Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 1

Físico Química de Biomoléculas
Licenciatura en Biotecnología
PRACTICA 4
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
1.- OBJETIVO:
El objetivo fundamental de la practica es la comprobación de la migración
electroforética de los aminoácidos sometidos a un campo eléctrico en función de su
carga y PI
2.- FUNDAMENTO:
a) PUNTO ISOELECTRICO
Los aminoácidos son moléculas que poseen, al menos, dos grupos ionizables, un
amino y un carboxilo. A un pH adecuado (pH 7,4) toman la forma de ion dipolar. Para
el aminoácido más sencillo, la glicina (Gly), la estructura ion dipolar se le denomina
glicina isoeléctrica, por tener igual número de cargas positivas y negativas:
En medio ácido, la forma dipolar puede aceptar un protón (H+) en el grupo
carboxilato (- COO-), y también puede en medio alcalino, perder un protón (H+) del
grupo (- NH3+).
Al pasar de pH muy ácido a pH muy alcalino, la evolución de las cargas en la
representación de Bronsted del aminoácido glicina, sería:
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El aminoácido glicina es un ácido diprótico, que se caracteriza por tener dos constantes
de ionización y por consiguiente dos pKs:
* El primero (pK1) corresponde a la disociación del grupo carboxilo
(- COOH).
* El segundo (pK2) corresponde a la disociación del grupo amino (-NH3+).
Entre estos dos pK se sitúa el punto de equivalencia de las dos disociaciones iónicas: se
conoce como punto isoeléctrico (pHi), para el cual las cargas (+) y (-) se encuentran en
equilibrio. A este pHi, la movilidad del aminoácido es nula cuando se encuentra situado
en un campo eléctrico.
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Para la glicina:
pH < pI
pH=pI
pH > pI
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅
R-CH-COOH
R-CH-COOR-CH-COONH3+
NH3+
NH2
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅
carga neta:
+1
0
-1
Para un aminoácido básico, serían:
pH << pI
pH < pI
pH = pI
pH > pI
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅
NH3+
NH3+
NH3+
NH2
|
|
|
|
R-CH-COO
R-CH-COOR-CH-COOH
R-CH-COO
|
|
|
|
+
+
NH3
NH3
NH2
NH2
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅
carga neta:
+2
+1
0
-1
b) Electroforesis
Por electroforesis se entiende el método basado en el movimiento de iones o
moléculas cargadas por acción de un campo eléctrico. En la Bioquímica y Biología
Molecular sirve para la separación e identificación de biomoléculas. La electroforesis se
aplica en el campo de la Bioquímica a la separación de compuestos que poseen grupos
ionizables (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos) teniendo en cuenta que la
carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren.
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Una partícula cargada en un campo eléctrico intenso esta sometida a dos fuerzas
importantes, la fuerza eléctrica proporcional a la carga y al campo eléctrico, y una
fuerza hidrodinámica de frenado debido a la viscosidad del medio, obtenida mediante la
ley de Stokes. En cambio, se puede despreciar en este análisis otra fuerza debida a la
agitación térmica llamada fuerza browniana y que causa la difusión de las partículas.
Fel = ezE ,
donde e es la carga elemental, z la carga iónica, y E el campo eléctrico igual a
V/d, con V la diferencia de potencial aplicada y d la distancia entre electrodos.
FStokes = 6πηav ,
es la viscosidad del medio, a el radio de la partícula supuesta esférica y v
donde
su velocidad.
La fuerza de Stokes es proporcional a la velocidad, por lo que al someter la
partícula al campo eléctrico, ésta acelera en un lapso de tiempo muy breve hasta que las
dos fuerzas queden iguales, la partícula ha alcanzado la velocidad límite. Equiparando
las dos fuerzas se obtiene la expresión para la velocidad límite:
v=
ez
6πηa
E = uE ,
donde se ha introducido u, la mobilidad electroforética. La velocidad de migración
de la partícula es proporcional al campo eléctrico aplicado y a la mobilidad
electroforética:
u=
ez
6πηa
De esta última fórmula, se deduce que la mobilidad electroforética es proporcional
a la carga de la molécula, pero es inversamente proporcional a su tamaño (a) y a la
viscosidad de la solución ( ).
Entre los distintos métodos de electroforesis que se utilizan, cabe destacar:
· La electroforesis de zona, que se realiza en distintos soportes, tales como papel,
acetato de celulosa, almidón, agar, poliacrilamida, etc., a bajos (6 V/cm) o altos
campos eléctricos (20 V/cm), y en presencia o ausencia de agentes
desnaturalizantes.
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· La inmuno-electroforesis, que combina la electroforesis en agar con la reacción
de precipitación específica antígeno-anticuerpo.
· La electrofocalización o electroenfoque, que separa en base al punto
isoeléctrico de la biomolécula. Se emplea fundamentalmente para proteínas.
La electroforesis que se va a realizar en la práctica es la zonal en papel de
celulosa. Se va a aplicar a la separación de los aminoácidos glicina (Gly), leu (Leu),
ácido aspártico (Asp) y lisina (Lys).
En el transporte electroforético, a la fuerza del campo se opone la resistencia viscosa
del medio, produciéndose cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de
las partículas.
La fuerza iónica de la solución tampón tiene una importancia fundamental en la
electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migración de los solutos
más rápidas y con menor desprendimiento de calor.
La fuerza impulsora de la separación es el campo eléctrico. La fuerza retardadora
es la interacción del soporte con las moléculas cargadas a separar. A igualdad de campo
eléctrico, tamaño de las moléculas y viscosidad de la solución, el único parámetro que
afecta a la separación es la carga, dependiente a su vez del pH del medio. La celulosa
del papel hace de soporte para la emigración de los iones y del medio conductor de la
corriente entre los electrodos, a través de una solución tampón de pH.
Los aminoácidos al situarlos en el medio tamponado de pH característico,
adquirirán una determinada carga de acuerdo con la naturaleza ionizable de sus grupos
funcionales.
Por tanto, la separación de una mezcla de aminoácidos por electroforesis consistirá
en la emigración de los aminoácidos cargados positivamente hacia el electrodo
denominado cátodo (polo negativo), o al electrodo opuesto llamado ánodo (polo
positivo) si están cargados negativamente, o no se desplazarán si la carga neta del
aminoácido es nula.
Puesto que el tampón de electroforesis que se va a utilizar en la práctica está
constituido por piridina/ácido acético glacial/agua de pH = 6,1, se puede predecir la
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carga que tendrá cada uno de los aminoácidos a dicho pH y si el aminoácido, por tanto,
emigrará al cátodo, al ánodo o permanecerá en el origen o punto de aplicación de la
muestra.
Como el parámetro que define la carga de una molécula de aminoácido es el
punto isoeléctrico (pI), si se conocen o calculan los valores de pI para cada aminoácido
que se va a ensayar, la carga que mostrarán al pH de la experimentación y la emigración
que sufrirán por acción del campo eléctrico, es fácil determinarlas para cada uno de los
aminoácidos.
Aminoácido
Gly
Leu
Asp
Lys
pI
5,97
5,98
2,77
9,74
Carga a
0
0
(-)
(+)
Origen
Origen
Ánodo
Cátodo
pH=6,1
Emigración
Predicción del comportamiento electroforético de los aminoácidos
En resumen, puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en un
campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga
eléctrica, 2) su tamaño, 3) la intensidad del campo eléctrico y 4) la temperatura del medio.
Si la molécula tiene carga positiva migrará hacia el cátodo; si tiene carga negativa,
hacia el ánodo.
Por tanto, a la vista de la tabla, se puede decir que al pH de 6,1 al que se realiza la
electroforesis, los aminoácidos neutros se quedarán en el origen, los aminoácidos ácidos
emigrarán al ánodo y los aminoácidos básicos emigrarán al cátodo.
3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
3.1.- MATERIALES Y REACTIVOS
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- Aminoácidos al 1%
o
glicina
o
leucina
o
ácido aspártico
o
lisina
- papel whatman nº 1
- pinzas de madera
- micropipeta
- pulverizador
- secador
- solución de nihidrina (1mg/ml en acetona)
- Tampón piridina: tampón pH 6,1, (40 ml piridina, 3,2 ml ácido acético
glacial y agua hasta 1L)
- tijeras
- guantes
- fuente de electroforesis
- cubeta para electroforesis en papel
- cubeta de revelado
3.2.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
El dispositivo experimental necesario para realizar una electroforesis zonal en
papel consiste en:
-
Una fuente de alimentación que suministre un potencial constante (300 V).
-
Una cubeta de electroforesis en papel de celulosa. La cubeta posee dos
compartimentos separados, cada uno de los cuales contiene un electrodo de
platino, que deben conectarse a la fuente de alimentación mediante los cables
con conectores adecuados, uno para el electrodo que hace de cátodo y otro para
el que hace de ánodo.
Las principales precauciones que hay que tener son:
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- El papel de celulosa hay que procurar no tocarlo con los dedos. El papel
hay que manejarlo con las pinzas de madera.
- No contaminar las soluciones de los aminoácidos patrón y de la muestra
problema.
- Desde el momento en que se conecte la fuente de corriente a la cubeta de
electroforesis, hasta que termine la misma, no se deben de tocar los cables,
conexiones o disolución que esté en contacto con la corriente.
a.- Aplicación de las muestras.
-
Se traza con el lápiz una línea muy débil en el centro del papel. En la línea se
señalan débilmente cinco puntos distribuidos equitativamente a lo ancho de la
placa.
-
Al mismo tiempo se señala en el margen superior derecho de la tira de papel el
signo (+), para indicar el extremo del papel que se va a situar en el
compartimento de la cubeta que va a actuar como ánodo.
A1
A2
A3
A4
problema
Tira papel whatman nº 1
b.- Electroforesis de las muestras.
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Una vez aplicadas las muestras, se rocía ligeramente el papel con la solución
tampón de electroforesis mediante el pulverizador, procurando no mojar directamente
las muestras.
Se quita la tapadera de la cubeta, se coge el papel con las pinzas y se coloca sobre
la cubeta. Se introducen cada uno de los extremos del papel en los compartimentos de la
cubeta, procurando que el extremo señalado en el papel con (+) sea el compartimento
del ánodo
Si los extremos no quedan bien sumergidos en la solución tampón de
electroforesis, se llenan los compartimentos con más tampón.
Antes de comenzar la electroforesis, hay que asegurarse que el papel está bien
humedecido.
Se coloca la tapadera en la cubeta, se conecta la fuente de alimentación a la red de
alimentación y se enciende la misma. Con el mando del voltaje se ajusta el potencial a
unos 300 V.
Al cabo de media hora se apaga la fuente, se desconecta de la red, se quita la
tapadera, se saca el papel de la cubeta mediante las pinzas, procurando no romperlo y se
coloca encima del papel de filtro de la mesa del laboratorio
c.- Secado y detección de los aminoácidos.
-
Se airea el papel para que se seque
-
Con las pinzas de madera se sumerge en la cubeta que contiene la solución de
ninhidrina. Nada más que se impregne, se saca de la solución, dejando que
escurra el exceso de la misma.
-
Se espera hasta que se produce la reacción de color
-
La detección de los aminoácidos patrón y de la muestra problema se realiza por
la aparición de las manchas de color púrpura.
La reacción que se produce entre los aminoácidos y la nihidrina es la siguiente:
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d.- Identificación electroforética de los aminoácidos de la muestra
problema.
Los aminoácidos contenidos en la muestra problema se identifican
mediante la comparación de los desplazamientos de las manchas con los
correspondientes a los de los aminoácidos patrones
A1
A2
a
b
A3
A4
problema
Catodo (-)
Anodo (+)
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4.- BIBLIOGRAFÍA
-
Modern experimental biochemistry. Rodney Boyer : Boyer, Rodney F
-
Bioanalytical chemistry. Susan R. Mikkelsen, Eduardo Cortón.
5.- CUESTIONES
1. Señala de que factores depende el movimiento de los aminoácidos en la
electroforesis en papel.
2. ¿Qué aminoácidos están presentes en la muestra problema?
3. Si el pH del tampón fuera 2 ¿cual sería el resultado de la electroforesis?
4. ¿Se podría identificar mediante esta técnica una mezcla de los aminoácidos
valina y triptofano utilizando las condiciones de la práctica?
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