TIPIFICACIÓN DE UN CULTIVO DE CÉLULAS SATÉLITE

TIPIFICACIÓN DE UN CULTIVO DE CÉLULAS SATÉLITE: CÉLULAS TRONCALES
IMPORTANTES EN LA REGENERACIÓN DE MIOFIBRAS.
Salinas Bautista D.I. (1); Rosas Sánchez F. (2); Martínez Torres A. (2)
(1)
Facultad de Química
Universidad Autónoma de Querétaro
(2)
Laboratorio de Neurobiología Molecular II
Instituto de Neurobiología, UNAM
RESUMEN
Las células satélite son precursores miogénicos del músculo esquelético adulto, descritas por primera
vez en 1961 por Mauro A.; estas células pueden proliferar, diferenciarse en mioblástos y fusionarse
para generar y reparar fibras musculares tras un evento de lesión, así como de renovarse para mantener
su propia población. En el presente trabajo se utilizaron células satélite (i28), las cuales provienen de
un cultivo primario de músculo esquelético de ratón. La importancia de determinar con precisión la
identidad de las células i28, en estos cultivos, podría favorecer el avance en el conocimiento de estas,
en la regeneración y el desgaste de las fibras musculares adultas. Con el fin de confirmar la identidad
de estas células en pases tempranos, se decidió realizar su tipificación mediante inmunofluorescencia,
usando anticuerpos contra MyoD y Vimentina. En este proyecto se abordo la caracterización de estos
en fibroblastos (células 3T3) y células i28. Durante la estancia de investigación se propagaron las
células i28 y 3T3, se observaron al microscopio fotónico, se probaron los anticuerpos, se tiñeron los
núcleos y se adquirieron imágenes al microscopio de epifluorescencia. Los fibroblastos tuvieron un
marcaje negativo a MyoD, conforme lo esperado, sin embargo los marcajes para i28 fueron
inconclusos. Estos resultados sugieren la revisión del procedimiento de inmunofluorescencia y de las
diluciones de los anticuerpos, con el fin de poder realizar la tipificación de estos cultivos en trabajos
posteriores.
INTRODUCCIÓN
El músculo esquelético está compuesto por células multinucleadas (miofribras) que son formadas por la
fusión de mioblastos mononucleados. En el desarrollo embrionario, los mioblastos derivan de somitas,
pero en el músculo adulto estos provienen de los precursores miogénicos en estado quiescente llamados
células satélite musculares (Mauro., 1961; Jansen y Pavlath., 2008). Estas células se localizan entre la
lámina basal y el sarcolema de una fibra muscular adulta en mamíferos, anfibios, aves y reptiles
(Mauro., 1961; Chargé y Rudnicki., 2004). Las células satélite, en posición histológica inactiva
(quiescente) se dividen infrecuentemente pero cuando el músculo es dañado, éstas cuentan con la
habilidad de proliferar, diferenciarse y fusionarse con las fibras adyacentes no dañadas o entre sí para
formar nuevas miofibras (Moss y Leblond., 1971), de estas, aproximadamente 20% regresan a la
reserva, dicha condición es inversamente proporcional a la edad del sujeto, al igual que su capacidad de
proliferar (Bishoff, 1994; Schultz., 1996; Seale y Rudnicki., 2000).
Las células i28 son células satélite de un cultivo primario en monocapa provenientes del músculo
esquelético de ratón, aisladas de ratones macho de 4-13 días de nacidos, a los cuales se les extrajo la
musculatura, esta se cultivo en solución salina balanceada de Hank (HBSS), después se trato con una
solución de colagenasa Tipo Ia, posteriormente se trituro y se obtuvo un pellet, el cual se trato con una
solución de tripsina. Una vez detenida la actividad de la tripsina se filtro y centrifugo, resuspendiendo
el pellet en Ham‟s F-10, suero fetal bovino (FBS) y antibiótico, las células fueron sembradas en una
matriz de colágeno tipo I e incubadas a 37°C en 5% de CO2 (Irintchev y col., 1997).
Con el fin de identificar la identidad de un cultivo de células i28 en pases tempranos se decidió tipificar
a la misma. Para ello se planteo el uso de la técnica de inmunocitoquímica con marcadores
fluorescentes, la cual nos permite utilizar anticuerpos específicos para detectar la localización de
proteínas dentro de las células (Webster., 2000).
En este trabajo se usaron los fluoróforos, isotiocianato de fluoresceína (FITC) y rodamina (R), estos
tienen la propiedad de absorbe la energía de una longitud de onda y la remite a una longitud de onda
diferente, dando una apariencia fluorescente; esto sucede ya que la emisión de la luz a cierta longitud
de onda excita a los electrones produciendo que pasen a un nivel de energía más alto, esto es más lejos
del núcleo. Pero debido a que los electrones no se pueden encontrar a esa distancia, vuelven a su
distancia inicial liberando la energía adquirida primero en forma de calor y el resto en forma de luz,
pero esta luz es de diferente longitud de onda (más larga o igual), por la parte de energía liberada en
forma de calor, por lo tanto de diferente color (Overton., 2006).
Como anticuerpos primarios se usaron anti-Vimentina y anti-MyoD; la Vimentina es una molécula
filamentosa intermedia de tipo III, que se encuentra en células de origen mesenquimal en vertebrados,
entre ellas en fibroblastos (como las células 3T3), células endoteliales, adipositos, macrófagos,
neutrófilos y linfocitos (Schweitzer y Evans., 1998; Maillet., 2002; Hayat., 2006). Mientras que MyoD
es un factor de regulación miogénica (MRF) Hélice-Giro-Hélice básico, como Myf5, miogenina y
MRF4, los cuales tienen una importante función en la determinación y termino de la diferenciación del
músculo esquelético ya que interactúan con otros factores, como la familia de proteínas Mef2, para
coordinar la expresión de genes durante la miogénesis. La expresión de MyoD se activa cuando las
células satélite han salido de un estado quienescente, es decir, dejan la lámina basal y comienzan a
proliferar, y continúa hasta la diferenciación. (Oustanina y col., 2004; Berkes y Tapscott., 2005;
Schiaffino y Partridge., 2008).
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron células i28 propagadas en cajas de 25cm2, en pase 10 (P10), en medio de crecimiento
(MG) compuesto por 80% Ham‟s F-10, 20% FBS, 100µL antibiótico/antimicótico [100u/µL] /10 mL
de medio, 100µL L-glutamina [20µM] /10 mL de medio a 37°C con 5% de CO2, las cuales se trataron
con Tripsina, resuspendidas en medio para criopreservar con un 90% FBS y un 10% Dimetil Sulfóxido
(DMSO), y congeladas a -80°C.
Para realizar la inmunofluorescencia se descongelaron estas células i28 (P10) y se sembraron en dos
cajas de 24 pozos, 1000 células/pozo, sobre cubreobjetos de 12mm de diámetro, previamente tratados
con poli-L-lisina, con medio MG. También fueron sembrados fibroblastos 3T3 (P5), 4400 células/pozo,
en un medio compuesto de Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) 95%, SFB 5% y 100µL de
antibiótico/10mL de medio.
Una vez que las células i28 alcanzaron una confluencia de 30-40% y 50-60% en cada caja
respectivamente se procedió a la fijación, este proceso permite la preservación del proteína de interés,
para ello se uso paraformaldehído al 4%, que forma enlaces entre los grupos reactivos de las proteínas
adyacentes y es tolerado por la mayoría de los tejidos (Muñoz., 2007).
Se permeabilizó con PBS-0.1% TritonX-100 y PBS-0.1% Tween20 (en los pozos del control sin
permeabilizar [SP], se sustituyo con PBS 1X), con esto se permite la entrada de los anticuerpos dentro
de la célula. Después se coloco la solución bloqueadora (PBS, 1%BSA, 0.1% Tween20, 0.1% TritonX100 y 2% del suero de la base del 2do anticuerpo, en este caso de burro y/o bovino, en los pozos SP se
omitieron el Tween20 y el TritonX-100), esto para prevenir las uniones no específicas. En seguida se
incubaron los anticuerpos primarios, anti-MyoD (SantaCruz Biotechnology sc-32758, 200 µg/mL) y/o
anti-Vimentina (Sigma V4630) según lo planteado, 1:100 en PBS 1X, 1% BSA, 0.1% Tween20 y 0.1%
TritonX-100 (En los pozos SP se uso PBS 1X-1% BSA, así como en los pozos de control sin el
anticuerpo 1°), en una cámara húmeda para evitar la deshidratación (Muñoz., 2007).
Se incubaron los anticuerpos secundarios, burro anti-ratón acoplado a fluoresceína (SantaCruz
Biotechnology sc-2099, 200µg/0.5 mL) y/o bobino anti-cabra acoplado a Rodamina (SantaCruz
Biotechnology sc-2349, 200µg/0.5 mL), según correspondía a la base del anticuerpo primario, 1:400 en
PBS1X. Y se realizó la contratinción del núcleo con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:100. Por
último, en los portaobjetos se coloco el medio de montaje y se montaron los cubreobjetos sellando las
orillas con barniz. Las muestras fueron observadas bajo el microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse
E600, Mercurio 100W) a 40X.
c)
SP MyoD
CONCLUSIONES
Se observaron las características de
las células i28 y 3T3, identificando
las diferencias en el tamaño de las
células y el largo de las
proyecciones. También se observo
un marcaje negativo para MyoD en
las células 3T3, sin embargo debido
a la baja intensidad de la
fluorescencia no se obtuvieron
resultados para las células i28 ni
para Vimentina. Por ello no se pudo
concluir con la tipificación, sin
embargo sería importante realizarla
ya que es necesario el estudio de
específico de la identidad de los
cultivos de células i28 para poder
realizar trabajos que permitan
- MyoD
+ MyoD
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las células i28 cultivadas en su mayoría eran pequeñas y presentaban proyecciones cortas en
comparación con las células 3T3. Las 3T3 también presentaban mayor cantidad de nucléolos, esto se
puede ver en la tinción con DAPI (figura 1). La fluorescencia que se presentó fue inespecífica para
aproximadamente en el 99% de las muestras, en ambos marcajes, tanto en las células i28 como en las
3T3. Como se puede observar en la figura 2a las marcas de fluorescencia con casi el 90% de intensidad
se observaron con una frecuencia menor al 10% en las muestras, y más del 99% de estas marcas no
eran específicas. La tinción con DAPI fue específica en las células i28 al igual que en las células 3T3, y
presentó una emisión del 100% en
aproximadamente el 70% de las
células (figura 1 y 2).
La falta de intensidad y la poca
especificidad de la fluorescencia,
pueden deberse a la dilución de los
anticuerpos primarios, al tiempo de
incubación o a otros factores del en
el
procedimiento
de
la
inmunofluorescencia,
algunas
diferencias en este, encontradas en
las
referencias
fueron:
las
diluciones de MyoD y Vimentina, Figura 1. Tinción con DAPI de las células i28 y células 3T3. En la imagen de la
1:30 y 1:50, respectivamente izquierda muestra la tinción con DAPI para las células i28 mientras que la de la
(Olguin
y
Olwin.,
2004; derecha muestra la tinción de las células 3T3. Ambas observadas a 40X.
FITC
DAPI
DAPI-Campo
Goodpaster y col., 2008); la
a)
Claro
realización de la incubación a 4°C
durante toda la noche (Gnocchi y
col., 2009); y el proceso de fijación
con paraformaldehído al 2% o 3%
de dos minutos a 20 min. (Olguin y
Olwin., 2004; Goodpaster y col.,
b)
2008; Wang y col., 2009).
Figura 2. Células 3T3 con marcaje para MyoD. Las células presentadas
en estas imágenes (40X) son células 3T3 tratadas con anti-MyoD y
anticuerpos acoplados a isotiocianato de fluoresceína (FICT). a) En esta
imagen se observa una marca de fluorescencia para FICT, sin embargo esta
no concuerda con las células. b) El control negativo no presento marca de
fluorescencia para FITC en este tratamiento como se puede ver en la imagen
de la primera columna. c) En el tratamiento sin permeabilización solo se
presentaron algunas sombras de fluorescencia sin embargo estas no se
pueden percibir en la imagen debido a su poca intensidad.
comprender la regeneración y el desgaste de las fibras musculares adultas, y así, al adquirir el
conocimiento sobre estas se puedan buscar alternativas para la generación de avances que permitan a
los seres humanos y otros animales tener una mejor calidad de vida. Con el fin de mejorar los
resultados de este experimento se deberán de modificar las condiciones del protocolo, así como llevar a
cabo la titulación precisa de los anticuerpos para obtener la dilución adecuada para cada uno.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Berkes, C. A. y Tapscott, S. J., “MyoD and the transcriptional control of myogenesis”, Seminars in
Cell & Developmental Biology., 16, 585–595, 2005.
Bischoff, R., “Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture”, Dev. Biol., 115,
129-139, 1986.
Bishoff, R.,“The satellite cell and muscle regeneration”, In Myogenesis, Engel AG, FransziniArmstrong C., 97–118, 1994.
Chargé, S. B. P. y Rudnicki, M. A., “Cellular and Molecular Regulation of Muscle Regeneration”,
Physiol. Rev., 84, 209–238, 2004.
Gnocchi, V. F. y col., “Further Characterization of the Molecular Signature of Quiescent and Activated
Mouse Muscle Satellite Cells”, PLoS ONE., 4, 1-9, 2009.
Goodpaster, T. y col., “An Immunohistochemical Method for Identifying Fibroblasts in Formalin-fixed,
Paraffin-embedded Tissue”, Journal of Histochemistry & Cytochemistry., 56(4), 347–358, 2008.
Hayat, M. A., “Handbook of Immunohistochemistry and in situ Hybridization of Human Carcinomas.
Volumen 4: Molecular Genetics, gastrointestinal carcinoma and ovarian carcinoma”, Academic
Press., Estados Unidos, 2006.
Irintchev y col., “Functional improvement of damaged adult mouse muscle by implantation of primary
myoblasts”, Journal of Physiology.,500.3, 775-785, 1997.
Jansen, K. M. y Pavlath, G. K., “Molecular Control of Mammalian Myoblast Fusion”, Methods in
Molecular Biology., 475, 115-133, 2008.
Maillet, M., “Manual de Biología Celular”, Masson., España, 2002.
Mauro, A., “Satellite cell of skeletal muscle fibers”, J. Biophys. Biochem. Cytol., 9, 493- 495, 1961.
Moss, F. P. y Leblond, C. P., “Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats”, Anat.
Rec., 170, 421-436, 1971.
Muñoz, M., “Immunocytochemistry on Suprachiasmatic Nucleus Slices”, Methods in Biology
Molecular, Circadian rhythms: Methods and protocols., 362, 549-559, 2007.
Olguin, H. C. y Olwin, B. B., “Pax-7 up-regulation inhibits myogenesis and cell cycle progression
insatellite cells: a potential mechanism for self-renewal”, Developmental Biology., 275, 375– 388,
2004.
Oustanina, S. y col., “Pax7 directs postnatal renewal and propagation of myogenic satellite cells but not
their specification”. EMBO Journal., 23, 3430–3439, 2004.
Overton, W.R., “Immunofluorescence”, Immunohistochemical Staining Methods., 55-60, 2006.
Rosenblatt, J. D. y col., “Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants”, In Vitro
Cell. D.V. Biol.-Animal., 31, 773-779, 1995.
Schiaffino, S. y Partridge, T., “Skeletal muscle repair and regeneration”, Springer., Países Bajos, 2008.
Schultz, E., “Satellite cell proliferative compartments in growing skeletal muscles”, Dev Biol., 175: 84–
94, 1996.
Schweitzer, S.C. y Evans, R. M., “Vimentin and lipid metabolism”, Subcellular Biochesmistry:
Intermediate filaments., 31, 437-462, 1998.
Seale, P. y Rudnicki, M. A., “A new look at the origin, function, and „stem-cell‟ status of muscle
satellite cells”, Dev Biol., 218: 115–124, 2000.
Wang, Z. y col., “Regulation of muscle differentiation and survival by Acheron”, Mechanisms of
Development., 1-10, 2009.
Webster, P., “The production of cryosections through fixed and cryoprotected biological material and
their use in immunocytochemistry”, Electron microscopy methods and protocols., 49-75, 2000.