Enzimas digestivas 2014

Enzimas de origen marino
Dr. José Luis Cárdenas López
Enzimas endógenas de importancia en
los productos marinos
•
•
•
•
•
•
Proteinasas digestivas
Lipasas y fosfolipasas
Enzimas que degradan el TMAO
Polifenoloxidasa
Enzimas degradantes de nucleótidos
La SOD y enzimas que protegen de la
oxidación
• Enzimas y biogénesis de sabor
Proteinasas o proteasas
• 3.4. hidrolasas.proteasas
• Son el grupo más importante desde el punto
de vista de uso de enzimas (panificación,
recuperación de péptidos, queso, caviar, etc.)
• Gran potencial en las proteinasas de origen
marino por la diversidad de ambientes a las
que están adaptadas
Clasificación
• Varias, según el enfoque:
– Por su parecido con enzimas bien caracterizadas:
Tipo tripsina, tipo quimiotripsina, tipo catepsina
– Por su sensibilidad al pH: ácidas, neutras, alcalinas
– Por su especificidad a sustratos
– Por su especificidad a inhibidores
– Por la comisión de enzimas:
Proteinasas digestivas
• Cuatro categorías:
– Proteasas ácidas o aspárticas 3.4.23.
• Pepsina, quimosina, gastricsina, catepsina D
– Serina proteasas 3.4.21.
• Tripsina, quimiotripsina, elastasa, colagenasas
– Cisteina proteasas 3.4.22.
• Catepsinas B, L, H, S, calpainas
– Metaloproteasas 3.4.24.
• Colagenasas, Miosinasa I y Miosinasa II
Proteasas aspárticas
• Son activas a pH ácidos e inestables a pH
alcalino, se encuentran en los estómagos de
animales
• Pepsina y tipo-pepsina
– Peso molecular de 27 a 42 kDa
– pH óptimo mas alto que en mamíferos
– Estable a pH mas altos (2-4) que mamíferos
– Los zimógenos (pepsinógeno) estables a pH
alcalino
– Resistentes a la autólisis a pH bajo
– Rango amplio de temp óptima (37-55oC)
• Quimosina y tipo-quimosina
– Presente en la renina
(fabricación de queso)
– Activas y estables a pH neutro
– Especificidad más estrecha que otras proteasas
ácidas
– Susceptibles a inactivación con urea
– Las quimosinas de animales marinos no hidrolizan
el sustrato ADP (acetil fenilalanina diyodotirosina)
– PM alrededor de 35kDa
Gastricsina
• Similares a pepsinas, diferente estructura y
propiedades catalíticas
• pH óptimo 3.0 similar a los mamíferos
• Estables en amplio rango de pH (hasta 10),
mientras que las de mamífero son estables
hasta 6.7
• Peso molecular 32-33 kDa
Formación del complejo ES
Compuesto de transición
Complejo EP
Mecanismo de catálisis ácido-base para proteasas aspárticas
La numeración corresponde a pepsina porcina
Serina Proteasas
• En tejidos del páncreas, intestinos y ceca
(saco) pilórica de los animales. Activas a pH
neutros a alcalinos, son inactivas y/o
inestables a pH ácido
• Se caracterizan por un mecanismo catalítico
que involucra acilación/deacilación con una
serina en el sitio activo
Animación
http://telstar.ote.cmu.edu/biology/animation/SerineProtease/SerineProtease_bc.html
Tripsina
• Es la más estudiada y es primordial en la digestión de
muchos animales
• Tiene un PM de 22 a 24 kDa
• Sensible a inhibidores como STI, PMSF(fluoruro de
fenilmetilsulfonilo) y TLCK (tosyl-L-lysine chloromethyl
ketone)
• pH óptimo entre 7.5 a 10
• Temperatura óptima 35-45°C
• Las tripsinas de marinos son más estables a pH
alcalino, inestables a pH ácido.
• Sustratos BAPNA (benzoil arginina paranitroanilida) y
TAME (tosil arginina metil ester)
Unión
Quimiotripsina
•
•
•
•
•
Una subunidad, PM de 25-28 kDa
Activo a pHs 7.5 a 8.5
Estables hasta pH 9
Más termolábiles que las qt de mamíferos
Más activas en varios sustratos que las de
mamíferos
• Sustrato BTEE (benzoil-tirosina etil ester)
• Sensible al inhibidor TPCK (tosyl-Lphenylanine chloromethyl ketone)
Elastasa
• Producida en el páncreas, degrada la elastina
en condiciones alcalinas (intestino)
• Estables a pH 5-9
• Inhibidas por STI pero parcialmente por TPCK
(tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone) y
no por TLCK
Colagenasas
• Purificadas de glándulas digestivas de
animales marinos
• Similares a las de los mamíferos en su acción
sobre colágeno nativo, pero las marinas tienen
especificidades similares a tripsina y
quimiotripsina
• Activas a pHs 6.5-9, inactivadas a <5
• PM cerca de 25 kDa
• En invertebrados, se les atribuye la pérdida de
textura
Tiol proteasas o cisteína proteasas
• Mecanismo catalítico similar a las serina
proteasas: acilación, deacilación (complejo
covalente) solo que el ataque nucleofílico es
del S de la cisteina
• Algunos animales presentan una excepcional
actividad de estas enzimas en el
hepatopáncreas: Calamar, el 90% de la act
proteolítica del HP es de tipo cisteína
His 159
CH
3
Cys 25
SH
His 159
Substrate
N
NH
Cys 25
a
His 159
S
S
-
HN
HN
********
NH
b
********
NH
NH
P1
Cys 25
-
O
O
P' 1
NH
His 159
His 159
-
Cys 25
HN
Cys 25
********
NH
c
P1
S
O
H
O
H2O
e
*******
NH
NH
NH
P1
HN
NH
*******
d
S
O
-
P'1
H
NH
Cys 25
HN
Gln 19
Mecanismo de rx de cisteína proteasas
Cys 25
SH
+
f
O
*******
NH
P1
O
-
His 159
CH
3
Cys 25
SH
N
His 159
Substrate
NH
Cys 25
a
His 159
S
********
Cys 25
S
HN
HN
NH
NH
O
O
P'1
NH
a) La cys involucrada está en equilibrio entre la forma neutral y zwiteriónica
b) el azufre aniónico ataca nucleofílicamente al carbonilo
b
********
NH
P1
-
-
His 159
His 159
Cys 25
HN
********
Cys 25
HN
NH
c
NH
O
H
NH
O
H2O
*******
NH
P1
S
P1
-
NH
*******
d
S
e
c) Se forma un intermediario tetrahédrico
d) Uno de los productos queda tioacilado
e) Desacilación por ataque nucleofílico del agua
O
-
P'1
H
NH
Cys 25
HN
Gln 19
Catepsinas
• Lisosomales
• No todas son cisteína proteasas (Cat D, Cat C,
Cat E)
• B, L, H, S, K, características muy similares.
• PM 23-42 kDa, pH óptimo de 4.5 a 7, estables
a un amplio rango de temperatura
• Requieren agentes reductores y/o agentes
quelantes (DTT y cisteína; EDTA)
• Requieren iones Cl-
Especificidad en las proteasas
The inhibitors shown : N-[1-(cyanomet-hylcarbamoyl)cyclohexyl]-4-[1-(2-methoxyethyl)piperidin-4-yl] benzamide (1) [22], (S)-N-[1(cyanomethylamino)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl] biphenyl-4-carboxamide (2) [23], N-(S)-4-methyl-1-oxo-1-{[R]-3-oxo-1-(pyridin-2ylsulfonyl)azepan-4-ylaminopentan-2-yl}benzofuran-2-carboxamide (3) [23], N-(S)-4-methyl-1-oxo-1-{[S]-3-oxo-1-(pyridin-2ylsulfonyl)azepan-4-ylaminopentan-2-yl}benzofuran-2-carboxamide (4) [23], benzyl (2S,2´S)-1,1´-[2,2´-carbonylbis(hydrazine-2,1diyl)]bis(4-methyl-1-oxopentane-2,1-diyl)dicarbamate (5) [24], Cbz-Leu-NH-NH-C(O)-O-Bz (6) [25], Cbz-Leu-NH-NH-C(O)-O-Ph (7) [25]
and N-(S)-4-methyl-1-oxo-1-{[S,E]-5-phenyl-1-(phenylsulfonyl)pent-1-en-3-ylaminopentan-2-yl} morpholine-4-carboxamide (LHVS) (12)
[26] were synthesized using previously published methods.
Calpainas
•
•
•
•
•
Activadas a por Ca++
Micromolar y milimolar
pH óptimo mas cerca del neutro
PM alrededor de 100 kDa
Forman complejos con la calpastatina
(inhibidor)
Metaloproteinasas
• Se han caracterizado de algunos peces como
Sebastes y carpa y de manto de calamar, pero
no son comunes en animales marinos
• Algunas colagenasas
• Su mecanismo catalítico involucra la creación
de complejos con metales
mecanismo
Involucra coordinados con metales
(compuesto de transición)
Propiedades unicas de proteinasas
digestivas marinas de frio
• Baja Ea, alta Km, estabilidad al frio, temp
optima baja, alto pH optimo
• Estructura mas flexible (∆S* bajos)
• Multiples isoenzimas
Comparación de algunas propiedades de tripsinas terrestres y acuáticas1
Propiedad
Bovina
Acuatica
Estabilidad a pH ácido
Muy alta
Muy baja
Estabilidad a pH alcalino
Moderado
Alto
Especificidad catalítica
Igual
Igual
Constante Michaelis
Mas baja
Mas alta
Actividad molecular a 0-5°C
Bajo
Alto
pH óptimo
Igual
Igual
Sensibilidad a inhibidor de soya
Moderado
Muy alto
Coeficiente de temperatura
2.0
1.4-1.6
Desnaturalización térmica
≈80°C
≈35-45°C
1
Comparaciones respresentativas de organismos acuáticos de aguas frias
Comparación de tripsinas
• Entre más bajo el ∆G* mayor la eficiencia del catalizador
Diferencias muy pequeñas se traducen en grandes diferencias
en kcat
• Ejemplo: ∆G* de tripsina de bacalao del Atántico tiene 200
cal/mol menos que la tripsina bovina y su kcat es 5 veces
mayor
• La otra componente termodinámica es ∆H* (entalpía de
activación). La ∆H* está relacionada con la energía de
activación de Arrehnius (Ea). Generalmente el valor de ∆H*
para tripsinas adaptadas al frio es menor que las de animales
de sangre caliente.
• Esto se traduce en una relación de dependencia de
temperatura de 2.0 (res). El Q10 para tripsina de bacalao del
Ártico es solamente 1.4. Una isoenzima de este último tiene
un Q10 de solamente 1.1. Significado?
Peces sin estómago
• Tripsinas activas en proteinas nativas
Pectato liasa
La proteasa tipo tripsina de
Crawfish rompe la Lys 43
[Jeong et al. 2001. J Food
Biochemistry].
Zimogramas Electroforéticos de
Isoformas de Pepsinógeno (trucha)
Peptidasas
(3.4.11 a 3.4.17)
•
•
•
•
Di peptidasas
Carboxipeptidasas
Aminopeptidasas
Quitar el sabor amargo de péptidos
“Peptidasas” y proteinasas