Evolución de levaduras autóctonas durante la elaboración y

Resumen: E-078
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Evolución de levaduras autóctonas
durante la elaboración y maduración de Queso Artesanal de Corrientes
1
1
1
2
Cardozo, Marina C. - Vasek, O. M. - Fusco, A. J. V. - Carrasco, M. S.
1. Lab. de Bromatología-FACENA-UNNE
Avda. Libertad 5600-Campus [email protected].:03783-457996, int. 110
2. Facultad de Ingeniería Química-UNL
Santiago del Estero 2829.
Introducción
El efecto de levaduras en quesos recién ha suscitado interés en los últimos años (Beresford et al., 2001; Wouters et al.,
2002). Su densidad poblacional, evolución, especies dominantes, rol durante la maduración están siendo estudiados
recientemente en quesos particulares (van den Tempel y Jakobsen, 1998; Fox et al., 2000, Crow et al., 2001), cuyos
resultados indican efectos benéficos que sugieren la posibilidad de su adición como adjunto al fermento.
Estudios previos (Vasek, 2003) mostraron tasas elevadas de levaduras como biota secundaria durante la elaboración y
maduración de Quesos Artesanales de Corrientes, que se mantuvieron inafectadas por las bacterias lácticas dominantes.
Para conocer su biodiversidad y acción durante el proceso mencionado e interacción con la biota dominante es
necesario en primera instancia, evaluar la cinética de crecimiento, aislar, purificar e identificar taxonómicamente a las
levaduras componentes de este grupo secundario en cada etapa de la manufactura.
El objetivo de este trabajo es estudiar la evolución de levaduras autóctonas durante la elaboración y maduración del
Queso Artesanal de Corrientes. En esta presentación se comunican los resultados obtenidos hasta el momento.
Materiales y métodos
Elaboración de quesos. Se realizó en el establecimiento de la familia Goiriz, ubicado en la localidad de Ramada Paso.
Los quesos fueron elaborados por el productor, con el agregado del fermento “Gaucho” constituido por cepas
autóctonas de la Provincia de Corrientes, en períodos diferentes y su maduración se realizó en el lugar de origen.
Preparación del fermento. El cultivo iniciador se preparó cada día de elaboración de quesos. Los microorganismos se
activaron en forma individual por dos pasajes sucesivos en leche descremada deshidratada reconstituida al 10% (LDD).
El escalamiento se realizó en caldo LAPTg10 (Raibaud et al., 1961). Cada cultivo láctico crecido (30 °C, 14 h), fue
centrifugado (5000 g, 15 min), lavado con 0.9 % de NaCl y resuspendido en LDD al volumen original para ser usado.
Estas suspensiones celulares fueron mezcladas en proporciones adecuadas para preparar el fermento.
Muestras. Leche, agente coagulante, cuajada y quesos de 1, 6, 15 y 30 días de maduración, fueron transportados al
laboratorio bajo condiciones de refrigeración y analizadas dentro de las 24 horas.
Preparación de las muestras. Cuajada y quesos: 5 g de muestra más 45 ml de citrato de sodio 2% homogeneizados,
constituyeron la primera dilución de muestras sólidas o semisólidas, la primera dilución de muestras líquidas (leche y
agente coagulante) se preparó en agua de peptona al 1%.
Recuento total y diferencial de levaduras. Diluciones seriadas apropiadas de las muestras se sembraron en cajas de Petri
por duplicado utilizando el método de inoculación y vertido. Se empleó el medio de cultivo Agar azul de bromofenolcloranfenicol-glucosa-extracto de levadura (YGCB Biokar). Se incubaron a 30ºC durante 4 días y los resultados se
expresaron como logaritmo de Unidades Formadoras de Colonias (log ufc) ml-1 ó g-1 de muestra.
Aislamiento y purificación de levaduras. Se seleccionaron tres colonias por cada uno de los grupos de colonias
macromorfológicamente iguales de la caja de Petri crecida, y se sembraron en caldo YM (3 g/l extracto de levadura, 3
g/l extracto de malta, 5 g/l peptona, 10g/l glucosa, pH final 6.0) con adición de cloranfenicol (10 ml de solución, 500
mg cloranfenicol /100 ml de alcohol etílico, cada 90 ml de medio). Luego de incubar durante 4 días a 30º C., las cepas
fueron purificadas por pasajes sucesivos en medio líquido y agarizado YM - cloranfenicol, verificando su pureza por
microscopía directa.
Conservación. Las cepas puras, se activaron por dos pasajes sucesivos en caldo YM y se conservaron a mediano plazo
en agar YM a 4ºC y a largo plazo en caldo YM con glicerol (15%) a –20ºC .
Análisis estadístico. La estadística descriptiva, análisis de varianza y test de comparación posterior (LDS Fisher, α =
0.05), se realizó utilizando el software Infostat (2002). V.1.1.
Resultados y discusión
Recuento total y diferencial de levaduras. Hasta la fecha de esta presentación se realizaron 3 cinéticas. La estadística
descriptiva de los resultados expresados como log ufc ml-1 ó g-1, se presentan en la Tabla 1, y los valores promedio se
muestran en la Fig. 1.
Cada resultado a su vez, corresponde al valor medio de datos duplicados obtenidos de dos diluciones sucesivas.
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Las cinéticas de crecimiento realizadas hasta el momento indican un marcado aumento en el número de levaduras (8.08
105 ufc g-1) durante los 30 días de maduración de Quesos Artesanales de Corrientes, lo que significa un crecimiento
poblacional del 1400%. Este perfil de evolución es coincidente con el comunicado por Vasek (2003), quien además
detectó tasas superiores a las de esta presentación, pero similar aumento poblacional porcentual.
Tabla 1. Estadística descriptiva de la cinética de crecimiento de levaduras en Quesos Artesanales de Corrientes.
Media
DE
CV
Mín.
Máx.
Leche
4.39
0.13
3.06
4.24
4.49
Agente
coagulante
4.14
0.68
16.42
3.59
4.90
Cuajada
5.26
0.39
7.49
4.83
5.60
Queso1
4.80
0.75
15.65
3.94
5.34
Queso 6
4.89
0.32
6.61
4.52
5.13
Queso15
5.38
0.10
1.86
5.28
5.48
Queso30
5.94
0.68
11.38
5.28
6.63
DE: Desviación estándar. CV: coeficiente de variación
7
log ufc ml-1 o g-1
6
5
4
3
LAC 1
6
15
30
Tiempo (días)
Figura 1. Cinética de crecimiento promedio de levaduras (x ½ + Desviación estándar) durante la elaboración y la
maduración de Queso Artesanal de Corrientes.
L: leche
A: agente coagulante
C :cuajada
Las mayores desviaciones estándar (DE) correspondieron a las etapas iniciales de elaboración (Fig. 1) a excepción de
los muestreos a los 30 días de maduración de los quesos y corroboradas por elevados coeficientes de variación (Tabla
1).
Con el objetivo de aclarar estas variaciones, se graficaron las cinéticas de crecimiento individuales (Fig. 2), que
mostraron un perfil de evolución similar en las elaboraciones 1-3, con un progresivo aumento, pero diferentes (P <
0.05) a la 2 en la cual los resultados correspondientes al muestreo del día 30 evidencian una pendiente negativa.
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Cuando se analizó la variación existente en cada una de las etapas de elaboración y maduración, se observó que la leche
empleada en las tres cinéticas tuvo una población levaduriforme en niveles semejantes (P > 0.05), sin embargo esta
biota en el agente coagulante artesanal utilizado presentó cargas distintas (P < 0.05), siendo probablemente ésta, la
causa de las diferencias estadísticamente significativas (P < 0.05) en las etapas posteriores de proceso entre los niveles
bióticos de los tres experimentos.
7
-1
log UFC g ó ml
-1
6
1
2
5
3
4
3
LAC1
6
15
30
Tiempo (días)
Figura 2. Cinética individual de crecimiento de levaduras (x ½ + Desviación estándar) durante la elaboración y la
maduración de Queso Artesanal de Corrientes.
L: leche
A: agente coagulante
C :cuajada
Aislamiento, purificación y conservación de levaduras. Hasta la fecha de esta presentación, se han aislado 396 cepas de
levaduras, 186 de ellas se hallan en etapa de purificación, 15 cultivos puros están siendo activadas para su conservación,
y 47 se conservan en cultivo puro congeladas a –20ºC para los estudios de identificación taxonómica y biodiversidad.
Conclusiones preliminares
Los resultados obtenidos hasta el momento indican un pronunciado aumento en el número de levaduras durante la
maduración de Quesos Artesanales de Corrientes.
La presente Comunicación tiene carácter de preliminar, ya que forma parte de un trabajo más amplio referido al
estudio de biodiversidad poblacional de levaduras como parte del Proyecto Elaboración Artesanal del Queso de
Corrientes.
Referencias
Beresford, T. P., N. A. Fitzsimns, N. L. Brennan, and T. M. Cogan. 2001. Recent advances in cheese microbiology. Int.
Dairy J., 11:259-274.
Fox, P. F., P. L. H. McSweeney, and C. M. Lynch. 2000. Fundamental of cheese science. Gaitherburg: Aspen
Publishers, Inc.
Raibaud , P., M. Caulet, J.V. Galpin and G. Mocquot. (1961). Studies on the bacteial flora of the alimentary tract of
pigs. II. Streptpcocci: Selective enumeration and differentiation of the dominant group. Appl. Bacteriol. 24:285-291.
Software Infostat. 2002, versión 1.1. Grupo Infostat, F. C. A., Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.
Van del Tempel and M. Jakobsen. 1998. Yeasts associated with Danablu. Int.Dairy J., 8:25-31.
Vasek, O. M. 2003. Fermento autóctono para la elaboración de Queso Artesanal de Corrientes. Tesis Doctoral. Facultad
de Ciencias Exactas y Agrimensura. Universidad Nacional del Nordeste. Corrientes, Argentina.
Wouters, J. T. M., E. H. E. Ayad, J. Hugenholtz, and G. Smit. 2002. Microbes from raw milk for fermented dairy
products. Int. Dairy J., 12:91-109.