UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
TESIS PARA OPTAR POR EL GRADO DE DOCTORA EN
QUÍMICA Y FARMACIA
TEMA:
“ LIOFILIZACION DE LA CEPA DE
BORDETELLA PERTUSSIS FACTORES
DETERMINANTES DE LA CALIDAD PARA SU
PRESENTACIÓN EN VIALES Y AMPOLLAS ”
AUTOR: Q.F. DIANA PATRICIA CEVALLOS SALAZAR
TUTOR: DRA. OLGA PAZMIÑO DE SAYAGO
GUAYAQUIL – ECUADOR
2004
CERTIFICO
El presente trabajo, luego de ser revisado cumple con las normas establecidas
para el desarrollo del tema investigado, por lo tanto autorizo su presentación para
ser aprobado.
___________________________________
Dra. Olga Pazmiño de Sayago
Tutora de la Tesis
“La responsabilidad por los hechos, ideas y doctrinas, expuestos en esta tesis
corresponde exclusivamente a su autor.”
_______________________
Q.F. Diana Cevallos Salazar
PENSAMIENTO
“No es grande el que siempre triunfa sino, el que jamás se desalienta.”
J.L. Martin Descalzo
DEDICATORIA
A mi Madre, Sra. Fanny Salazar I.: Por su inmenso amor, apoyo espiritual y la
realización de sus sueños de ver culminada una etapa más de mi vida.
A mi Esposo, Dr. Santiago Fernández V.: Por ser mi compañero, quien con amor
me ha brindado siempre su apoyo.
A mis Hijos: Eduardo Paúl, Diana María y Santiago Eduardo, por ser las semillas
de mi amor y que su germinación sea fecunda en sabiduría y conocimiento pleno
de Dios.
AGRADECIMIENTO
A Dios, por ser mi guía y la base de mi formación.
A mi tutora,
la Dra. Olga Pazmiño de Sayago, por saber orientarme con
certidumbre en el desarrollo de mi tesis.
A mis compañeros de trabajo del subproceso de Vacuna Pertussis, en especial a
la Dra. Virginia Riera Coello.
A la Universidad de Guayaquil, Facultad de Ciencias Químicas, en cuyo seno me
formé con la maestría de mis educadores, logrando culminar mi carrera
profesional
RESUMEN
En liofilización, lo más difícil es mantener la vida; y el objetivo es obtener un
producto seco, con un contenido de humedad aceptable y una actividad biológica
u organoléptica lo más cercana posible a la natural, conteniendo la integridad total
de moléculas termolábiles y, además, a la vida misma de células en tejidos,
bacterias y virus.
Esto se logra con un proceso de liofilización basado en la optimización,
condiciones de trabajo que permiten lograr el objetivo en menos tiempo y al
menor costo.
El desarrollo de la liofilización de la cepa bacteriana de Bordetella Pertussis, que
provoca síndrome conocido como COQUELUCHE – TOSFERINA Ó TOS
CONVULSA, es materia prima en la producción de Vacuna Pertussis Concentrada
(producto al granel) y principio activo para la formulación de la Vacuna Triple ó
D.P.T. (Difteria-Pertussis-Tétanos).
En el Instituto Nacional de Higiene “Leopoldo Izquieta Pérez” de Guayaquil se
produce la liofilización de Bordetella Pertussis en AMPOLLAS de 5 ml,
cumpliendo las especificaciones de calidad requeridas tanto del envase como del
producto liofilizado.
Como aplicación, a este tema de tesis, se realizó el cambio de presentación de la
cepa, de ampollas a VIALES de 1 ml, conociendo los resultados de los lotes
liofilizados en ampollas con los parámetros de calidad y límites de aceptación.
Se liofilizaron 4 lotes en la presentación de Viales, cada lote de 26 viales.
Se introdujo el uso de gradillas que servían de base a los viales.
Tres lotes se ensayaron con el Medio de Leche Descremada al 10%, y el lote Nº 4
se liofilizó con la Cepa 143 Bordetella Pertussis.
De los ensayos realizados se observó que en el lote en que se trabajó con base
metálica estable se obtuvo un mejor porcentaje de viales con buen vacío, en
comparación con los 2 lotes en que se utilizó otro tipo de base.
Así tenemos:
Lote 1 (con base espumaflex):
53.84 % viales con vacío
Lote 2 (con base metálica inestable):
84.60 % viales con vacío
Lote 3(con base metálica estable):
96.15 % viales con vacío
Quedando establecida la aplicación de la gradilla metálica con base estable, y con
ella se realizó el proceso de liofilización de la Cepa Bordetella Pertussis,
obteniendo así en el lote Nº 4 un rendimiento de 100% de viales liofilizados con
buen vacío, de excelente calidad, eficiencia antigénica y seguridad al igual que
las que se obtiene en la presentación en ampollas.
La importancia de este cambio de presentación, a VIALES, está representado en
la disminución en el porcentaje de pérdidas por rompimiento de los mismos y en
la mínima probabilidad de contaminación del vial liofilizado al iniciar el flujo de
producción de la vacuna con la reconstitución de la cepa.
En consecuencia, su coste-producto supera las expectativas de aceptación y
ahorro comparado con la presentación anterior.
SUMMARY
The most difficult part in freeze-drying is to keep life; and the main objective is to
obtain a dry product, with an acceptable wetness contain and the closest possible
to natural biological or organoleptic activity, containing the total integrity of the
termolabiles molecule and the life itself of the tissues, germs, viruses.
In order to get this, it is used a freeze-drying process based is optimization, work
conditions that allows to obtain the objective in the fewest time with the cheapest
cost.
The development of the Bordetella Pertussis germ stock freeze-drying, provokes
the syndrome known as Pertussis, also known as Whooping Couch, is raw
material in the production of the Pertussis vaccine and active principle for the
formulation of the Triple D.P.T. (Diphtheria, Pertussis, Tetanus).
In the Hygiene National Institute “Leopoldo Izquieta Peréz” -Guayaquil, it is
produced the Bordetella Pertussis freeze-drying in 5 ml blister accomplishing the
quality specifications required as much as for the container as for the freeze dried
product.
As an application for this thesis topic, It was carried out a change of presentation
of the strain’s container, of ampoules to 1ml vials, knowing all quality results and
acceptance limits of the lots contained in ampoules that had been freezed dried
before.
Four lots were freezed dried in vials, each lot of 26 vials.
The griddles use was introduced that served from base to vials.
Tree lots were used
as tests with a 10% descremada milk media, and lot 4
Bortedella Pertussis strain 143 was freeze dried.
It was observed that lot worked with stable metallic base it was gotten a better
vials percentage with vacuum, in comparison with the 2 lots in which another base
type was used.
In this way we have:
Lot 1 (with foamy base):
53.84% vials with vacuum
Lot 2 (with unstable metallic base)
84.60% vials with vacuum
Lot 3 ( stable metallic base):
96.15% vials with vacuum
It have left established metallic griddle with stable base to freeze dryer Bortedella
Pertussis strain, in this way it was obtained 100%
of vials with vacuum with
excellent quality, antigenic efficiency and security the same as that one obtains in
the presentation in ampoules.
The importance of this presentation change to vials, it is represented in decrease
in percentage off losses for break of the same ones and minimum probability of
contamination of vial dried when beginning the flow off vaccine production.
In consequence its cost-product exceeds the acceptation expectative and the
economy comparing with the previous presentation.
INTRODUCCIÓN
Uno de los problemas que siempre ha preocupado a los investigadores y
científicos, es el de la habilidad que presentan gran números de productos
biológicos, químicos y alimenticios, que al ser fácilmente desnaturalizables, no
permiten su conservación sin que sus cualidades originales sean alteradas.
Los científicos franceses Bordas y D´Arsonval en 1906 y el americano Shackell en
1909, descubren la aplicación del principio físico de la sublimación, construyendo
un sencillo aparato de liofilización de laboratorio.
Durante la segunda guerra mundial, los bancos de sangre americanos, empiezan
a producir industrialmente plasma humano liofilizado para el ejército. En esta
época, Fleming, Florey y Cain, descubren y sintetizan la penicilina. El gran éxito
de la desecación del plasma y su buena conservación por liofilización fue
rápidamente aplicado a la penicilina y a continuación a muy diversos antibióticos,
enzimas, sueros y vacunas a fines de prolongar su actividad terapéutica.
En las dos últimas décadas han sido publicados eventos científicos y trabajos
técnicos que se han ido perfeccionando su técnica de proceso, los equipos e
instalaciones.
La liofilización es un proceso que consiste en desecar un producto previamente
congelado, lográndose la sublimación del hielo bajo vacío. Es por lo tanto el paso
directo del hielo (sólido) a gas (vapor), sin que en ningún momento aparezca el
agua en su estado líquido. (7)
Las vacunas liofilizadas, las que contienen virus o bacterias vivas, son selladas al
VACIO durante la manufactura. Se asegura un material seco, con un contenido de
humedad aceptado; una actividad biológica lo más cercana posible a la natural;
una esterilidad, ya que no hay multiplicación bacteriana y la posibilidad de
contaminación puede fácilmente reducirse a una probabilidad; una solubilidad
fácil, rápida y completa y una conservación ilimitada. (5) (8)
En nuestro país, las aplicaciones de la liofilización son múltiples tanto en el campo
de la industria alimenticia y farmacéutica .
En el Instituto Nacional de Higiene “Leopoldo Izquieta Pérez” de Guayaquil, se
realizan
liofilizaciones
de
Cepas:
Bordetella
Pertussis,
Corynebacterium
diphtheriae, Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis, Virus Rábico CVS
(Virus Challenger Standard) que se procesan para elaborar las vacunas DPT,
BCG y Vacuna Antirrábica; además, se liofilizan elementos utilizados en el campo
de la investigación inmunoquímica, inmunológica y microbiológica.
El desarrollo de la liofilización de la cepa bacteriana de Bordetella Pertussis
requiere un gran cuidado tanto en su método operativo como en la optimización
de condiciones para lograr el aseguramiento de su calidad. Esta cepa es materia
prima en la producción de Vacuna Pertussis Concentrada.
La aplicación de la vacuna en la población, presenta un interés individual y
comunitario, formando parte de los programas de Salud Pública. La vacuna
Pertussis o Tosferina al igual que la Difteria, Poliomielitis, Sarampión, Rubéola y
Parotiditis son vacunas sistemáticas, eficaces frente a enfermedades frecuentes
en la infancia, de reservorio humano y con transmisión de persona a persona.
Por esta razón, esta investigación va dirigida a dar a conocer el estudio de los
factores determinantes de la calidad del liofilizado de Bordetella Pertussis para su
presentación en Ampollas y Viales.
Anteriormente se elaboraba éste liofilizado en Ampollas. En la actualidad, como
aplicación a éste tema de tesis, se ha efectuado un cambio de presentación del
liofilizado, a Viales, que ayuda a que su proceso sea en forma más rápida y de
menor riesgo por la manipulación más factible del Vial. Con el objetivo de
contribuir al conocimiento de la importancia que esto reviste, al obtener un
liofilizado de Bordetella Pertussis de óptima calidad necesaria para que las
vacunas sean seguras, eficaces y de excelente calidad.
A
N
E
X
O
S
ANEXO Nº 1
COMPROBANDO VACIO EN VIAL LIOFILIZADO
ANEXO Nº 2
PRESENTACION DE AMPOLLA Y VIAL LIOFILIZADO
ANEXO Nº 3
GRADILLAS USADAS EN EL PROCESO DE LIOFILIZACION DE VIALES
ANEXO Nº 4
GRADILLAS FABRICADAS ESPECIALMENTE PARA EL PROCESO
ANEXO Nº 5
ENSAYO EN VIALES LIOFILIZADOS, LOTE Nº 1
ANEXO Nº 6
ENSAYO DE VIALES LIOFILIZADOS, LOTE Nº 2
ANEXO Nº 7
PRODUCTOS DE VIALES LIOFILIZADOS, LOTE Nº 4
ANEXO Nº 8
VIAL ANTES Y DESPUES DE LA LIOFILIZACION DE BORDETELLA
PERTUSSIS
ANEXO Nº 9
REALIZACION DE LA PRUEBA DE ESTERILIDAD DE LOS VIALES
LIOFILIZADOS
BIBLIOGRAFÍA
CABRERA CONTRERAS R. “VACUNAS”: FUNDAMENTOS PARA
SU
DESARROLLO”.
Edit. Manual Moderno. México, 1996. (1)
COMPENDIO DEL DIPLOMADO DE MICROBIOLOGIA
Área Bacteriología. Escuela de Post-Grado de la universidad de Guayaquil. 2003.
(2)
EL CONDOR, LA SERPIENTE Y EL COLIBRI
La OPS/OMS y la Saluda Pública en el Ecuador en el Siglo XX. Quito, 2002 (3)
FARMACOPEA DE LOS EE.UU. USP 26 NF 21. 2003 (4)
HELMAN JOSE DR. “FARMACOTECNIA TEORICA Y PRACTICA”
Edit. Continental. Tomo III. México, 1984 (5)
INSTITUTO NACIONAL DE HIGIENE Y M.T. “LEOPOLDO IZQUIETA PEREZ”
DE GUAYAQUIL
Laboratorio de Bacteriología – Peste. 2004 (6)
REVISTA MEDICA: “LAS NUEVAS VACUNAS CONTRA LA TOSFERINA”
Editor Medical MAG. Vol. 4 Nº 28, 1993. (9)
REVISTA MEDICA: “RESPUESTA INMUNE HUMORAL ANTI-BORDETELLA
PERTUSSIS EN NIÑOS”
Arch. Argent. Ped. Vol. 90. N 4. 1992. (10)
INTERNET
LA LIOFILIZACIÓN DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS
Sinterfarma 4. 1998 (7)
http://www. Google.com
LAS VACUNAS EN AVICULTURA
http://www.ppca. Com vc/va 34p. 27 htm (8)
VACUNA PERTUSSIS. VACUNA USTED
http://www. Google.com (11).
GLOSARIO
Aglutinógenos de Bordetella Pertussis:
Contiene 8 aglutinógenos, que son proteínas muy antigénicas que inducen la
generación de anticuerpos capaces de aglutinar a la bacteria.
Anticuerpo:
Sustancia defensora (proteína) sintetizada por el sistema inmunitario como
respuesta a la presencia de una proteína extraña (antígeno) que el anticuerpo
neutraliza.
Antígeno:
Sustancia extraña a un organismo, normalmente una proteína, que desencadena
como reacción defensiva a la formación de anticuerpos que reaccionan
específicamente con el antígeno. En general, cualquier sustancia que provoca
una respuesta inmunitaria.
Cepa Bordetella Pertussis:
Estas pueden ser aislamientos frescos o pueden ser obtenidas de fuentes
respetables y conocidas. Idealmente deben seleccionarse las cepas que den
origen a vacunas menos tóxicas y más estables y potentes.
Cepa Celular:
Células derivadas de un cultivo primario o de una línea celular por selección y
clonación de células que tienen propiedades específicas.
Esterilidad:
Prueba de control de calidad, para asegurar que un producto está libre de
microorganismos viables contaminantes.
Estridor Inspiratorio:
Síntoma del paciente con tos ferina. Ruido parecido al roncus, como lo realiza el
gallo en la mañana, y se da en la inspiración cuando el paciente toma aire.
Fimbria:
Uno de los apéndices filamentosos diminutivos de algunas bacterias; son
bastantes más pequeños y menos rígidos que los flagelos y guardan relación con
propiedades antigénicas de la superficie celular.
Humedad Relativa:
La relación (porcentaje) entre la cantidad real de vapor de agua en un volumen
dado de aire a una temperatura determinada y la cantidad máxima de vapor de
agua que habría si el aire estuviera saturado de vapor de agua a aquella
temperatura.
En un producto biológico, al ser despreciable la humedad remanente, el producto
puede ser almacenado por tiempo ilimitado, constituyendo productos de larga
estabilidad.
Liofilizacion:
Creación de un preparado estable de una sustancia biológica (plasma sanguíneo,
suero,etc.) mediante congelación rápida y deshidratación del producto congelado
bajo intenso vacío.
Liofilizador:
Equipo que se emplea en la liofilización; desecador bajo congelación.
Lote:
Es una cantidad específica de cualquier materia prima o producto que haya sido
elaborado bajo condiciones equivalentes de operación y durante un período
determinado.
Oxidación:
Reacción en la que el oxígeno se combina químicamente con otra sustancia, y se
transfiere electrones.
En la liofilización, se eliminan los fenómenos de oxidación, dado que se opera y
envasa a alto vacío.
Potencia:
Prueba de control de calidad para asegurar que un producto biológico es capaz
de producir una respuesta inmune y proteger lo cual se expresará en Unidades
Internacionales o porcentajes de protección, de acuerdo a lo establecido en los
requisitos mínimos de calidad del producto.
Pureza:
Prueba de control de calidad mediante la cual se verifica que existe en el
producto, únicamente el microorganismo indicado y que está libre de
microorganismos extraños.
Pruebas de control de calidad:
Es el conjunto de actividades llevadas a cabo en el laboratorio para certificar que
las características de un producto cumplen con las especificaciones vigentes.
Torr:
En el presente, la unidad de presión es Pa (Pascal) en el sistema internacional de
unidades. Sin embargo, se usa en el manual del liofilizador modelo FDU-830, guía
de este trabajo investigativo.
1 torr (133 pa)
1 pa
(7.5X103 torr)
Tosferina:
Enfermedad infecciosa causada por Bordetella pertussis y que se caracteriza por
catarro de las vías respiratoria y paroxismo peculiares de tos, que termina en una
respiración jadeante o convulsiva.
Tos Quintosa:
Síntoma del paciente con tosferina, y es una tos a repetición constante que
produce períodos de apnea; como consecuencia de hemorragias conjuntivales,
hernias y el paciente expulsa gases en forma involuntaria.
Toxina pertussis (TP):
LLamada también factor sensibilizador a la histamina o factor promotor a la
linfocitosis, factor de virulencia mayor de la Bordetella pertussis, ya que existe
otras toxinas.
Toxoide:
Una toxina (exotoxina) bacteriana modificada que se ha hecho no tóxica
(destoxificada). Pero retiene su capacidad para estimular la formación de
antitoxina, previniendo así las intoxicaciones bacterianas.
Vacuna:
Anfígeno procedente de uno o varios organismos patógenos que se administra
para inducir la inmunidad activa protegiendo contra la infección de dichos
organismos.
Es una aplicación práctica de la inmunidad adquirida.
Vacuna Celular Antipertúsica:
Las vacunas de célula entera, que se aplican hoy en día, están compuestas de
una mezcla de suspensiones bacterianas inactivadas por exposición al calor.
Vacuna acelular:
Existen diversas fórmulas que contienen uno o más antígenos de virulencia de
Bordetella pertussis (si bien siempre contienen el toxoide preparado en base a la
toxina pertúsica).
U.O.:
Unidad de Opacidad. Es la medida de la opacidad determinada en comparación
con la Preparación Internacional de Referencia.