ENSAYOS PARA RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS

LABORATORIO DE QUÍMICA ORGANICA 502502
GUÍA No 9: ENSAYOS PARA RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS
I. EL PROBLEMA
El carácter único de cada α aminoácido se debe a la estructura del grupo R. En los polipéptidos
los grupos R de los aminoácidos a menudo se denominan cadenas laterales y pueden variar desde
un átomo de hidrógeno, hasta estructuras complejas como el grupo guanidina, el propósito de esta
práctica es identificar algunos aminoácidos que presentan grupos característicos en las cadenas
laterales utilizando ensayos cualitativos y específicos para cada función.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO
Los aminoácidos tienen un papel primordial en la formación de los seres vivos, puesto que
constituyen los bloques fundamentales con que se forman las proteínas..
Entre las principales reacciones de identificación de los aminoácidos se encuentran las siguientes:
Reacción con la ninhidrina
El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta
azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e
hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene un grupo amido en la cadena lateral. Esta
reacción también identifica los grupos alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas.
Reacción de Millón
El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las sales de Mercurio a pH ácido,
formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de la tirosina y las proteínas que la
contienen.
Reacción Xantoprotéica
Los anillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos reaccionan con ácido nítrico concentrado
formando nitroderivados de color amarillo o anaranjado por lo cual esta reacción permite reconocer
la presencia de Tirosina, Fenilalanina y Triptófano.
Reacción de Sakaguchi
El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la Arginina reacciona con soluciones de alfanaftol en presencia de Bromo en medio alcalino formando complejos coloreados rosados o rojos.
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Reacción de Ehrlich
La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los
Aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanílico y nitrito de Sodio por
formación de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la presencia de
Tirosina e Histidina libres o formando péptidos y proteínas.
Reacción de Hopkins Cole
El anillo indólico presente en la cadena lateral de los alfa-aminoácidos libres o haciendo parte de
péptidos y proteínas se puede reconocer mediante reacción con el ácido glioxílico a pH ácido,
puesto que forma complejos de coloración violeta o amarillo violeta, permitiendo así identificar al
triptófano.
Reacción con acetato de Plomo alcalino
Los Aminoácidos azufrados como Metionina, Cisteina y Cistina se reconocen por la formación de
precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con
Acetato de Plomo en medio alcalino.
III. TEMAS DE CONSULTA
El preinforme debe contener los siguientes aspectos:
Investigar la clasificación de los aminoácidos desde los siguientes puntos de vista: Esenciales y no
esenciales para el hombre, ácidos y básicos en forma molecular, polares con carga y sin carga,
apolares.
Estudiar las estructuras, nombres y abreviaturas para los veinte aminoácidos que son usados en
la biosíntesis de proteínas.
Para cada aminoácido señale la cadena lateral o el grupo R e identifique las funciones presentes.
Defina proteínas
Estudie que aminoácidos están presentes en las siguientes proteínas1: Colágeno, albúmina,
IV. MATERIALES Y REACTIVOS
Las soluciones están propuestas para cada grupo de trabajo en el laboratorio, por ejemplo 10 ml
de ninhidrina para un grupo, si el curso es de 8 grupos se requieren máximo 80 ml de ninhidrina.
Materiales
15 Tubos de ensayo
2 Pipetas graduadas de 1 ml.
2 Pipetas graduadas de 2 ml.
2 Pipetas graduadas de 5 ml.
2 Vasos de precipitados de 250 ml.
1 Vasos de precipitados de 600 ml.
1 Embudo ordinario
1 Erlenmeyer de 125 ml.
1 Gradilla para tubo de ensayo
1 Pinza metálica para tubo de ensayo
1 Placa refractaria
1
El profesor le asignará alguna proteína para su experiencia en el laboratorio.
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1 Aro con nuez
Material general
Soportes
Para prevenir la contaminación de los reactivos: las soluciones que no estén en frasco gotero
deben tener una pipeta exclusiva y el monitor debe estar pendiente, que las pipetas no sean
intercambiadas durante al práctica.
Reactivos por cada grupo de trabajo:
10 ml de Ácido sulfúrico concentrado
12 ml de Ácido nítrico concentrado
10 ml de Ácido acético concentrado
Se requiere la preparación de los siguientes reactivos:
10 ml de Reactivo de ninhidrina : disolver 100 mg. de nilhidrina en 10 ml. de etanol a 95% y
completar a 100 ml con agua destilada
10 ml de Reactivo de millon:.disolver 1 g de mercurio en 1 ml. De ácido nítrico concentrado,
calentar suavemente, dejar enfriar y completar a 60 ml con agua
5 ml de Reactivo de sakaguchi: cuidadosamente disolver 2 g. De bromo en 100 ml. De NaOH al 5%
10 ml de Reactivo de Hopkins cole: ácido acético impurificado con trazas de ácido glioxílico
Soluciones
30 ml de Hidróxido de sodio 40%.
20 ml de Hidróxido de sodio 10 %.
10 ml de Hidróxido de amonio 10%
20 ml de Ácido clorhídrico 2%.
20 ml de Acetato de plomo 10%.
20 ml de Sulfato de cobre 0.5%.
10 ml de Nitrito de sodio 0.5% (fresco).
10 ml de Ácido sulfanílico 0.5% en HCl.
50 ml de Alfa-naftol 0.15%.
15 ml de Soluciones al 0.1% en agua acidulada de los siguientes aminoácidos
Cisteína ó metionina.
Glutamina ó asparragina.
Lisina ú ornitina.
Tirosina.
Fenil-alanina.
Prolina.
Arginina.
Histidina.
Triptófano.
Alanina.
Albúmina de huevo: separar la clara de un huevo y diluir en relación 1: 10 con agua destilada
Harina de trigo: dispersar 10 g. de harina de trigo en 100 ml. de agua caliente y filtrar a través de
gasa doble
No olvide pedir al profesor la muestra problema que va a analizar2
2
Soluciones problema sugeridas: colágeno, albúmina, gelatina, y las que el profesor considere
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V. PROCEDIMIENTO
Realice todos los ensayos en tubos limpios y secos
Ensayo con ninhidrina
Rotule cinco tubos de ensayo identificando cada uno como: blanco, alanina, problema, albúmina de
huevo, y proteína de trigo. A cada uno de los tubos de ensayo agregue 1 mL. de las respectivas
sustancias que indica el rótulo usando agua destilada para el tubo marcado como blanco. Adicione
a cada tubo 1 mL. de reactivo de Ninhidrina, caliente en baño de agua a ebullición por 10 min.
Observe los colores desarrollados y anote los resultados.
Ensayo de Millon
Rotule 6 tubos de ensayo identificados cada uno como: blanco, tirosina, fenil-alanina, problema,
albúmina de huevo y proteína de trigo. A cada uno de ellos agregue 2 mL. de la solución
correspondiente y 1 mL. de reactivo de Millon. Caliente en baño de agua en ebullición por 10 min.
observe los colores desarrollados y anote los resultados.
Ensayo Xantoprotéico
Rotule 6 tubos de ensayo de la misma manera que para el ensayo de Millon. Agregue a cada tubo
2 mL. de la solución correspondiente y 2 mL. de ácido nítrico concentrado. Caliente en baño de
agua a ebullición, la aparición de una coloración amarilla es una prueba positiva para aminoácidos
aromáticos. Deje enfriar y agregue a cada tubo de ensayo 1.5 mL. de NaOH 40%, el cambio de
color a anaranjado confirma la prueba.
Reacción de Sakaguchi
Rotule 5 tubos de ensayo como: blanco, arginina, problema, albúmina de huevo y proteína de trigo.
Agregue a cada uno 5 mL. de las soluciones correspondientes, enfríe en baño de hielo por 10 min.
y luego adicione 1 mL. de NaOH 40%, deje enfriar 10 min. más y luego agregue 5 mL. de α-naftol
y 3 gotas de Reactivo de Sakaguchi, la aparición de un color rosado o rojo es prueba positiva para
el grupo guanidinio.
Reacción de Ehlrich
En 5 tubos de ensayo rotulados como: blanco, triptófano, problema, albúmina de huevo, proteína
de trigo. Agregue a cada tubo en el siguiente orden: 1 mL de ácido sulfanilico 0.5% y 1 mL. de
Nitrito de sodio, mezcle bien y deje en reposo durante 15 min. luego a cada tubo agregue 1 mL. de
la solución correspondiente al rótulo. Mezcle y adicione a cada tubo 0.5 mL. de NH4OH 10%.
Observe y anote los resultados.
Reacción de Hopkins Cole
Rotule 5 tubos de ensayo como: blanco, triptófano, problema, albúmina de huevo y harina de trigo.
Adicione a cada uno 2 mL. de la solución correspondiente y 2 mL. del reactivo de Hopkins Cole.
Mezcle bien el contenido y adicione a cada tubo por las paredes lenta y cuidadosamente, sin
mezclar 1 mL. de ácido sulfúrico concentrado, la formación de un anillo violeta en la interfase es
prueba positiva para el triptófano.
Reacción con acetato de Plomo alcalino
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Rotule 6 tubos de ensayo como: blanco, metionina, cisterna, problema, albúmina de huevo y
proteína de trigo. En cada uno agregue 2 mL. de la solución correspondiente, 2 mL. de NaOH 10%
y 0.5 mL. de acetato de Plomo al 10%. Caliente en baño de agua a ebullición por 5 min. La
formación de un precipitado gris oscuro o negro es prueba positiva para aminoácidos azufrados.
VII. PARA EL ANÁLISIS DE LA PRACTICA
Con base en los resultados obtenidos para la solución problema, indique las características
estructurales e identifique hasta donde sea posible el tipo de aminoácidos que contienen las
proteínas analizadas.
Con base en los resultados obtenidos para los materiales biológicos que se ensayaron indique qué
tipo de aminoácidos se encuentran presentes.
Escriba las estructuras de los aminoácidos que analizó en cada prueba e identifique el grupo que
estaba reaccionando o el responsable de la coloración positiva del ensayo..
VIII. BIBLIOGRAFÍA
BOHINSKI. 1991 Bioquímica. 5ed., Pearson. México.
Mathews Van Holde . 2004 Bioquímica. 3 Ed Pearson. España
Fesenden and fesenden. 2002. Química orgánica. Interamericana. México
Ciencias Básicas
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