CAPITULO I MARCO TEORICO

CAPITULO I
MARCO TEORICO
1.1
Liofilización
1.1.1 Historia
Los científicos franceses Bordas y D´Arsonval en 1906 y el americano Shackell en
1909, descubren la aplicación del principio físico de la sublimación, construyendo
un sencillo aparato de liofilización de laboratorio.
El gran impulso de la aplicación industrial de la liofilización, se debe a los trabajos
de E.W Flosdonf y S.Murdd, que trabajando en la escuela de Medicina de la
Universidad de Pennsylvania, liofilizan los primeros productos para uso clínico en
gran escala, principalmente sueros y plasma humano.
Durante la segunda guerra mundial, los bancos de sangre americanos, empiezan
a producir industrialmente plasma humano liofilizado para el ejército.
En esta época, Fleming, Florcy y Cain, descubren y sintetizan la penicilina. El
gran éxito de la desecación del plasma y su buena conservación por liofilización
fue rápidamente aplicado a la penicilina y a continuación a muy diversos
antibióticos, enzimas, sueros y vacunas a fines de prolongar su actividad
terapéutica.
En las dos últimas décadas, se ha ido perfeccionando la técnica del proceso y los
equipos e instalaciones, como apareciendo nuevas aplicaciones de la liofilización
a nivel de investigaciones o de la industria.
(7)
1.1.2 Definición
La liofilización es un proceso que consiste en desecar un producto previamente
congelado, lográndose la sublimación del hielo bajo vacío. Es por lo tanto, el paso
1
directo del hielo (sólido) a gas (vapor), sin que en ningún momento aparezca el
agua en su estado líquido.
(7)
Es una red sólida, muy frágil y fácilmente redisoluble en agua. Esta operación se
llama:
LIOFILIZACIÓN, FREEZE DRYING (en inglés), LYOPHILIZATION (en
francés), GEFRIERTROCKNUNG (en alemán).
(5)
1.1.3 Etapas de la Liofilización
Se realiza a temperaturas inferiores a la de solidificación total, o sea, el producto
debe estar congelado a temperaturas entre 10 y 15 ºC bajo cero.
1.1.3.1 Congelación Inicial
Es una operación previa y obligatoria. El tiempo de duración depende de varios
factores como la cantidad, concentración y naturaleza propia del producto.
Una congelación adecuada es la base de que el producto liofilizado presente
óptimas condiciones de aspectos, conservación de sus propiedades originales y
rápida rehidratación.
1.1.3.2 Sublimación ó Desecación Primaria
Es la etapa en la que la mayor parte del agua libre pasa a vapor. Los parámetros
temperatura, presión y tiempo pueden ser modificados independientemente
pero están íntimamente relacionados.
1.1.3.3 Desorción ó Desecación Secundaria
Su misión es eliminar las últimas trazas de vapor de agua, evaporando el agua no
congelada ligada al producto.
(7)
2
1.1.4 Ventajas de la técnica de Liofilización
·
La temperatura a que es sometida el producto, está por debajo de aquella a la
que muchas sustancias inestables sufren cambios químicos.
·
Debido a la baja temperatura que se opera se reduce el peligro de
contaminación microbiana.
·
Se eliminan los fenómenos de oxidación, dado que se opera y envasa a alto
vacío.
·
La gran porosidad del producto facilita con rapidez la reconstitución por la
adición de agua o del solvente adecuado.
·
Al ser despreciable la humedad remanente , el producto puede ser
almacenado por tiempo ilimitado, constituyendo productos de larga estabilidad.
1.1.5 Desventajas de la Liofilización
·
Es un proceso costoso.
·
Necesidad de personal calificado en la operación y mantenimiento de los
equipos.
·
Elevado costo de inversión de las instalaciones y equipos.
1.1.6 Los Equipos
1.1.6.1 Generalidades
Los principales países que producen equipos de liofilización apto para la industria
farmacéutica son:
En América:
EE.UU., Canadá y Argentina.
En Europa:
La mayoría de los países, especialmente: Suiza, Francia,
Alemania e Inglaterra.
3
En Asia:
Japón
1.1.6.2 Formas de Equipos
Bajo “forma” entendemos que la cámara sea:
a) Cilíndrica y horizontal
b) Cilíndrica y vertical
c) Rectangular, con puerta frontal.
(5)
4
1.1.6.3 Liofilizador Utilizado
Manejo del equipo de liofilización que cuenta el subproceso de Vacuna Pertussis
del INSTITUTO NACIONAL DE HIGIENE “LEOPOLDO IZQUIETA PÉREZ” DE
GUAYAQUIL.
FIGURA Nº 1
5
1.2
Bordetella Pertussis
1.2.1 Generalidades
El género Bordetella es una bacteria cocobacilar de crecimiento lento.
B. Pertussis fue descrita en 1906 por Bordet y Gengou como agente responsable
de la Coqueluche.
Este género abarca 4 especies conocidas:
·
B. Pertussis
·
B. parapertussis
·
B. bronchiséptica
·
B. avium
Y 2 especies recién descritas:
·
B. hinzii
·
B. holmesii
(10)
1.2.2 Habitat
·
La B. pertussis patógeno estricto del hombre. Se encuentra en vías
respiratorias superiores, igual que B. parapertussis.
·
La B. bronchiséptica se encuentra en perros, gatos, conejos, etc.
Ocasionalmente en el ser humano.
·
La B. avium ejerce una acción patógena en las aves.
(2)
6
1.2.3 Caracteristicas
·
Son cocobacilos gram negativos, en aislamientos primarios.
·
En subcultivos, por lo general, son más pleomorfos.
·
Son aeróbicos obligados, se desarrollan a 35 – 37º C en atmósfera húmeda.
·
No fermentan Hidratos de Carbono
·
La B. Pertussis y parapertussis son inmóviles.
·
La B. bronchiséptica y B. avium son mótiles.
·
Aislamiento primario B. Pertussis requiere carbón, resinas intercambio iónico o
sangre (15 – 20%) para neutralizar efecto inhibidor crecimiento, de ácidos
grasos insaturados, sulfuros, peróxidos y metales pesados.
·
B. parapertussis es algo menos exigente, pero requiere igual los medios
selectivos.
·
Las otras especies, no son tan exigentes, se desarrollan en los medios de
rutina, como Agar Sangre, Chocolate, Mac Conkey.
(2)
1.2.4 Importancia Clínica de B. Pertussis
·
B. Pertussis provoca síndrome conocido como Coqueluche, Tosferina o Tos
convulsa, es una enfermedad infecciosa y altamente contagiosa. Afecta
predominantemente a niños y tiene evolución prolongada.
·
La Bordetella Pertussis se transmite a gotitas de secreciones respiratorias.
·
El 50% de los casos denunciados, afectan a lactantes pequeños no vacunados
o parcialmente vacunados.
·
En los adultos, por lo general, se presenta tos convulsa asintomático o de
presentación atípica, aprox. 25%. Aunque también ha habido casos de Tos
convulsa con paroxismos de tos, vómitos y encefalopatía.
(9)
7
1.2.5 Estructura Antigénica
Bordetella Pertussis produce sustancias biológicamente activas y virulentas, que
desempeña un papel en el origen de la tos convulsa:
·
La Toxina Pertussis (TP) también llamada factor sensibilizador a la histamina
o factor promotor de la linfocitosis, factor de virulencia mayor de la B.Pertussis,
ya que existen otras toxinas.
·
La Hemoglutinina filamentosa (FHA) adhesina de superficie celular que
posee actividad hemoglutinante (aglutina eritrocitos) por ella se da, la
adherencia a células ciliadas del tracto respiratorio superior.
·
La Adenilato ciclasa hemolisina (ACH) esta proteína tiene capacidad de
fijarse a células susceptibles y es traslocada al interior de célula intacta.
·
La Citotoxina
traqueal (TCT)
está compuesta
por
fragmentos
del
peptidoglucano de la pared celular y tiene capacidad de destruir células
epiteliales de la tráquea.
·
El Lipopolisacárido (LPS) que se encuentra en la membrana externa de la
pared celular, libera pirógenos hacia los monocitos.
·
Las especies de Bordetella poseen antígenos termoestables somáticos,
llamados Aglutinógenos “O” que son comunes a todas ellas.
Además se han descrito 14 aglutinógenos capsulares termolábiles designados
factores.
Estos se asocian con Fimbrias y aparentemente también participan en la fijación
de las bacterias a las células efectoras.
(1)
8
1.2.6 Fisiopatología
·
La B. Pertussis llega a vías aéreas superiores, se adhiere y multiplica en
epitelio de la tráquea y los bronquios. Altera mecanismos de depuración
mucociliar (primera línea defensa), inhibe funciones fagocíticas y provoca la
necrosis celular.
·
Los microorganismos en desintegración liberan endotoxinas, que irritan células
superficiales, originando manifestaciones catarrales y necrosis del epitelo, con
un infiltrado inflamatorio en que predominan linfocitos.
·
No hay invasión del torrente sanguíneo.
·
En infiltrado inflamatorio, se encuentran abundantes bacterias que producen
exudado purulento; la reacción inflamatoria atraviesa las paredes de la tráquea
y bronquios, originando una peribronquitis, donde se hallan tapones mucosos.
En los alvéolos puede haber hemorragia y edema.
·
Los espasmos de tos y la anoxia, pueden originar hemorragias cerebrales
puntiformes, de la nariz, de las conjuntivas, ruptura de los vasos sanguíneos
de la mucosa, aparato digestivo y petequias en la cara y el cuello.
·
La encefalitis es una complicación poco frecuente, que es originada por las
endotoxinas del microorganismo.
(2)
1.2.7 Manifestaciones Clínicas
Luego de un período de incubación del microorganismo de 7 a 14 días,
comienzan los signos y síntomas de la Tosferina, que comprende 3 fases:
1.2.7.1 Período Invasión ó Catarral
Se caracteriza por síntomas inespecíficos de “resfrío común” o “gripe”. En este
período, (aprox. 1 semana) la enfermedad es muy contagiosa, porque hay una
gran cantidad de bacterias que se eliminan con las secreciones.
9
Al final de esta fase se presenta una tos seca y molesta, no productiva, que se
vuelve persistente.
Los cultivos realizados en esta etapa se asocian con alta probabilidad de
positividad.
1.2.7.2 Período Paroxístico
Puede durar 2-4 semanas. Se caracteriza por tos quintosa, que finaliza con el
prolongado estridor inspiratorio, audible al final acceso de tos; además este puede
asociarse con cianosis y vómitos.
Esta etapa puede ser tan severa que, debe recurrirse a la respiración mecánica
intermitente.
Durante la evolución de la enfermedad las complicaciones posibles son: Otitis
media bacteriana, convulsiones, encefalopatía, hernia inguinal y prolapso rectal,
etc.
1.2.7.3 Período Convalecencia
Generalmente comienza entre tercera o cuarta semana después de instalación de
la enfermedad.
Se observa una declinación de la frecuencia y severidad de los accesos de tos, en
unas dos semanas. Aunque podría mantenerse así, unos 3-6 meses más.
(1)
1.2.8 Epidemiología de la Coqueluche
·
Tosferina sigue siendo enfermedad de importancia mundial, con incidencia
estimada en 60 millones de casos y unas 600.000 muertes por año. En países
desarrollados ha habido disminución de vacunación infantil y por tanto un
aumento de la incidencia de Tosferina.
10
·
Esta enfermedad es endémica, presentándose epidemias en ciclos de 3-5
años y difiere de otras infecciones de la infancia, porque los índices de ataque,
morbilidad y mortalidad son significativamente mayores en el sexo femenino,
sin haber una razón para esto.
·
No se ha identificado un estado de portación prolongado, pero se han
detectado personas asintomáticas con cultivos positivos, durante brotes
epidémicos.
·
Antes de que se desarrolle la vacuna, la tos ferina afectaba en mayor escala a
niños de 1 - 5 años, debido a protección pasiva conferida por los anticuerpos
maternos, la infección a menores de 1 año, estaba reducida a un 20%.
·
La vacuna Anti-Tosferina desarrollada con microorganismos enteros, ha sido
la causa de la menor incidencia de la enfermedad, pero en cambio también es
la razón para que haya desplazamiento de la edad pico de incidencia, a
menores de 1 año de edad, en un porcentaje considerable.
·
La vacuna confiere una inmunidad limitada de menos de 12 años, por lo que
los adultos poseen muy pocos anticuerpos para la transferencia pasiva al niño,
lo que explica, que los niños menores de 1 año, son el grupo menos protegido.
·
De casos comunicados de Tos ferina, el 10-15 % corresponden a personas de
más de 15 años de edad y hay tendencia a que esto se acrecente.
(2)
1.2.9 Diagnóstico
Después de la valoración clínica, en que se sospecha Tosferina el diagnóstico de
laboratorio se lo hace en forma directa e indirecta.
1.2.9.1 Diagnóstico Directo
·
Debe hacerse durante el Período Catarral y al comienzo del Paroxístico, para
poder recuperar la cepa. La muestra se obtiene por hisopado o por aspiración
de secreciones bronquiales o nasofaríngeas.
11
·
CULTIVO en Agar selectivo de Bordet Gengou o de Reagan Lowe con el
agregado de antibiótico, como Meticilina o Cefalexina para inhibir el desarrollo
de la flora normal. La muestra cultivada debe examinarse diariamente durante
5 a 7 días e identificar colonias hemolíticas diminutas, que son de crecimiento
lento.
·
Reacción INMUNOFLORESCENCIA directa en extendidos de muestra
nasofaríngea, para detectar B. Pertussis con anticuerpos fluorescentes (F .A),
revela cocobacilos pequeños con fluorescencia periférica de color verde
brillante, antes de que haya crecimiento en cultivo. La interpretación de la
prueba es delicada y algunos investigadores creen que es insensible e
inespecífica.
·
La Prueba de F. A. para detectar B. Pertussis debe realizarse junto con el
cultivo, ya que las dos pruebas son complementarias.
·
La tinción de Gram, podemos confirmar, simultáneamente la morfología
cocobacilar de los microorganismos, que presentan fluorescencia con el
reactivo por lo que constituye una de las pruebas más importantes, en la
identificación de B. Pertussis.
1.2.9.2 Diagnóstico Indirecto
·
Se lo realiza al final del Período Paroxístico y hasta después del Período de
Convalecencia.
·
Método ELISA reacciones de Aglutinación con antisueros específicos para
detección de anticuerpos en el suero sanguíneo. Estas pruebas son útiles
desde el punto de vista epidemiológico, para el diagnóstico ayuda poco,
porque la elevación de anticuerpos recién se produce en la tercera semana de
enfermedad.
·
Se han desarrollado otros métodos para la identificación del microorganismo o
sus componentes, mediante hibridación con DNA, Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), pero estos métodos no se utilizan en la práctica general.
(2)
12
1.2.10 Casos reportados de Coqueluche a nivel local en el INSTITUTO
NACIONAL DE HIGIENE M.T. “L.I.P” DE GUAYAQUIL.
A partir del año 1.999, el Subproceso de Bacteriología-Peste del Instituto Nacional
de Higiene “Leopoldo Izquieta Pérez” de Guayaquil, realiza el Diagnóstico Directo
por método de Cultivo en sospecha de Tosferina.
Inicialmente realizaban el aislamiento de la Bordetella Pertussis en Agar selectivo
de Bordet Gengou. Actualmente lo efectúan con el medio de Reagan Lowe,
obteniendo mejor aislamiento de la Bordetella Pertussis, confirmando la
morfología coco bacilar de los microorganismos con la Tinción de Gram.
Según registros facilitados por esta Fuente, los casos de Bordetella Pertussis son
los siguientes
AÑO
TOTAL DE MUESTRAS
NEGATIVOS
POSITIVOS B. PERTUSSIS
POSITIVOS B. PARAPERTUSSIS
1999
2000
2001
2002
2003
42
25
17
-
147
112
29
6
109
82
17
10
42
42
-
26
26
-
En lo que va del año 2004 no se han registrado casos positivos de Bordetella
Pertussis.
La edad de mayor incidencia de positivos de B. Pertussis son niños menores de 2
años, rara vez adultos, de posición económica baja.
(6)
13
1.2.11 Diagrama de Flujo del proceso de Liofilización de Cepa Bordetella
Pertussis utilizadas en producción de Vacuna Pertussis
SELECCION VIAL LIOFILIZADO CEPA
MADRE B. PERTUSSIS
EMULSION VIAL LIOFILIZADO
PUREZA
1ERA SIEMBRA (M. BORDET GENGOU AGAR
SANGRE) INCUBACION 35ºC - 37ºC 72 HORAS
PUREZA
2DA SIEMBRA (M. BORDET GENGOU AGAR SANGRE)
PUREZA
INCUBACION 35ºC - 37ºC 48 HORAS
INOCULACION EN TUBOS CON MEDIO GENGOU
BORDET AGAR SANGRE
INCUBACION 35ºC - 37ºC 24 HORAS
OBSERVACION
MICROSCOPICA DE CADA
TUBO INOCULADO
DILUCION Y COSECHA DE BIOMASA
CENTRIFUGACION
MASA BACTERIANA
DESCARTAR
SOBRENADANTE
DILUCION Y HOMOGENIZACION
AGITACION EN BASE MAGNETICA
ENVASE
SUBCERO ( - 40ºC)
LIOFILIZADOR
SELLADO
COMPROBACION DE
VACIO
ROTULACION
ALMACENAMIENTO
( 2º - 8ºC)
SEMILLAS DE TRABAJO
14
Emulsión vial liofilizado cepa madre Bordetella Pertussis
FIGURA Nº 2
15
Almacenamiento en Cámara Fría (2º C – 8º C) de Cepas Bordetella Pertussis
FIGURA Nº 3
16
1.3
Vacuna Pertussis
La Vacuna Pertussis cumple las regulaciones de la FDA concerniente a
Biológicos. Es una fracción bacteriana estéril o suspensión de bacilo pertussis
muerta (Bordetella pertussis) de una cepa o cepas seleccionadas por su alta
eficiencia antigénica.
Debe contener requisitos de calidad cuyos resultados estén dentro de los límites
de aceptación. Para esto, se realizan diferentes Métodos de Ensayo. Contiene un
preservativo.
(4)
1.3.1 Historia de la vacunación
Se inició en 1906 cuando Bordet y Gengou cultivaron por primera vez Bordetella
Pertussis La primera vacuna antipertúsica contenía bacterias inactivadas de
célula entera. Las primeras pruebas clínicas se realizaron en las Islas Faroe en
1923-24, y en 1925 Madsen informó resultados de esta vacunación.
Las siguieron otras en los Estados Unidos, y luego en Inglaterra con diversas
vacunas.
Al concluir estas pruebas, se introdujo la vacunación con células
enteras para utilización en gran cantidad de países industrializados, primero en
Estados Unidos, luego en Japón y Europa.
La vacuna antipertúsica se introdujo por primera vez en Estados Unidos en 1948,
y se administró ampliamente en 1953.
En Japón, la inmunización masiva
comenzó en los años 50. En Gran Bretaña, las campañas de vacunación masiva
se iniciaron en 1960, mientras que en Francia no comenzaron sino hasta 1966.
(11)
1.3.2 Vacunas Disponibles
1.3.2.1 Célula Entera (Celular)
Esta vacuna antipertúsica está en uso desde la década de 1950.
17
Asociada a los Toxoides Diftérico y Tetánico forman la vacuna triple o D.P.T.
llamada Vacuna Tradicional, razonablemente similar en todo el mundo e induce
una alta eficacia y es bastante segura.
(1)
En la actualidad, la vacuna antipertúsica de célula entera se administra en
conjunción con las vacunas antidiftérica, antitetánica, antipoliomielitica inactivada,
polisacárido capsular conjugado de Haemophilus influenzae b y hepatitis b.
Las vacunas de célula entera que se aplican hoy en día están compuestas de
una mezcla de suspensiones bacterianas inactivadas por exposición al calor. (11)
1.3.2.2 Acelular
Las vacunas acelulares, de las que existen diversas formulas, contienen 1 o más
antígenos de virulencia de Bordetella pertussis (si bien siempre contienen el
toxoide preparado en base a la toxina pertúsica).
(11)
En 1981, se inició en Japón la vacunación con la nueva vacuna acelular, lo que
despertó numerosas reacciones en todo el mundo, los informes indican resultados
muy positivos.
La vacuna acelular japonesa tradicional contiene toxina de B. Pertussis en forma
de toxoide y hemaglutinina fibrosa. Las vacunas acelulares se introdujeron por
primera vez en Estados Unidos en 1995.
Merecen especial atención, los estudios realizados por el Centro Sclavo en Italia
que ha producido con la manipulación genética de Bordetella resultando mutantes
igualmente inmunogénicas que la toxina nativa, pero que carecen de actividad
tóxica.
Estas mutantes se están empleando para desarrollar acelular que no
requiera destoxificación y que seguramente se podrán usar, inclusive para la
vacuna tradicional.
(1)
18
1.3.3 Riesgo y Beneficio de las Vacunas Celulares y Acelulares
Es evidente que lo que se procura es una vacuna altamente eficaz con mínimos
efectos colaterales.
Los resultados de distintos trabajos apoyan el concepto de que la vacuna celular
produce reacciones locales de importancia; pero también se debe admitir que
posee muy alta eficacia, induce una buena protección que se estima puede ser
entre el 90-95% y es bastante segura.
En contraste, las vacunas acelulares, que casi no producen efectos colaterales,
presentan una eficacia mucho mas baja. Según investigadores de la Academia de
Medicina Sueca establecieron que la eficacia de estas vacunas varia entre 54 y
69%, es decir el resultado es poco satisfactorio. Otra investigación sueca insiste
que la eficacia de la vacuna acelular disponible en ese país es de 89 a 100%.
Kato y Col, en el Japón, afirman que la vacuna acelular japonesa tiene el 90% de
eficacia.
(1)
Es decir, que todavía no se pueden sacar conclusiones de dos estudios que
apoyen la inmunización masiva de los niños con vacunas acelulares.
El costo de las vacunas acelulares es significativamente más alto que el de la
tradicional.
(9)
1.3.4 Impacto Mundial de la Vacunación
La pertussis o Tosferina es una infección bacteriana altamente contagiosa: del 90
al 100% de los niños susceptibles contraen la enfermedad al ser expuestos a un
solo sujeto infectado.
(11)
19
1.3.5 Vacuna Pertussis Elaborada en el Ecuador
1.3.5.1 Generalidades
En 1945, en el Instituto Nacional de Higiene M.T. “Leopoldo Izquieta Pérez” de
Guayaquil, se inició la producción de las vacunas Tifoidea y Pertussis, del Toxoide
Diftérico y de la vacuna doble de Pertussis Difteria.
En 1966, se construyó un nuevo edificio para la Producción de Biológicos y se
inició la elaboración del Toxoide Tetánico, lo que permitió preparar la Vacuna
Triple bacteriana D.P.T. (Difteria Pertussis Tétanos) de uso oficial en los
programas de inmunización colectiva en el Ecuador. (3)
Utiliza el Método de Producción Estacionario, donde la Bordetella Pertussis crece
en medio sólido (Medio de Cohen y Wheleer`s).
Es una vacuna celular, de una excelente calidad-eficiencia antigénica y seguridad.
Contiene 16 U.O. (Unidades de Opacidad) por dosis.
1.3.5.2 Especificaciones de la Vacuna Pertussis Concentrada
Nombre:
Vacuna Pertussis concentrada
Descripción:
Suspensión salina blanquecina de células completas de
dos o más cepas de Bordetella Pertussis, las cuales han
sido muertas y destoxificadas con thimerosal en
condiciones adecuadas de temperatura, tiempo y pH
eliminando
su
toxicidad
y
manteniendo
su
inmunogenicidad.
Aplicación propuesta: Principio activo para la formulación de la vacuna D.P.T.
Formulación:
*
Bacterias muertas y destoxificadas c.s.p.
*
Solución salina 0.85%
*
Thimerosal al 0.01%
20
Forma de presentación: Producto granel
Tiempo de vencimiento: 18 meses
Requisitos de
calidad
Esterilidad
Pureza
PH
Opacidad
(contenido
bacteriano)
Inocuidad
Toxicidad
Específica
Potencia
Contenido de
thimerosal
Manipulación:
Límites de aceptación
Métodos de Ensayo
Ausencia de
microorganismos
contaminantes
Presencia solo de coco
bacilos gram negativo de
Bordetella Pertussis
Cultivo directo.
6.8 a 7.4
Potenciometría
≥ 250 UO/ml
Espectrofometría
(Unidades opacidad)
Inocuo, los animales no
deben presentar signos de
enfermedad o muerte
Al final de las 72 h. El peso
del grupo de ratones no es
menor que al momento de la
inoculación.
Al final de los 7 días el peso
promedio ganado por ratón
no es menor que el 60% de
aquel del grupo control.
No menos de 4 UI/DHS
Prueba biológica .
0.005 a 0.02 g %
Espectrofotometría
Microscopia
Prueba biológica
Prueba biológica
Manipular con cuidado, evitar exposición al ambiente y a altas
temperaturas.
Almacenamiento: De 2º a 8º C.
Transporte:
Transportar en cajas termo manteniendo cadena de frío.
21
1.3.6 Diagrama de Flujo del proceso de producción de Vacuna Pertussis
RECONSTITUCION DE
CEPA LIOFILIZADA
Microscopia
PUREZA
(SEMILLA DE TRABAJO)
Incubación 72 Horas, 35º C
Esterilidad
IDENTIDAD
ELABORACION DE PRESEMILLA
(Incubación 72Horas, 35ºC)
PUREZA
ELABORACION DE SEMILLA
(Incubación 72Horas, 35ºC)
PUREZA
SIEMBRA
(Incubación 72 horas, 35ºC)
PUREZA
COSECHA
(Incubación 72 horas, 35ºC)
PUREZA
OPACIDAD
MUERTE Y
DESTOXIFICACION
AUSENCIA B.
PERTUSSIS
VIVA
pH
CENTRIFUGACION
ESTERILIDAD
0
PUREZA
MASA
BACTERIANA
OPACIDAD
SUSPENSIONES
INDIVIDUALES
DESCARTAR
SOBRENADANTE
ESTERILIDAD
PUREZA
pH
VACUNA
PERTUSSIS
CONCENTRADA
Ph
OPACIDAD
INOCUIDAD
TOXICIDAD
ESPECIFICA
POTENCIA
CONTENIDO DE
THIMEROSAL
22
1.3.7 DESCRIPCIÓN DE LAS ÁREAS DE PRODUCCIÓN
La Vacuna Pertussis concentrada se produce en una área estéril, de gran
asepsia, de atmósfera controlada clasificada como tipos A y B con pisos antipolvo
y liso, paredes y techos de cemento pulido recubiertos de pintura epóxica, puertas
de acero inoxidable, aluminio y vidrio hemérticas y lavables. Esta área posee
sistema de climatización con aire filtrado por filtros HEPA de alta eficiencia y
mesones de trabajo de granito cubiertos con resina epóxica.
1.3.8 EQUIPAMIENTO UTILIZADO
·
Autoclave
·
Destilador de agua
·
Horno
·
Balanza Analítica
·
Cabina de Bioseguridad Clase II tipo A
·
Comprobador de Vacío
·
pH metro
·
Microscopio
·
Centrífuga Refrigerada
·
Liofilizador
·
Cámara Fría (2º C - 8º C)
·
Cuarto incubadora (35º C - 37º C)
23
CAPITULO II
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
2.1
Problema
Al cambiar la presentación de ampollas a viales al liofilizar la Cepa Bordetella
Pertussis hay factores determinantes que facilitarían el proceso de liofilización
para la obtención de un producto de excelente calidad.
2.2
Hipótesis
¿ De qué factores dependerá el proceso de liofilización de la Cepa Bordetella
Pertussis al realizar el cambio de presentación de ampollas a viales?
2.3
Objetivos
General
Contribuir al conocimiento del estudio de los factores determinantes de la calidad
del liofilizado de Bordetella Pertussis en la presentación de viales, en el Instituto
Nacional de Higiene M.T.
“Leopoldo Izquieta Pérez” de Guayaquil, período
Enero-Octubre del 2002.
Especificos
· Determinar los factores que influyen en la calidad del liofilizado de la
presentación en viales.
· Evaluar los factores técnicos del proceso de liofilización en viales.
· Correlacionar los proceso técnicos de la producción de la cepa de Bordetella
Pertussis para ampollas y viales.
24
2.4
Variables a Evaluar
Para la interpretación de los datos primarios, se emplearán las siguientes
variables:
Variables Cualitativas
· Aspecto físico del liofilizado.
· Color
· Consistencia
· Pureza
· Prueba de vacío del liofilizado
· Esterilidad del liofilizado
Variables Cuantitativas
· Tiempo de Liofilización
· Temperatura del proceso
· Unidades de medida del vacío
· Humedad
25
CAPITULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizó un estudio de tipo PROSPECTIVO ANALÍTICO sobre los factores
determinantes de la calidad de liofilizado de la cepa Bordetella Pertussis para
ampollas y viales, en el Instituto Nacional de Higiene M.T. “Leopoldo Izquieta
Pérez” de Guayaquil, en el período Enero-Octubre del 2002.
3.1
Universo
Está constituído por todos los lotes de ampollas y viales.
3.2
Muestra
Está constituída por un grupo selectivo de ampollas y viales, obtenidos de los
diferentes lotes elaborados en un tiempo comprendido de 10 meses, de Enero a
Octubre del 2002.
3.3
Criterio de Inclusión de Datos
Se incluyeron dentro de esta investigación:
Liofilizador del Subproceso de Vacuna Pertussis con sus implementos, ampollas y
viales utilizados en los diferentes lotes, cumpliendo con los parámetros a estudiar.
Equipos del Instituto Nacional de Higiene “Leopoldo Izquieta Pérez” de Guayaquil,
durante el periodo Enero-Octubre del 2002.
26
3.4
Criterio de Exclusión
Fueron excluídos en esta investigación los demás liofilizadores que existen en
otros subprocesos del Instituto Nacional de Higiene “Leopoldo Izquieta Pérez” de
Guayaquil.
3.5
Obtención de Datos Primarios
Para la obtención de datos primarios se elaboró una hoja de recolección de datos
donde se incluyen las variables cualitativas y cuantitativas.
Para tal efecto, se revisó el proceso de liofilización de la cepa Bordetella
Pertussis, se ejecutó las corridas necesarias y de los cuales se obtuvieron
resultados que se analizarán mas adelante.
3.6
Procedimiento de Trabajo
· Se correlacionó los procesos técnicos y materiales
para la producción de
Bordetella Pertussis tanto en ampollas como en viales.
· Se controló método operativo para el proceso de liofilización.
· Se realizaron liofilizaciones en viales conteniendo el Medio Leche Descremada
al 10% (pruebas de ensayo).
· Se realizó un Lote en el que se obtuvo Liofilizado de cepa Bordetella Pertussis,
en Viales.
· Se determinaron en los Lotes liofilizados: prueba de vacío, esterilidad,
humedad, color, consistencia, morfología y aspecto físico del liofilizado.
· Se reportó los resultados de acuerdo a las pruebas realizadas.
27
3.7
Procesamiento de la Información
Toda la información recogida será procesada en una base de datos,
confeccionada en un sistema de cómputo compatible con el análisis estadístico
básico donde se empleará los sistemas clásicos Microsoft, Epinfo, Word, Excel.
Para ésto, se situaron los datos de cada presentación y sus parámetros en formas
de tablas donde se reflejó todo lo riguroso del estudio.
Una vez analizados los parámetros de las dos presentaciones, se confeccionaron
las tablas # 1 y # 2 donde constan los elementos sobresalientes que
predominaron en cada uno de los datos con el porcentaje significativo, y un
Cuadro Comparativo del proceso de liofilización en viales y ampollas, con las
Ventajas y Desventajas de las dos presentaciones.
3.8
Presentación de la Información
Toda la información será presentada en tablas o gráficos para una mejor
comprensión y análisis del estudio realizado que se obtiene de la recolección de
datos en general, de las dos presentaciones estudiadas e incluídos dentro de la
discusión de los resultados.
3.9
Materiales
Los materiales utilizados en el estudio consistieron en:
3.9.1
Equipos Utilizados
· Liofilizador. Es de procedencia Japonesa, donado al INH ”L.I.P.” de Guayaquil,
en el año 1999
· Cabina de Bioseguridad Clase II Tipo A
· Autoclave
· Destilador de Agua
· Subcero ( -40ºC)
28
· Centrífuga Refrigerada (4ºC)
· Horno
· Horno al Vacío (determinación de humedad)
· Microscopio
· Agitador Magnético
· Comprobador de Vacío
· Mechero de Bunsen
· Cámara Fría ( 2º C - 8º C)
· Cuarto Incubadora ( 35º C - 37º C)
3.9.2
Materiales
· Cepas Bordetella Pertussis (137 – 143)
· Envases: Ampollas (5ml), Viales ( 1ml) estériles
· Tapones de Caucho estériles
· Aros de Aluminio estériles
· Jeringuillas descartables de 3ml
· Agujas largas estériles
· Fiolas estériles
· Tubos estériles
· Placas Portaobjetos estériles
· Cajas de Petri estériles
· Barra Magnética estéril
· Tubos de centrífuga estériles
· Campos de gasa estériles
· Campos de algodón estériles
29
3.9.3
Medios de Cultivo
· Bordet Gengou Agar Sangre
· Leche Descremada al 10%
· Ácido Casamino al 1%
· Ácido Casamino al 1% más Solución Salina 0.85% al 0.4%
· Thioglicolate F. al 2.98%
· Soya Caldo al 3%
3.9.4 Soluciones
· Alcohol 70%
· Fenol 0.5%
· Tinción de Gram
3.9.5 Equipo Utilizado: Liofilizador
Su forma es de ramales o conectores múltiples (manifolds) para Ampollas; y
secador de bandeja cilíndrica para Viales. Estos implementos van ensamblados
al Liofilizador, que a su vez está conectado a una Bomba de Vacío (Fig. Nº 4 y
Fig. Nº 5).
30
Liofilizador para Ampollas, forma de Ramales o Conectores Múltiples
(Manifolds)
FIGURA Nº 4
31
Liofilizador para Viales, forma de Campana o Secador de Bandeja Cilíndrica
FIGURA Nº 5
32
3.9.5.1
Especificaciones del Liofilizador
· Marca:
Eyela
· Modelo:
FDU – 830
· Presión de la Bomba:
6.7 x 10-2
· Temp. de la Cámara de Secado:
-80ºC
· Tiempo Requerido de refrigeración:
30Min
· Bomba de Vacío:
Pirani Caudal (4-0.004 torr)
· Electricidad:
100 V AC, 50/60 Hz. 20 A, 1 fase.
(5x10-4) pa (Torr)
· Dimensiones Ancho x Diámetro x Altura (mm):
455 x 504 x 901
· Peso Neto:
60 Kg
· Accesorios:
Bomba de vacío, Removedor de hielo,
Forma
T
Manifold
(ramales)
para
Ampollas y secador de bandeja cilíndrica
para Viales
3.9.5.2 Envases Utilizados
a)
Ampollas:
Vidrio Neutro, incoloro, de capacidad 5 ml.
b)
Viales:
Vidrio Neutro, incoloro, de capacidad 1 ml.,
boca 13 mm. Con tapones ranurados, butilo gris.
Y los sellos color Standard de aluminio.
33
3.9.5.3
Calidad de los Envases
·
Los dos envases son de vidrio de borosilicato.
·
Cumplen con los requisitos Tipo I para la Clase A de la Farmacopea de los
EE.UU.AA. para vidrio Tipo I .
·
De alta durabilidad química, pueden esterilizarse repetidamente.
·
Transparentes.
3.10 Funcionamiento del liofilizador
3.10.1 Método operativo para Ampollas
ACTIVACION UNIDAD DE
REFRIGERACION DEL
LIOFILIZADOR
REGISTRO OPTIMO INDICADOR DE VACIO
COLOCACION DE LAS AMPOLLAS
(SUBCERO) A LOS RAMALES DEL MANIFOLD
LIOFILIZACION
SELLADO DE AMPOLLAS
APAGAR EL EQUIPO
COMPROBACION DE
VACIO DE CADA
AMPOLLA
ROTULACION
ALMACENAMIENTO
( 2º -8ºC)
34
3.10.1.1
Liofilización en Ampollas
En todos los Lotes estudiados presentan las siguientes características según
variables estudiadas.
Aspecto Físico del Liofilizado
Pastilla compacta con características homogéneas.
Color
La Pastilla obtenida es de color crema.
Consistencia
Pastilla de fácil desprendimiento de las paredes de las ampollas.
Pureza
La observación realizada de la Bordetella pertussis es de morfología satisfactoria,
coco-bacilo gram negativo.
Prueba de vacío del Liofilizado
Se realizó la prueba con el Comprobador de Vacío obteniendo un porcentaje no
satisfactorio de ampollas con vacío.
Esterilidad del producto Liofilizado
La esterilidad la realicé en tubos conteniendo medio thioglicolate 2.98% y caldo
soya triptica al 3%, dando como resultado una esterilidad satisfactoria.
Tiempo del proceso de Liofilización
El tiempo del proceso de liofilización es de 6 horas.
35
Temperatura del proceso
La temperatura que alcanzó en el proceso de liofilización es de - 80ºc.
Unidades de medida de vacio
Dentro de los rangos 4 - 0.004 torr.
Humedad
Dentro de los valores de aceptación, hasta el 3% de humedad.
36
3.10.2 Método Operativo para Viales
ACTIVACION UNIDAD DE
REFRIGERACION DEL
LIOFILIZADOR
REGISTRO OPTIMO INDICADOR DE VACIO
COLOCACION DE LOS VIALES (SUBCERO)
EN LA BANDEJA CILINDRICA
LIOFILIZACION
SELLADO DE VIALES
APAGAR EL EQUIPO
COMPROBACION DE
VACIO DE CADA VIAL
ROTULACION
ALMACENAMIENTO
( 2º -8ºC)
37
3.10.2.1
Liofilización en Viales
Aspecto Físico del Liofilizado
Pastilla compacta con características homogéneas.
Color
La pastilla obtenida es de color crema.
Consistencia
Pastilla de fácil desprendimiento de las paredes del vial.
Pureza
La observación realizada de la Bordetella pertussis es de morfología satisfactoria,
coco bacilo gam negativo.
Prueba de Vacío del Liofilizado
Se realizó la prueba con el Comprobador de Vacío obteniendo un porcentaje alto
de viales con un buen sellado.
Esterilidad del Liofilizado
La esterilidad la realicé en tubos conteniendo medio thioglicolate al 2,98% y caldo
soya triptica al 3%, dando como resultado una esterilidad satisfactoria.
Tiempo de Liofilización
El tiempo del proceso de liofilización es de 6 horas.
Temperatura del Proceso
La temperatura que alcanzó en el proceso de liofilización es de - 80ºc.
38
Unidades de Medida de Vacío
Dentro de los rangos 4 - 0.004 torr.
Humedad
Dentro de los valores de aceptación, hasta el 3% de Humedad.
39
CAPITULO IV
RESULTADOS E INTERPRETACIONES
4.1
Análisis de los Resultados e Interpretaciones
4.1.1 Análisis de las Dos Presentaciones
Después del estudio de las pruebas realizadas en cada presentación con sus
respectivas tablas, dimos origen a la siguiente tabla en la cual obtuvimos los
resultados finales de nuestro estudio.
El Aspecto Físico de las dos presentaciones fue satisfactorio al igual que el
color, consistencia y pureza del producto.
En la Prueba de Vacío se obtuvieron los siguientes resultados:
En Ampollas
· En el Lote Nº 1:
41.66 %
· En el Lote Nº 2:
66.66 %
· En el Lote Nº 3:
75.00 %
· En el Lote Nº 4:
83.33 %
En Viales
· En el Lote Nº 1:
53.84 %
· En el Lote Nº 2:
84.60 %
· En el Lote Nº 3:
96.15 %
· En el Lote Nº 4:
100
%
Demostrando que en la presentación de Viales, fue un alto porcentaje de producto
con vacío.
40
La Esterilidad en las dos presentaciones se los realizó con los Medios de Cultivo
siguientes:
· Thioglicolate F. al 2.98 %
· Soya Caldo Triptica al 3 %
Incubándolos a 35ºC
y 26ºC por 14 días y obtuvimos que en las dos
presentaciones esta prueba Pasa el Ensayo (P.E.).
La Determinación de Humedad realizada en las ampollas dieron los siguientes
resultados:
En Ampollas
· En el Lote Nº 1:
2.30 %
· En el Lote Nº 2:
2.30 %
· En el Lote Nº 3:
1.88 %
· En el Lote Nº 4:
2.20 %
En Viales
· En el Lote Nº 1:
3.50 %
· En el Lote Nº 2:
3.00 %
· En el Lote Nº 3:
1.96 %
· En el Lote Nº 4:
2.30 %
Con lo cual podemos determinar que los valores están dentro de los rangos de
aceptación.
El Tiempo y la Temperatura del proceso de Liofilización fue igual en la dos
presentaciones, registrando valores óptimos de las unidades de medidas de vacío
para cada desarrollo.
41
42
TEMPERATURA DEL PROCESO
- 80 C
6 HORAS
2.3 %
P.E
66.66 %
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
CREMA
SATISFACTORIO
2
- 80 C
6 HORAS
1.88 %
P.E
75%
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
CREMA
SATISFACTORIO
3
4
- 80 C
6 HORAS
2.2 %
P.E
83.33 %
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
CREMA
SATISFACTORIO
Lotes Nº 1, 2 , 3 y 4 realizados con Cepa B.Pertussis 137 - 143
Cada lote se conforma de 24 Ampollas
* P.E = Pasa el Ensayo
* SATISFACTORIO = Cumple con las especiificaciones de calidad
- 80 C
6 HORAS
2.3 %
HUMEDAD DEL PRODUCTO LIOFILIZADO
TIEMPO DE LIOFILIZACION
P.E
ESTERILIDAD DEL PRODUCTO LIOFILIZADO
41.66 %
SATISFACTORIO
PUREZA DEL PRODUCTO
PRUEBA DE VACIO A LA AMPOLLA
SATISFACTORIO
CREMA
SATISFACTORIO
1
CONSISTENCIA DEL PRODUCTO
COLOR DEL PRODUCTO
ASPECTO FISICO DEL PRODUCTO
LOTE
LIOFILIZACION EN AMPOLLAS
TABLA Nº 1
43
- 80 C
- 80 C
6 HORAS
3,00%
P.E
84,60%
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
CREMA
SATISFACTORIO
2
- 80 C
6 HORAS
1.88 %
P.E
96,15%
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
CREMA
SATISFACTORIO
3
4
- 80 C
6 HORAS
2.3 %
P.E
100%
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
CREMA
SATISFACTORIO
Lotes Nº 1, 2 y 3 de ensayo. Lote Nº 4 realizado con Cepa B.Pertussis 143
Cada lote se conforma de 26 frascos (viales)
* P.E = Pasa el Ensayo
* SATISFACTORIO = Cumple con las especiificaciones de calidad
TEMPERATURA DEL PROCESO
6 HORAS
3,50%
HUMEDAD DEL PRODUCTO LIOFILIZADO
TIEMPO DE LIOFILIZACION
P.E
ESTERILIDAD DEL PRODUCTO LIOFILIZADO
53,84%
SATISFACTORIO
PUREZA DEL PRODUCTO
PRUEBA DE VACIO DE VIALES
SATISFACTORIO
CREMA
SATISFACTORIO
1
CONSISTENCIA DEL PRODUCTO
COLOR DEL PRODUCTO
ASPECTO FISICO DEL PRODUCTO
LOTE
LIOFILIZACION EN VIALES
TABLA Nº 2
LIOFILIZACION EN AMPOLLAS DE CEPA BORDETELLA PERTUSSIS
CEPA 137 -143
LOTE
AMPOLLAS
DESCARTADAS PORCENTAJES
1
2
3
4
24
24
24
24
7
3
4
3
1lote
2lote
3lote
4lote
29,16
12,50
16,66
12,50
29.16%
12.50%
16.66%
12.50%
100
90
80
PORCENTAJES
70
60
100
50
40
29,16%
30
12,50%
16,66%
12,50%
20
10
1lote
2lote
3lote
4lote
LOTES
Podemos observar que cada lote consta de 24 ampollas y que durante el proceso
de liofilización se rompen, por lo tanto son descartadas.
Los principales motivos de rotura de las ampollas se dan:
·
En la selección de ampollas al ser adaptadas a los ramales del liofilizador.
·
En el alargamiento de las ampollas, después del envase, conteniendo el
producto a liofilizar.
44
·
En el acoplamiento de las ampollas en forma rápida a los ramales del
liofilizador, para evitar la descongelación del producto (mantenidas en el
subcero a -40º C).
·
En el sellado de ampollas con el mechero de bunsen, con llama graduada
como soplete.
·
Al retirarlas de los ramales del equipo previo entorchamiento de la ampolla con
el mechero.
Es decir, que se observó un porcentaje algo elevado de riesgo en la manipulación
de las ampollas.
45
LIOFILIZACION EN AMPOLLAS DE CEPA BORDETELLA PERTUSSIS
CEPA 137 -143
LOTE
AMPOLLAS
LIOFILIZADAS
CON VACIO
PORCENTAJE
AMPOLLAS
LIOFILIZADAS
SIN VACIO
PORCENTAJE
1
2
3
4
10
16
18
20
41,66%
66,66%
75,00%
83,33%
7
5
2
1
29,16%
20,83%
8,33%
4,16%
90
1lote
2lote66,66%
3lote
4lote
80
70
41,66
66,66
75
83,33
75,00%
29,16
20,83
8,33
4,16
83,33%
PORCENTAJES
60
50
41,66%
40
29,16%
30
20,83%
20
8,33%
10
4,16%
0
1lote
2lote
3lote
4lote
LOTES
Después de la liofilización se comprobó el vacío de las ampollas y podemos
observar que en los primeros lotes es elevado el número de ampollas sin vacío,
mejorando a medida que se han ido ejecutando las corridas del proceso.
46
DETERMINACION DE HUMEDAD EN AMPOLLAS
LOTE
HUMEDAD
1
2
3
4
2,30%
2,30%
1,88%
2,20%
3
1lote
2lote
2,6
3lote
2,4 4lote
PORCENTAJES
2,8
2,3%
2,3
2,3
1,88
2,3% 2,2
2,2%
2,2
1,88%
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
1lote
2lote
3lote
4lote
LOTES
Se determina la Humedad de cada lote de producto liofilizado y se observó la
eficacia esperada de calidad, siendo los valores de aceptación hasta el 3% de
humedad
47
PRUEBA DE ESTERILIDAD EN AMPOLLAS
LOTE
ESTERILIDAD
1
2
3
4
100,00%
100,00%
100,00%
100,00%
120 1lote
2lote
3lote 100%
100
4lote
100
100
100%
100
100
100%
100%
ESTERILIDAD
80
60
40
20
0
1lote
2lote
3lote
4lote
LOTES
Las pruebas de esterilidad se realizaron con los Medios Thioglicolate al 2.98% y
caldo Soya Tríptica al 3% de los productos liofilizados, en tubos a 35ºc y 26º por
14 días.
Siendo la prueba satisfactoria, no presentando crecimiento alguno, dando como
resultado que Pasa el Ensayo.
48
LIOFILIZACION EN VIALES DE CEPA BORDETELLA PERTUSSIS
CEPA 143
120
100
LOTE
VIALES
DESCARTADAS
1
2
3
4
26
26
26
26
0
0
0
0
1lote
2lote
100%
3lote
4lote
100
100
100%
100
100
1lote
2lote
PORCENTAJES
100%
100%
100%
100%
100%
100%
PORCENTAJES
80
60
40
20
0
3lote
4lote
LOTES
Podemos observar la eficacia en el cambio de presentación, a viales; no hay
riesgos en la manipulación del envase durante el proceso de liofilización.
Pudiendo concluir, que el cambio de presentación es conveniente para la
obtención y conservación de la Cepa Bordetella Pertussis.
49
LIOFILIZACION EN VIALES DE CEPA BORDETELLA PERTUSSIS
CEPA 143
LOTE
VIALES LIOFILIZADOS CON
VACIO
1
2
3
4
14
22
25
26
PORCENTAJES
53,84%
84,60%
96,15%
100,00%
120
1lote
2lote
3lote
84,60%
4lote
100
PORCENTAJES
80
60
53,84
96,15%
84,06
100,00%
96,15
100,00
53,84%
40
20
0
1lote
2lote
3lote
4lote
LOTES
En esta tabla podemos observar que existe una variación al obtener los viales
liofilizados con vacío.
En el estudio para el cambio de presentación, a viales, se basó en el uso de 3
gradillas que servían de base.
50
El Lote # 1 a base de espumaflex, como lo indico en el Anexo Nº 5 encontrando
que el material no era el adecuado para este procedimiento, por lo tanto registra
un alto valor de viales sin vacío.
El Lote # 2 se cambió a una gradilla metálica, algo inestable por su base cuya
superficie no era plana, tal como lo indica el Anexo Nº 6
El Lote # 3 se procedió a cambiar la gradilla metálica con una base estable en
que todos los viales se asientan bien y con ella partimos para realizar el proceso
en producto, según Anexo Nº 7.
Los Lotes 1 - 2 y 3 se hicieron con el Medio de ensayo Leche Descremada al
10%.
El Lote # 4 se lo realizó usando la última gradilla (metálica) y viales con la cepa
Bordetella Pertussis, obteniéndose viales con buen vacío; por lo tanto, tuvimos
un 100% de seguridad en el uso de viales en el proceso de la liofilización.
51
LIOFILIZACION EN VIALES DE CEPA BORDETELLA PERTUSSIS
CEPA 143
50
LOTE
VIALES LIOFILIZADOS SIN VACIO
1
2
3
4
12
4
1
0
46,15%
45
PORCENTAJES
40
35
1lote
2lote
3lote
4lote
PORCENTAJES
46,15%
15,38%
3,84%
0,00%
46,15
15,38
3,84
0
30
25
20
15,38%
15
10
3,84%
5
0
0
1lote
2lote
3lote
4lote
LOTES
52
DETERMINACION DE HUMEDAD EN VIALES
LOTE
HUMEDAD
1
2
3
4
3,50%
3,00%
1,96%
2,30%
4
1lote 3,5%
3,5 2lote
3lote
PORCENTAJES
3 4lote
3,5
3,0
1,96
3,0%
2,3
2,3%
2,5
1,96%
2
1,5
1
0,5
0
1lote
2lote
3lote
4lote
LOTES
Podemos observar que la humedad obtenida, tanto de los 3 Lotes de ensayo y 1
Lote con producto Liofilizado, su resultado es satisfactorio, siendo los valores de
aceptación hasta el 3% de humedad.
53
PRUEBA DE ESTERILIDAD EN VIALES
LOTE
ESTERILIDAD
1
2
3
4
100,00%
100,00%
100,00%
100,00%
120
1lote
2lote 100%
100
3lote
4lote
100
100%
100
100
100
100%
100%
ESTERILIDAD
80
60
40
20
0
1lote
2lote
3lote
4lote
LOTES
En esta tabla se registran los resultados excelentes de la Prueba de Esterilidad de
los productos liofilizados, realizados con los Medios Thioglicolate al 2.98% y
Caldo Soya Tríptica al 3% en tubos a 35 º C y 26 º C por 14 días.
Por lo tanto esta prueba de Esterilidad Pasa el Ensayo (ver Anexo Nº 9).
54
4.1.2 Cuadro Comparativo del Proceso de Liofilización en Ampollas y
Viales
Ventajas y Desventajas:
Viales
Las Ventajas en el cambio de presentación son las siguientes:
· No encontramos variaciones en el Aspecto Físico - Color – Consistencia –
Pureza – Esterilidad y Humedad del producto Liofilizado, ni en el Tiempo –
Temperatura y Unidades de Medidas de Vacío del Proceso de Liofilización.
· No tuvimos que cambiar nada en los parámetros del liofilizador, usándolo en las
2 presentaciones. Solamente se adaptó al equipo, el Accesorio específico de su
presentación con su respectivo envase.
· Prueba de vacío: mejores resultados.
· Proceso más rápido y de menor riesgo en su manipulación y conservación.
· El Coste – Producto supera las expectativas de aceptación y ahorro.
Ampollas
Las Desventajas en esta presentación son las siguientes:
· Alto porcentaje de pérdidas por rompimiento de las mismas en el proceso de
liofilización:
55
·
Selección
·
Envase
·
Congelación
·
Sellado
· Riesgo de manipulación y conservación.
· Riesgo de contaminación del producto liofilizado al iniciar el flujo de producción
con la reconstitución del mismo.
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CAPITULO V
Conclusiones y Recomendaciones
5.1
Conclusiones
El presente trabajo ha permitido observar el Proceso de Liofilización de la Cepa
Bacteriana Bordetella Pertussis, específicamente los factores determinantes de la
calidad para su presentación en Viales y Ampollas.
Se ha podido
realizar una revisión del método operativo de las dos
presentaciones, como también la optimización del proceso de liofilización para
lograr el aseguramiento de su calidad.
La presentación de la Cepa Bordetella Pertussis ha sido en Ampollas con una
excelente calidad. Pero al ser manipuladas se corre el riesgo de contaminación en
la reconstitución de la Cepa al iniciar el Flujo de Producción de vacuna Pertussis y
un alto porcentaje de pérdidas por rompimiento de las mismas en el proceso que
puede suceder en las siguientes etapas:
· En la selección de ampollas que van a ser acopladas herméticamente a los
ramales del liofilizador.
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· Después de envasado el producto a liofilizar, se realiza el alargamiento de la
ampolla utilizando el mechero de Bunsen
· Después del proceso de congelación (subcero) pues deben ser adaptadas a los
ramales, en forma rápida, para evitar su descongelación.
· Al ser selladas con el mechero de Bunsen, con llama graduada como soplete.
· Al retirarlas de los ramales del equipo previo entorchamiento (giro) de la ampolla
con el mechero.
De ahí la importancia en el cambio de presentación, a Viales, obteniendo un
proceso más rápido y de menor riesgo en su manipulación, conservación y
mejorando el Coste-producto del mismo.
Concluyendo, que los resultados obtenidos en los Viales fueron las esperadas,
conservando la calidad-eficiencia antigénica y seguridad de la Cepa Bordetella
Pertussis , no variando al cambiar la presentación.
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5.2
Recomendaciones
Los resultados obtenidos en este trabajo me permiten hacer las siguientes
recomendaciones:
· Cumplir las Buenas Prácticas de Manufactura (B.P.M.) aplicables en el proceso
de Liofilización, para obtener un producto Biológico de excelente calidad.
· Validación del proceso de Liofilización.
· Realizar un mantenimiento constante del Liofilizador.
· Que los envases utilizados en la Liofilización cumplan con las especificaciones
de calidad requerida.
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