parte 1 tp, 1997. completo - Facultad de Ciencias Agropecuarias

MANUAL DE PRACTICAS DE FISIOLOGIA VEGETAL
Facultad de Ciencias Agropecuarias - UNER
Autores: Lallana, Víctor H.; Lallana María del C. (2001)
MEMBRANAS CELULARES
Contenido:
A. Velocidad de difusión
B. Factores que afectan la permeabilidad
Introducción
Todo protoplasma está rodeado por una membrana que lo separa de su ambiente y lo
capacita para controlar selectivamente la entrada y salida de sustancias. Asimismo todos los
orgánulos (mitocondrias, complejo de Golgi, etc.) están formados de o circundados por
membranas o partes de membranas. La membrana que envuelve al citoplasma se llama:
plasmalema y la que rodea a la vacuola se llama tonoplasto, ambas poseen una sola unidad
de membrana (algunos orgánulos tienen doble: núcleo, cloroplastos, etc.). Esta
compartimentalización celular es una manera de regular el metabolismo, carácter propio de los
organismos más evolucionados.
El modelo de estructura de membrana más ampliamente aceptado hoy en día es el
modelo de mosaico fluido. Como se puede observar en la Figura 1, la membrana está
compuesta por una doble capa lipídica (formada por fosfolípidos y esteroles) en la cual están
embebidas proteínas globulares. Estas proteínas denominadas proteínas integrales, a menudo
se extienden a través de la doble capa sobresaliendo a cada lado. La porción proteica incluida
en la bicapa es hidrófoba, mientras que la expuesta al exterior es hidrófila.
Fig. 1: Modelo de mosaico fluído de la estructura de una membrana.
(Tomado de Raven et al., 1991)
En la superficie interna de la membrana, unas moléculas proteicas adicionales, las
proteínas periféricas, se hallan unidas a algunas proteínas integrales que sobresalen de la
doble capa. En la superficie externa, pequeñas cadenas de hidratos de carbono se unen a
las proteínas que sobresalen. Los hidratos de carbono, que forman una cubierta en la
superficie externa de las membranas de algunas células eucariotas, se cree que tienen una
importante función en los procesos de adhesión entre células y en las transformaciones que se
realizan en la superficie celular
.
Aunque la doble capa lipídica constituye la estructura básica de las membranas
celulares, las proteínas son las responsables de la mayoría de sus funciones. La mayoría de
las membranas están compuestas por un 40 a un 50 por ciento de lípidos (en peso) y de un 50
a un 60 por ciento de proteínas, aunque la cantidad y tipos de proteína de una membrana son
fiel reflejo de su función.
Manual de Prácticas de Fisiología Vegetal - Edición digital - Lallana, V.H. y Lallana Ma. del C. (2003)Pág. ⇒ 2
La membrana plasmática de la mayoría de las células debe considerarse una
estructura dinámica, cuya conformación le permite desempeñar una serie de funciones como:
recibir y transmitir señales químicas, transportar moléculas pequeñas o iones, englobar
partículas por fagocitosis (sólidas) o picnocitosis (líquidas), recibir y transmitir las indicaciones
para el cese de la reproducción y del crecimiento, además de establecer los límites físicos de
la célula y resguardar el contenido citoplasmático.
Las membranas son elásticas y extensibles, pero su propiedad más importante desde
el punto de vista funcional, es la permeabilidad, que es la intensidad con que las sustancias
pasan a través de ellas.
Las membranas celulares poseen semipermeabilidad selectiva: ya que permiten el
pasaje del solvente y también de solutos en solución verdadera, pero no en solución coloidal.
Esto se refleja en el rápido movimiento del agua a través de ellas, con velocidades menores y
variables para los solutos. Debido a esta propiedad las células realizan el intercambio
necesario para el metabolismo, permiten el traslado entre distintos tejidos y se aseguran cierto
aislamiento con el medio, indispensable para la retención de solutos, mantenimiento de la
tensión de succión, de un pH más o menos constante, etc.. La entrada o salida del agua a las
células se cumple de acuerdo a las leyes de difusión y ósmosis. En el caso de los solutos
disueltos, la velocidad de su penetración está determinada en última instancia por las
diferencias de concentración de esas sustancias a un lado y otro de la membrana. Pero hay
una serie de factores que controlan el grado de permeabilidad de la membrana, para distintos
tipos de sustancias, restringiendo o facilitando su pasaje. Estos factores se refieren a las
propiedades físicas y químicas de las moléculas y de las membranas, siendo las más
importantes: solubilidad en lípidos de la partícula, su tamaño y grado de hidratación, su carga
positiva o negativa, la presencia de poros en la membrana, su diámetro y carga o neutralidad.
Las sustancias solubles en lípidos, compuestos no polares, (ej.: hidrocarburos; grupos
químicos: metilo, etilo, propilo, etc.), atraviesan la membrana con mayor facilidad, que las poco
o no solubles, por disolución en su capa lipídica. Los compuestos polares (agua, aminoácidos,
azúcares, iones, etc.) son poco solubles en lípidos y muy solubles en agua (grupos: carboxilo,
oxidrilo, aldehido, amino, etc.) y atraviesan la membrana con mayor dificultad.
La difusión relativa de sustancias de composición química similar es tanto más fácil
cuanto menor es el tamaño de la molécula, lo que sugiere el pasaje a través de poros o
canales. Por ello, polipéptidos, aminoácidos y proteínas, de gran volumen molecular y baja
solubilidad en lípidos, permanecen en general como sustancias de reserva intracelular.
También tiene importancia la carga eléctrica, a mayor carga, menor velocidad de penetración.
Pero las membranas citoplasmáticas, no son barreras pasivas y la permeabilidad no puede
explicarse en forma totalmente satisfactoria, en términos de solubilidad, tamaño molecular o
carga eléctrica. El movimiento de ciertas sustancias, depende de la actividad celular, se realiza
a expensas de la energía de reacciones ocurridas en el citoplasma e incluso en la propia
membrana (transporte activo).
Existen factores que afectan la permeabilidad de las membranas: las altas
temperaturas (superiores a 50-55°C), que producen la desnaturalización de las proteínas, las
bajas temperaturas (que producen la ruptura física), y los solventes orgánicos, que disuelven la
porción lipídica de las membranas.
Las sustancias se difunden de una región de mayor concentración a una de menor
concentración. La velocidad de esta difusión depende del gradiente y está determinada por la
diferencia entre las concentraciones de las sustancias en las dos regiones y por la distancia
que las separa.
Manual de Prácticas de Fisiología Vegetal - Edición digital - Lallana, V.H. y Lallana Ma. del C. (2003)Pág. ⇒ 3
Al disolverse un material sólido, como por ejemplo un cristal, en un solvente, su
concentración en los alrededores inmediatos de la sustancia aún sin disolverse es muy
grande; lo mismo puede decirse de una disolución concentrada de un colorante en contacto
con agua. Por lo tanto, al iniciarse la difusión es muy rápida. Luego, conforme aumenta la
distancia entre las partículas que se difunden y su punto de origen, decrece la concentración
de éstas y la velocidad de la difusión disminuye proporcionalmente con el tiempo.
Esto significa que las partículas de una sustancia pueden difundirse rápidamente de un
lado a otro de una célula, ya que las distancias son relativamente cortas, pero para su traslado
a través de un tejido entero o a otras partes de la planta, el tiempo necesario será
relativamente mayor.
Existen otros factores que pueden hacer variar la velocidad de difusión, tales como la
presión a que está sujeto el sistema, la densidad de las sustancias y su solubilidad; cualquier
fuerza de adsorción entre las partículas, por ejemplo; de naturaleza eléctrica o coloidal que
impide su libre movimiento, etc.
A. Velocidad de difusión
En este experimento, se estudiarán los factores que intervienen en la velocidad de
difusión, como:
1. Tamaño de las partículas
2. Temperatura
3. Concentración
4. Velocidad de difusión con relación al tiempo
5. Carga
Existen otros factores que pueden hacer variar la velocidad de difusión, tales como la
presión a que está sujeto el sistema, la densidad de las sustancias y su solubilidad; cualquier
fuerza de adsorción entre las partículas, por ejemplo; de naturaleza eléctrico o coloidal que
impide su libre movimiento, etc..
Para el estudio de la difusión en este experimento se usará un gel en lugar de agua pura. De
esta forma se impide que el contenido de los tubos pueda mezclarse a consecuecia de
movimientos involuntarios; por otra parte, debido a la gran cantidad de agua que hay entre las
micelas coloidales, el gel no constituye un gran obstáculo para el movimiento de las partículas
que se difunden. Debe recordarse que es necesario preparar los tubos con la gelatina
anticipadamente para que ésta se encuentre solidificada al iniciar el experimento.
1. Influencia del tamaño de la partícula
Tome cuatro tubos de gelatina, y llene unos 2 cm. del espacio libre de cada uno, con
una disolución de los colorantes que se indican a continuación. Asegúrese que queda un
espacio libre de 1 cm aproximadamente sobre las disoluciones una vez que los tubos han sido
bien tapados.
Tubo 1.
2.
3.
4.
0,01 M Crisoidina Y (Peso molecular 248)
0,01 M Eosina Y (Peso molecular 691)
0,01 M Rojo de Congo (Peso molecular 697)
0,01 M Eritrosina B (Peso molecular 897)
Manual de Prácticas de Fisiología Vegetal - Edición digital - Lallana, V.H. y Lallana Ma. del C. (2003)Pág. ⇒ 4
Anote en cada tubo el colorante agregado y la hora y la fecha de iniciación. Después
de transcurrido 1, 2 , 4, 6, 8 días y siempre a la misma hora, determine la velocidad de
difusión, midiendo las distancias recorridas por las partículas en cada tubo. Las medidas
pueden efectuase fácilmente invirtiendo los tubos, asegurándose antes de que estén bien
tapados. La exactitud de las medidas debe ser de +/- 1 mm; conceda especial importancia a
las medidas del primer día.
Calcule teóricamente las distancias recorridas por difusión por medio de la ecuación
siguiente.
d=a.√t
Donde:
d = distancia recorrida
a = factor de proporcionalidad; en este caso la distancia del primer día.
t = tiempo (en días)
Colorante
Distancia en mm. después de
2º día
4º día
6º día
med. I calc. med. I calc. med. I calc.
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
1er.
día
2º día
med.I calc.
Criosoidina Y
I
Eosina Y
I
Eritrosina B
I
Rojo de Congo
I
med.: medida; calc.: calculada
8º día
med.I calc.
I
I
I
I
Haga un gráfico en papel milimetrado, anotando la distancia en la ordenada, y el tiempo
en la abscisa.
2. Efecto de la Temperatura
Tome dos tubos con gelatina y llene el espacio libre con la disolución de eosina Y o
eritrosina B al 0,01 M. Coloque uno de los tubos en un refrigerador; deje el otro sobre la mesa.
Mida la distancia a que se difunde el colorante en ambos tubos, haciendo las lecturas siempre
a la misma hora en los intervalos indicados. Anote la temperatura del interior del refrigerador y
del ambiente de la mesa. Con los valores obtenidos calcule el coeficiente de temperatura para
10º C (Q10).
Distancia en mm. después de
Tratamiento
Temperatura
1º día
2º día
3º día
4º día
Coeficiente
de
Temperatura
(Q10)
Ambiente
Refrigerador
3. Influencia de la Concentración
Tome dos tubos con gelatina y en forma similar, en un tubo llene el espacio libre con
una disolución de eosina Y al 0,01 M y en otro con una disolución del mismo colorante diluída
10 veces, o sea al 0,001 M. Compare las distancias recorridas por la eosina en 1 día, varios
días, y una semana.
Manual de Prácticas de Fisiología Vegetal - Edición digital - Lallana, V.H. y Lallana Ma. del C. (2003)Pág. ⇒ 5
Distancia en mm. después de
Disolución
Concentrada
0,01 M
Diluida
0,001 M
1er. Día
2º día
3º día
4º día
1 semana
4. Velocidad de Difusión con relación al tiempo
En una probeta graduada vierta unos 10 ml de una disolución de eosina Y al 0,01 M en
el espacio libre que queda sobre la gelatina. Tape el cilindro. Anote la lectura inicial (la gelatina
al enfriarse se contrae un poco) y efectúe las lecturas siguientes, utilizando la graduación del
cilindro como medida relativa de la distancia de difusión del colorante. Mantenga el cilindro en
un lugar en que la temperatura sufra la menor fluctuación posible.
Tiempo
Distancia
30 min
1 hora
2 horas
3 horas
4 horas
12 horas
Tiempo
1 día
2 días
4 días
1 sem.
2 sem.
4 sem.
Distancia
5. Carga
- Extraiga del envés de hojas de Roheo discolor, ocho (8) trozos pequeños de
epidermis de la zona de la nervadura central.
- Colocar los trocitos en agua destilada.
- Colocar un papel blanco en la mesada y sobre él cuatro (4) cajas de Petri de 5 cm. de
diámetro.
- Colocar en la caja :
N°1: 5 ml de HCl 0,025 N
N°2: 5 ml de CH3COOH 0,025 N
N°3: 5 ml de KOH 0,025 N
N°4: 5 ml de NH4OH 0,025 N
- Colocar dos (2) trozos de epidermis en la solución de la caja N°3 (base fuerte).
- Colocar seis (6) trozos de epidermis en la solución de la caja N°4 (base débil).
- Cuando el cambio de color de los trozos de la caja N°4 sea total, retirar 4 trozos y lavarlos
con agua destilada, luego colocar dos (2) de ellos en la solución de la caja N°1 (ácido
fuerte) y los otros dos (2) en la solución de la caja N°2 (ácido débil).
B. Factores que afectan la permeabilidad de las membranas
El objetivo de esta parte del trabajo práctico será demostrar el efecto de diversos
factores sobre la permeabilidad de las membranas celulares.
1. Efecto del calor: Corte 10 trozos iguales de remolacha de aproximadamente 1 cm de ancho,
3 cm de largo y 1 cm de espesor. Lávelos en agua corriente durante 10 minutos para eliminar
Manual de Prácticas de Fisiología Vegetal - Edición digital - Lallana, V.H. y Lallana Ma. del C. (2003)Pág. ⇒ 6
el pigmento de las células dañadas. Secar con papel de filtro y pesar. Luego coloque los trozos
en agua destilada.
Caliente unos 300 ml de agua destilada a 70 ºC en un vaso de pecipitado, sumerja uno
de los trozos de remolacha en el agua exactamente durante un minuto y páselo a un tubo de
ensayo conteniendo unos 10 ml de agua destilada a la temperatura ambiente. Repita lo mismo,
con los trozos restantes a : 60º , 55º , 50º , 45º , 40º, permitiendo que el agua del vaso
descienda a esas temperaturas. Finalmente coloque el trozo no tratado en agua destilada a la
temperatura ambiente, como testigo. Una hora después de haber colocado cada trozo en agua
destilada, saque cuidadosamente el trozo del tubo, agite, pase su contenido a un tubo de
colorímetro o espectrofotómetro y determine por colorimetría la proporción de pigmento rojo
que ha difundido del trozo de raíz hacia el tubo de ensayo.
2. Efecto de la congelación: Corte un trozo de raíz de remolacha, previamente congelado y
lávelo con agua corriente; como en el caso anterior colóquelo en un tubo de ensayo con 10 ml
de agua destilada, a temperatura ambiente. Después de una hora extraiga el trozo y determine
con el colorímetro el pigmento rojo que ha difundido.
3. Efecto de los solventes orgánicos: Coloque un trozo de raíz de remolacha, previamente
lavado en agua corriente, en un tubo de ensayo con 10 ml de una solución saturada con
benceno o etanol al 95 %. Agite de vez en cuando durante una hora. Luego extraiga el trozo y
compare el pigmento rojo de los tubos de ensayo, usando el colorímetro. Corrija la lectura para
el tubo de benceno, midiendo la absorción de la solución saturada.
4. Efecto de las sales minerales: Coloque un trozo de raíz de remolacha, previamente lavado
en agua corriente, en un tubo de ensayo con 10 ml de una solución de Cl Na al 2%. Después
de 45 minutos, extraiga el trozo y determine con el colorímetro el pigmento rojo que ha
difundido. Efectúe la misma operación colocando otro trozo, en una solución de Cl2Ca al 1 %.
Se puede representar gráficamente el resultado de las experiencias anteriores,
ubicando la absorbancia (a 525 nm) en el eje de las abscisas y los distintos tratamientos en
ordenadas. La absorbancia se referirá a gramo de peso fresco, utilizando para ello el peso
inicial de los trozos de raíz. Registre y analice los resultados. Redacte el informe.
Lecturas complementarias:
- Ayuda didáctica N° 1 (1994) . La célula vegetal. Cát. Fisiología Vegetal. F.C.A. UNER. 17 p.
- Córdoba, C.V. 1979. “Biología celular y molecular". Blume. Madrid, 476p.Cap. I.
- Deblin, R.M 1980. "Fisilogía Vegetal". Ed. Omega. Barcelona. 517 p.Cap.I. p.11- 18.
- Garrahan, P.J. y A.F. Rega. 1977. "Transporte a través de la membrana celular". O.E.A. Serie
Biología. 80 p. Cap. I .
- Muller, L.E. 1964. Manual de laboratorio de Fisiología Vegetal. O.E.A. . Turrialba, Costa Rica.
165 p.
- Raven, P.H.; R.E. Evert y S.E. Eichhorn.1991. Biología de las plantas. Ed. Reverté,
Barcelona, España, 773 p.
- Sívori, E.; Montaldi, E. y Caso, O. 1980. Fisiología Vegetal. Ed. Hemisferio Sur. 681 p. Cap.
II , pp. 17-19.
Manual de Prácticas de Fisiología Vegetal - Edición digital - Lallana, V.H. y Lallana Ma. del C. (2003)Pág. ⇒ 7