormente
con ADN radioactivo. Después de un lavado astringente abundante, los filtros son expuestos a un film
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radiográfico con una película reforzadora durante un tiempo determinado a 80o C. Una alternativa al
uso de sustancias radioactivas es la aplicación de dUTP biotinilado (LANGER y col., 1981) para el
marcado de fragmentos. Biotina tiene una fuerte afinidad a la avidina, la cual por su parte puede
acoplarse a indicadores adecuados (anticuerpos, enzimas, colorantes). De esta forma se pueden
identificar también las cantidades más pequeñas de complejos biotina/ADN.
En el método Southern-Blot la elección de la o las enzimas y de las pruebas de hibridación tiene una
importancia definitiva. En los casos más adecuados hay una enzima cuyos dos lugares de división en la
estructura génica están separados entre si en forma suficiente para usar el fragmento ubicado entre
medio como grupo de hibridación. Si para la división del ADN se emplean los lugares de corte
marginales, en los cuales el fragmento fue separado del vector, aparecen en el análisis Southern-Blot,
junto con el o los fragmentos esperados con el tamaño correspondiente a la estructura génica, dos
fragmentos en lo general más largos.
El análisis de patrones ("pattern") de tal naturaleza permite sacar algunas conclusiones sobre la
integración. Se sabe que, en muchos animales transgénicos, no sólo se integra una copia de la
estructura génica inyectada. Varias copias son frecuentes en dependencia de los lugares marginales,
concatómeros unidos al genoma en forma de "head to tail", "head to head" o "tail to tail". De la misma
forma no es un fenómeno extraño que se pierdan algunas bases en terminales sobresalientes de los
fragmentos, durante la integración. De esta forma desaparecen los lugares de división en los terminales
5'-3'- en los fragmentos integrados de ADN. Si se divide el ADN genómico con enzimas de restricción,
que cortan al final de la estructura génica, se separan los concatómeros del interior del fragmento de
ADN en forma precisa y esperada. Sin embargo, dado que los lugares de corte en las terminales se
pierden, se originan en las posiciones 5'-3'- fragmentos más grandes. Ello es así porque en ambas
copias marginales del genoma se encuentran aún las secuencias hasta los próximos lugares de
fragmentación en la cadena de ADN, apropiados para las enzimas de restricción. El largo de esas
copias génicas marginales es casual y depende de la presencia de lugares de división adecuados en la
zona de integración del ADN genómico. En casos relativamente escasos la integración de la estructura
génica se produce no solamente en un lugar sino en dos o más. En casos favorables puede
comprobarse su existencia por medio de análisis Southern-Blot. Con frecuencia esto no se logra en el
primer animal receptor, pero sí después de la segregación del transgen en la descendencia. Se supone
que para la expresión de las estructuras génicas la pérdida de bases marginales en general no tiene
importancia.
Si se emplean en la transferencia génica secuencias homólogas, es decir fragmentos de ADN
provenientes de la misma especie, el análisis Southern-Blot debe planearse cuidadosamente. En esos
casos la comprobación específica de la integración génica sólo es posible mediante la correcta
selección de adecuadas enzimas de restricción, de lo contrario la diferenciación entre el ADN endógeno
y el transferido es difícil. Dado que, sin embargo, sólo en casos excepcionales se elige el mismo orden
de regiones no trasladadas promotoras y estructurales del gen y del genoma, se adecuan
especialmente los lugares entre ambos genes como pruebas de hibridación. A pesar de ello ocurren
también en esos casos señales a través de la hibridación cruzada de las pruebas con secuencias
genómicas, que deben ser consideradas en el análisis. De vez en cuando se observan en las pruebas
de integración patrones de integración inesperados. En esos casos el complejo patrón de restricción,
que no responde al original, se puede determinar mediante un análisis de restricción y Southern.
El número de estructuras génicas integradas en el genoma se determina por medio del análisis Dot-blot.
El mismo no es una técnica de transferencia capilar, dado que el ADN es aplicado a la membrana de
soporte mediante una máscara perforada. La electroforesis no es necesaria y la calidad del ADN no
necesita ser tan buena como para el análisis de Southern-Blot. El ADN desnaturalizado es aplicado,
lavado, horneado e hidrolizado. A través de la cuantificación densimétrica se calcula aproximadamente
el número de copias del transgen (tamaño del genoma haploide = 3 . 109 pb).
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Una técnica desarrollada hace pocos años, la reacción PCR (Polymerase Chain Reaction, capítulo XV),
puede emplearse para evaluar si un animal es transgénico en un tiempo relativamente corto y con poco
material celular. Cuando se pretende localizar el lugar de integración en el cromosoma se puede llevar a
cabo una hibridación in situ de los cromosomas en metafase. El término hibridación in situ se emplea
también para la comprobación directa de ADN y ARN en muestras de tejidos congelados.
La especificidad para la expresión de un gen o estructura génica en un tejido se establece, entre otros,
a través de su promotor. Por esa razón, para la evaluación de la transcripción correcta de una
estructura génica inyectada se aisla el ARN de los tejidos en los cuales se espera la mayor expresión.
La preparación del ARN se lleva a cabo según los protocolos de CHIRGWIN y col. (1979) y GLISIN y
col. (1974), los cuales se basan en la lisis celular y desnaturalización proteica con isotiocianato de
guanidina. El ARN es transferido a filtros de nitrocelulosa o de nylon (THOMAS, 1980) como para el
análisis Southern-Blot o a geles desnaturalizados de agarosa/formaldehido, después de su
desnaturalización con glioxal o dimetilsulfóxido (DMSO).
Para recabar información sobre cantidad, estructura o porcentaje de síntesis se llevan a cabo tests con
nucleasa S1 y ribonucleasa o ensayos de extensión del iniciador ("primer"). En el análisis S1 (SHARP y
col., 1980) o el test de la protección de la ribonucleasa (CHAMBERLIN y RYAN, 1982) se emplean
pruebas de cadenas simples, complementarias con el ARN que se pretende evaluar. Con ese método
se pueden estudiar los puntos terminales 5'- y 3'- como así también la cantidad específica de ARN.
Después que se pudo comprobar que la estructura génica microinyectada se transcribe correctamente,
se debe evaluar la translación. Se analiza en primer lugar si la proteína correspondiente se sintetiza y,
de ser así, en que cantidad. Para ello se disponen de métodos colorimétricos o electroforéticos en gel
con coloración posterior (Comassie-Blue, plata) del gel o transporte a filtros de nitrocelulosa o
membranas de nylon (Western-Blot). Además pueden emplearse métodos clínicos de diagnóstico
(radioinmunoensayo, ELISA), los cuales están disponibles en parte en forma de kit. Para más
información sobre esos métodos consultar la literatura siguiente: LOWRY y col., 1951; BRADFORD,
1976; PETERSON, 1977; PETERSON, 1979; OAKLEY y col., 1980 HAMES & RICKWOOD, 1981;
MOEREMANS y col, 1985; DARBRE, 1986; MOEREMANS y col., 1986; SALINOVICH & MONTELARO,
1986.
Herencia del transgen
Un requisito indispensable para la aplicación de la transferencia génica en producción animal es que el
gen transferido se transmita a la descendencia. Para ello es necesario que el animal receptor del gen
(microinyectado) posea en todas o, al menos, en parte de sus células reproductivas el transgen.
Lamentablemente se conoce poco sobre los caminos moleculares y biológicos que se suceden en la
integración de un ADN inyectado. Por ejemplo, no se conoce exactamente cuando se lleva a cabo la
integración y si ésta permanece estable en todas las células durante el desarrollo posterior del embrión.
En ensayos de evaluación de animales nacidos transgénicos y especialmente en aquellos de
producción de descendencia transgénica se ha observado que a pesar de la inyección del ADN, en el
pronúcleo embrionario pueden originarse mosaicos.
Mosaicos son animales originados por diferentes líneas, que provienen de un cigoto pero que poseen
diferentes genotipos. Mosaicos transgénicos poseen células que contienen el transgen y otras que no lo
tienen. Ello puede conducir a problemas en la formación de descendencia transgénica cuando en las
células gonadales de los progenitores no está presente el transgen. Según las experiencias obtenidas
se puede esperar que aproximadamente 30% de los animales receptores primarios del gen (por medio
de microinyección) son mosaicos y que no transmitirán el transgen a su descendencia en la frecuencia
esperada de 50%.
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La herencia de animales transgénicos, en los cuales la estructura génica inyectada se integró en forma
estable y se transmite a la descendencia, responde a las leyes mendelianas, dado que en general la
integración del gen se produce en un solo lugar en un cromosoma. De acuerdo a la definición se
describe a este tipo de animales como transgénicos heterocigotas. Sin embargo este término no es el
adecuado, dado que falta el alelo correspondiente al transgénico en el cromosoma homólogo. Como es
de esperar, 50% de la descendencia debe poseer el transgen. Sin embargo, si las gónadas son
mosaicos de líneas transgénicas y no transgénicas, el porcentaje de descendencia transgénica variará
entre 0-50% de acuerdo a la participación cuantitativa de ambas líneas celulares. Los mosaicos se
originan sólo en la generación F0. Los animales transgénicos de la generación F1 y posteriores poseen,
si son positivos, la estructura génica en todas las partes del cuerpo y células de la hilera germinal. Se
ha observado, no obstante, que la integración no siempre permanece estable a través de las
generaciones.
La observación de que un transgen no permanece estable sino que puede perderse no fue aclarada en
forma suficiente. Aún más frecuente que la inestabilidad de la integración es la gran variabilidad de la
expresión del transgen, de forma tal, que en el curso de las generaciones, se presentan todas las
formas posibles de variación: aumento, disminución o ausencia de expresión. Aún dentro de grupos de
hermanos enteros se observó variabilidad de la expresión del transgen entre animales positivos. Las
razones para ello no han sido aclaradas, seguramente desempeña el fenómeno conocido como
"imprinting" un rol de importancia. A través de la diferente metilación, la expresión de un gen depende
de su origen materno o paterno.
La comprobación de varios lugares de integración en el genoma de animales transgénicos ocurre con
relativa poca frecuencia. Si los lugares de integración están tan alejados entre sí, que pueden conducir
a recombinaciones al azar, pueden originarse más de 50% de descendencia transgénica. De un animal
transgénico con dos tipos de integración independientes puede esperarse que el 75% de la
descendencia hereden el transgen, 25% recibirá uno de ambos transgenes y otro 25% ambos tipos en
su genoma. El 25% restante no será transgénico. A través del apareamiento de animales transgénicos
heterocigotas se obtiene, en casos normales, 50% de transgenes heterocigotas, 25% de homocigotas y
25% de negativos.
El azar de la integración génica en los animales transgénicos primarios (F0) puede conducir a la
integración en el sector de un gen de importancia para el desarrollo del feto. Mientras un alelo intacto en
el cromosoma homólogo de animales heterocigotas esté presente, no se producen problemas como
consecuencia de esa mutación por inserción. Una excepción la constituyen posiblemente los efectos
génico-aditivos, cuya integración en un lugar génico determinado tienen como consecuencia una
reducida expresión de la característica endógena aditiva. Del apareamiento de animales heterocigotas
que tienen una mutación de inserción no es posible obtener descendencia transgénica homocigota. Si el
gen afectado por la mutación de inserción es esencial para el desarrollo del feto no nacerán animales
transgénicos homocigotas. Antes de la reproducción de animales transgénicos debe evaluarse si los
animales son libres de mutaciones de inserción, a fin de evitar un aumento de la carga letal. Dichas
mutaciones de inserción pueden ser interesantes en investigación básica.
Para la producción animal la aparición de mosaicos y mutantes de inserción tiene como consecuencia
que para la introducción de un gen determinado en una población, un solo animal transgénico no es
suficiente. Independientemente de la alta tasa de consanguinidad que se pueda generar, las
posibilidades de producir una línea transgénica con un solo animal son reducidas.
Para que una línea transgénica pueda tener éxito y aplicación en la práctica deberían cumplir las
siguientes condiciones:
- Transmisión estable del transgen a la descendencia.
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163
- Ausencia de mutaciones de inserción y la posibilidad de producir animales transgénicos
homocigotas.
- Expresión estable del transgen y efecto biológico positivo sobre la característica deseada.
De ello se desprende que se deben producir como mínimo 5-10 animales transgénicos primarios (F0)
para producir, con una probabilidad suficientemente alta, líneas que respondan a las exigencias
establecidas.
Programa de transferencia génica en el bovino
Después que se informó por primera vez, en el año 1985 (HAMMER y col., 1985; BREM y col., 1985),
sobre la exitosa aplicación de la transferencia génica en los animales domésticos (cerdo, oveja, conejo)
se intensificaron los esfuerzos en los años siguientes para mejorar la metodología y los genes. Mientras
que la tasa de integración no aumentó sensiblemente, en algunos ensayos se pudo mejorar la
expresión a través del empleo de genes optimizados. La eficacia de un programa de transferencia
génica depende de una serie de factores, como la habilidad en la manipulación embrionaria, el tipo y
duración del cultivo in vitro, la calidad de la transferencia de los embriones, la edad de las receptoras
empleadas y la sincronicidad entre donantes y receptoras.
El esquema de desarrollo de un programa de transferencia génica se inicia con la selección,
estimulación e inseminación (natural o artificial) de las donantes (fig. 1). La obtención de los cigotos se
lleva a cabo por medio de la matanza o cirugía de las donantes, 75-97 h después del celo. Los
embriones son centrifugados para exponer los pronúcleos (WALL, 1985). Junto con embriones de una
célula se emplean para la inyección también embriones con 2 blastómeros. Una forma alternativa para
la obtención de embriones para la microinyección de ADN en el bovino es la producción in vitro de
embriones (ver capítulo XI).
En la actualidad este método biotecnológico desplaza a la obtención in vivo de los embriones. La
producción y el cultivo in vitro presentan las ventajas de ser más económicos, se evita la intervención
quirúrgica de las donantes y receptoras como así también de los animales empleados para el cultivo
temporal. Otra ventaja de la producción in vitro es la posibilidad de determinar el estadio del pronúcleo
con mayor precisión. Ello permite la inyección de un mayor número de embriones. Después de la
microinyección los embriones se cultivan in vitro o in vivo en el oviducto de receptoras temporales. La
desventaja del último método se basa en las reducidas tasas de recuperación de los embriones como
así también en su trabajosa ejecución. Los problemas de falta de desarrollo de los embriones
producidos in vitro, a partir de los estadios de 8 y 12 células, pudieron resolverse con la aplicación del
cocultivo de los embriones con células de la granulosa y del oviducto. Los embriones microinyectados
son transferidos en los días 6-7 de desarrollo, momento en que alcanzan los estadios de mórula o
blastocisto, en forma no quirúrgica a receptoras sincronizadas.
LOHSE y col. (1985) informaron sobre el primer ensayo de transferencia génica en el bovino. Los
autores inyectaron en ovocitos fertilizados una estructura génica TQ (timidin quinasa) y demostraron
que 30% de los embriones indicaban una actividad TQ de 2 desviaciones estándar por encima de los
controles. LOSKUTOFF y col. (1986) lograron 3 preñeces de la transferencia de 43 cigotos y 17
embriones de dos blastómeros inyectados. En otro estudio McEVOY y col. (1990) obtuvieron 569
ovocitos de 52 vaquillonas superovuladas (5,1 embriones de una y dos células por cada donante) por
medio de laparotomía en la línea media. Los pronúcleos fueron observados en 71% de los casos
después de 3 min y 81% después de 5 min de centrifugación a 13000 g, 62 y 60% de ellos se
desarrollaron 24h después del cultivo. Como consecuencia de la microinyección degeneraron 20% de
los cigotos. Embriones de una y dos células (n = 108) fueron transferidos a 46 receptoras. Al día 55
fueron detectadas 20 hembras (43%) con 32 fetos, 17 de las cuales parieron (37%). Uno de los 27
terneros nacidos fue transgénico. La tasa de sobrevivencia de los embriones de uno y dos blastómeros
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fue de 22 a 36%. CHURCH y col. (1986) informaron que se desarrollaron 111 embriones de 852 cigotos
bovinos inyectados con el gen de la fetoproteína alfa, de los cuales se identificaron 4 que integraron el
gen. Después de la inyección de 1161 cigotos con 3 diferentes estructuras génicas y la transferencia de
641 (55%) la tasa de nacimiento fue de 10,5% (126) frente a 43% del grupo control. De los 126
embriones inyectados y transferidos integraron el ADN 7 terneros. BIERY y col. (1988) informaron sobre
la tasa de detección de los pronúcleos después de la centrifugación de 1325 cigotos a 15000 g durante
4 min. Después de la microinyección y el cultivo in vivo en oviducto de oveja durante 6 días, se
recuperaron 84% de los embriones, de los cuales 21% se desarrollaron hasta los estadios de mórula y
blastocisto.
La integración del ADN se registró en 4 fetos. ROSCHLAU y col. (1988) obtuvieron, luego de la
castración de las donantes, 513 cigotos de oviductos que fueron inyectados con 3 diferentes estructuras
génicas virales. En 14 de 44 embriones, de dos semanas de edad, fue posible comprobar la presencia
del ADN; 5 embriones exprimieron el gen. De la transferencia de 43 embriones a 23 receptoras
resultaron 14 preñeces y nacimientos. La integración del ADN bGH inyectado se comprobó en 1 ternero.
En ensayos propios (REICHENBACH, 1989) se compararon diferentes sistemas de cultivo in vivo con
cultivos in vitro. Las tasas de desarrollo obtenidas se detallan en la tabla 2. De ello se concluye que de
las 3 especies obtenidas, el cerdo fue menos y el conejo fue el más adecuado para el cultivo de los
cigotos. Lo destacable de este estudio fue que los sistemas de cultivo in vitro empleados (BERG y
BREM, 1989) fueron comparables a los mejores resultados obtenidos in vitro, considerando los
embriones cultivados y los transferidos.
Tabla 2: Tasas de recuperación y desarrollo de los cigotos y embriones cultivados in vivo e in vitro
después de la inyección génica (REICHENBACH, 1989)
Cultivo
temporal
Embriones
transferidos
de 1 y 2
células
Embriones desarrollados
Embriones
Recuperados
>1 división
mórulas/blastocistos
celular
(a)
n
(b)
n
(b/a)
%
(c)
n
(c/b)
%
(d)
n
(d/b)
%
(d/a)
%
in vivo
vaca
8 Mi
3K
183 66
93
48
51
73
24
27
26
56
17
14
18
29
9
21
in vivo
cerda
3 Mi
1K
79
29
22
12
28
41
7
5
7
5
3
2
14
17
4
7
in vivo
coneja
4 Mi
2K
82
41
46
31
56
76
28
21
28
21
13
14
28
45
16
34
in vitro
5 Mi
4K
123
71
123
71
100
100
63
43
63
43
18
21
15
30
15
30
Mi = Microinyectados
K = no microinyectados (controles)
Tres grupos de trabajo: en Texas (U.S.A, MASSEY, 1990), en Leiden (Holanda, KRIMPENFORT y col.,
1990) y en Munich (República Federal de Alemania) publicaron el empleo exitoso de los embriones
bovinos producidos in vitro hasta el nacimiento de terneros (tabla 3). Los primeros terneros
transgénicos, producidos con el empleo de embriones producidos in vitro, nacieron en 1991
(KRIMPENFORT y col., 1991). Como se señala en la tabla 3, 1% de los ovocitos recolectados culmina
en terneros después de la fertilización, microinyección, cultivo y transferencia de los embriones tratados.
A pesar de ello las ventajas de la producción in vitro de embriones superan al sistema de producción in
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vivo. En el futuro la producción de animales transgénicos se desarrollará, con seguridad, apoyada en la
producción in vitro de los embriones, porque se considera que la eficacia de las diferentes etapas
mejorará en los próximos años.
Tabla 3: Microinyección de ADN en embriones producidos in vitro según diferentes autores
Texas, USA
MASSEY, 1990
Pasos
Maduración de
los ovocitos
Microinyección
de los ovocitos
Embriones
transferidos
Gestaciones/
Terneros
n
%
Leiden, Holanda
KIMPENFORT y
col., 1991
n
%
Munich, Alemania
resultados propios,
1989, 1991/92
n
%
2408
-
2297
-
686
-
858
36
1154
50
496
72
49
6
129
11
60
12
12
24
21*
21
12
26
* 2 terneros transgénicos
Dado que las receptoras significan el mayor costo de un programa de transferencia génica, empleando
la producción in vitro de embriones, se trabaja intensamente en el diagnóstico de la integración del gen
ya sea durante la gestación (a través de la recolección y análisis de las células embrionarias) o, mejor
aún, en los embriones de 6-7 días de edad, por medio del diagnóstico de PCR (capítulo XV).
Foto 1: Microinyección de ADN en el pronúcleo de un cigoto de
ratón
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