extracción y determinación de pigmentos fotosintéticos

EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS
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MÉTODO DEL DMSO (Dimetilsulfóxido)
Para la cuantificación de los diferentes pigmentos se utilizan discos de hojas previamente congeladas
en nitrógeno líquido y almacenadas a -80ºC.
Los pigmentos se extraen a partir de un disco de 0,5-0,8 cm de diámetro. Dicho disco se introduce en
un tubo de ensayo con 1 ml de DMSO, y debe permanecer 2 horas a 80ºC.
Transcurrido este tiempo el DMSO ha extraído por completo los pigmentos del tejido y se vierte el
sobrenadante, desechándose el precipitado, en la cubeta de medida del espectrofotómetro. Posteriormente
se mide la absorbancia a 750, 665, 649 y 480 nm, empleándose como blanco el DMSO. Para medir la
turbidez del extracto se mira la absorbancia a 750 nm, ya que las clorofilas no absorben en esa longitud de
onda. Se miden las absorbancias a 665 y 649 nm, máximos de absorción para la clorofila a y la clorofila b
respectivamente, en el caso de utilizar como disolvente el DMSO. Igualmente el contenido de carotenos y
xantofilas (carotenoides) se cuantifica a 480 nm.
La concentración de clorofilas se calcula mediante las siguientes fórmulas, teniendo en cuenta que el
disolvente empleado es DMSO:
Chla (µg / ml) = 12,47 x A665 – 3,62 x A649
Chlb (µg / ml) = 25,06 x A649 – 6,50 x A665
1000 x A480 – 1,29 Chla – 53,78 Chlb
Cx+c (Carotenoides) (µg / ml) = ---------------------------------------------------220
x + c = xantofilas + carotenos
Referencias bibliográficas: Barnes, J.D., Balaguer L., E. Manrique (1992) Dymethyl-sulfoxide
according to Barnes et al.
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MÉTODO DE LA ACETONA (80%)
Para la cuantificación de los diferentes pigmentos se utilizan discos de hojas previamente congeladas
en nitrógeno líquido y almacenadas a -80ºC.
Los pigmentos se extraen a partir de 0,1 g de peso fresco y se homogeneizan en 10 ml de acetona al
80% durante 2 minutos en oscuridad. Con el fin de eliminar los restos de material vegetal, el
homogeneizado se centrifuga a 3000 rpm durante 15 minutos en tubos protegidos de la luz, para evitar de
esta manera la fotodegradación de los pigmentos. El sobrenadante se vuelca a otros tubos fotoprotegidos,
desechándose el precipitado.
Se toman 0,2 ml del sobrenadante anterior a los que se añaden 2 ml de acetona al 80% y se agita.
Posteriormente se mide la absorbancia a 750, 663, 646 y 470 nm, empleándose como blanco la acetona al
80%. Para medir la turbidez del extracto se mira la absorbancia a 750 nm, ya que las clorofilas no
absorben en esa longitud de onda. La absorción máxima de las clorofilas se encuentra en la región roja y
azul del espectro visible, por eso se miden las absorbancias a 663 y 646 nm, máximos de absorción para
la clorofila a y la clorofila b respectivamente, en el caso de utilizar como disolvente acetona al 80%.
Igualmente el contenido de carotenos y xantofilas (carotenoides) se cuantifica a 470 nm.
La concentración de clorofilas se calcula mediante las siguientes fórmulas, teniendo en cuenta que el
disolvente empleado es acetona al 80%:
Chla (µg / ml) = 12,25 x A663 – 2,79 x A646
Chlb (µg / ml) = 21,50 x A646 – 5,10 x A663
Chla+b = 7,15 x A663 + 18,71 x A646
1000 x A470 – 1,82 Chla – 85,02 Chlb
Cx+c (Carotenoides) (µg / ml) = ---------------------------------------------------198
x + c = xantofilas + carotenos
Referencias bibliográficas: Lichtenthaler,HK. 1987. Chlorophyll and carotenoids: Pigments of
Photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148: 350-382
Fórmula para la acetona al 80% según el meeting, Liverpool
Chla (µg / ml) = 12,21 x A663 – 2,81 x A646
Chlb (µg / ml) = 20,13 x A646 – 5,03 x A663
Chla+b = 7,15 x A663 + 18,71 x A646
1000 x A470 – 3,27 Chla – 104 Chlb
Cx+c (Carotenoides) (µg / ml) = ---------------------------------------------------229