TP LIPIDOS

Química Biológica I TP 3 LÍPIDOS
OBJETIVOS:
-Poner de manifiesto ciertas propiedades de lípidos.
-Comprobar la presencia de los lípidos complejos en cerebro de vaca luego de extracción con
diferentes solventes y posterior fraccionamiento de los extractos.
FUNDAMENTOS:
Los lípidos, son un grupo heterogéneo de compuestos, de naturaleza antipática, es decir que
contienen regiones hidrofóbicas y regiones hidrofílicas. La mayor parte de los lípidos
abundantes en la naturaleza (triacilgliceroles), están formados por ácidos grasos de cadenas
hidrocarbonadas pares, saturados o insaturados. Los lípidos llevan a cabo múltiples funciones
en el organismo, como: almacenamiento de energía, de transporte, cumplir funciones
hormonales, actuar como vitaminas, formar parte de las membranas celulares confiriéndoles
la propiedad de permeabilidad selectiva, al permitir el paso o no de algunas sustancias y en
determinada dirección, así como la conducción nerviosa y el transporte activo como la bomba
+
+
de Na /K . A diferencia de los carbohidratos, proteínas y ácidos nucleicos, no forman
polímeros, son mas bien moléculas pequeñas que presentan una fuerte tendencia a asociarse
mediante fuerzas no covalentes. Algunas de las propiedades de los lípidos pueden ser usadas
para su reconocimiento, ya que pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose
productos coloreados, desprendimiento de vapores, formación de jabones, entre otros.
El tejido adiposo está constituído principalmente por las grasas neutras, pero el cerebro
contiene relativamente pocas, los constituyentes lipídicos de estos tejidos son los lípidos
complejos como: fosfolípidos y colesterol.
Basados en la solubilidad de los lípidos en solventes orgánicos, es posible extraer y purificar
lípidos del cerebro por sucesivas extracciones con diferentes solventes y posterior
fraccionamiento
de
los
extractos
para
obtener
fracciones
ricas
en:
esteroles,
glicerofosfolípidos y esfingolípidos. El esquema se basa en los siguientes hechos:
•
Los esteroles son solubles en acetona, al contrario de lo que sucede con otros lípidos
complejos.
•
Algunos glicerofosfolípidos, como las lecitinas, la fosfatidiletanolamina y la
fosfatidilserina, son solubles el éter e insolubles en acetona.
1
•
Los glucósidos de esfingosina se disuelven en alcohol caliente y son insolubles en
acetona y éter.
Los productos finales de este experimento son sustancias de una pureza relativa y serán
identificados una vez efectuadas las extracciones.
PARTE EXPERIMENTAL
I - Extracción de lípidos
Pesar 20 g de cerebro triturarlo en mortero y secarlo parcialmente en un vaso de precipitado.
Agregar 50 ml de alcohol etílico, llevar a ebullición y mantenerlo por 3 minutos, luego filtrar
por gasa. El filtrado se concentra en manta calefactora hasta unos 30 ml y se agregan luego 25
ml de éter, agitar y separar en ampolla de decantación.
Se obtienen dos fracciones:
Fracción superior A : etérea, que tendrá disueltos lecitina, cefalina, grasas, colesterol y restos
de esfingomielina y cerebrósidos.
Fracción inferior B : alcohólica que tendrá disueltos esfingomielina y cerebrósidos.
Fracción A: concentrar en baño María a mitad de volumen inicial y agregar 25 ml de acetona:
se observará un precipitado que corresponde principalmente a fosfolípidos, quedando en
solución el colesterol y las grasas. Separar por centrifugación obteniendo un sobrenadante C y
un precipitado D.
Sobrenadante C: separar en dos fracciones, en una reconocer grasas y en la otra extraer el
colesterol con 10 ml de éter, separar en ampolla de decantación y reconocer el colesterol.
Precipitado D: reconocer lecitina y cefalina como fosfolípidos.
Fracción B: reconocer cerebrósidos.
II - Reacciones de reconocimiento
1 - Reconocimiento de grasas:
Es una prueba para identificar ácidos grasos, por lo tanto, general para los lípidos que los
contengan. Los jabones se define químicamente como, las sales metálicas de los ácidos grasos
superiores.
Prueba de saponificación
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Se separan las grasas por saponificación, para esto se coloca 1 ml de la muestra, 1 ml de
etanol y 0,5 ml de hidróxido de sodio al 40%. Calentar suavemente. Agregar unas gotas de
ácido sulfúrico. La presencia de enturbiamiento indica liberación de ácidos grasos.
2 - Reconocimiento de colesterol: reacción de Liebermann –Burchard.
El colesterol reacciona con anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado. Se produce una
pérdida de agua y una protonización del colesterol. Se constituyen en medio anhidro
polímeros de hidrocarburos no saturados de intenso color verde azulado.
Secar la muestra a baño María. Resuspender en 2 ml de cloroformo.
En un tubo de ensayo mezclar 1 ml de anhídrido acético y 1 ml de cloroformo. Enfriar a 0°C
en baño de hielo. Agregar al tubo los 2 ml de la muestra y colocar en hielo. Agregar por las
paredes 1 gota de ácido sulfúrico cc. Enfriar y observar . Una coloración verde azulada indica
la presencia de grupo esteroide, colesterol en nuestro caso.
3 - Reconocimiento de cerebrósidos:
Mediante la reacción de Molish para hidratos de carbono. ( Ver TP H de Carbono).
4 - Reconocimiento de fosfolípidos: lecitina y cefalina mediante la determinación de la
presencia de fósforo.
La reacción se basa en que el fosfato inorgánico, en medio ácido, con el molibdato (reactivo
1) da fosfomolibdato, color amarillo, que es reducido luego por el ácido ascórbico (reactivo 2)
a azul de molibdeno, color azul verdoso. El reactivo 3 (arsenito/citrato) se combina con el
exceso de molibdato impidiendo su reacción posterior con fosfatos liberados de ésteres
lábiles, lo que se aprovecha cuando se quiere determinar fosfato inorgánico libre en presencia
de, por ejemplo, fosfolípidos (que no es nuestro caso).
Muestra soluble de ppdo D
Reactivo 1
1
ml
0,5 ml
Mezclar y esperar 30 segundos.
Reactivo 2
0,5 ml
Mezclar y esperar 30 segundos.
Reactivo 3
0,75 ml
Mezclar. Luego de 10 minutos la presencia de color azul demuestra la presencia de fosfato
unido a lecitina y cefalina en el tejido.
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