Resistencia al stress osmótico de levaduras aisladas de Queso

Resumen: E-042
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Resistencia al stress osmótico de levaduras aisladas
de Queso Artesanal de Corrientes.
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Cardozo, Marina C. - Vasek, O. M. - Fusco, A. J. V. - Carrasco, M. S.
1. Lab.de Bromatología - FaCENA -U.N.N.E. - Campus Avda.Libertad 5600 - Corrientes.
2. Facultad de Ingeniería Química - UNL - Santiago del Estero 2829 - Santa Fe.
e-mail:[email protected] Tel-fax: 03783-457996, int.110
Antecedentes
El principal grupo de microorganismos asociados a quesos es el constituido por bacterias del ácido láctico
(BAL), sin embargo es reconocido el hecho que las levaduras son un componente importante de la microflora de
muchas variedades de quesos (Corbo et al., 2001) y que pueden jugar un rol significativo durante la maduración,
contribuyendo positivamente al desarrollo del flavour o por el contrario, produciendo defectos en el producto (Viljoen
et al, 1995.).
El Queso Artesanal de Corrientes es un queso blando producido en las zonas rurales de la Provincia a partir de
leche cruda sin la adición de cultivo starter. Su maduración está caracterizada por el predominio de bacterias del ácido
láctico acompañadas de una biota levaduriforme muy significativa (Vasek et al., 2003).
Las condiciones ambientales que prevalecen en este queso durante la maduración: bajo pH, refrigeración,
elevado número de BAL y alto contenido de sal no inhiben el desarrollo de las levaduras, muy por el contrario
favorecen su crecimiento (Cardozo et al., 2005). Por ello, resulta interesante evaluar la influencia de estos factores sobre
la biota levaduriforme.
El objetivo de este trabajo fue estudiar la resistencia de levaduras aisladas de Queso Artesanal de Corrientes y sus
materias primas a distintas concentraciones de NaCl a fin de caracterizarlas en función de su potencial aplicación como
herramienta tecnológica en la producción lacto-casearia.
Materiales y Métodos
Manufactura de quesos. Se elaboraron un total de 8 quesos artesanales de Corrientes durante el período de un año.
Las producciones se realizaron en el mismo establecimiento sito en la localidad de Ramada Paso, provincia de
Corrientes. Los quesos fueron elaborados por el productor, con el agregado del fermento “Gaucho”, en una
concentración del 2 % (v/v), constituido por cepas de bacterias lácticas autóctonas de la provincia según Vasek et al.
Cada queso tuvo un tamaño medio de 1 kg. y una maduración de 30 días bajo condiciones de refrigeración en su lugar
de origen.
Muestras. Leche, agente coagulante, cuajada y quesos de 1, 6, 15 y 30 días de maduración fueron transportados al
laboratorio en frascos estériles bajo condiciones de refrigeración y analizados dentro de las 24 horas.
Recuento total y diferencial. Muestras de 10 g de cuajada y quesos fueron homogeneizadas con 90 mL de citrato de
sodio al 2 % (p/v), este homogenato constituyó la primera dilución de las muestras sólidas.
Diluciones decimales seriadas del homogenato, la leche y al agente coagulante fueron hechas en agua peptonada estéril
al 1 % (p/v).
Las diluciones apropiadas de cada muestra fueron sembradas por duplicado por el método de inoculación y vertido en
cajas de Petri, usando agar azul de bromofenol-cloranfenicol-glucosa-extracto de levadura (YGCB). Las placas fueron
incubadas a 30ºC durante 4 días.
Los recuentos de las colonias se realizaron con una lupa Olympus VM 1x-4x. El recuento diferencial de las colonias de
levaduras se realizó sobre la base de sus características macroscópicas y microscópias.
Aislamiento y purificación. De cada uno de los grupos de colonias macromorfológicamente iguales de la caja de
Petri crecida, se seleccionaron tres colonias.
Para su purificación, se sembraron alternativamente por pasajes sucesivos y al menos tres veces en medio líquido y
agarizado YM (Extracto de levadura, 3 g/l; extracto de malta, 3 g/l; peptona, 5 g/l; glucosa, 10 g/l; pH 6.0; esterilizado a
121ºC, 15 mín.) con la adición de 10 % cloranfenicol (500 mg cloranfenicol /100 mL de alcohol etílico 96º), con
incubación a 30 ºC durante 4 días como máximo, dependiendo de la velocidad de crecimiento, verificando su pureza por
microscopía directa.
Conservación. Las cepas puras, se activaron por dos pasajes sucesivos en caldo YM, se concentraron por
centrifugación (3500 r.p.m., 15 min.), se lavaron una vez con solución fisiológica (0.9 % NaCl), se resuspendieron al 60
% del volumen original en caldo YM con glicerol (15%) y se homogeneizaron. Esta suspensión celular concentrada se
empleó para conservar cada cepa de levadura pura por: a) inoculación por estría en superficie (agar YM) para su
conservación a corto plazo bajo refrigeración (4 ºC), y b) congelación a –20ºC, previo fraccionamiento en tubos
Eppendorf para su conservación a largo plazo.
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Respuesta a distintos valores de concentración de cloruro de sodio. Se empleó el medio basal YNB (glucosa, 5 g/l;
sulfato de amonio, 5g/l; fosfato dibásico de potasio, 0,85 g/l; sulfato de magnesio, 0,5 g/l; cloruro de calcio, 0,1 g/l;
cloruro de sodio, 0,1 g/l). Se agregó cloruro de sodio en los distintos porcentajes a evaluar: 10, 15 y 20 % y se esterilizó
a 121ºC durante 15 minutos.
46 cepas puras congeladas a caracterizar fueron sometidas a un descongelamiento rápido en baño maría a 40 ºC
y activadas por dos pasajes sucesivos en caldo YM (30 ºC). El cultivo activo fue lavado con solución fisiológica y
centrifugado (3000 rpm, 15 min.) dos veces, y resuspendido al 50 % del volumen original en dicha solución. Un inóculo
de 0.3 mL de estas suspensiones fue empleado para realizar cada uno de los ensayos. Se incubó a 30 ºC, durante 3
semanas.
El test fue considerado positivo cuando se observó presencia de turbidez.
Resultados
Se estudió la tolerancia de 46 cepas de levaduras a distintas concentraciones de NaCl. Se observó que todas las
levaduras evaluadas presentaron una alta resistencia a presiones osmóticas elevadas ya que ninguna experimentó
inhibición con concentraciones de NaCl del 10 %, en concordancia con lo encontrado por otros autores (Suzzi et al.,
2003).
Al analizar la influencia de mayores concentraciones de sal (15% y 20%) sobre el crecimiento levaduriforme
se observó que un porcentaje del 38% de la población toleraba una concentración del 15 % y que prácticamente un
quinto de la misma era capaz de crecer en presencia de NaCl en una concentración del 20 %.
Agrupando las cepas a través del análisis cluster (Fig. 1) en función de sus resistencias a altas concentraciones de NaCl,
se obtuvieron tres grupos:
-Grupo I: constituido por las levaduras que sólo toleraron hasta un 10 % NaCl
-Grupo II: levaduras que toleran hasta 15 % NaCl
-Grupo III: levaduras que toleran hasta 20 % NaCl
El grupo I agrupó al 63 % de la población total, el grupo II al 15 % de la misma y el III al 22 %.
Grupo II
Grupo III
Grupo I
0.00
0.17
0.35
0.52
0.70
Distancia
Figura 1. Dendrograma mostrando las relaciones de similitud de 46 levaduras aisladas durante la elaboración y
maduración de QAC en función de su resistencia a elevadas concentraciones de NaCl.
En la tabla 1 se presentan las frecuencias de resistencia, expresadas como porcentaje, a las distintas
concentraciones de NaCl de las levaduras aisladas de materias primas y quesos en distintos estados de maduración.
Todas las cepas aisladas del agente coagulante fueron capaces de tolerar las concentraciones máximas evaluadas.
Si tenemos en cuenta que el agente coagulante empleado en la elaboración de QAC es el suero obtenido de leche coagulada
por acción de las enzimas del cuajo (cuarto estómago de ternero secado y salado en una proporción de sal 1 + 2), podríamos
decir que las altas concentraciones de NaCl ejercerían una selección inicial sobre la población levaduriforme. Selección
que permite, que sólo las cepas de levaduras capaces de tolerar altas presiones osmóticas sobrevivan y predominen sobre las
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sensibles, y de hecho los resultados obtenidos confirman esta afirmación ya que el 100 % de las cepas aisladas de agente
coagulante presentaron las máximas resistencias a la sal.
Tabla 1. Frecuencia de resistencia a diferentes concentraciones de sal, expresada como porcentaje, de levaduras aisladas
durante la maduración y elaboración de QAC.
Muestra
a
leche
Agente
coagulante
Cuajada
Queso 1a
Queso 6a
Queso 15a
Queso 30a
10 % NaCl
100
100
100
100
100
100
100
15 % NaCl
43
100
80
53
66
33
33
20 % NaCl
14
100
40
25
17
33
33
Días de maduración
Por otro lado, las cepas aisladas de la cuajada también presentan una frecuencia elevada de resistencia cuando la
concentración es de 15 %, porcentaje que disminuye a la mitad cuando la concentración se incrementa al 20 %.
Si comparamos los porcentajes de resistencia de las levaduras de la leche, vemos que, para ambas concentraciones
evaluadas, estos son muchos más bajos que los correspondientes a las cepas provenientes de la cuajada, el agente
coagulante y las muestras de queso en sus primeros estadios de maduración.
Si consideramos sólo la frecuencia de aislamientos de leche capaces de tolerar concentraciones de 20 %, al
compararlas con las demás muestras se observa que presentan el valor más bajo, lo cual es concordante con el hecho de que
esta es la única muestra carente de sal.
Conclusiones
√ Las cepas de levaduras aisladas durante la elaboración y maduración de QAC
considerablemente elevadas de NaCl.
son resistentes a concentraciones
√ Las máximas concentraciones de sal encontradas en las condiciones de elaboración lacto-casearia no afectan al
crecimiento de las levaduras aisladas del agente coagulante.
La propiedad fisiológica del grupo microbiano estudiado en este trabajo se transforma en una propiedad de
interés tecnológico desde el punto de vista práctico, dado que, teniendo en cuenta la concentración de sal residual y
adicionada durante el proceso de elaboración, aún presentando propiedades de interés, estos microorganismos no
podrían utilizarse si fueran sensibles a este factor de estrés presente en la materia prima y esencial durante la
maduración.
La resistencia a elevadas presiones osmóticas de las levaduras salvajes aisladas del ambiente lácteo de Corrientes, es de
suma importancia al considerar que el objetivo final es utilizarlas como adjuntos al fermento “Gaucho” destinado a la
elaboración de Quesos Artesanales de Corrientes.
Referencias
- Cardozo, M. C.; O. M.Vasek, A. J. V. Fusco, M.S. Carrasco. Variación de la evolución de levaduras autóctonas en Queso
Artesanal de Corrientes en función de las estaciones. 2005. Comunicaciones Científicas y Tecnológicas, SeCyTUNNE.
-Corbo, M. R., R. Lanciotti, M. Albenzio, M. Sinigaglia. 2001. Occurrence and characterization of yeasts isolated from
milks and dairy products of Apulia region. Int. J. Food Microbiol., 69: 147-152.
- Suzzi, G., Schirone, M., Martuscell, M, Gatti, M., Fornasari, M. E., Neviani, E. 2003. Yeasts associated with Manteca.
FEMS Yeast Res., 3:159-166.
- Vasek, O. M. 2003. Fermento autóctono para la elaboración de Queso Artesanal de Corrientes. Tesis Doctoral. Facultad de
Ciencias Exactas y Agrimensura. Universidad Nacional del Nordeste. Corrientes, Argentina.
-Viljoen, B.C., Greyling, T. 1995. Yeasts associated with Cheddar and Gouda making. Int. J. Food Microbiol., 28: 79-88