información usuarios - secuenciacion sanger

SERVICIO DE SECUENCIACIÓN SANGER
UNIDAD DE GENÓMICA - Campus Moncloa
C.A.I. Genómica y Proteómica
Universidad Complutense de Madrid
INFORMACIÓN AL USUARIO
1.
2.
3.
4.
5.
SERVICIOS QUE SE OFRECEN
CONDICIONES QUE DEBEN CUMPLIR LAS MUESTRAS
INFORMACIÓN ADICIONAL
CÓMO HACER USO DEL SERVICIO
RESULTADOS
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1.- SERVICIOS QUE SE OFRECEN
Nuestro servicio de secuenciación automática ofrece la determinación de
secuencias de DNA a partir de moldes de DNA ya sean:
Productos de PCR
Plásmidos
BAC´s
Los primers utilizados para la reacción de secuenciación pueden ser
universales (consultar listado de los primers disponibles en el servicio en
el apartado de “información adicional”) o específicos (proporcionados por
el usuario).
El usuario puede elegir entre las siguientes modalidades de servicio:
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El usuario puede elegir entre las siguientes modalidades de servicio:

Secuenciación DNA+primer: las muestras deben contener una mezcla de 5 ul de
DNA y 1 ul de primer en un único tubo, partiendo de las concentraciones indicadas
en la TABLA1.

Secuenciación estándar: las muestras de DNA y los primers se envían en tubos
separados a las concentraciones indicadas en la TABLA 1.

Secuenciación con ajuste de concentración: las muestras de DNA se pueden
enviar a una concentración variable dentro de los rangos indicados en la TABLA 2 y
nosotros nos encargamos de ajustar la reacción.

Secuenciación express: el usuario envía la reacción de secuenciación ya
procesada y purificada, “lista para cargar” en el secuenciador. Servicio disponible
únicamente para envío de muestras en formato placa.
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2.- CONDICIONES QUE DEBEN CUMPLIR LAS MUESTRAS :
2.1- Secuenciación DNA+primer y Secuenciación estándar:
CONCENTRACIÓN: TABLA 1.
VOLUMEN:
-Secuenciación DNA+primer: 5 ul de DNA y 1 ul de primer (en un solo tubo)
-Secuenciación estándar: volumen mínimo por reacción de secuenciación
solicitada, 6 ul de DNA y 2 ul de primer (en tubos separados).
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2.2- Secuenciación con ajuste de concentración:
Las muestras pueden enviarse a la concentración que más convenga al usuario dentro
de los intervalos que a continuación se indican y nosotros nos encargamos de ajustar la
reacción. Para ello, es imprescindible indicar la concentración a la que se envía las
muestras en el correspondiente apartado de la solicitud de servicio.
CONCENTRACIÓN. TABLA 2
VOLUMEN:
-
Volumen mínimo por reacción de secuenciación solicitada: 6 ul de DNA y 2 ul de
primer (en tubos separados)
También existe la posibilidad de enviar las muestras sin cuantificar, solicitando nuestro
servicio de cuantificación de DNA. (Consultar tarifas)
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2.3- Secuenciación express**:
Las reacciones de secuenciación deben ser enviadas “listas para ser cargadas en
el secuenciador”. Ello supone que el usuario previamente tiene que haber realizado
los siguientes procesos en su laboratorio;
•
La reacción de secuenciación con la versión de BigDye "Terminator V3.1
Cycle Sequencing Kit".
•
La purificación de las reacciones de secuenciación para eliminar ddNTPs no
incorporados en la reacción, con alguno de los sistemas disponibles en el
mercado.
** Servicio disponible a partir de 48 muestras.
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3.- INFORMACIÓN ADICIONAL:
• PRIMERS UNIVERSALES A DISPOSICIÓN DEL USUARIO SIN COSTE
M13Rv: 5’ CAGGAAACAGCTATGACC 3’
M13Fw: 5’ TGTAAAACGACGGCCAGT 3’
Sp6: 5’ GATTTAGGTGACACTATAGAATAC 3’
T7: 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’
T3: 5’ ATTAACCCTCACTAAAG 3’
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• SECUENCIAS FALLIDAS
Los métodos empleados en nuestro servicio están diseñados para minimizar los casos de
secuencias fallidas. No obstante pueden producirse fallos debido a diferentes causas:
1) características de las muestras (DNA molde y/o primers),
2) información insuficiente por parte de usuario,
3) error operativo (funcionamiento del servicio).
Cuando los resultados no sean los esperados se procederá de la siguiente manera:
• Cuando se considere probable un error en el procesamiento de las reacciones de
secuenciación, las secuencias fallidas se repetirán sin coste para el usuario.
• En caso de que no se puedan determinar las causas y el usuario así lo solicite, se repetirá
el ensayo. Si la repetición de nuevo falla, se asumirá que no se ha debido a errores
operativos y la repetición se facturará.
Cuando el material proporcionado por el usuario no cumpla los requisitos de las tablas 1 y 2
anteriores o la información proporcionada sea incorrecta, la Unidad no se hará responsable
de los resultados. Si el usuario solicita la repetición del ensayo, ésta será facturada.
NOTA: se considera repetición siempre y cuando se trate del mismo DNA y primer.
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• RECOMENDACIONES
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS:
-
La calidad de los datos obtenidos va a depender en gran medida de la pureza y
correcta cuantificación de las muestras de ADN. Recomendamos utilizar métodos
de purificación y cuantificación fiables así como verificar la integridad y
concentración de las muestras.
-
Un factor importante es la correcta cuantificación del ADN. Si la cantidad de ADN
presente en la muestra es inferior a la necesaria, probablemente la reacción de
secuenciación fallará. La cuantificación se puede realizar mediante
espectrofotometría a 260 nm o bien mediante electroforesis en gel de agarosa junto
a un control de concentración conocida.
-
Recomendamos diluir las muestras en agua. Evitar los tampones de elución de DNA
de los kits comerciales y el tampón TE ya que la presencia de EDTA en la muestra
puede inhibir la reacción de secuenciación.
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4.- CÓMO HACER USO DEL SERVICIO:
• ¿Cómo darse de alta como usuario?
Para darse de alta como usuario simplemente hay que rellenar y enviar el formulario que
encontrará en la página web https://www.ucm.es/gyp/genomica-1
•
•
¿Cómo enviar las muestras?
Las muestras de ADN y los primers (debidamente identificados) pueden enviarse en
formato TUBO o PLACA.
•
Deben ir acompañados de una copia impresa de la SOLICITUD DE SERVICIO DE
SECUENCIACIÓN DE ADN. Las distintas modalidades de solicitud se pueden
descargar en la página https://www.ucm.es/gyp/solicitud-de-servicio-1
•
Esta misma solicitud debe enviarse por correo electrónico a la siguiente dirección:
[email protected]
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•
¿Cómo enviar las muestras? (cont.)
•
El ENVÍO DE MUESTRAS podrá realizarse por correo o bien ser entregadas en
persona en el laboratorio.
•
En determinados centros, el servicio de secuenciación de la Unidad de GenómicaCampus Moncloa, realiza una recogida diaria o semanal de muestras. Si está
interesado, consúltenos si su centro cuenta con este servicio.
•
Para evitar la rotura de los tubos/placas se recomienda el uso de sobres
acolchados.
•
La dirección postal a la que deben enviar las muestras es la siguiente:
Servicio de Secuenciación
Unidad de Genómica - Campus Moncloa
Facultad de Ciencias Biológicas - UCM
C/ José Antonio Nováis, 2
28040 Madrid
Tel.: (+34) 913 945 036
Fax: (+34) 913 944 883
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•
Gestión de muestras:
El usuario puede solicitar la devolución de las muestras y/o primers indicándolo en
el apartado de OBSERVACIONES de la solicitud de servicio. Podrá recogerlas en el
laboratorio en el plazo de un mes a partir de la entrega de resultados. Tras este
plazo las muestras se eliminarán siguiendo el plan de gestión de residuos de la
UCM.
5.- RESULTADOS:
El envío de resultados se realiza por correo electrónico a la/s dirección/es indicadas
en la solicitud de servicio. Los archivos de resultados de extensión Ab1 contienen el
electroferograma. Pueden abrirse con diversos programas de análisis de
secuencias o con visores gratuitos como los siguientes: Sequence Scanner
Software V1.0 (PC), Chromas (PC), BioEdit (PC), FinchTV (PC o Mac) o 4Peaks
(Mac).