Comparación HPLC - CG - Departamento de Química Orgánica

ANÁLISIS FUNCIONAL ORGÁNICO
1º cuatrimestre 2013
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
Cromatografía líquida de alta resolución
(CLAR)
Diseño instrumental de HPLC
Muestra
Inyector
Mezclador
Bombas
Cromatograma
Columna
(fase fija)
Detector
Solventes (fase móvil)
Descarte
Comparación HPLC - CG
Propiedad
HPLC
CG
Volatilidad de la
muestra
No es requisito
Muestra soluble en
fase móvil
Es un requisito
Polaridad de
analitos
Iónicos, polares, no
polares
Polares, no polares
Estabilidad térmica
Análisis a
T amb o menor
(Tmáx 60 ºC)
Es un requisito
(inyector, columna)
Peso molecular
No hay límite
teórico superior
(solubilidad)
Típicamente hasta
500-600
(volatilidad)
Comparación HPLC – CG (cont.)
Propiedad
HPLC
CG
Preparación de la
muestra
Filtrar
Sv inyección = fase
móvil (idealmente)
Sv inyección volátil,
eluye antes que los
analitos (idealmente)
Escala
Analítica, preparativa
Analítica
Separación
Fase móvil, fase
estacionaria
Gas carrier
Fase estacionaria
(temperatura)
Detectores
Más común UV-vis
Muchos no
destructivos
HPLC-MS
Más común FID
GC-MS
Conceptos teóricos básicos
tR,B
Eficiencia (Nº platos teóricos)
tR,A
N = 16 (tR/wt)2 = 5,54 (tR/w1/2)2
tR,C
Parámetros de columna
t0
Fase móvil (viscosidad)
W1/2
Wt
Velocidad de flujo de solvente
Analitos
Conceptos teóricos básicos
Factor de retención
(factor de capacidad)
k = (tR-t0)/ t0
tR,B
Tiempo en fase estacionaria vs
tiempo en fase móvil
tR,A
tR,C
t0
W1/2
Wt
Conceptos teóricos básicos
Selectividad o factor de
separación
α= k2/ k1 = (tR,B-t0)/ (tR,A-t0)
tR,B
α≥1
tR,A
Composición de fase móvil
Composición de fase estacionaria
Temperatura
tR,C
t0
W1/2
Wt
Conceptos teóricos básicos
tR,B
tR,A
tR,C
t0
W1/2
Wt
Resolución
Conceptos teóricos básicos
Selectividad tiene el
mayor impacto sobre
resolución (fase
estacionaria, fase móvil)
Rs = 0,6 ⇒ valle entre picos
Rs = 1⇒ permite cuantificar
Rs = 1,6-1,7⇒ cuantificación
confiable
Conceptos teóricos básicos
Cambio de
presión
Viscosidad
Velocidad
de flujo
Longitud de
columna
Radio de la
columna
Diámetro de
partícula
Conceptos teóricos básicos
Altura de plato (H)
Ecuación de van Deemter
Hmín
uopt
Velocidad lineal (u)
A menor altura de plato, hay mayor número de platos y es mayor la resolución
cromatográfica
Conceptos teóricos básicos
Retención con gradiente de solvente
Tiempo de
gradiente
Velocidad
de flujo
Volumen muerto de
columna
Cambio de fracción
en volumen del
solvente B
Desarrollo de un método para HPLC
-Modos de HPLC
-Elección de dimensiones de la columna y tamaño de partícula
-Elección de fase estacionaria
-Aplicación a fase reversa
-Selección de fase estacionaria
-Selección de fase móvil
-pH
-Optimización de condiciones
-Desarrollo de condiciones para otros modos cromatográficos
Variables: fase estacionaria y fase móvil
Elección del modo cromatográfico
-Fase reversa (RP, reverse phase)
-Fase normal
-HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography),
[ANC (aqueous normal phase)]
-Intercambio iónico (IEC)
-Exclusión por tamaño (SEC) sistema acuoso
Permeación por geles (GPC) sistema no acuoso
Selección determinada por -tipo de analito y su solubilidad
-peso molecular del analito
-matriz de la muestra
-disponibilidad de fase estacionaria y columna
Fase reversa es aplicable a
analitos iónicos, polares y no
polares.
Selección adecuada de
condiciones.
Varios modos
posibles para un
mismo tipo de
analito
Elección de dimensiones de la columna y tamaño de partícula
Columna HPLC
Dimensiones de
columna
Fase estacionaria
Tipo de
superficie
Tamaño de
poro
Propiedades químicas
Selectividad,
factor de retención
Tamaño de
partícula
Largo
Propiedades físicas
Eficiencia,
velocidad de análisis
Diámetro
interno
Algunas especificaciones de columnas para cromatografía líquida
Tamaño de partícula
-Tradicional 5 μm, tendencia actual 3 μm
-UHPLC (Ultra high pressure liquid chromatography)
Para mayor velocidad de análisis y/o mayor resolución → 1,8-2 μm, en combinación con
columnas cortas (50 mm o menos).
Partículas más pequeñas: mejoran resolución, eficiencia y tiempo de análisis;
aumenta la presión de trabajo (600-1200 bar)
Clasificación según tiempo de análisis:
fast
≤ 10 min
ultra fast ≤ 1min
-Se desarrolaron recientemente partículas superficialmente porosas (SPP), tienen un core
sólido (1,7 μm) recubierto con una capa porosa de sílica (0,5 μm de espesor).
Separación superficial ⇒ disminuye difusión
Ventaja: resolución similar a partículas de 1,8 μm a menor presión de trabajo (<400 bar) ⇒
se puede aumentar la velocidad de flujo, menor tiempo de análisis
Algunas especificaciones de columnas para cromatografía líquida (cont)
Dimensiones de columna
-Tradicional para desarrollo analítico:
4,6 x 150 mm; 5 μm
4,6 x 100 mm; 5 μm
4,6 x 250 mm; 5 μm
Tendencia actual:
4,6 x 100 mm; 3 μm (partícula común)
4,6 x 100 mm; 2,7 μm (partícula porosa)
-Columnas de menor diámetro interno para mejorar sensibilidad o
cuando la muestra es limitada
Nano → muestra < 1 pg; velocidad de solvente: nl/min
Capilar → muestra pg-ng; velocidad de solvente: 4 μl/min
Microbore → muestra ng-μg; velocidad de solvente: 40 μl/min
Dimensiones de columna
Diámetros de columna según su aplicación
-Análisis de alta capacidad de muestras (high throughput) → Longitud ↓, partícula < 2 μm
- Muestra compleja con varios componentes → Longitud ↑, partícula pequeña (P ↑)
-LC-MS → diámetro ↓ (≤ 2,1 mm), velocidad de flujo ↓
-Cromatografía preparativa → diámetro ↑ (10-50 mm), partículas grandes (5-10 μm),
velocidad de flujo ↑
Fase estacionaria – Modo fase reversa
Principio:
Partición de analitos entre fase estacionaria no polar y fase móvil polar.
Interacciones no polares y no específicas de los analitos con la fase estacionaria hidrofóbica.
Fases estacionarias ligadas:
grupos hidrofóbicos unidos a los grupos silanoles (SiOH) de la sílica.
-C18
-C8
-C3
-fenilo
Fase móvil
-agua, con control de pH opcional (buffer, ácido o base)
-solvente orgánico miscible con agua
Separación de moléculas no polares, polares, ionizables y iónicas
Se mejora la retención de compuestos ionizables por agregado de un modificador a la fase móvil.
Regla general:
los analitos de mayor tamaño (proteínas, PM > 2000) se analizan en columnas de fase reversa de
cadena corta (C3, CN) con poro grande (300 Å); los analitos más pequeños (PM < 2000) se separan
en columnas de cadena más larga (C8, C18) con poro menor (80-120 Å).
Fase estacionaria – Modo fase reversa
Diferentes estrategias para distribuir las cadenas hidrofóbicas sobre los SiOH
OH
OH
No recubierta
Recubierta
Protegida
estéricamente
(end capped)
No recubierta
Fase estacionaria – Modo fase reversa
Recubierta,
mayor estabilidad al pH
(hasta pH 11)
Fase móvil – Modo fase reversa
H2O + modificador orgánico: acetonitrilo, metanol (THF, i-propanol)
Cambio en fase móvil → Variación en selectividad y retención de muestras.
La solubilidad de la muestra puede condicionar la selección de la fase móvil.
Es importante controlar el pH y la fuerza iónica de la fase móvil cuando los analitos son
compuestos ionizables o iónicos. Se recomienda trabajar a pH 2-4.
pH de trabajo: ± 1 unidad de pH con respecto a pKa o pKb de los solutos analizados (90% de
predominio de especies no ionizadas). Ajustar el pH sobre el componente acuoso.
Fase móvil – Modo fase reversa
Siempre considerar a la fase móvil como una
potencial fuente de problemas para la columna.
Consultar tablas de propiedades de solventes y
miscibilidades.
Usar solventes frescos (cambio de composición
o contaminación).
Asegurar la desgasificación de los solventes:
-Desplazamiento con un gas menos soluble (He)
-Vacío
-Sonicación
-Calentamiento
Fase móvil – Modo fase reversa
En lo posible preparar la muestra un solvente de la misma composición que la fase móvil para
evitar distorsiones por solventes con gran poder de elución.
pH de la fase móvil – Modo fase reversa
Supresión iónica: regulación del pH de la fase móvil para evitar la ionización de los analitos y
mejorar su retención en la fase fija.
Un buffer es efectivo para regular el pH a ± 1 unidad con respecto a su pK.
Ejemplo: buffer acético/acetato tiene pKa 4,8, regula a pH 3,8-5,8.
pH de la fase móvil – Modo fase reversa
pH de la fase móvil – Modo fase reversa
- Par iónico: alternativa a supresión iónica.
Fase unida
Reactivo de par iónico
SO3 Na+
SO3
+
H
R
N
R
R
Separación de bases con
alquilsulfonatos
Ácido Trifluoroacético (TFA)
Ácido Heptafluorobutírico (HFTBA)
Ácido Hexanosulfónico
- Compuestos básicos: muchas veces no es necesario trabajar a pH alto, que puede dañar
la columna.
- Ionización potencial de los SiOH a pH ~7 ⇒ SiO- ⇒ aumenta la retención de cationes
(aminas protonadas), interacción secundaria, ensanchamiento del pico cromatográfico. Se
evita a pH bajo. Otra opción: columnas end-capped, recubiertas.
pH de la fase móvil – Modo fase reversa
Es posible usar una fase móvil sin buffer, simplemente una fase acuosa ácida
Detector UV:
La fase móvil y en particular el buffer deben ser transparentes a la λ de medición ⇒ solvente y
buffer con cutoff < 220 nm ⇒ sales de ácido fosfórico + acetonitrilo.
Desventaja: no se debe exceder 70% de solvente orgánico debido a la baja solubilidad de las
sales de fosfato.
pH de la fase móvil – Modo fase reversa
Detector espectrómetro de masa:
Se deben excluir materiales no volátiles de la fase móvil para no dañar la fuente
de ionización ⇒ se evitan sales de fosfato y contraiones no volátiles; se evitan
TEA y TFA que presentan supresión iónica en la fuente de ionización.
Se usan sales de amonio de buffer formiato y acetato, que no sirven para
detector UV.
Idealmente, ambas fases móviles (A = acuosa, B = orgánica) deberían tener el
mismo contenido de buffer, de modo que cuando se use un gradiente de
solvente sólo varíe la proporción de fase orgánica.
Optimización de condiciones – Modo fase reversa
1)
Isocrática
Para un método de control de calidad, se reducen variables.
2) Gradiente
Para una muestra compleja con un rango amplio de tR de los analitos.
Optimización de condiciones – Modo fase reversa
1)
Isocrática
Se varía %B de modo que 1 ≤ k ≤ 10.
Se comienza con %B alto para asegurar elución de todos los analitos, se va reduciendo
10-20% (¡cuidado con el uso de buffer!)
-Buena resolución
-Análisis rápido
Optimización de condiciones – Modo fase reversa
Luego de optimizar la retención, si no se logró resolución adecuada,
se varía la selectividad (α):
Temperatura
pH
Tipo de buffer (acetato, formiato, fosfato)
Modificador orgánico (acetonitrilo, metanol, mezclas)
Velocidad de flujo de solvente
Optimización de condiciones – Modo fase reversa
2) Gradiente
Se comienza con un amplio rango de %B en poco tiempo, luego se ajusta la retención k*
Análisis antidoping en orina humana – SPE - LC- ESI - TOF
Detección de 124 analitos, incluyendo estimulantes, β-bloqueantes,
narcóticos, agonistas β-adrenérgicos,
antiestrogénicos, diuréticos y cannabinoides.
Columna C18 2 x 100 mm; 3 μm.
Fase móvil:
A: 5 mM NH4Ac en HCOOH 0,1%;
B: acetonitrilo.
Gradiente: 10% a 40% B en 10 min; a 75% B en
13,5 min; a 80% en 16 min; 5 min a 80% B.
Equilibrio post-run 6 min.
Flujo de solvente: 0,3 ml/min
metilfenidato
(m/z 234,1489)
Muestra de orina adquirida luego de
administrar metilfenidato:
a) Cromatograma TIC;
b) Cromatograma reconstituido por
superposición de iones específicos
correspondientes a metilfenidato (m/z
234,1489), su metabolito ácido ritalínico (m/z
220,1332) y dibenzepina (m/z 296,1757) como
estándar interno
Ac. ritalínico
(m/z 220,1332)
Rango m/z: 50-800
Resolución promedio: 10000 para m/z 300
ESI, modo +, [M+H]+
Identificación en base a tiempo de
retención, masa exacta y pattern
isotópico.
metilfenidato
(m/z 234,1489)
Ac. ritalínico
(m/z 220,1332)
Anal. Clin. Acta 2007, 585, 94-102.
Elección del modo cromatográfico
-Fase reversa (RP, reverse phase)
-Fase normal
-HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography),
[ANC (aqueous normal phase)]
-Intercambio iónico (IEC)
-Exclusión por tamaño (SEC) sistema acuoso
Permeación por geles (GPC) sistema no acuoso
Fase estacionaria: sílica, otras fases polares como amino (RNH2), diol (RCHOHCH2OH) o
ciano (RCN), en orden decreciente de polaridad.
Fase móvil no polar inmiscible con agua: hidrocarburos, CH2Cl2, EtOAc.
Los compuestos más polares son más retenidos.
Razones para usar fase normal: -mayor retención de compuestos polares
-elución de compuestos hidrofóbicos muy retenidos en RP
-separación de isómeros
-solvente de inyección inmiscible con agua
-separaciones preparativas
-recuperación de muestra en solvente no polar
HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)
Fase estacionaria: polar.
Fase móvil no polar miscible con agua, con un pequeño porcentaje de agua (≥ 2,5% en volumen).
Los compuestos hidrofílicos, polares o cargados son más retenidos que los compuestos
hidrofóbicos. El agregado de agua a la fase móvil reduce la retención ⇒ picos agudos para
analitos polares (≠ fase normal).
Útil para compuestos muy polares poco retenidos en RP ⇒ modo complementario a RP
Fácilmente adaptable a equipos acoplados a espectrómetro de masa.
Cuando se usa fase móvil con alta proporción de solvente orgánico aumenta la sensibilidad de MS
debido a que se reduce la supresión iónica de la fuente (con respecto a buffer acuosos).
Optimización de los siguientes parámetros:
Fase estacionaria:
sílica,
amino (RNH2),
modo mixto (alquil-diol, alquil-carboxilo, C18-amida, aromáticociano, alquil-hidroxilo, etc)
zwitteriónico (tetraalquilamonio-sulfónico)
Concentración de solvente orgánico
Tipo de buffer y concentración (si se usa)
pH
Temperatura
HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)
Paroxetina
m/z 330 → 192
Gradiente: 5% B a 90% B en 10 min
RP C18
Ranitidina
m/z 315 → 176
A: HCOOHNH4 8mM en H2O
B: HCOOHNH4 8mM en 95% acetonitrilo
Paroxetina
m/z 330 → 192
Ranitidina
m/z 315 → 176
HILIC
LC-MS/MS
Gradiente: 100% B a 50% B en 10 min
Selección de los iones
Paroxetina
m/z = 330
192,0
[M+1]+
330,2
Ranitidina
175,9
m/z = 315
[M+1]+
315,1
Varias consideraciones importantes
Preparación de muestras
Muestras libre de interferencias, compatible con el método de separación y detección
seleccionados.
Filtrar la muestra: a medida que disminuye el tamaño de partícula, disminuye también el
fritado de la columna. Bloqueo de capilares, fritados, ingreso a la columna, detector.
Filtrar la fase móvil. Daños en válvulas, sellos, pistones, agujas y jeringas, tubería
capilar.
HPLC estándar: filtro 0,45 μm
UHPLC: filtro 0,22 μm
Lavar la columna, lavar el buffer, dejar con fase móvil: agua/solvente orgánico.
Usar fases móviles miscibles con el solvente de inyección de la muestra.
Usar la columna hasta un 10% por debajo del límite máximo de presión (¡ver manual!),
regular las velocidades de flujo de solvente.
Seguir la dirección de flujo marcada en la columna.
Evitar ajustar excesivamente las roscas (fittings) de las columnas al colocarlas o
sacarlas del equipo.
Bibliografía
-The LC Handbook. Guide to LC columns and method development. Agilent. 2011.
Publication number 5990-7595EN.
www.chem.agilent.com\Library\primers\public\LC-Handbook-Complete-2.pdf
-Agilent ZORBAX column guide selection.
-The basics of HILIC. www.sepscience.com
-Trends in universal detection in high performance liquid chromatography. Joshi, P. B.;
Bhoir, S. I.; Bhagwat, A. M. www.sepscience.com