HPLC/CLAR

Análisis Funcional Orgánico
Cromatografía Líquida de
Alta Resolución (HPLC/CLAR)
PARTE A
Introducción
Técnicas instrumentales cromatográficas
1. Gaseosa líquida (CGL) o sólida (CGS)
2. Líquida de Alta Resolución (HPLC/CLAR)
HPLC-AFO
Introducción
Aplicabilidad
La muestra debe
disolverse en la FM
Amplio espectro de
compuestos
Ventajas
- Alta resolución, eficiencia y reproducibilidad
- Análisis rápidos, analíticos y preparativos
-Resultados cuantitativos buenos δstd < 5%
- Automatización
-Límites de detección buenos
UV-Vis (depende de λ) 10-10 g
Fluorescencia 10-12 g
Desventajas
-Costo inicial alto y operacional medio
-Muestra debe ser soluble
-Requiere uso de patrones
-Difícil resolución en muestras complejas
-Detectores universales
Índice de refracción poco sensible 10-6 g
EM inversión inicial alta
HPLC-AFO
Introducción
Teoría: Conceptos básicos
Respuesta del Detector
1. Eficiencia (N° platos teóricos)
HPLC-AFO
tR Tiempo de retención
Wt Ancho de pico en la base
W1/2 Ancho de pico a media altura
A mayor valor de N mayor eficiencia
Parámetros que afectan la eficiencia:
•
Flujo
•
Longitud de la columna
•
Diámetro de partícula (relleno)
•
Distrución del diámetro partícula
Introducción
Teoría: Conceptos básicos
2. Factor de retención (factor de capacidad)
Respuesta del Detector
Mide el período de tiempo que la muestra
reside en la fase estacionaria relativo al
tiempo que lo hace en la fase móvil. Se calcula
en función tR y t0.
Parámetros que afectan a k:
•
•
•
•
Fase móvil (tipo de solvente de elución)
Composición de la fase móvil
Fase estacionaria
Naturaleza del analito
HPLC-AFO
Introducción
Teoría: Conceptos básicos
3. Selectividad o factor de separación
Respuesta del Detector
α= selectividad k2= Factor de retención de 2
K1= Factor de retención de 1
Parámetros que afectan la selectividad:
•
•
•
•
•
α=1 los analitos eluyen juntos
HPLC-AFO
Fase estacionaria
Naturaleza del analito
Aditivos del solvente de elución
Temperatura de trabajo
Composición fase móvil
(analitos ionizables)
Introducción
Teoría: Conceptos básicos
4. Resolución
Parámetros que afectan la resolución:
El valor de α es el más influyente en el
cambio de la resolución.
Los parámetros que influencian a α lo
hacen sobre Rs
Valores de Rs
0,6 valle entre picos. Muy bajo.
1,0 mínimo valor para cuantificar.
1,2 valor práctico de trabajo.
1,6 valor ideal.
HPLC-AFO
Introducción
Teoría: Conceptos básicos
Ecuación de Van Deemter
Valores de H menores
hacen el proceso más
eficiente
Partícula chica
Altura de
plato teórico
Partícula grande
Suma: Curva de
Van Deemter
Resistencia a la
transferencia de
masa FM y FE
Difusión
longitudinal
Proceso multipaso
o difusión Eddy
Velocidad Lineal
HPLC-AFO
H disminuye al reducir el
tamaño de partícula
Introducción
Componentes del equipo
4. Inyector
1. Reservorio de Fase móvil
3. Mezclador
2. Bombas
5, Columna
3. Mezclador
6. Control
Temparatura
4. Inyector
2. Bombas
5. Columna
2. Bombas
6. Control de temperatura
7. Detector
7. Detector
1. FM
8. Sistema de adquisición y
procesado de datos
1. Solventes
8. Adquisición y Procesado de datos
HPLC-AFO
1. Fase móvil
Requisitos
• Pureza grado HPLC/UV
• Compatible con el detector
• Solubilice el analito
• Baja viscosidad
• Libre de impurezas sólidas
•Precio accesible
• Fase normal: principalmente no polar
• Fase reversa: água + otro solvente orgánico
(metanol, acetonitrilo, THF)
Preparación
HPLC-AFO
• Filtración al vacío.
• Desgasificación
1. Fase móvil
Mezclas de solventes
Generalmente se usan mezclas de solventes. En modo isocrático dependiendo de la complejidad
no se utiliza el sistema de mezclado del equipo.
Siempre consultar tablas de
propiedades y miscibilidades para
evitar inconvenientes
HPLC-AFO
1. Fase móvil
Longitud de onda de corte (cut off)
Es la longitud de onda a la que la absorbancia del solvente es igual a 1 UA
(unidades de absorbancia) usando agua en la celda de referencia (1 cm
longitud de camino óptico)
Solvente
λ de corte
Solvente
λ de corte
Acetonitrilo
190
Tetrahidrofurano
212
Pentano
190
Diclorometano
233
Agua
190
Cloroformo
245
Hexano
195
Acetato de etilo
256
Metanol
205
Iso-Octane
215
Etil alcohol
210
Isobutyl Alcohol
220
Ácido trifluoroacético
210
HPLC-AFO
1. Fase móvil
Para compuestos ionizables,
como los ácidos o bases
orgánicas, se recomienda
controlar el pH y la fuerza
iónica.
El rango de pH recomendado
es de pH 2-4
El pH de trabajo es +/- 1
unidad de pH con respecto al
pKa o pKb de los analitos. Se
trabaja generalmente con un
predominio de la especie no
ionizada. El pH se ajusta
siempre en el componente
acuoso
HPLC-AFO
1. Fase móvil
Preparación
Membrana de Nylon
La fase móvil no debe tener partículas en suspensión
filtrarla cuidadosamente cada vez que se usa
Importancia desgasificación
Equipo para
filtrar solventes
de HPLC
Métodos
1.
2.
3.
4.
HPLC-AFO
Ultrasonido
Vacío
Saturación con He o N2
Desgasificación ¨on-line¨
2. Bombas y tuberías
Tipos de bomba
Tuberías
A. Reciprocante
Bomba a diafragma
B. Bomba jeringa
Modos de utilización
A. Isocrático
B. Gradiente
HPLC-AFO
4. Inyector
A. Flujo normal
B. Agregado de muestra
bomba
Jeringa punta roma
Manual y automático
bomba
loop
columna
columna
C. Ingreso al sistema
bomba
columna
HPLC-AFO
5. Columna
Tipos
Analítica: Interesa saber cuántos componentes hay, cuánto hay de cada uno (cuantificar), pero no me
interesa colectarlos por separado. Cantidad de muestra < 0.1 mg
Preparativa: Interesa separar todos los componentes y colectarlos por separado para después analizarlos
individualmente. Cantidad de muestra desde 1 mg hasta 100-200 mg
UHPLC (Ultra high
pressure liquid
chromatography):
Para reducir los tiempos de
análisis y con resolución
mejorada. Columnas de 1,82
µm
de
tamaño
de
partícula, columnas cortas (5
cm). Mejor resolución y
eficiencia.
La
presión
aumenta a 600-1200 bar.
HPLC-AFO
5. Columna
HPLC-AFO
5. Columna
Características
HPLC-AFO
5. Columna
Fabricación de las fases
Silanoles
libres
Uniones hidrógeno
entre silanoles
vecinales
Superficie de la sílica
HPLC-AFO
uniones
siloxano
5. Columna
Estrategias de cobertura
No cubierta
HPLC-AFO
Impedimento
estérico. No
cubierta
Recubierta en dos
etapas.
Endcapped
Recubierta