Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Escuela de Biología

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Escuela de Biología
Análisis Del Efecto De La Pérdida De Función De Rac1 Sobre El Citoesqueleto
De Actina En El Desarrollo Embrionario Temprano Del Pez Cebra
Tesis para obtener el título de Biólogo
Presenta:
Jorge Medel Medel
Asesor:
Dr. Enrique Salas Vidal
PUEBLA, PUE., AGOSTO, 2011
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Modelo de estudio: Danio rerio
1.2. Etapas del desarrollo temprano del pez cebra (Danio rerio)
1.3. Las Rho GTPasas
1.4. Citoesqueleto de Actina
1.5. Genes y proteínas afectadas en el knockdown de rac1 en pez cebra
2. HIPÓTESIS
3. OBJETIVO GENERAL
4. OBJETIVOS PARTICULARES
5. MATERIAL Y METODOS
5.1. Mantenimiento de peces
5.2. Cruzas y recuperación de embriones
5.3. Microinyección y tinciones
5.4. Clonación de secuencias genéticas: PCRs, ligaciones, electroporaciones,
cultivo celular, MiniPrep, digestiones y electroforesis
6. RESULTADOS
6.1. Etapas del desarrollo embrionario del pez cebra en las primeras 24 horas
6.2. Patrón de distribución de los filamentos de actina y de distribución celular
en las primeras 24 horas del desarrollo embrionario del pez cebra
6.3. Periodo de cigoto y primeras divisiones
6.4. Periodo de blástula
6.5. Periodo de gástrula
6.6. Periodo de segmentación
6.7. Efecto de la pérdida de función de Rac1 sobre los filamentos de actina en
embriones de pez cebra (Danio rerio)
6.8. Clonación de secuencias genéticas de proteínas afectadas en el
knockdown de rac1 en pez cebra
7. DISCUSIÓN
7.1. Distribución de los F-actina en embriones de pez cebra
7.2. Rac1 durante la gastrulación
7.3. Miogénesis
7.4. Moléculas participantes en la miogénesis
7.5. Miogénesis en pez cebra
7.6. Rac1 durante la miogénesis
8. CONCLUSIONES
9. PERSPECTIVAS
10. BLIBLIOGRAFÍA
11. APÉNDICE
11.1. Elaboración de cajas para montaje de embriones
11.2. Electroporación
11.3. Ligación
11.4. Oligos sintetizados en la unidad de síntesis y secuenciación (IBT-UNAM)
11.5. PCRs de las Digestiones del Plásmido con las secuencias genéticas
11.6. PCRs
11.7. Purificación de Plásmido por lisis alcalina
11.8. Tratamiento con RNasa para la visualización de núcleos celulares
RESUMEN
Durante el desarrollo embrionario del pez cebra ocurren múltiples procesos
celulares y moleculares que contribuyen a que se formen todas las estructuras
que lo caracterizan. Se sabe que durante la embriogénesis, el citoesqueleto de
actina participa de manera importante en los distintos comportamientos
celulares como migración, convergencia, movimientos de epibolia; así como en
la formación de proyecciones de la membrana celular y cambios en la forma de
las células. Varios de estos procesos son modulados por miembros de la
familia de Rho GTPasas mediante la modulación de la dinámica del
citoesqueleto de actina. Una de las cuales es la Rho GTPasa Rac1, la cual
tiene una participación importante durante el desarrollo embrionario modulando
el citoesqueleto de actina y distintos comportamientos celulares. En el presente
trabajo, primeramente se muestra el patrón de distribución de los filamentos de
actina (F-actina) y el patrón de distribución celular durante las primeras 24 hrs
del desarrollo temprano del pez cebra en embriones de tipo silvestre.
Posteriormente, se muestra los efectos que tiene la pérdida de función de Rac1
sobre el citoesqueleto de actina; sobre todo en la formación de algunas
estructuras durante la gastrulación y en la etapa de 24 hpf durante la
miogénesis. Los resultados muestran que durante la gastrulación concretamente en las etapas de 70 y 90% de epibolia- no ocurren cambios
significativos en el patrón de distribución de los F-actina. Los efectos son
apreciables en la etapa de 24 hpf ya que son muy diferentes en tamaño los
embriones Rac1MO, así como la morfología de los miotomos, distribución y
número de miofilamentos; comparados con los embriones inyectados con el
morfolino control (CoMO).