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“NANOTOX -Evaluación del efecto de
nanomateriales sobre el modelo animal pez cebra”
Convenio AZTI/DAPA
Informe FINAL- 2007
para:
Dirección de Innovación y Desarrollo Tecnológico,
Viceconsejería de Política e Industria Alimentaria,
Dpto. Agricultura, Pesca y Alimentación , Eusko
Jaurlaritza - Gobierno Vasco
Sukarrieta, 28 de Febrero de 2008
Tipo documento
Informe FINAL- 2007
“NANOTOX -Evaluación del efecto de nanomateriales sobre el
modelo animal pez cebra”
Titulo documento
Fecha
Proyecto
28/02/2008
“NANOTOX -Evaluación del efecto de nanomateriales sobre el
modelo animal pez cebra”
Código
IA2007051
Cliente
Dirección
de
Innovación
y
Desarrollo
Tecnológico,
Viceconsejería de Política e Industria Alimentaria, Dpto.
Agricultura, Pesca y Alimentación, Eusko Jaurlaritza Gobierno Vasco
Equipo de proyecto:
Oskar Mtez. De Ilarduya
Irune Rojo
Sandra Rainieri (sustituye a Oskar Matez. Ilarduya)
Maider Olasagasti (sustituye a Irune Rojo)
Usua Oyarbide
Responsable
proyecto
Sandra Rainieri
Revisado por
Matxalen Uriarte (Coordinadora Área Sistemas de Detección)
Fecha
Aprobado por
Antonio Duch (Director Tecnológico de la UIA)
Fecha
NANOTOX-Informe Final 2007
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ÍNDICE
1.
INTRODUCCION .................................................................................................. 4
2.
BENEFICIOS GENERADOS................................................................................ 6
2.1
RESULTADOS MÁS IMPORTANTES.............................................................. 6
2.2
PRODUCCION CIENTIFICA, DIVULGACION – PLAN DE DIFUSION..... 10
2.3
POSIBILIDADES DE TRANSFERENCIA – INTERES DE EMPRESAS ..... 11
2.4
PLANTEAMIENTO DE NUEVOS PROYECTOS Y OTRAS ACCIONES...... 11
2.5
FORMACION DE PERSONAL Y DEL GRUPO DE TRABAJO ..................... 11
2.6
ENTREGABLES Y OTROS INFORMES
3.
12
CONCLUSIONES................................................................................................ 12
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1.
INTRODUCCION
La incorporación de nanomateriales en elementos útiles para la vida diaria
va cada día en aumento; de hecho las aplicaciones de estos materiales son
numerosas y varían desde la biomedicina y la cosmética hasta a la
alimentación. A pesar de la utilización de nanomateriales tan extendida, no
se han establecido aún con certeza los riesgos toxicológicos y ambientales de
la presencia de nanopartículas. La evaluación concreta sobre la seguridad de
las nanopartículas asume una importancia mayor cuando las aplicaciones se
refieren a la alimentación.
Los procedimientos para evaluar la toxicidad de una sustancia química se
realizan habitualmente en dos fases; una fase preliminar donde se evalúan
los parámetros toxicológicos más importantes y una fase secundaria donde se
realizan investigaciones adicionales que traten todos los parámetros
toxicológicos habituales. Actualmente los ensayos de toxicidad se realizan en
modelos vertebrados (rata y conejo). Este tipo de ensayos son muy laboriosos
y costosos e implican sacrificar un gran número de animales de
experimentación. Por este motivo se está haciendo un gran esfuerzo en
desarrollar métodos alternativos a la experimentación animal y más acordes
con el principio de las tres Rs; Reemplazar, Reducir y Refinar (Rusell and
Burch, 1959). Tradicionalmente, la toxicología ha estudiado los efectos
deletéreos de las moléculas sobre la base de parámetros citológicos,
fisiológicos y morfológicos. Los cambios en estos parámetros se manifiestan
solo después de una exposición prolongada o después de una exposición a una
alta concentración de las moléculas. Para resolver los inconvenientes que
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caracterizan los procedimientos de evaluación de toxicidad tradicionales es
necesario aplicar un método de diagnosis toxicológica rápido y general.
Con este proyecto hemos desarrollado un test de toxicidad basado en un
enfoque
toxicogenómico,
para
evaluar
el
potencial
efecto
tóxico
de
nanomateriales de interés en alimentación, en embriones del modelo animal
pez cebra (Danio rerio). Los nanomateriales elegidos para desarrollar este
estudio son los nanotubos de carbono (MWCNT) y la plata coloidal. Los
nanotubos son ampliamente utilizados principalmente en la construcción de
aparatos electrónicos y biosensores. La nanoplata coloidal es actualmente
utilizada en la industria alimentaria y en la industria de envases, gracias a
sus propiedades microbiocidas.
El modelo animal pez cebra es largamente utilizado en estudios de
ecotoxicología. En acuerdo con consideraciones de tipo ético, una version
alternativa in vitro, que utliza embriones de este organismo modelo, ha sido
recientemente propuesta (2006). Aún siendo ensayos in vitro, estos test
permiten evaluar los efectos de una molécula sobre el organismo. Al mismo
tiempo, el uso de embriones facilita el control de las condiciones ambientales
por su fácil manejo minimizando posibles interferencias en el ensayo y reduce
sensiblemente los tiempos de experimentación requeridos para la realización
de las pruebas de laboratorio. Además, el desarrollo de un ensayo genético de
toxicidad crónica permite aumentar la sensibilidad, consintiendo testar muy
bajas concentraciones del compuesto, una condición que se presenta
típicamente en la aplicación de las nanomoléculas.
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2.
BENEFICIOS GENERADOS
2.1 RESULTADOS MÁS IMPORTANTES
La realización de este proyecto ha aportado el diseño de un test de toxicidad,
utilizando embriones del modelo animal pez cebra. Los embriones de pez
cebra son un modelo muy bien conocido que se está empleando habitualmente
en estudios de ecotoxicidad. Por el contrario, el uso de embriones de pez cebra
en
estudios
toxicológicos
de
componentes
de
uso
alimentario
es
absolutamente innovador.
En este estudio hemos conseguido adaptar un test ecotoxicológico que refleja
eventos de toxicidad aguda sobre embriones de pez cebra, para determinar la
toxicidad
crónica
asociada
a
contaminantes
alimentarios
de
nanodimensionados, en concreto nanotubos de carbono (MWCNT) y
nanoplata coloidal.
Embriones de pez cebra incubados durante 48 horas con nanotubos de
carbono (0,01ppm – 10ppm) y con plata coloidal (0,01ppm – 5ppm) en una
primera tanda de experimentos, no mostraron modificaciones significativas
sobre el desarrollo embrionario, a la observación directa. En una segunda
fase de experimentación, realizada con una solución diferente de nanoplata
coloidal, se revelaron modificaciones evidentes de los embriones tratados con
la concentración de 5 ppm, la más alta de las concentraciones testadas
(Figura 1).
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A
B
Figura 1. A - Ejemplo de embrión de pez cebra de 24 horas no tratado
(control). B – Ejemplo de embrión de pez cebra de 24 horas tratado con 5
ppm de nanoplata colloidal.
Para identificar el efecto tóxico, que no era siempre evidente a la observación
directa, se midió por PCR en tiempo real (RT-PCR) el nivel de la expresión de
genes específicos de los embriones tratados con nanopartículas. Estos genes
fueron elegidos a partir de la bibliografía buscando los más frecuentemente
implicados en respuestas a efecto tóxicos de una variedad de sustancias
químicas. Específicamente, se analizaron lo siguiente genes:
1) Cyp1A1, un miembro de la familia de los isozyma P450, utilizado como
biomarcador para la exposición a hidrocarburos aromáticos policíclicos.
2) Ahr2, un receptor de hidrocarburos arilo que une dioxinas y otras
substancias químicas.
3) Ctp1, un enzima clave en la β-oxidación de los ácidos grasos implicados
en la reacción redox nutricional de la homeostasis.
4) iNOS que en macrófagos tiene función antitumoral y bactericida y en
condiciones de inflamación aguda actúa como un inhibidor de apoptosis
en el hígado.
5) Ncf1, gen implicado en la limpieza de la célula de potenciales
metabolitos deletéreos.
6) c/EBP-α, que es un factor de trascripción que se une a algunos
promotores. La proteína codificada puede reaccionar con algunas
quinasas causando disminución de crecimiento celular.
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7) MafT, implicado en la regulación del sistema de defensa celular.
Concisamente, todos los genes testados están implicados en eventos de
toxicidad mediada por receptores, en daño oxidativo, regulación de la
expresión de otros genes, indicadores de neurotoxicidad, regulación del la
división celular, respuesta inmune y división celular.
Los genes testados mostraron diferente patrones de expresión según del tipo
de nanopartícula testada. En el caso de la nanoplata, la mayoría de los genes
estudiados manifestaron un aumento en expresión después del tratamiento,
con un efecto que parecía ser directamente proporcional a la concentración
utilizada. En particular, la incubación de los embriones en presencia de 5
ppm de nanoplata provocaron un aumento de expresión en los genes Ahr2
(toxicidad mediada por receptores), NudT1 (daño oxidativo), c/EBP-α
(regulación
de
la
expresión
de
otros
genes),
MafT
(indicador
de
neurotoxicidad). Los genes iNOS y Cyp1A1 también mostraron un pico en el
nivel de expresión con concentraciones de nanoplata de 1 ppm. La expresión
coordinada de los diferentes genes revela un efecto tóxico general por parte de
la nanoplata a las concentraciones estudiadas.
En el caso de los nanotubos de carbono, los efectos sobre los embriones no
fueron tan evidentes. Solo los genes iNOS (daño oxidativo) y el receptor de
MNDA mostraron un leve incremento en el nivel de expresión. Los nanotubos
de carbono analizados mostraron un efecto mucho mas leve en comparación
con el efecto provocado por la nanoplata coloidal, sin embargo, no es posible
excluir un efecto tóxico de estos compuestos. La figura 2 muestra el nivel de
expresión de los genes testados a diferentes concentraciones de nanotubos de
carbono y nanoplata coloidal.
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A
B
Figura 2. Nivel de expresión de los genes testados en embriones de pez cebra
tras exposición de 48h a diferentes concentraciones de nanoplata (A) y
nanotubos de carbono (B).
En resumen, con la realización de este proyecto se ha comprobado que el
análisis de los efectos tóxicos de nanopartículas con genes concretos asociados
a mecanismos de toxicidad conocidos (biomarcadores) efectuado por RT-PCR,
es un test que ofrece la posibilidad de identificar efectos tóxicos que aún no
resultan evidentes a la observación directa. Además, se ha verificado que el
uso de biomarcadores podría proporcionar información sobre la acción
toxicológica que realizan determinados contaminantes y podría asistir al
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desarrollo de un ensayo de toxicidad general basado en la identificación de
efectos.
2.2 PRODUCCION CIENTIFICA, DIVULGACION – PLAN DE DIFUSION
Contribuciones:
•
Publicación de un proceeding del congreso NSTI NanoTech 2007:
Rojo I,Uriarte M, Obieta I, Bustero I, Egizabal A, Pardo MA, Martínez
de Ilarduya O. Toxicogenomics study of nanomaterials on the model
organism zebrafish. “NSTI Nanotech 2007”, Technical Proceedings,
Vol. 2, 655-658. CRC Press, New York NY. 2007.
•
Realización de una presentación oral en el congreso NSTI NanoTech
2007:
Rojo I, Uriarte M, Obieta I, Bustero I, Egizabal A, Pardo MA, Martinez
de Ilarduya O. (2007) Toxicogenomics study of nanomaterials on the
model organism zebrafish. NSTI NanoTech 2007 Santa Clara, CA,
(USA) 20-24/05/2007
•
Realización de una presentación oral en el congreso NanoToxicity
2007:
Rojo I, Pardo MA, Obieta I, Bustero I, Egizabal A, Uriarte M, Martínez
de Ilárduya O. (2007) Zebrafish as a model organism for the
toxicogenomics study of nanomaterials. NanoToxicity 2007 Paris,
(Francia) 28-27/06/2007
•
Presentacion de un abstract al congreso NANOTOX 2008:
Olasagasti M, Oyarbide U, Uriarte M, Pardo MA, Martínez de
Ilárduya O, Rainieri S (2008) Nanosilver toxicity detected through a
toxicogenomic approach on zebrafish embryos. Nanotoxicology - 2nd
International Conference, Zurich (Suiza) 7-10/09-2008.
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Además, se está realizando la redacción de dos artículos científicos, uno que
reporta los efectos de la nanoplata y el otro de los nanotubos de carbono sobre
los embriones de pez cebra, que se enviaran a la revista internacional
Toxicology Letters durante los próximos meses.
2.3 POSIBILIDADES DE TRANSFERENCIA – INTERES DE EMPRESAS
El interés principal y muy demandado es el de la administración europea que,
en el actual marco de financiación para la investigación europea (FP7), dedica
un presupuesto significativo a la búsqueda de alternativas para la sustitución
de los análisis toxicológicos en animales.
2.4 PLANTEAMIENTO DE NUEVOS PROYECTOS y OTRAS ACCIONES
Las presentaciones orales realizadas a dos congresos internacionales a lo
largo del año 2007, han llamado la atención de algunos de los más notables
expertos internacionales en tema de toxicidad. Este interés se ha concretado
en una invitación, por parte de un consorcio de expertos, a participar en la
propuesta de un Proyecto Europeo del tipo “Large-scale integrating unit”
dirigido específicamente a realizar la validación, adaptación y el desarrollo de
métodos de evaluación de riesgos de nanopartículas modificadas. En la
actualidad se está en fase de solicitud de la subvención para este proyecto en
cualidad de líderes de uno de los Work Packages.
2.5 FORMACION DE PERSONAL Y DEL GRUPO DE TRABAJO
La temática del presente proyecto es parte del trabajo desarrollado en una
tesis doctoral, en donde se estudian las posibilidades de aplicación del modelo
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animal pez cebra para investigación alimentaria (estudios del efecto de
componentes alimentarios, detección de efectos adversos y toxicología).
A raíz de los inconvenientes y limitaciones técnicas encontradas con la
experimentación en pez cebra nuestro grupo ha planteado una formación de
alto nivel en centros especializados en estudios con el modelo animal y en
diferentes campos de aplicación, que finalmente se llevará a cabo durante el
año 2008 y con perspectivas de futura colaboración con dichos grupos. El
objetivo de las estancias en centros de prestigio es, además del aprendizaje, la
búsqueda de planteamiento de nuevas propuestas de proyectos.
2.6 ENTREGABLES Y OTROS INFORMES
-
El hito principal es el desarrollo de un test de toxicidad de
nanopartículas, en embriones de pez cebra.
-
3.
Publicación de dos artículos científicos (2008)
CONCLUSIONES
Con la realización de este proyecto:
•
Se ha desarrollado un test de toxicidad sobre embriones de pez cebra
para determinar la toxicidad crónica asociada a contaminantes
alimentarios de nanodimensione.
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•
Se ha visto que, solo la concentración más alta (5ppm) de nanoplata
empleada ha producido efectos morfológicos sobre los embriones; en los
restantes casos los embriones se han desarrollado normalmente.
•
Se ha visto que la nanoplata coloidal a concentraciones de 1-5 ppm
manifiesta un efecto tóxico general.
•
Se ha observado que los nanotubos de carbono a las concentraciones
testadas (0.01 – 10 ppm) no muestran señales evidentes de toxicidad,
aunque no se puede excluir un efecto tóxico a concentraciones mas
altas.
•
Se ha demostrado que el test desarrollado ofrece la posibilidad de
identificar efectos tóxicos que aún no resultan evidentes a la
observación directa.
•
Se ha verificado que el uso de biomarcadores podría proporcionar
información sobre la acción toxicológica que realizan determinados
contaminantes y podría asistir al desarrollo de un ensayo de toxicidad
general basado en la identificación de efectos.
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