B - Repositorio Académico

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
Caracterización funcional de la proteína RhoGEF3, un
posible intercambiador de nucleótidos de
RhoGTPasas.
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado
académico de Doctor en Bioquímica
Por
ALEJANDRO ANTONIO ZÚÑIGA PRADO
Directora de Tesis
Dra. Verónica Cambiazo Ayala
SANTIAGO – CHILE
Enero - 2010
i
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
Functional characterization of RhoGEF3 protein, a
putative Nucleotide Exchange Factor for Rho
GTPases.
Thesis submitted to the University of Chile to qualify for the degree of
Doctor in Biochemistry
By
ALEJANDRO ANTONIO ZÚÑIGA PRADO
Thesis director
Dra. Verónica Cambiazo Ayala
SANTIAGO – CHILE
January - 2010
ii
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACEUTICAS
INFORME DE APROBACION
TESIS DE DOCTORADO
Se informa a la Comisión de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas de la Universidad de Chile que la Tesis de Doctorado presentada por el
candidato
ALEJANDRO ANTONIO ZÚÑIGA PRADO
Ha sido aprobada por la Comisión evaluadora de Tesis como requisito de Tesis
para el Grado de Doctor en Bioquímica, en el examen de defensa de Tesis rendido el
26 de Enero de 2010.
Directora de Tesis:
Dra. Verónica Cambiazo Ayala
_______________________
Comisión evaluadora de Tesis:
Dr. Jorge Martínez Winkler
_______________________
Dr. Christian Gonzalez Billault
_______________________
Dr. Manuel Kukuljan Padilla
_______________________
Dr. Miguel Concha Nordeman
_______________________
Dr. Juan Larraín Correa
_______________________
iii
Publicaciones:
Zuñiga A., Hodar C., Hanna P., Ibañez F., Moreno P., Pulgar R., Pastenes L.,
Gonzalez M., Cambiazo V. 2009. Genes encoding novel secreted and transmembrane
proteins are temporally and spatially regulated during D. melanogaster embryogenesis.
BMC Biol. 7:61.
Participaciones en congresos.
Zúñiga A., Cambiazo V. 2009. RhoGEF3 de Drosophila regula la reorganización del
citoesqueleto de actina mediante la activación de la GTPasa Rac1 en células S2R+.
XXIII Reunión anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile. Pucón, Chile.
Zúñiga A., Latorre M., Hanna P., Cambiazo V. 2008. Molecular and functional
characterization of RhoGEF3, a regulator of RhoGTPases in Drosophila melanogaster
embryos.
4th International Meeting of the Latin American Society of Developmental Biology.
Buenos Aires. Argentina.
Zúñiga A., Latorre M., Hanna P., González M., Cambiazo V. 2008. Caracterización
molecular y funcional de la proteína RhoGEF3, un activador de RhoGTPasas en
embriones de D. melanogaster.
XXII Reunión anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile. Pucón, Chile.
Zúñiga A., Cambiazo V. 2007. La expresión de RhoGEF3, un potencial regulador del
citoesqueleto de actina, es temporal y espacialmente restringida durante el desarrollo
de Drosophila.
XXI Reunión anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile. Pucón, Chile.
iv
Esta tesis está dedicada con mucho amor y gratitud a
toda mi familia:
A mi hijo Nicolás, mi mayor orgullo y alegría
A mi esposa Andrea, mi compañera incondicional y mi
apoyo fundamental
A mis padres Eustaquio y Antonieta, mi hermano
Rodrigo y su familia, María Inés, Tamara y Bruno, por
su constante apoyo e interés
v
Muchas personas compartieron conmigo este camino y ellas generan en mí
sentimientos de gratitud, cariño, respeto, confianza y admiración:
En primer lugar, Verónica y Mauricio, por recibirme en su laboratorio y aceptar la
responsabilidad y el arduo trabajo que significa formar un nuevo científico.
A mis compañeros de laboratorio que estuvieron más estrechamente ligados a mi
trabajo: Carmen, Patricia H., Patricia A., Freddy, Christian, Paula, Mauricio y Lorena.
Al resto de mis compañeros, que nunca dudaron en tenderme una mano: Rodrigo,
Leonardo, Felipe, Carolina, Guadalupe, Angélica R. y Angélica G., Luis, Carlos, Ana y
Juan Carlos.
A mis compañeros del INTA: Nicolás, Susi, Mónica, Rafael y Gastón.
Y a mis compañeros que ya no están en el laboratorio: Miriam, Talía, Marco,
Mauricio, y Patricia.
A los Profesores Jorge Martínez, Juan Pablo Rodríguez, Jaime Romero, Luis
Valladares, Argelia Garrido y Octavio Monasterio.
Agradezco también a los integrantes de mi Comisión de tesis, por su disposición
para discutir y evaluar constructivamente los resultados presentados en este trabajo.
La realización de esta tesis contó con el financiamiento de los proyectos Fondecyt
1050235 y 1090211, el aporte de la Iniciativa Científica Milenio a través del Centro de
Genómica de la Célula, el programa de Becas de Doctorado de Conicyt y el Proyecto
Mecesup de este Programa de Doctorado.
vi
Índice
Índice
vii
Índice Figuras
xii
Resumen
xiv
Summary
xvi
Introducción
1
1. El Desarrollo de Drosophila
2
1.1. Primeras etapas del desarrollo embrionario de D. melanogaster
2
1.2. Eventos morfogenéticos posteriores a la gastrulación
4
2. Bases moleculares de la morfogénesis de Drosophila
5
2.1. Mecanismos celulares de la morfogénesis
5
2.2. El citoesqueleto de actina durante la morfogénesis
7
2.3. Regulación del citoesqueleto de actina durante la morfogénesis
9
3. GTPasas
14
3.1. Descripción de las GTPasas
14
3.2. Activación de las GTPasas y características de las proteínas GEF
15
3.3. Rho GTPasas en el desarrollo de Drosophila y su regulación
16
4. El gen rhogef3 codifica una proteína putativa GEF
19
Hipótesis
21
Objetivo general
21
Objetivos específicos
21
Materiales y Métodos
22
1. Materiales
22
1.1. Cepas de D. melanogaster
22
1.2. Cepas de E. coli
24
1.3. Células de Drosophila
24
1.4. Vectores
25
1.5. Partidores
27
vii
2. Métodos Generales
29
2.1. Colecta de embriones
29
2.2. Electroforesis de DNA y RNA
30
2.3. Análisis densitométricos
30
2.4. Electroforesis de proteínas (SDS-PAGE)
31
2.5. Preparación de muestras para SDS-PAGE
31
2.6. Western Blots
32
2.7. Cuantificación de proteínas
32
2.8. Transformación bacteriana
32
2.9. Purificación de ácidos nucléicos
33
2.10. Extracción de DNA Plasmidial
34
i. Miniprep
34
ii. Midiprep
34
2.11. Digestión del DNA
35
2.12. Extracción de DNA desde gel
35
2.13. Desfosforilación de DNA
35
2.14. Extraccion de DNA genómico
36
i. A partir de 25 moscas
36
ii. A partir de una mosca
36
2.15. Extracción de RNA total
37
2.16. Síntesis de cDNA
37
2.17. PCR
38
2.18. PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR)
38
2.19. Tinción de X-gal en embriones
39
2.20. Inmunofluorescencias de embriones
40
2.21. Inmunofluorescencias en células
40
2.22. Inmunofluorescencias en glándulas salivales de larvas
41
2.23. Adquisición de imágenes
41
3. Métodos particulares por objetivos
42
3.1. Objetivo 1
42
3.1.1. Análisis Bioinformáticos
42
3.1.2. Identificación del sitio de inicio de transcripción de rhogef3
42
viii
3.1.3. Generación de sondas de cRNA para hibridaciones in situ
44
3.1.4. Hibridaciones in situ
44
3.1.5. Generación de anticuerpo α-RhoGEF3
45
i. Generación de proteína recombinante
45
ii. Expresión y purificación
46
iii. Inyecciones en conejo
46
iv. Purificación del anticuerpo por inmunoadsorción
47
3.2. Objetivo 2
47
3.2.1. Cultivo de células de Drosophila
47
3.2.2. Construcción de vectores para sobreexpresión de RhoGEF3
en células de Drosophila
48
i. Vector RhoGEF3-∆N
48
ii. Vector RhoGEF3-V5
48
iii. Vector RhoGEF3-Myc
48
3.2.3. Generación de RNA de doble hebra (dsRNA)
49
3.2.4. Transfección de células de Drosophila
49
3.2.5. Clonamiento de proteínas fusionadas a GST
50
3.2.6. Expresión de proteínas fusionadas a GST
51
3.2.7. Purificación de proteínas fusionadas a GST
52
i. Precipitación con Sulfato de Amonio
53
ii. Filtración por gel
53
3.2.8. Ensayos de actividad GTPasica
53
3.2.9. Ensayo de intercambio
54
3.3. Métodos del objetivo 3
54
3.3.1. Ensayos de ganancia y pérdida de función de RhoGEF3
54
3.3.2. PCR inverso (iPCR)
55
3.3.3. Escisión del gen rhogef3
56
i. Generación de eventos de escisión de elemento P
56
ii. Análisis de deleciones por PCR
58
3.3.4. Análisis de fenotipos
58
ix
Resultados
60
1. Determinar la secuencia completa del cDNA de rhogef3 y la expresión
espacio-temporal de su transcrito y de su proteína
60
1.1. Caracterización molecular del gen rhogef3
60
1.1.1 Inicio de la transcripción del gen rhogef3
60
1.1.2. Expresión temporal del transcrito rhogef3
64
1.1.3. Expresión espacio-temporal del transcrito rhogef3
66
1.2. Análisis de la proteína RhoGEF3
70
1.2.1. Análisis de la secuencia primaria de RhoGEF3
70
1.2.3. Comparación de secuencia con otras proteínas GEF
71
1.3. Localización de la proteína RhoGEF3
75
1.3.1. Producción de anticuerpo anti-RhoGEF3
75
1.3.2. Localización de la proteína RhoGEF3
83
1.3.3. Distribución de RhoGEF3 respecto a marcadores moleculares
87
2. Determinar in vitro la capacidad de la proteína RhoGEF3 de funcionar
como intercambiador de nucleótidos de Rho/Rac GTPasas y de
reorganizar el citoesqueleto de actina
2.1. Experimentos de pérdida y ganancia de función en líneas celulares
90
90
2.1.1. Sobreexpresión de la región carboxilo-terminal de la proteína RhoGEF3
en células S2
90
2.1.2. Sobreexpresión de la proteína RhoGEF3-V5 en células S2
95
2.1.3. Sobreexpresión de RhoGEF3 en células S2R+
98
2.1.4. Pérdida de función en células S2R+
103
2.2.1. Ensayo de intercambio de GTP
119
3. Analizar el papel que cumple RhoGEF3 en estados tempranos del
Desarrollo a través de la generación de mutantes de pérdida y
ganancia de función
132
3.1. Ganancia de función
132
3.1.1. Generación de animales transgénicos y mapeo de inserción
134
3.1.2. Sobreexpresión en distintos tejidos del embrión y el adulto
138
x
3.2. Pérdida de Función
140
3.2.1. Escisión imprecisa de elemento P
140
3.2.2. RNAi
146
3.2.3. Deleción cromosómica
149
Discusión
151
1. Caracterización de RhoGEF3: bioinformática, otras GEF y ensayos de
intercambio
151
2. Expresión de RhoGEF3 en líneas celulares de Drosophila
155
3. Expresión del gen y de la proteína
162
4. Morfogénesis de las glándulas salivales y posibles funciones de RhoGEF3
166
Conclusiones
170
Bibliografía
171
xi
Índice Figuras
Figura 1. Escisión del gen rhogef3
57
Figura 2. Anotación del gen rhogef3
61
Figura 3. Inicio de la transcripción del gen rhogef3
63
Figura 4. Expresión del gen rhogef3 durante el ciclo de vida de Drosophila
65
Figura 5. Distribución espacio-temporal del transcrito rhogef3 en estadíos
tempranos del desarrollo
68
Figura 6. Distribución espacio-temporal del transcrito rhogef3 en estadíos
tardíos del desarrollo
69
Figura 7. Análisis de la secuencia aminoacídica de la proteína RhoGEF3
72
Figura 8. Similitud entre diferentes GEF
74
Figura 9. Diseño y expresión de péptido inmunogénico
77
Figura 10. Caracterización del anticuerpo a-RhoGEF3
79
Figura 11. Detección de RhoGEF3 en embriones de Drosophila
82
Figura 12. Expresión de la proteína RhoGEF3 en embriones de Drosophila
84
Figura 13. Expresión de la proteína RhoGEF3 en las glándulas salivales
85
Figura 14. Comparación de la localización subcelular de RhoGEF3 y Crumbs
en glándulas salivales del embrión de Drosophila
88
Figura 15. Optimización de la expresión de la proteína recombinante
RhoGEF3-DN-V5 en células S2
91
Figura 16. Expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-ΔN-V5
en células S2
94
Figura 17. Expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-V5 en células S2 96
Figura 18. Expresión de proteínas recombinantes RhoGEF3 en células S2R+
101
Figura 19. Transfección con dsRNA dirigido contra rho1
106
Figura 20. Transfección de dsRNAs dirigidos contra cdc42, rac1 y rhogef3
en células S2R+
108
Figura 21. Transfección de dsRNAs dirigidos contra rac1 y rhogef3
en células S2R+ sembradas sobre concanavalina A
111
xii
Figura 22. Fenotipos observados en respuesta al tratamiento con dsRNAs
114
Figura 23. Expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-Myc en presencia
del dsRNA dirigido contra rac1 en células S2R+
117
Figura 24. Expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-Myc en presencia
del dsRNA dirigido contra cdc42 en células S2R+
118
Figura 25. Expresión de proteínas recombinantes fusionadas a GST
121
Figura 26. Purificación de proteínas recombinantes fusionadas a GST
122
Figura 27. Ensayo de intercambio de GDP in vitro
124
Figura 28. Precipitación por Sulfato de Amonio
126
Figura 29. Purificación de Cdc42-GST por filtración por gel
128
Figura 30. Resumen de la nueva purificación de Cdc42-GST
129
Figura 31. Actividad GTPasica de Cdc42-GST
131
Figura 32. Sistema UAS-Gal4
133
Figura 33. Caracterización de los sitios de inserción del vector
UAS-RhoGEF3-Myc
135
Figura 34. Sitios de inserción del vector UAS-RhoGEF3-Myc
137
Figura 35. Escisión imprecisa del gen rhogef3
141
Figura 36. Análisis de alelos generados por escisión de elemento P
144
Figura 37. Verificación del silenciamiento del gen rhogef3 en embriones
148
Figura 38. Deleción de la región cromosómica del gen rhogef3
150
xiii
Resumen
La morfogénesis en el embrión de Drosophila requiere de la organización
tridimensional de poblaciones de células con formas y comportamientos característicos
de las cuales surgirán las estructuras del animal adulto. Los cambios de forma y
movimiento coordinados de estos grupos de células tienen su origen en la
reorganización del citoesqueleto de actina. Este proceso se encuentra dirigido por una
compleja red de señalizaciones y bajo el control de las Rho GTPasas, encargadas de
organizar los filamentos de actina en estructuras especializadas de la célula. La
actividad de las Rho GTPasas se encuentra, a su vez, finamente regulada a través de
proteínas GAP (GTPase Activating Protein) y proteínas GEF (Guanine Exchange
Factor), que modifican el estado de activación de las Rho GTPasas y permiten su
articulación con diversas vías de señalización, siendo las responsables de dirigir
temporal y espacialmente la acción de las GTPasas.
En Drosophila existen 22 genes que codificarían para proteínas GEFs, de los
cuales un numero reducido ha sido funcionalmente caracterizado durante el desarrollo,
por lo que el estudio de estos genes y la caracterización de la función de sus productos
proteicos parece fundamental para lograr una mayor comprensión de los mecanismos
que regulan los cambios en la conducta celular durante la morfogénesis del epitelio
embrionario. En este trabajo de tesis se propuso caracterizar molecular y
funcionalmente un nuevo GEF de Drosophila, denominado RhoGEF3. Para ello se
formuló la siguiente hipótesis: La función de la proteína RhoGEF3 otorga especificidad
espacial y temporal a la respuesta mediada por GTPasas, lo que se traduce en una
reorganización del citoesqueleto de actina durante las etapas tempranas del desarrollo
xiv
embrionario de Drosophila. Para abordar esta hipótesis se plantearon tres objetivos
específicos: (1) Determinar la secuencia completa del cDNA de rhogef3 y la expresión
espacio-temporal de su transcrito y de su proteína; (2) Determinar in vitro la capacidad
de la proteína RhoGEF3 de funcionar como intercambiador de nucleótidos de Rho
GTPasas y de reorganizar el citoesqueleto de actina, y (3) Analizar el papel que
cumple RhoGEF3 en estados tempranos del desarrollo, a través de la generación de
mutantes de pérdida y ganancia de función.
Nuestros resultados indican que el gen rhogef3 es diferencialmente expresado
durante el desarrollo embrionario y su expresión se encuentra restringida en grupos
particulares de células epiteliales. La generación de un anticuerpo anti-RhoGEF3
permitió detectar esta proteína en glándulas salivales, tráqueas y en el primordio del
proctodeo. Esta proteína se localiza en la región apical de las células que componen la
porción secretora de la glándula salival.
Experimentos in vitro sugieren que la proteína RhoGEF3 promueve la
disociación de GDP desde la GTPasa Rac1. Consistentemente, la expresión de
RhoGEF3 es capaz de inducir el ensamblaje de estructuras similares a lamelas en
cultivos de células S2 y S2R+ de Drosophila. La pérdida de función de esta proteína
afecta la morfología de las células S2R+, de manera similar a la pérdida de función de
la GTPasa Rac1, no así de las GTPasas Rho1 y Cdc42. Los resultados obtenidos
siguieren que in vivo la proteína RhoGEF3 participa en la regulación espacial y
temporal de la señalización mediada por GTPasas, particularmente en procesos de
reorganización del citoesqueleto de actina, mediante la activación específica de la
GTPasa Rac1. En experimentos en curso, estamos evaluando esta hipótesis en el
contexto del desarrollo del embrión de Drosophila.
xv
Summary.
Morphogenesis in the Drosophila embryo requires the three-dimensional
organization of cell populations with distinctive shapes and behaviors that that give rise
to the adult structure of the animal. The changes in cell shape and the coordinated
movement of these groups of cells relies on the reorganization of actin cytoskeleton.
Reorganization of actin cytoskeleton is governed by complex signaling networks and
controlled by of Rho GTPases, which are responsible of organizing actin filaments in
specialized cellular structures. The activity of Rho GTPases is, in turn, finely regulated
through GAP proteins (GTPase Activating Protein) and GEF proteins (Guanine
Exchange Factor), which modulate the activation status of Rho GTPases and connect
them with various signaling pathways, thus they are responsible of directing GTPase
activities in a temporally and spatially coordinate manner.
In Drosophila there are 22 genes that codify for GEF proteins, however only a
small number of these putative GEFs has been functionally characterized during
development. The study of these genes and the characterization of their protein
products seem to an essential step to better understand the mechanisms that regulate
changes in cell behavior during embryo morphogenesis. In this thesis work we
undertook the molecular and functional characterization of new Drosophila GEF named
as RhoGEF3. In doing so, we proposed the following hypothesis: The activity of
RhoGEF3 endows with spatial and temporal specificity the cell response mediated by
GTPases, affecting the reorganization of the actin cytoskeleton during early stages of
embryonic development of Drosophila. The specific objectives were: (1) To determine
the complete sequence of rhogef3 cDNA and the spatio-temporal pattern of expression
xvi
of its transcript and its encoded protein, (2) To determine in vitro the capacity the
RhoGEF3 to promote GDP/GTP exchange on RhoGTPases, and (3) To analyze the
role of RhoGEF3 in early stages of embryo development through the generation of loss
and gain of function mutants.
Our results indicate that the rhogef3 gene is differentially expressed during
embryonic development and its expression is restricted to particular groups of epithelial
cells. The generation of an antibody against RhoGEF3 allowed detecting this protein in
salivary glands, tracheae and in the hindgut primordium. RhoGEF is localized in the
apical region of the cells that make up the secretory portion of salivary glands.
In vitro experiments suggest that RhoGEF3 protein promotes the dissociation of
GDP from the GTPase Rac1. Consistently, the expression of RhoGEF3 induces the
assembly of lamellae-like structures in cultures of S2 and S2R+ Drosophila cells. The
loss of function of this protein affects the morphology of S2R+ cells, in a way that
resembles the loss of function of the GTPase Rac1, but not that of Rho1 and Cdc42
GTPases. The results suggest that RhoGEF3 protein is involved in spatial and temporal
regulation of signaling mediated by GTPases, particularly in the reorganization of the
actin cytoskeleton through the activation of the GTPase Rac1. In ongoing experiments,
we are evaluating this hypothesis in the context of embryonic development of
Drosophila.
xvii
Introducción
El estudio del desarrollo embrionario de los metazoos se ha centrado en tres
aspectos fundamentales: diferenciación, crecimiento y morfogénesis. Las células
diferenciadas no están distribuidas al azar sino que se encuentran organizadas en
tejidos y órganos y es la adquisición de este orden lo que llamamos morfogénesis. La
presente Tesis Doctoral pretende contribuir a dilucidar los mecanismos celulares y
moleculares que gobiernan los procesos de morfogénesis utilizando a Drosophila
melanogaster como modelo de estudio.
La morfogénesis en el embrión de Drosophila requiere de la organización
tridimensional de poblaciones de células con formas y comportamientos característicos
de las cuales surgirán las estructuras del animal adulto. Estudios genéticos han
identificado un gran número de genes que especifican la forma y el comportamiento de
las células. Muchos de estos genes codifican factores de transcripción que se expresan
en patrones espaciales precisos, sin embargo, los mecanismos por los cuales estos
patrones se traducen en cambios morfogenéticos aun no están completamente
descifrados. Desde la secuenciación del genoma de Drosophila se han realizado
variados estudios de expresión génica a gran escala que han permitido revelar redes
genéticas que conducen el desarrollo. En particular, en trabajos anteriores en nuestro
laboratorio, hemos identificado genes que se expresan diferencialmente al inicio de la
gastrulación de Drosophila (González-Agüero y cols., 2005; Zúñiga y cols., 2009).
Muchos de los genes identificados aun no han sido caracterizados molecularmente y
solo podemos establecer correlaciones entre sus patrones de expresión y la
información que es posible extraer desde las secuencias aminoacídicas de las
-1-
proteínas codificadas por ellos. Entre estos genes no caracterizados, encontramos el
gen rhogef3, que codifica para un posible factor intercambiador de nucleótidos de
guanina, un activador de GTPasas de la familia Rho con potencialidad de participar en
la organización del citoesqueleto de actina, que a su vez está íntimamente relacionado
con los cambios morfogenéticos que experimenta el embrión de Drosophila. El
propósito general del presente trabajo es estudiar el gen rhogef3 y avanzar en
determinar la función que desempeñaría la proteína RhoGEF3 en el contexto del
desarrollo embrionario de Drosophila.
A continuación haré una breve descripción de los principales eventos
morfogenéticos que sufre el embrión y luego nos centraremos en su regulación,
enfocándonos en fenómenos que involucran la regulación del citoesqueleto de actina a
través de las GTPasas a lo largo de la embriogénesis, revisaremos como funcionan y
se regulan las GTPasas y sus GEF, para terminar con una exposición de los
antecedentes que sustentan esta propuesta de investigación.
1. El Desarrollo de Drosophila.
1.1. Primeras etapas del desarrollo embrionario de D. melanogaster.
Durante la primera etapa del desarrollo embrionario de Drosophila, el zigoto
fecundado sufre 13 divisiones nucleares sucesivas originando una célula multinucleada
con un citoplasma común, llamado blastodermo sincicial (estados 2 a 4 del desarrollo,
Campos-Ortega y Hartenstein, 1985). Esta etapa está regulada por las proteínas y
transcritos aportados por la madre y finaliza con la localización de los núcleos en la
periferia. Durante la 14ava división nuclear se requiere por primera vez de transcritos
sintetizados por el embrión, y las proteínas por ellos codificadas se encargarán de
-2-
dirigir y organizar el resto del desarrollo (Merril y cols., 1988; Wieschaus y Sweeton,
1988). En este momento comienza la formación del blastodermo celular (estado 5 del
desarrollo), etapa en que los núcleos son separados por membranas formándose un
epitelio de células columnares morfológicamente idénticas. Una vez finalizada la
celularización comienza la gastrulación (estados 6 y 7 del desarrollo), proceso que
resulta en la definición de las capas primordiales endodermo, mesodermo y ectodermo.
La gastrulación involucra un cambio dramático en la organización del epitelio
embrionario como consecuencia de la invaginación del endodermo y del mesodermo y
de movimientos dados por intercalación de las células en el epitelio (Campos-Ortega y
Hartenstein, 1985).
El inicio de la gastrulación está determinado por la invaginación del surco
ventral, cuyas células formarán el mesodermo y parte del endodermo anterior.
Simultáneamente, se forma el surco cefálico a lo largo del eje dorso-ventral (DV), en el
tercio anterior del embrión. Pocos minutos después de iniciarse la gastrulación, las
células localizadas en la región posterior del embrión se invaginan para formar el
endodermo posterior. Una vez dentro del embrión, las regiones anterior y posterior del
endodermo se unen formando el primordio del intestino (Costa y cols., 1993). La región
del polo posterior del embrión comienza a moverse dorsalmente iniciando la extensión
de la banda germinal. Para acomodar la banda en extensión, el epitelio dorsal debe
formar dos pliegues profundos, que posteriormente se diferenciarán en una delgada
capa, la amnioserosa (Campos-Ortega y Hartenstein, 1985).
-3-
1.2. Eventos morfogenéticos posteriores a la gastrulación.
La neurogénesis se inicia con la segregación de los neuroblastos, los
progenitores neurales, desde el ectodermo y ocurre dentro de los límites del ectodermo
neurogénico, que está compuesto por dos porciones bien definidas de ectodermo, uno
en el lóbulo procefálico y otro en la banda germinal (Campos-Ortega y Hartenstein,
1997).
El acortamiento de la banda germinal restaura las relaciones anatómicas de la
larva. De este modo, el extremo caudal del intestino es localizado en el polo posterior
del embrión. El acortamiento de la banda está involucrado en la fusión de los
primordios anterior y posterior del intestino, en el establecimiento de la continuidad de
varias secciones que darán origen al árbol de las tráqueas y en la formación de las
gónadas. La segmentación definitiva de la banda germinal es completada al final del
acortamiento de la banda (estado 13 del desarrollo), gracias al desarrollo de surcos
entre los segmentos (Campos-Ortega y Hartenstein, 1997).
Con el acortamiento de la banda germinal el embrión queda abierto
dorsalmente y se forma la amnioserosa, que es una membrana extraembrionaria que
queda en contacto directo con la membrana vitelina. De este modo, la epidermis dorsal
en este estado del desarrollo queda localizada lateralmente. Otro importante
movimiento morfogenético es el cierre dorsal, que ocurre por extensión de la epidermis
ubicada a cada lado del embrión y que migra hasta fusionarse en la línea media dorsal
desplazando la amnioserosa. En este momento se produce la involución de la cabeza,
que es el resultado de complejos movimientos que involucran los segmentos anteriores
y termina con la formación de las estructuras anteriores como el atrio y la fusión de los
ductos de las glándulas salivales. Con la involución de la cabeza y el cierre dorsal
-4-
finaliza la morfogénesis del embrión de Drosophila (Campos-Ortega y Hartenstein,
1997).
2. Bases moleculares de la morfogénesis de Drosophila.
2.1. Mecanismos celulares de la morfogénesis.
Los mecanismos moleculares que sustentan la morfogénesis del embrión, son
principalmente dos, cambio de forma e intercalación de células. La formación del surco
ventral constituye un ejemplo representativo de los cambios de forma celular que
tienen lugar durante la gastrulación. A través de constricciones apicales sostenidas y
del desplazamiento de los núcleos hacia el extremo basal, una banda de
aproximadamente 22 células de ancho en la región medio-ventral del epitelio
embrionario cambia su forma desde columnar a trapezoide, provocando su
invaginación. Posteriormente, las células se acortan a lo largo de su eje apical-basal,
resultando en la internalización completa del epitelio. Una vez dentro del embrión, esta
capa de células sufre una transición epitelio-mesenquima dispersándose y formando el
mesodermo (Costa y cols., 1993).
La intercalación de células, es decir, células que
intercambian sus lugares con sus vecinas, ocurre durante la extensión de la banda
germinal, siguiendo un proceso llamado extensión convergente (Irvine y Wieschaus,
1994). Este es un fenómeno polarizado, que ocurre de una manera orientada y permite
la elongación del tejido sobre el eje antero-posterior (AP), aumentando su tamaño a
más del doble. Esta extensión está asociada con una convergencia o estrechamiento
del tejido dado por intercalación de células en la dirección del eje DV, es decir,
perpendicular a la dirección de la extensión, y es dirigido exclusivamente por una
-5-
remodelación de contactos célula-célula específicos que siguen un patrón espaciotemporal (Irvine y Wieschaus, 1994; Bertet y cols., 2004; Zallen y Wieschaus, 2004).
Durante la extensión de la banda germinal ocurren varios movimientos
morfogenéticos: la invaginación del estomodeo, la aparición de surcos entre los
segmentos (y también parasegmentos), y las invaginaciones del primordio de las
tráqueas y las glándulas salivales. En ellos no hay desplazamientos relativos entre
células, ya que la arquitectura epitelial persiste y tampoco dependen de división celular.
El mecanismo celular que subyace estas invaginaciones es similar al empleado
durante la invaginación del surco ventral (Myat, 2005; Andrew y Ewald, 2009). Por su
parte, el acortamiento de la banda germinal involucra un remodelamiento de la forma
de los segmentos que es llevada a cabo por mecanismos de cambio de forma de las
células individuales en lugar de revertir la intercalación de las células ocurrida durante
la extensión de la banda (Campos-Ortega y Hartenstein, 1997).
La formación del cierre dorsal es llevada a cabo por la elongación de las células
de la epidermis, la cual es debida a cambios de forma y no requiere proliferación o
reclutamiento de nuevas células. En una primera etapa, denominada iniciación, las
células del borde, una fila única de células de la epidermis que colindan con la
amnioserosa, se elongan a lo largo del eje DV. Esto es seguido por la elongación de
las células epiteliales laterales lo que conlleva a la extensión del epitelio. Durante esta
fase las células del borde proyectan filopodios sobre la amnioserosa. La fase final se
completa cuando las células de cada lado del embrión se encuentran en la línea media
dorsal y forman uniones entre ellas encerrando al embrión en un epitelio continuo
(VanHook y Letsou, 2008).
-6-
2.2. El citoesqueleto de actina durante la morfogénesis.
Los filamentos de actina, junto con los motores de miosina, ayudan a controlar
la forma de todas las células eucarióticas, y en organismos pluricelulares, generan las
fuerzas requeridas para muchos procesos morfogenéticos (Jacinto y Baum, 2003). En
Drosophila, la constricción apical que sufren las células que forman el surco ventral y la
invaginación del intestino posterior está asociada con contracciones en el citoesqueleto
cortical de actina, lo cual resulta en la aparición de protusiones de la membrana
plasmática en el extremo apical (Young y cols., 1991). En este contexto, no resulta
sorprendente la redistribución espacial de miosina
β y
H -espectrina
observada al
iniciarse la gastrulación (Young y cols., 1991; Thomas y Kiehart, 1994), ambas
proteínas desaparecen de los extremos basales y se concentran en los extremos
apicales de las células que forman las invaginaciones, sugiriendo un papel protagónico
del citoesqueleto en estos cambios de forma (Young y cols., 1991; Thomas y Kiehart,
1994).
Por otra parte, durante la intercalación celular se requiere de profundas
modificaciones de las uniones adherentes entre células vecinas. Para que el
movimiento ocurra, estas uniones sufren un proceso de desensamblaje y reensamblaje
en otro lugar de la célula, estableciendo contactos con nuevas células vecinas,
resultando en la extensión del epitelio en la dirección AP. Este patrón de
remodelamiento polarizado indica que las células son capaces de discriminar entre sus
diferentes fronteras celulares y controlar específicamente cada una de ellas, indicando
que las células son inherentemente polarizadas dentro del plano del epitelio (Bertet y
cols., 2004). Se ha observado que la cadena pesada de la miosina II se localiza
específicamente en uniones adherentes apicales en células que se intercalan
-7-
(ectodermo ventral) y no es detectada en sus membranas basolaterales ni en células
que no se intercalan en el ectodermo dorsal. Además, tanto la miosina como la
proteína Bazooka, una proteína que es parte del complejo estabilizador de E-caderina,
se encuentran distribuidas de manera polarizada en el plano del epitelio y
perpendicular entre ellas, sugiriendo que la distribución asimétrica de estos elementos
es importante para establecer la dirección del movimiento (Zallen y Wieschaus, 2004;
Bertet y cols., 2004).
Durante el cierre dorsal existe una acumulación de miosina y actina en la región
más dorsal de las células del borde de la epidermis formando un gran anillo cuya
contracción es responsable del cierre dorsal estableciendo un modelo llamado “tirar la
cuerda” (purse-string model). Según este modelo, la miosina y la actina ejercen fuerza
contráctil en cada célula propiciando una contracción de la región dorsal de la célula en
una dirección AP (Young y cols., 1993).
Durante el desarrollo de las tráqueas, utilizando proteínas de las uniones
adherentes fusionadas a GFP en combinación con microscopía in vivo, se observó que
las células sufren intercalación a través de una reestructuración de sus uniones
adherentes (cierre de cremallera) para reestructurar el epitelio desde tubos
multicelulares a tubos unicelulares. Al inicio de la intercalación, un par de células
enfrentadas se encuentran unidas compartiendo uniones adherentes intercelulares y
sus extremos apicales forman el lumen del tubo. Una célula del par curva su superficie
apical y rodea a la otra célula hasta el otro lado del lumen y al entrar en contacto
consigo misma forma el inicio de una unión adherente autocelular. Una vez establecida
esta unión, ambas células se elongan y la unión adherente autocelular crece como si
-8-
se tratara de una cremallera. Al término de la elongación y del cierre se forma un tubo
unicelular cuyo lumen está rodeado por una sola célula (Ribeiro y cols., 2004)
En todos estos casos, las variaciones en la distribución subcelular de estas
proteínas sugieren la existencia de reguladores que modulan los cambios de forma
celular y movimientos a través de la regulación del citoesqueleto de actina y de las
proteínas de unión a actina (Young y cols., 1991; Thomas y Kiehart, 1994; Irvine y
Wieschaus, 1994; Bertet y cols., 2004; Zallen y Wieschaus, 2004).
2.3. Regulación del citoesqueleto de actina durante la morfogénesis.
La forma precisa, localización y propiedades mecánicas de la red de actina son
reguladas por la acción de distintos grupos de proteínas de unión a actina (Jacinto y
Baum, 2003), por lo tanto, la activación controlada espacial y temporalmente de estos
reguladores del citoesqueleto de actina, así como variaciones en la organización de
sus componentes, deben ser los responsables, en último término, de los cambios de
forma y los movimientos celulares. Durante el desarrollo, esto se logra mediante la
integración
de
diversos
procesos
celulares.
En
primer
lugar,
reguladores
transcripcionales son responsables de determinar el destino de las células en el
embrión, especificando los grupos de células que experimentarán los diferentes
movimientos morfogenéticos. En segundo lugar, señales extracelulares son necesarias
para coordinar temporal y espacialmente estos movimientos (Costa y cols., 1993;
Leptin, 1999).
La formación del surco ventral se encuentra bajo el control del factor de
transcripción Dorsal, que define la polaridad DV del embrión dirigiendo la expresión
cigótica de los genes twist y snail (Leptin y Grünewald, 1990) cuyos dominios de
-9-
expresión determinan las células que formarán el mesodermo (Leptin, 1995).
Embriones mutantes para twi o sna forman un surco ventral anómalo y transitorio y el
mesodermo no es internalizado (Leptin, 1991). Durante la formación del surco ventral,
se ha demostrado que la constricción apical de las células que se invaginan requiere
de los productos de tres genes, fog (Costa y cols., 1994) concertina (Parks y
Wieschaus, 1991) y DRhoGEF2 (Barret y cols., 1997; Häcker y Perrimon, 1998). Estos
tres genes codifican proteínas implicadas en procesos de señalización: una molécula
de secreción, una proteína de alta identidad con subunidades alfa de proteínas G
heterotriméricas y un factor intercambiador de nucleótidos de guanina específico que
activa la GTPasa Rho1, respectivamente. Los fenotipos de embriones mutantes para
fog y cta son muy similares, en ellos la invaginación del surco ventral se produce, pero
de una forma más lenta y desorganizada, lo que ha llevado a proponer un modelo en el
cual ambos se sitúan en una vía común de transducción de señales. En este modelo,
la señal generada por Fog es recibida por un receptor desconocido y transducida, a
través de Cta, al citoesqueleto (Costa y cols., 1994; Barret y cols., 1997; Morize y cols.,
1998; Dawes-Hoang y cols, 2005). Debido a que la función de fog y cta no es esencial
para la formación del surco ventral, esta vía de señalización no parece asociarse con el
control de los cambios de forma celular, sino más bien con los procesos que coordinan
estos cambios (Costa y cols., 1994). Por el contrario DRhoGEF2, pareciera ser
esencial para la invaginación del surco ventral, ya que al suprimir la expresión cigótica
del gen, se inhibe completamente el cambio de forma de las células anulando la
internalización del endodermo y mesodermo (Barret y cols, 1997; Häcker y Perrimon,
1998). Sin embargo, aun desconocemos los mecanismos moleculares que utilizan los
productos de estos genes para transducir la señal de remodelación (Aracena y cols.,
- 10 -
2006). A pesar de que los mutantes para estos tres genes presentan fenotipos
distintos, se ha observado que DRhoGEF2 es requerida por Fog para ejercer su
función (Dawes-Hoang y cols, 2005). Además, tanto DRhoGEF2 como Fog y Cta
parecen influir sobre los cambios de forma celulares a través de la relocalización y
activación de la miosina, produciendo esta relocalización mediante la activación de la
quinasa dependiente de Rho, ROCK, sugiriendo que ambas vías se comunican en
algún punto. Esta activación de la miosina provocaría la contracción de las fibras de
actina que produciría cambios en la forma de las células que se invaginan (DawesHoang y cols, 2005).
La extensión de la banda germinal no depende de la especificación de células
en el eje DV, produciéndose normalmente en mutantes de dorsal, twist y snail,
indicando que este movimiento tampoco depende de presiones externas ejercidas
sobre el tejido por grupos de células que se invaginan, sino que radica en fuerzas
locales en los límites de cada célula (Irvine y Wieschaus, 1994). Sin embargo, la
especificación del eje AP parece ser esencial para que este movimiento se lleve a
cabo. En Drosophila, esta señal es iniciada por genes maternos, nanos y bicoid, que
definen el patrón de expresión de genes cigóticos de segmentación, krüpel, even
skipped y runt, los que codifican para factores de trascripción y su expresión, a su vez,
define diferentes dominios celulares a lo largo del eje AP. En mutantes Kr, el número
de uniones en remodelación se ve reducido drásticamente, pero cuando estas ocurren,
lo hacen de una manera aleatoria y sin polaridad, por lo que no se produce movimiento
neto (Bertet y cols., 2004). Más aún, en embriones mutantes de eve o run, la extensión
de la banda germinal no ocurre, sugiriendo la existencia de información espacial, que
debe ser percibida por las células y que es necesaria para la intercalación (Irvine y
- 11 -
Wieschaus, 1994; Zallen y Wieschaus, 2004). Si bien se desconoce su mecanismo de
acción, la expresión de estos genes es fundamental para la localización polarizada de
miosina y Bazooka, (Irvine y Wieschaus, 1994; Zallen y Wieschaus, 2004). En
embriones mutantes para los genes que codifican las cadenas pesada y liviana de la
miosina (zip y sqsh), las células no se intercalan (Bertet y cols., 2004). Embriones
donde se inhibe ROCK, la intercalación de células no ocurre normalmente,
probablemente por un defecto en la relocalización de la miosina, la que se encuentra
enriquecida en la membrana basal de estas células. Esto sugiere que la activación de
miosina mediada por ROCK y su posterior relocalización en uniones que se
desensamblan, es requerida para su desestabilización. En este sentido, en células de
mamíferos, la activación de miosina por ROCK, desestabiliza uniones adherentes
(Sahai y Marshall, 2002). Coherentemente, la localización y función de Bazooka
sugieren que su ausencia también ayuda a desestabilizar estas uniones y además su
presencia es requerida para ensamblar y estabilizar las uniones adherentes recién
formadas con sus nuevas vecinas (Bertet y cols., 2004; Zallen y Wieschaus, 2004).
La señalización por JNK es requerida para la integridad del citoesqueleto de las
células del borde de la epidermis durante el cierre dorsal, indicando que esta vía de
señalización afecta el ensamblaje de la actina. Por otra parte, mutaciones en los genes
thick veins (tkv) y punt (put), los cuales codifican receptores tipo I y II de TGF-β causan
defectos en el cierre dorsal. JNK dirige la expresión de Dpp, un miembro de la familia
TGF-β, sugiriendo que JNK act
úa a través de TGF
-β durante el cierre dorsal. La
sobreexpresión de Dpp o la expresión de su receptor, thick veins, son capaces de
rescatar el fenotipo del cierre dorsal defectuoso ocasionado por mutantes de JNK
(Harden, 2002).
- 12 -
El factor de transcripción Fork head (Fkh), que es necesario para la formación
del intestino y cumple un papel importante en la morfogénesis de las glándulas
salivales. Fkh es requerido para la constricción apical de las células de la glándula. En
mutantes fkh estas células no sufren constricción apical, aunque los núcleos migran
basalmente. Además, las células no cambian su forma de columnar a piramidal y no
invaginan, probablemente debido a la falta de esta constricción. Además fkh es
requerido para la supervivencia de estas células previniendo la apoptosis. Fkh ejerce
esta función a través del gen senseless, el que codifica para un factor de transcripción
de dedos de zinc. Sin embargo, los genes rio abajo en esta cascada de señalización y
que son responsables de los cambios de forma de las células de la glándula son
desconocidos (Myat, 2005), si bien se ha determinado que la constricción apical de las
células de la glándula salival y su cambio de forma requieren de la activación de la
GTPasa Rho1 a través de un mecanismo muy similar al descrito para la formación del
surco ventral (Andrew y Ewald, 2009).
Las evidencias hasta ahora mencionadas revelan la existencia de mecanismos
finos de regulación del citoesqueleto durante esta el desarrollo embrionario. Es lógico
suponer que las Rho GTPasas, que cumplen un papel fundamental en la regulación del
citoesqueleto de actina en una amplia variedad de sistemas biológicos (Takai y cols.,
2001), estén estrechamente vinculadas a la regulación de procesos morfogenéticos
que tienen lugar durante el desarrollo del embrión.
- 13 -
3. GTPasas.
3.1. Descripción de las GTPasas.
Las GTPasas monoméricas pequeñas se pueden clasificar en 5 familias, Ras,
Ran, Rab, Arf y Rho GTPasas. Son conservadas desde levaduras a mamíferos y todas
cumplen un papel central dentro de la maquinaria de transducción de señales que
modulan procesos tan variados como proliferación y ciclo celular, expresión génica,
adhesión y regulación del citoesqueleto (Takai y cols., 2001). Ellas se activan en
respuesta a señales extracelulares mediante una transición conformacional desde un
estado inactivo unido a GDP, a un estado activo unido a GTP. Esta activación es
modulada directamente por la interacción con proteínas que: a) las activan,
intercambiando el GDP unido por GTP (GEF, Guanine nucleotide Exchange Factor); b)
las inactivan, estimulando su actividad GTPasa intrínseca (GAP, GTPase Activating
Protein); y c) mantienen inactivas inhibiendo la disociación de GDP (GDI, Guanine
nucleotide Dissociation Inhibitor, Takai y cols., 2001). Las proteínas pertenecientes a la
subfamilia de Rho GTPasas son los principales reguladores del citoesqueleto de
actina. Los miembros mejor estudiados de ésta familia son Rho, Rac y Cdc42. Durante
el último tiempo se ha acumulado abundante información que ha vinculado a estas
GTPasas en una multitud de procesos celulares ocurridos a través de todo el desarrollo
de Drosophila, sin embargo, el conocimiento que poseemos respecto a los
mecanismos moleculares que regulan estos procesos aún es incompleto (Sawyer y
cols., 2009). La activación de las Rho GTPasas tiene efectos bien estereotipados en
cultivos celulares que apuntan a vías de señalización específicas que conllevan a la
polimerización y organización de filamentos de actina. La activación de Rho conduce a
la formación de fibras contráctiles de actina-miosina, la activación de Rac conduce a la
- 14 -
formación de lamelas y la activación de Cdc42 conduce a la formación de filopodios
(Jaffe y Hall, 2005).
3.2. Activación de las GTPasas y características de las proteínas GEF.
Las GTPasas monoméricas pequeñas son activadas por las proteínas GEF
(Guanine nucleotide Exchange Factor). Esta familia de proteínas es definida por la
presencia de un dominio DH (Dbl Homology domain). Este dominio es el que interactúa
con la GTPasa, define la especificidad de cada GEF por una o más GTPasas y
confiere la actividad de intercambio de nucleótidos. En los GEFs específicos de Rho
GTPasas, el dominio DH está invariablemente acompañado de un dominio PH
(Plekstrin Homology domain) en su extremo carboxilo. Este dominio, que reconoce y se
une a fosfoinositidos, define la localización subcelular de las proteínas GEF (Lemmon y
cols., 2002), y posiblemente actúa como un regulador alostérico (Hoffman y Cerione,
2002). Las GTPasas poseen dos bolsillos en su estructura que unen el nucleótido y el
ion Mg2+ respectivamente. La unión de GTP o GDP en el bolsillo modula los cambios
conformacionales que conllevan a la activación o inactivación de la GTPasa, mientras
que el ion Mg2+ es necesario para producir una unión de alta afinidad entre el
nucleótido y la GTPasa. El dominio DH de las proteínas GEF promueve intermediarios
libres de nucleótido y Mg2+, facilitando la entrada de GTP al bolsillo de la GTPasa,
debido a que en las células el GTP se encuentra a concentraciones más altas que el
GDP (Rossman y cols., 2005)
Existe una amplia variedad de proteínas con dominios DH-PH, y cada una de
estas proteínas GEF posee un carácter único, dado por el tamaño de la proteína y la
presencia de otros dominios estructurales que acompañan a los dominios DH-PH.
- 15 -
Entre ellos, dominios con actividad catalítica como quinasa, pero esencialmente
dominios que permiten la interacción proteína-proteína, como los dominios PDZ, SH2 y
SH3, los cuales permiten interactuar a cada GEF con un grupo diferente de proteínas e
incluso permitirían a las proteínas GEF participar como proteínas de andamiaje
integrando complejos de señalización (Rossman y cols., 2005).
3.3. Rho GTPasas en el desarrollo de Drosophila y su regulación.
Existe abundante evidencia que indica que las Rho GTPasas cumplen un papel
fundamental al transducir información al citoesqueleto, lo que determina cambios en la
forma, adhesión y movimiento celular. La propiedad de utilizar las mismas GTPasas y
efectores eficientemente para dirigir y coordinar temporal y espacialmente distintos
procesos morfogenéticos radicaría en el uso diferencial de las proteínas GAP y GEF,
los reguladores de las GTPasas. Estas proteínas actuarían en respuesta a señales
extracelulares dirigiendo la acción de las GTPasas a regiones subcelulares de células
particulares en un momento determinado. Ejemplo de esto son las proteínas GEF de
Rho1, Pebble y DRhoGEF2. Ambas son aportadas por la madre y se distribuyen de
manera ubicua en el embrión, pero se activan mediante señales extracelulares que
proveen información espacial y temporal logrando dirigir procesos distintos.
Concordantemente, mutaciones en rho1 provocan fenotipos más severos que
mutaciones en DRhoGEF2, sugiriendo que Rho1 participaría en un mayor número de
procesos, sugiriendo que podría ser regulada por proteínas GEF distintas, aún no
caracterizadas.
Estudios con mutantes de pérdida de función de Cdc42 indican que ésta es
requerida para la correcta diferenciación, citoarquitectura y distribución de células
- 16 -
epiteliales en procesos de desarrollo y ovogénesis. Particularmente en el embrión, las
células pierden el carácter epitelial, produciéndose defectos en la retracción de la
banda germinal (Genova y cols., 2000). Rac participa de la morfogénesis del tubo
epitelial en las glándulas salivares del embrión, donde induce invaginaciones dirigiendo
la relocalización de E-cadherina mediada por dinamina (Pirraglia y cols., 2006). Rac
participa además en fusión de mioblastos (Luo y cols., 1994), polaridad celular (Eaton y
cols., 1996; Fanto y cols., 2000) y diferenciación de neuronas (Awasaki y cols., 2000).
Entre las proteínas GEF que activan a Rac, la mejor descrita es Trio, sin embargo, ella
es requerida sólo en algunos de estos procesos (Hakeda-Suzuki y cols., 2002),
sugiriendo que otras proteínas GEF son necesarias para la regulación de Rac durante
la embriogénesis. Tanto Rac como Cdc42 utilizan como efector a la proteína QGAP1
en fibroblastos, la que regula la adhesión célula-célula mediada por cadherinas,
capturando y estabilizando microtúbulos a través de la proteína de unión a
microtúbulos CLIP-70, estableciendo una morfología polarizada y una migración celular
direccionada (Fukata y cols., 2005).
Rho1 ha sido la Rho GTPasa mejor estudiada en Drosophila, permitiendo
entender con mayor profundidad los mecanismos de su regulación. Ella es requerida
en diversos procesos que involucran una reorganización del citoesqueleto de actina
como la citoquinesis (Prokopenko y cols., 1999), la celularización del embrión (Padash
Barmchi y cols., 2005), cambios de forma (Magie y cols., 1999) y la transición epiteliomesenquima de las células del mesodermo (Smallhorn y cols., 2004). La activación de
Rho1 durante la citoquinesis y la transición epitelio-mesenquima ocurre gracias a la
proteína GEF Pebble (Prokopenko y cols., 1999; Smallhorn y cols., 2004). Sin
embargo, la activación de Rho1 durante la celularización requiere de una proteína GEF
- 17 -
distinta, DRhoGEF2 (Padash Barmchi y cols., 2005). Se ha propuesto que DRhoGEF2
es capaz de traslocar a Rho1 al polo apical, donde colocaliza con actina y miosina II
(Padash Barmchi y cols., 2005). Rho1 también ha sido vinculada con la endocitosis de
los complejos ligando-receptor de varias proteínas importantes en la diferenciación de
los segmentos embrionarios, tales como Engrailed, Wingless y Hedgehog (Magie y
Parkhurst, 2005). Además, se ha descrito su participación en la formación de las
uniones adherentes basadas en cadherinas (Magie y cols., 2002) y en fenómenos de
adhesión celular y desarrollo de epidermis, donde dirige la localización apical de la
miosina (Bloor y Kiehart, 2002, Dawes-Hoang y cols., 2005). Sin embargo, para
muchos de estos procesos aún se desconocen las proteínas involucradas en el
mecanismo de su regulación.
Durante el cierre dorsal, encontramos un ejemplo donde los tres miembros
principales de la familia están implicados en regular distintos fenómenos (Harden y
cols., 1999). Rho1 es necesaria para la regulación de la constricción de los cables de
actina a través de la activación de miosina (Jacinto y cols., 2002). Embriones que
expresan dominantes negativos de Rac1 o mutantes con pérdida de función de Cdc42
presentan defectos en el cierre dorsal (Harden y cols., 1995; Genova y cols., 2000).
Rac sería responsable de la localización de actina, miosina y α-espectrina. Por su parte
Cdc42 induce filopodios y lamelipodios que serían necesarios en la adhesión de
células a lo largo de la línea media dorsal (Jacinto y cols., 2000). Si bien las tres
GTPasas son requeridas para este proceso, aún no se han identificado las proteínas
con actividad GEF o GAP que las regulan en este contexto (Settleman, 2001).
Ciertamente, las proteínas GEFs podrían otorgarle especificidad a la respuesta
mediada por Rho GTPasas, debido principalmente a dos propiedades que las
- 18 -
diferencian entre sí: motivos estructurales de unión a distintas proteínas y su expresión
y distribución subcelular localizada. En consecuencia, es interesante estudiar a las
proteínas GEF no caracterizadas, determinar sus patrones de expresión y sus
dinámicas de distribución subcelular (Schöck y Perrimon, 2002; Nikolaidou y Barrett,
2004; Settleman, 2001; Dawens-Hoang y cols., 2005). Por ejemplo, recientemente se
ha caracterizado una nueva proteína, GEFmeso, que se expresa solo en el mesodermo
e interactuaría específicamente con Cdc42. Al parecer su función sería necesaria
durante la invaginación del surco ventral, sin embrago, estudios respecto a su
mecanismo de acción son aún preliminares (Blanke y Jäckle, 2006).
4. El gen rhogef3 codifica una proteína putativa GEF.
En Drosophila, 22 genes codifican para proteínas GEFs, de los cuales 4 han
sido funcionalmente caracterizados, de ellos solo dos, DRhoGEF2 y GEFmeso
participarían en la remodelación del epitelio embrionario durante la gastrulación. En la
búsqueda de descubrir nuevos elementos que estén involucrados de la regulación de
la morfogénesis del embrión, en nuestro Laboratorio hemos utilizado un procedimiento
de hibridación sustractiva que ha permitido aislar genes diferencialmente expresados
en la gástrula de Drosophila (González-Agüero y cols., 2005, Zúñiga y cols., 2009).
Entre los genes aislados se encuentran varios genes descritos, tales como stumps,
sog, tailup, homotorax, cubitus interruptus, antennapedia, thickveins, myosin heavychain like, y shibire entre otros, que participan en procesos que ocurren en esta etapa
del desarrollo, entre ellos factores de transcripción y proteínas de unión a actina.
Además se aislaron un número importante de genes de los cuales se desconoce su
- 19 -
función y que el ser detectados mediante esta metodología sugiere una participación
activa durante la morfogénesis temprana del embrión.
Entre estos genes se encuentra el gen CG1225, el cual se encuentra anotado
en BDGP (Berkeley Drosophila Genome Project, http://flybase.org) bajo el nombre de
rhogef3, debido a que producto génico presenta alta identidad con los dominos DH y
PH característicos de proteínas GEF de Rho GTPasas. Además, su secuencia
aminoacídica indica que esta proteína posee un dominio SH3 en el extremo amino
terminal, lo que la diferencia de las otras proteínas GEF descritas en Drosophila.
Experimentos en microarreglos indican que la expresión de rhogef3 es escencialmente
cigótica y dinámica en el transcurso de las primeras etapas del desarrollo embrionario
(Zúñiga y cols., 2009). La expresión temporal del transcrito de rhogef3 es otro de los
atributos que lo distinguen de otros transcritos que codifican proteínas GEF durante el
desarrollo temprano, ya que estos son escencialmente maternos y se distribuyen de
manera ubicua en el desarrollo (Häcker y Perrimon, 1998; Barrett y cols., 1997;
Prokopenko y cols., 2000; Bateman y cols., 2000).
Tanto la información de la expresión del transcrito del gen CG1225, así como la
información contenida en la secuencia aminoacídica deducida le dan atributos
característicos que permiten diferenciar a RhoGEF3 de otras proteínas GEF presentes
en el desarrollo. Estos atributos sugieren que la proteína RhoGEF3 podría participar en
la regulación espacial y temporal de la señalización mediada por GTPasas y por lo
tanto, ser relevante en la regulación de la reorganización del citoesqueleto de actina en
procesos morfogenéticos durante el desarrollo embrionario de Drosophila.
En este trabajo he caracterizado la expresión y estructura del gen rhogef3.
Además, el presente estudio es un aporte en la caracterización de la proteína
- 20 -
RhoGEF3, ya que incluye un análisis de su actividad catalítica, de sus interacciones
con distintas Rho GTPasas, estudios de distribución espacial en embriones y análisis
funcionales in vivo, basados en la observación de fenotipos generados por ganancia y
pérdida de función en un modelo celular.
A continuación declaro, en términos formales la hipótesis de trabajo y los
objetivos que propongo ejecutar para abordar la hipótesis planteada.
Hipótesis.
La función de la proteína RhogEF3 otorga especificidad espacial y temporal a la
respuesta mediada por GTPasas, lo que se traduce en una reorganización del
citoesqueleto de actina durante las etapas tempranas del desarrollo embrionario de
Drosophila.
Objetivo general.
Caracterizar molecular y funcionalmente la proteína codificada por el gen rhogef3.
Objetivos específicos.
1. Determinar la secuencia completa del cDNA de rhogef3 y la expresión espaciotemporal de su transcrito y de su proteína.
2. Determinar in vitro la capacidad de la proteína RhoGEF3 de funcionar como
intercambiador de nucleótidos de Rho GTPasas y de reorganizar el citoesqueleto de
actina.
3. Analizar el papel que cumple RhoGEF3 en estados tempranos del desarrollo, a
través de la generación de mutantes de pérdida y ganancia de función.
- 21 -
Materiales y Métodos.
1. Materiales.
1.1. Cepas de D. melanogaster.
La cepa Cantos S fue utilizada como cepa silvestre.
La cepa 5HA1662, que porta un elemento de inserción en el séptimo intrón del
gen rhogef3 (Ryder y cols., 2004) fue adquirida desde la colección Szeged Drosophila
Stock Centre (Departamento de Genética, Universidad de Szeged, Alemania).
La Cepa UAS-RNAi-RhoGEF3 que porta una construcción inducible de una
horquilla de RNA (hpRNA) que reconoce específicamente el transcrito de rhogef3
(Dietzl y cols., 2007) fue obtenida de la colección Vienna Drosophila RNAi Center
(Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA) y
Research Institute of Molecular Pathology (IMP), de Austria.
Las siguientes cepas fueron obtenidas de la colección Bloomington Drosophila
Stock Center de la Universidad de Indiana, Estados Unidos:
I.
w*; ry506 Sb1 P{Δ2-3}99B/TM6B, Tb1, portadora de la transposasa Δ2-3 en el
tercer cromosoma.
II.
y1 w*; TM3, y+ Ser1/Sb1, porta un cromosoma 3 balanceador que contiene los
marcadores dominantes Stubble (Sb) and Serrate (Ser).
III.
w1118; Df(3L)BSC126/TM6B, Tb1 posee una deleción cromosómica en la región
del gen rhogef3, entre las posiciones citológicas 61B3 y 61C1.
IV.
w1118;
Df(3L)Ly,
sensLy-1/TM6B,
P{Ubi-GFP.S65T}PAD2,
Tb1,
porta
un
cromosoma 3 balanceador que contiene el marcador Tuby (Tb) y expresa GFP,
en todas las células del embrión, bajo el control del promotor del gen ubiquitina.
- 22 -
V.
st1 e1 HemJ4-48/TM6B, P{ase-lacZF:2.0}PK3, Tb1, porta un cromosoma 3
balanceador que contiene el marcador Tuby (Tb) y expresa β-galactosidasa
bajo el control del promotor del gen asense en el sistema nervioso central y
periférico.
VI.
w1118; DrMio/TM3, P{GAL4-twi.G}2.3, P{UAS-2xEGFP}AH2.3, Sb1 Ser1 porta un
cromosoma 3 balanceador que contiene los marcadores Stubble (Sb) y Serrate
(Ser) y expresa GFP bajo el control del sistema GAL4-UAS en el dominio de
expresión del gen twist.
VII.
w*; P{matα4-GAL-VP16}V37, en esta cepa el factor de transcripción GAL4 se
encuentra fusionado al activador viral VP16, y se expresa bajo el control de
promotor de α-tubulina 67C.
VIII.
y1 w*; P{GAL4-nos.NGT}40, en esta cepa la expresión del factor de
transcripción GAL4 en todo el embrión es regulada por el promotor del gen
materno nanos.
IX.
y1
w*;
P{Act5C-GAL4}17bFO1/TM6B,
Tb1 la
expresión
del
factor
de
transcripción GAL4 en todo el embrión es regulada por el promotor del gen
actina 5C.
X.
y1 w*; P{en2.4-GAL4}e22c/SM5, expresa la proteína GAL4 en el dominio de
expresión del gen engrailed.
XI.
y1 w*; D* gl3/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1, la
expresión de la proteína Gal4 está dirigida por el promotor del gen krüppel.
XII.
w*; P{eve.st3-GAL4.S}8, la proteína Gal4 se expresa en la tercera banda del
dominio de expresión del gen even skipped.
- 23 -
XIII.
w1118; DrMio/TM3, P{GAL4-twi.G}2.3, P{UAS-2xEGFP}AH2.3, Sb1 Ser1, la
expresión de la proteína Gal4 es dirigida por el promotor del gen twist.
XIV.
w*; P{GAL4-ey.H}4-8/CyO, la proteína Gal4 se expresa en el disco imaginal de
ojo.
XV.
w1118 P{GawB}BxMS1096, la proteína Gal4 se expresa en el hemisferio posterior
del disco imaginal de ala.
1.2. Cepas de E. coli.
I.
Para el clonamiento de productos de interés se utilizó la cepa DH5-α
(Invitrogen, F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (r k -,
m k +) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1) de Escherichia coli. Esta cepa contiene
un marcador (φ80lacZΔM15) que provee complementación al gen de la βgalactosidasa presente en el vector pGEMT-Easy, permitiendo la identificación
por color de las colonias transformantes positivas.
II.
Cepa BL21 (Stratagene, B F– dcm ompT hsdS(r B – m B –) gal) de Escherichia coli.
Esta cepa fue utilizada para la expresión de proteínas ya que carece de la
proteasa lon y la proteasa de membrana externa ompT, que pueden degradar
proteínas durante su expresión.
1.3. Células de Drosophila.
I.
Las células S2 (Schneider 2) de Drosophila melanogaster derivan de cultivos
primarios de embriones tardíos (Schneider, 1972) y fueron adquiridas a
Invitrogen. Estas células son débilmente adherentes y crecen preferentemente
en suspensión.
- 24 -
II.
Las células S2R+ de Drosophila fueron obtenidas del Drosophila Genomics
Resource Center de la Universidad de Indiana, Estados Unidos. Provienen de
un aislado de células S2, pero a diferencia de éstas, las células S2R+ son
mucho más adherentes, y fueron aisladas, en principio, por su habilidad de
responder al ligando Wnt (Yanagawa y cols., 1998).
1.4. Vectores.
I.
El vector pGEX-Rhogef2 fue donado por el Doctor Jörg Grosshans, de la
Universidad de Heidelberg, Alemania. Este vector de expresión en bacterias
codifica para una proteína de fusión compuesta por la región codificante del
dominio DH y PH de la proteína RhoGEF2 de Drosophila y la región codificante
de la GST (Glutation-S-transferasa, Grosshans y cols., 2005).
II.
Los vectores pCR2.1 Topo (Invitrigen) y pGEMT-Easy (Promega), contienen los
promotores SP6 y T7 flanqueando la región de clonamiento y una secuencia
que codifica para la enzima β-lactamasa que confiere resistencia a Ampicilina.
Estos vectores fueron utilizados para clonar los fragmentos de cDNA
destinados a la síntesis de sondas para hibridaciones in situ y en todos los
procedimientos de sub-clonamiento.
III.
El vector pTRHis2Topo (Invitrogen), es un vector de expresión en bacterias.
Posee un promotor inducible por IPTG que precede a la región de clonamiento
y a continuación una región que codifica para 6 histidinas y un epítope Myc.
Posee una secuencia que codifica para la enzima β-lactamasa que confiere
resistencia a Ampicilina.
- 25 -
IV.
El vector pGEX-6P1 (General Electric HealthCare) es un vector de expresión en
bacterias. Contiene un sitio de múltiple clonamiento en la región C-terminal del
gen GST (Glutation-S-Transferasa), permitiendo crear una proteína de fusión a
GST, cuya expresión es inducible por IPTG.
V.
El vector pMT/V5/His/Topo (Invitrogen) es un vector de expresión en células de
Drosophila. Posee el promotor del gen metalotioneina, inducible por Cobre, y
produce una proteína recombinante con una cola de histidinas y un epítope V5.
Posee un origen de replicación en bacterias y una secuencia que codifica para
la enzima β-lactamasa que confiere resistencia a Ampicilina.
VI.
El vector pUAST (Drosophila Genomics Resource Center) es un vector de
expresión en Drosophila. Posee un sitio de múltiple clonamiento, un promotor
del gen hsp70 y repeticiones de la secuencia UAS reconocida por el factor de
transcripción Gal4. Además posee una señal de poliadenilación, un origen de
replicación en bacteria y una secuencia que codifica para la βenzima
-
lactamasa que confiere resistencia a Ampicilina.
VII.
El vector UAST-Myc es un derivado del vector pUAST que porta la secuencia
de 6 histidinas y la región que codifica para el epítope Myc del vector
pTRHis2Topo (Invitrogen) y que fue desarrollado en nuestro laboratorio.
VIII.
El vector pUASpEGFPc1 es un derivado del Vector pUASP y que codifica para
una proteína Fluorescente verde mejorada y se expresa en células de
Drosophila (Megraw y cols., 2002). Posee un origen de replicación en bacterias
y una secuencia que codifica para la enzima β-lactamasa.
IX.
El vector pMT-Gal4 (Drosophila Genomics Resource Center) es un vector de
expresión en células de Drosophila y codifica para la proteína Gal4 y pose un
- 26 -
promotor del gen que codifica para metalotioneina y es inducible por CuSO4.
Posee un origen de replicación en bacterias y una secuencia que codifica para
la enzima β-lactamasa.
X.
pGIBS-LYS, Adquirido en American Type Culture Collection (ATCC, cat.
#87482,). Derivado del vector pBluescript II KS+, posee un marcador de
selección ampR y un origen de replicación pMB1, f1. El gen posee en su
extremo una secuencia de poliA agregada artificialmente y un sitio de unión
para la RNA polimerasa T3. Fue utilizado en la síntesis in vitro del dsRNA de
Lys.
1.5. Partidores.
cloninamiento RhoGEF3
DmRhoGEF3-s8
CAACATGGTTACATATCACTTTCGGTCA
DmRhoGEF-a3
CGCTGAGGAGCTGTCCGTTG
DmRhoGEF3-s6
ACCATGGCACCCAGTGTGGACTTTGTT
DmRhoGEF3-s3
AGATCTACCATGGTTACATATCACTTTCGGTCA
DmRhoGEF3-s5
CCCAGTGTGGACTTTGTTGC
DmRhoGEF3-a10
TTGGTCTGAGTAATCGCCCG
Sintesis de dsRNA
T7
TAATACGACTCACTATAGGGCG
SP6
ATTTAGGTGACACTATAGAATACTC
Cloninamiento de GTPasas
CDC42-s
ATGCAAACCATCAAGTGCGTG
CDC42-as
TAAGAATTTGCACTTCCTTTTCTT
- 27 -
Rho1-s
ATGACGACGATTCGCAAGAAATT
Rho1-as
GGATCCAAGGCATCTGGTCTTCTTCCT
Rac1-s
ATGCAGGCGATCAAGTGCGT
Rac1-as
GGATCCCGCACTTGCGCTTGGACTTG
RhoGEF2-s1
GAAGACGACGTGAACGAGGC
RhoGEF2-as1
TGGATCACTAATACTCGTGTCAT
iPCR
P-31
CGACGGGACCACCTTATGTTATTTCATCATG
pWiz-F1
TAGAGCCAGATATGCGAGCAC
pWiz-R1
GTCCGTGGGGTTTGAATTAAC
qPCR
DmRhoGEF3-RT-s
CATACCCTCGAGCCCTGA
DmRhoGEF3-RT-as
ACCGTCTGTATCGTTCCCT
actina-s
CACCGGTATCGTTCTGGACT
actina-as
CTCGTAGGACTTCTCCAACG
pLys-s_qPCR
GATGTTCTTCTTCGGATCACGC
pLys-as_qPCR
CGATATGGCAATGGACACCCAG
PCR
pLys-s_PCR
CGCTGAGGAAGAGGGAC
pLys-as_PCR
CGTAACGGGAAGCATTT
Determinación de inicio de la transcripción
Oligo RNA
CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUAAGGAGUAGAAA
Oligo dT primer
GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24
- 28 -
GeneRace 5′ Primer
CGACTGGAGCACGAGGACACTGA
GeneRace 5′ Nested Primer GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA
DmRhoGEF3-a
CGGTTGTACTTCGTCTTACGGCG
Análisis de deleciones
DmCG6234_Prom-s
GTAACTAACCCTAACCAGACA
DmCG6234_Prom-as
GCGGCTCTTAGAAATACTGG
SP1
ACACAACCTTTCCTCTCAACAA
SPEP1
CGACACTCAGAATACTATTCC
DmRhoGEF3-a2
CGCTGAGGAGCTGTCCGTTG
2. Métodos Generales.
2.1. Colecta de embriones.
Los embriones fueron colectados sobre placas conteniendo agar al 2% en jugo
de manzana, las placas fueron cubiertas con una capa de ácido acético y levadura
para estimular la oviposición. Las moscas fueron incubadas a 22ºC excepto los cruces
con cepas portadoras de Gal4 las cuales fueron incubadas a 28ºC.
Para la extracciones de RNA, los embriones fueron colectados en solución
Ringer (KCl 182 mM, NaCl 46 mM, CaCl2 3 mM, Tris-HCl pH 7.2 10 mM), preparada
con agua libre de nucleasas conteniendo y conteniendo Tritón 0,1% (Ringer/Tritón).
Los embriones fueron descorionizados con Hipoclorito de Sodio 50% en Ringer/Tritón
por 5 min y lavados en Ringer/Tritón. Los embriones fueron congelados en Nitrógeno
líquido y almacenados a -80ºC hasta su utilización.
- 29 -
Para la extracción de proteínas totales, embriones de todos los estados fueron
colectados en PBS-Tritón 0.1%, descorionizados con hipoclorito de sodio 50% en
PBTritón por 5 min, lavados 3 veces en PBS y congelados a -20ºC hasta su utilización.
2.2. Electroforesis de DNA y RNA.
Todas las electroforesis de DNA se llevaron a cabo en geles de Agarosa al 1%
en solución TAE (Tris 40 mM, Ácido Acético 1.1%, EDTA 2 mM) conteniendo una
concentración final de 0,5 µg/ml de Bromuro de Etidio (EtBr). Para las mediciones de
tamaño y masa fue utilizado el estándar 1 Kb Gene Ruler (Fermentas). Para las
electroforesis de RNA, se utilizaron geles desnaturantes de Agarosa/Formaldehído
37%. A cada muestra (10 µl en agua libre de nucleasas) se agregó 9 µl de formamida,
3 µl de Formaldehído 37%, 2 µl de MOPS 10X y 1 µl de EtBr 10%. Las muestras fueron
desnaturadas a 70ºC por 15 min, enfriadas en hielo por 5 min y se agregó 2 µL de
solución de carga (Ambion). El estándar de peso molecular RiboRuler (Fermentas) se
preparó igual que las muestras, a partir de 2 µL del stock. La electroforesis se llevó a
cabo en tampón MOPS 1X a 80 V por 40 minutos.
2.3. Análisis densitométricos.
Para la estimación de la masa de ácidos nucléicos obtenida en las reacciones
de PCR, síntesis in vitro y generación de sondas, se utilizó el programa Kodak 1D para
cuantificar la densidad de pixeles observada en geles de Agarosa. Para ello cada
banda de los estándares de tamaño, cuya masa es conocida, fue cuantificada para
obtener una curva estándar de masa vs intensidad. El mismo procedimiento de
- 30 -
cuantificación fue aplicado a las bandas de interés observadas en las electroforesis y
mediante un análisis de regresión se estimó la masa del DNA o RNA de interés.
2.4. Electroforesis de proteínas (SDS-PAGE).
Muestras de proteínas fueron fraccionadas en geles de Acrilamida al 10-12% y
SDS (Dodecil Sulfato de Sodio) al 0.01 % en cámaras verticales de electroforesis
MiniProtean II (BioRad) de acuerdo con protocolos estándares (Harlow y Lane, 1999).
Los geles fueron teñidos en una solución de Azul de Coomasie al 0.1 % p/v en Ácido
Acético 10% y Metanol 50% en agua destilada. Los geles fueron desteñidos en una
solución de Ácido Acético 10% y Metanol 10% en agua destilada, y fueron
fotografiados usando el programa Kodak 1D.
2.5. Preparación de muestras para SDS-PAGE.
Las muestras de proteínas bacterianas fueron disueltas en solución de carga
(SDS 6%, Glicerol 10%, Tris 192 mM pH 6.8, Azul de Bromofenol 0,04% y βMercaptoetanol 20%), e incubadas a 100ºC por 10 min.
Para la preparación de proteínas embrionarias, 200 µL de embriones
descorionizados y lavados en PBS fueron homogeneizados en 500 µL de solución
RIPA (Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 105 mM, NP-40 1%, SDS 0.2 %, EDTA 2 mM)
conteniendo inhibidores de proteasas Aprotinina (10 µg/mL, Sigma), Leupeptina (10
µg/mL, Sigma), Pepstatina (5 µg/mL, Sigma) y PMSF (100 µg/mL, Calbiochem). El
homogeneizado fue incubado en hielo por 10 min y centrifugado a 14000 x g a 4 ºC por
20 min. Finalmente el sobrenadante fue cuantificado, mezclado con tampón de carga e
incubado a 100 ºC por 10 min.
- 31 -
2.6. Western Blots.
Geles de SDS-PAGE fueron electrotransferidos a membranas de PVDF
(Polivinilideno Fluoruro, Millipore) por 12 horas a 20 volts o 1 hora a 100 volts a 4ºC en
módulos de electrotransferencia MiniProtean II (BioRad). La presencia de proteínas en
la membrana de PVDF fue verificada por tinción con Rojo Ponceau al 1% (Sigma). Las
membranas fueron bloqueadas en leche descremada al 5% en solución de lavado
(NaCl 100 mM, Tris pH 7.4 20 mM, Tween 20 0.1%) por 1 h y los anticuerpos fueron
diluidos en BSA al 5% en esta misma solución. En general, las membranas fueron
incubadas con el anticuerpo primario por 12 h a 4ºC con agitación suave y con el
anticuerpo secundario acoplado a Peroxidasa por 1 h a temperatura ambiente con
agitación suave. Ambos anticuerpos fueron lavados 4 veces por 5 min en solución de
lavado. La unión del anticuerpo a la membrana fue detectada utilizando el SuperSignal
West Pico Chemiluminiscent Substrate (Thermo Scientific). Las membranas fueron
expuestas a films radiográficos (Kodak) reveladas y fijadas. Las imágenes fueron
digitalizadas con un escáner Hewlett-Packard.
2.7. Cuantificación de proteínas.
Las proteínas fueron cuantificadas utilizando el protocolo de Bradford (1976) y
una curva estándar de albúmina sérica bovina (BSA).
2.8. Transformación bacteriana.
Para la transformación química, 30 µL de células competentes fueron
transformadas con 2 µL de reacciones de ligación o 50 ng de DNA plasmidial e
incubadas a 4ºC por 30 min, luego de los cuales fueron incubadas 37 ºC por 45 s y
- 32 -
sumergidas inmediatamente en hielo por 2 min. Se agregó 1 mL de medio LB y las
células fueron incubadas a 37ºC con agitación vigorosa por una hora y luego fueron
sembradas sobre placas de medio LB Agar complementado con Ampicilina a 50 µg/mL.
En el caso de la transformación eléctrica, 30 µL de células electrocompetentes fueron
incubadas con 50 ng de DNA plasmidial en hielo por 2 minutos y transformadas
mediante un shock de 2,5 voltios por 5 ms. Se agregó 1 mL de medio LB y las
bacterias fueron incubadas a 37 ºC con agitación vigorosa luego de los cuales fueron
sembradas sobre placas de medio LB Agar complementado con Ampicilina a 50 µg/mL.
2.9. Purificación de ácidos nucléicos.
Los ácidos nucléicos fueron separados de las proteínas mediante extracción
con un volumen de Fenol:Cloroformo:Alcohol Isoamílico en una proporción 25:24:1. La
mezcla fue agitada vigorosamente durante 20 segundos y centrifugada a 13000 x g por
1 minuto. La fase acuosa resultante fue tratada de la siguiente manera: en el caso de
DNA, se mezcló con 1/10 de volumen de Acetato de Sodio 3M pH 5.2 y 1 volumen de
Isopropanol, y se incubó a -20ºC por 12 horas. Luego la muestra fue centrifugada a
13000 x g por 1 hora a 4ºC, el sobrenadante fue descartado y el precipitado fue lavado
con 500 µL de Etanol 70%, centrifugado a 13000 x g por 1 hora a 4ºC. Finalmente, el
sobrenadante fue eliminado, el precipitado fue secado a temperatura ambiente y
resuspendido en agua libre de nucleasas.
En el caso del RNA, luego de la extracción fenólica la fase acuosa fue mezclada
con 1 volumen de Cloruro de Litio 8 M, Etanol absoluto y Glicógeno (5 ug/mL) y se
procedió igual que para el DNA.
- 33 -
2.10. Extracción de DNA Plasmidial.
I.
Miniprep: Tres mL de bacterias en medio LB crecidas 16 horas a 37 ºC fueron
centrifugados, el sobrenadante fue descartado y las células fueron resuspendidas
en 200 µL de solución 1 (Tris 50 mM, EDTA 10 mM), lisadas agregando 200 µL
de solución 2 (SDS 1%, NaOH 0.2 M) y neutralizadas con 200 µL de solución 3
(Acetato de K 3M, Ac Acético 11.5 % ) y luego fueron centrifugadas a 13000 x g
por 15 minutos. El sobrenadante fue rescatado y mezclado vigorosamente con
600 µL de Fenol:Cloroformo:Alcohol Isoamílico en una proporción 25:24:1,
centrifugado a 13000 x g por 10 minutos y la fase acuosa rescatada fue mezclada
vigorosamente con 420 µL de Isopropanol y centrifugado a 13000 x g por 10
minutos. El precipitado fue lavado con 1 mL de Etanol al 70% y centrifugado a
13000 x g por 10 minutos. El Etanol fue descartado y el DNA fue resuspendido en
30 µL de agua. El RNA fue degradado adicionando 1 µL de RNAsa A 10 mg/mL e
incubado a 37ºC por 30 minutos. Las muestras fueron fraccionadas mediante
electroforesis en geles de agarosa y cuantificadas por espectrofotometría a 260
nm, obteniéndose en promedio una concentración de 5 µg/µL.
II.
Midiprep: La extracción de DNA plasmidial utilizado para la síntesis de sondas
de RNA, transfección de células de Drosophila y transformación de células
bacterianas se realizó utilizando el sistema Plasmid Midi kit (QIAGEN) según
instrucciones del fabricante, obteniéndose 300 µL de DNA a una concentración
de 1 µg/µL.
- 34 -
2.11. Digestión del DNA.
Las digestiones de DNA plasmidial se realizaron en un volumen final de 10-20
µL utilizando 1 µg de DNA y 2.5-10 U de enzima de restricción incubando 1 hora a
37ºC.
2.12. Extracción de DNA desde gel.
Productos de PCR para secuenciar o fragmentos de DNA digeridos con
enzimas de restricción fueron fraccionados en geles de Agarosa mediante
electroforesis y la o las bandas de interés fueron cortadas y el DNA fue recuperado
utilizando el kit SV Gel & PCR Clean Up System (Promega), según instrucciones del
fabricante.
2.13. Desfosforilación de DNA.
Plasmidos linearizados fueron desfosforilados para evitar la re-circularización
mediante utilizando la enzima CIAP (Calf Intestine Alcaline Phosphatase, Fermentas).
En las reacciones de desfosforilación se utilizó 1 U de enzima por cada picomol de
DNA directamente en la reacción de digestión y la mezcla fue incubada por 30 min a
37ºC. El DNA tratado fue sometido a extracción Fenol:Cloroformo, precipitado y
resuspendido en agua libre de nucleasas. El DNA fue cuantificado por densitometría y
almacenado a -20ºC hasta su utilización.
- 35 -
2.14. Extraccion de DNA genómico.
i.
A partir de 25 moscas: Las moscas fueron homogeneizadas en 250 µL de
solución de lisis (0,1M Tris-HCL, pH 9,0, 0,1M EDTA y 1% SDS) e incubadas a
54ºC por 30 min en presencia de 0,1 mg/mL de Proteinasa K (Roche). Se agregó
350 µL de Acetato de Potasio 3 M, pH 5.2, la mezcla fue incubada a 4ºC por 30
min y centrifugada a 14.000 x g a 4ºC por 15 min. El sobrenadante fue mezclado
con 1 volumen de Fenol:Cloroformo en proporción 1:1, agitado vigorosamente y
centrifugado 1 min. Posteriormente, el DNA en la fase acuosa fue precipitado con
Isopropanol y lavado con etanol 70%, secado y resuspendido en 100 µL de agua
libre de nucleasas. Finalmente el RNA fue digerido con 0,1 mg/mL de RNAsa A a
37ºC por 30 min. La calidad del DNA genómico fue evaluada por electroforesis en
gel de agarosa y mediante amplificación por PCR de la región promotora del gen
CG6234 utilizando los partidores DmCG6234_Prom-s y DmCG6234_Prom-as.
ii.
A partir de una mosca: Una mosca fue homogeneizada en 500 µL de solución
de lisis (10 mM Tris-HCl pH 8,2, 2mM EDTA, 0,2% Tritón, 100 µg/mL de
Proteinasa K) e incubada a 56ºC por 30 min y luego a 95ºC por 10 min para
inactivar la Proteinasa K. Posteriormente, la muestra fue centrifugada a 14.000 x
g a 4ºC por 15 min y el sobrenadante fue almacenado a -20ºC hasta su
utilización. La calidad del DNA genómico fue evaluada mediante amplificación por
PCR utilizando los partidores mencionados en i).
- 36 -
2.15. Extracción de RNA total.
El RNA total fue extraído desde embriones homogeneizados en 1 mL del
reactivo RNAwiz (Ambion), 0,2 volúmenes de Cloroformo fueron agregados a esta
mezcla, sometiéndola a agitación e incubación a temperatura ambiente por 10 min y
centrifugación a 13.000 x g por 15 min a 4ºC, el RNA rescatado desde la fase acuosa
fue precipitado con Isopropanol mediante centrifugación a 14.000 x g a 4ºC por 15 min.
El precipitado fue lavado con Etanol 75% y centrifugado a 14.000 x g a 4ºC por 5 min.
Finalmente el RNA total fue resuspendido en 30 µL de agua libre de nucleasas. Se
obtuvo un rendimiento promedio de 1 µg/µL de RNA. La integridad del RNA fue
verificada por electroforesis en gel de Agarosa. La calidad se evaluó mediante la
síntesis de cDNA y la amplificación por PCR del transcrito de actina a partir de este
cDNA.
2.16. Síntesis de cDNA.
El RNA fue usado como sustrato para la síntesis de cDNA de hebra simple
mediante transcripción reversa en una reacción estándar, utilizando 200 U de la
enzima Superscript II RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) y 0,5 μg de partidor
oligo dT (15 nucleótidos). La calidad del cDNA resultante fue verificada mediante su
utilización como sustrato para la amplificación del transcrito de actina utilizando los
partidores actina-s y actina-as. Los cDNAs utilizados en los ensayos de qPCR fueron
preparados según se describe en el punto anterior pero además se hizo la siguiente
modificación: se agregó 0,2 µg de mRNA spike poliadenilado, preparado como se
indica en la sección 2.19. La presencia del cDNA spike fue verificada mediante
amplificación por PCR utilizando los partidores pLys-s_PCR y pLys-as_PCR
- 37 -
2.17. PCR.
Las reacciones de amplificación mediante PCR fueron realizadas en un
termociclador PTC-100 (MJ Research), utilizando el siguiente protocolo: los sustratos
de la reacción de PCR fueron 50 ng de DNA plasmidial ó 100 ng de cDNA, tampón 1X
(Invitrogen), MgCl 2 1,5 mM, dNTPs 0,2 mM y 2,5 U de Taq DNA polimerasa
(Invitrogen) en un volumen de 25 µl. En general se utilizó un programa de 35 ciclos de:
desnaturalización 30 segundos a 94 ºC, alineamiento 30 segundos a la temperatura
acorde a cada pareja de partidores y extensión de 2 minutos a 72 ºC. En general, se se
utilizó la enzima Taq DNA Polimerase High Fidelity (Fermentas), excepto en las
reacciones destinadas a la búsqueda de deleciones cromosómicas del gen rhogef3, en
las cuales se utilizó la enzima Go Taq Green Master Mix (Promega) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
2.18. PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR).
Para las reacciones de amplificación mediante qPCR se utilizó el sistema
Platinum SYBR Green qPCR SuperMix (Invitrogen) en un equipo LightCycler® 1.5
Instrument (Roche). Cada reacción fue realizada mezclando 50 ng de cDNA, 0,5 uM de
cada partidor, 0,5 μg de BSA y 5 μL de Platinum SYBR Green, en un volumen final de
10 μL. EL programa de amplificación consistió en una etapa de activación a 95 °C por
10 minutos, seguida de 35 ciclos de amplificación que consistían en 2 segundos de
desnaturación a 95 °C, 10 segundos de alineamiento a la temperatura adecuada para
cada pareja de partidores y una extensión de 15 segundos a 72 °C. Los productos
amplificados fueron examinados mediante electroforesis para descartar la presencia de
amplificaciones inespecíficas. Los niveles de expresión relativa fueron calculados a
- 38 -
partir de los crossing points (Cp) y de los valores de cycle-threshold (Ct) en un nivel
constante de fluorescencia, y utilizando el modelo de cuantificación relativa
∆∆Cp
descrito por Livak y Schmittgen (2001). Brevemente, a partir de los valores de Cp de la
muestra problema y la referencia, ambas normalizadas por los valores de Cp obtenidos
para el spike lisina, se obtienen las variaciones relativas entre las condiciones
comparadas. Para la síntesis de mRNA spike, se empleo el protocolo de síntesis de
sondas de cRNA, descrito en 3.1.3., utilizando la RNA polimerasa T3 (Promega) y DNA
el vector pGIBS-LYS, descrito en 1.4.
2.19. Tinción de X-gal en embriones.
Los embriones fueron colectados en solución DS (Drosophila Saline, 0,7%
NaCl, 0,03% Tritón), descorionizados en Hipoclorito de Sodio al 30% en DS por 90 s,
lavados en DS y en agua destilada. Los embriones fueron fijados en una mezcla de
solución de fijación (0,1M Fosfato de Na pH 7,5, 4% Formaldehído) y Heptano en una
proporción 1:1, incubados 20 min a temperatura ambiente con agitación suave. Los
embriones fueron lavados una vez con agua destilada y el Heptano residual fue
eliminado por evaporación. Finalmente, los embriones fueron rehidratados con
sucesivos lavados con DS e incubados en solución de tinció (10mM Fosfato de Na pH
7,2, 150mM NaCl, 1mM MgCl 2 , 3mM K 4 [Fe(CN) 6 ], 3mM K 3 [Fe(CN) 6 ], 0,3% Tritón X100) conteniendo 20 µL de X-GAL al 10% en Dimetilformamida. Los embriones fueron
incubados a 37 ºC entre 1 y 12 h hasta observar la tinción y luego fueron lavados y
desvitelinizados con una mezcla de Heptano: Metanol (1:1). Finalmente, los embriones
fueron lavados en etanol 100% y guardados a -20ºC hasta su utilización en ensayos de
Inmunofluorescencias.
- 39 -
2.20. Inmunofluorescencias de embriones.
Embriones de todos los estados fueron colectados en Tritón 0,1% en PBS,
descorionizados con Hipoclorito de Sodio 50% en PBTritón por 5 minutos, lavados 3
veces en PBTritón, transferidos a una solución PEM (Pipes 0.1M pH 1.6, EGTA 1mM,
MgCl2 2mM):Heptano 1:1 y mezclados por inversión durante 30 s. Luego fue agregado
un 1/3 de volumen de Formaldehído 37% y los embriones fueron incubados por 15 min
con agitación suave. La fase acuosa fue descartada quedando los embriones en la
interfase y se adicionó un volumen de Metanol-EGTA 50 mM, los embriones fueron
incubados 10 min con agitación suave para remover la membrana vitelina. Los
embriones desvitelinizados fueron lavados 3 veces con Metanol-EGTA y guardados a 20ºC hasta su utilización. Los embriones colectados fueron rehidratados en sucesivos
lavados en Tritón 0.1% en PBS (PBTritón) 2 veces por 5 min, y una vez por 30 min.
Los embriones fueron bloqueados con BSA al 5% en PBTritón durante 1 h a
temperatura ambiente e incubados con los anticuerpos primarios en solución de
bloqueo por 2 h a temperatura ambiente o 16 h a 4ºC, luego los embriones fueron
lavados 4 veces con PBTritón por 15 min cada vez. Los embriones fueron incubados
con los anticuerpos secundarios en solución de bloqueo durante 2 horas. Finalmente
los embriones fueron lavados en PBTritón 4 veces por 15
minutos cada uno y
montados en Mowiol-Dabco o Glicerol al 70% en PBS. Las diluciones de anticuerpos
primarios y secundarios se indican en cada figura.
2.21. Inmunofluorescencias en células.
Las células sembradas en cubreobjetos fueron lavadas tres veces con PBS,
fijadas en Paraformaldehído al 4% por 10 minutos, lavadas tres veces en PBS y
- 40 -
permeabilizadas en una solución de 1mg/mL de saponina (Sigma) en PBS. Las células
fueron bloqueadas con una solución BSA al 5% y 1 mg/mL de saponina en PBS por 30
minutos a 37ºC. Las células fueron incubadas con los anticuerpos primarios en esta
solución de bloqueo por 45 minutos a 37ºC y las células fueron lavadas tres veces en 1
mg/mL de saponina en PBS. Las células fueron incubadas con los anticuerpos
secundarios y sondas en solución de bloqueo por 45 min a 37 °C. Las células fueron
montadas en Dabco-Mowiol. Las diluciones de anticuerpos primarios, secundarios y
sondas se indican en cada figura.
2.22. Inmunofluorescencias en glándulas salivales de larvas.
Las larvas fueron abiertas por la parte media ventral y las glándulas expuestas
fueron retiradas y lavadas en PBS y fijadas en paraformaldehido al 4% en PBS por 1
hora. Luego fueron lavadas 3 veces por 15 minutos en PBS y adheridas a vidrios
tratados con Fro-Tissuer (Electron Microscopy Science) por 24 horas. Las glándulas
fueron rehidratadas con PBS, permeabilizadas con Tritón 0.1 % en PBS e incubadas
con los anticuerpos y Faloidina-Alexa-546 (Molecular Probes) en PBST BSA 0.5% por
2 h. Las diluciones de anticuerpos primarios, secundarios y sondas se indican en cada
figura.
2.23. Adquisición de imágenes.
Las preparaciones de Inmunofluorescencias de células y embriones fueron
examinadas en el Microscopio Confocal Zeiss LSM 510 Meta, las imágenes fueron
adquiridas con el software LSM Examiner (Zeiss) y tratadas con Adobe Photoshop CS.
- 41 -
Las preparaciones de hibridaciones in situ fueron examinadas en un
microscopio Carl Zeiss Axiovert 25. Los embriones fueron fotografiados con una
cámara digital Sony CyberShot DSC-S75.
3. Métodos particulares por objetivos.
3.1. Objetivo 1.
3.1.1. Análisis Bioinformáticos.
Las secuencias aminoacídicas predichas de las proteínas de Drosophila se
obtuvieron desde la base de datos de Berkeley Drosophila Genome Project (BDGP,
http://flybase.org). Las secuencias aminoacídicas de otras proteínas fueron obtenidas
desde bases de datos de National Center for Biotechnology Information (NCBI,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Los alineamientos contra el genoma de Drosophila se realizaron utilizando el
algoritmo BLASTN y BLASTP contra las bases de datos de nucleótidos (genes
anotados) y proteínas.
Para las búsquedas de dominios proteicos se utilizaron los algoritmos Interpro
Scan (http://www.ebi.ac.uk/interpro), SMART (http://smart.embl-heidelberg.de),
y
ScanProsite (http://www.expasy.ch/tools/scanprosite).
Los alineamientos de secuencias de proteínas se realizaron con el algoritmo
ClustalW de la aplicación Bioedit v 7.0.9.
3.1.2. Identificación del sitio de inicio de transcripción de rhogef3.
Para identificar el sitio de inicio de la transcripción se utilizó el kit GeneRacer
(Invitrogen) que se basa en la tecnología RLM-RACE (RNA Ligase-Mediated Rapid
- 42 -
Amplification of 5´ and 3´ cDNA Ends, Maruyama y Sugano, 1994; Schaefer, 1995;
Volloch y cols., 1994). Brevemente, 1 µg de RNA total de embriones de todos los
estados fue tratado con 10 U de CAIP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, Invitrogen)
e incubado a 50ºC por 1 hora, para desfosforilar los transcritos truncos, luego el RNA
fue purificado por precipitación y resuspendido en 7 µL de agua libre de nucleasas. A
continuación el RNA fue incubado durante 1 hora a 37ºC con 0,5 U de la enzima TAP
(Tobacco Acid Pyrophosphatase, Invitrogen) para remover la 7-metilguanosina. El RNA
fue purificado por precipitación y resuspendido en 7 µL de agua libre de nucleasas.
Esto procedimeinto deja solo aquellos transcritos que poseían la 7-metilguanosina con
fosfato disponible para la subsiguiente ligación de un oligo de RNA (ver lista de
partidores), realizada incubando el RNA tratado con 5 U de T4 RNA ligasa y 10 mM de
ATP durante 1 hora a 37 ºC. El RNA fue purificado por precipitación y resuspendido en
10 µL de agua libre de nucleasas. El RNA tratado fue utilizado para la síntesis de cDNA
mediante la enzima SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) y 50 µM de Oligo
dT primer. Este cDNA se utilizó como sustrato en una reacción de PCR con la enzima
High FIdelity Taq Polimerasa (Fermentas), el partidor específico DmRhoGEF3-a (10
µM) y el partidor GeneRace′ Primer
5
(10 µM), que reconoce específicamente la
secuencia del Oligo de RNA, generando
un solo producto de amplificación. Este
producto fue re-amplificado utilizando el mismo partidor específico de rhogef3 y el
partidor GeneRace 5′ Nested Primer (10 µM) que reconoce una secuencia distinta
dentro del oligo de RNA. Este producto fue purificado, clonado en el vector pCR 2.1
Topo (Invitrogen) y secuenciado.
- 43 -
3.1.3. Generación de sondas de cRNA para hibridaciones in situ.
La síntesis de las sondas se realizó a partir de 1 µg de DNA plasmidial
linearizado utilizando el kit Riboprobe In vitro Transcription System (Promega), con la
RNA polimerasa adecuada para iniciar transcripción desde los promotores T7 o SP6
(Promega) y 2 µL de una mezcla de nucleótidos mas rUTP acoplado a Digoxigenina
(DIG RNA labbeling mix, Roche). La reacción fue incubada por 2 h a 37 °C y luego el
RNA fue purificado como se describe en 2.9. El precipitado resultante fue resuspendido
en 25 µL de H 2 O libre de nucleasas. La integridad de los RNAs sintetizados fue
verificada mediante electroforesis en geles desnaturantes de Agarosa y los RNAs
fueron cuantificados por densitometría. Los RNAs fueron almacenados a -80 °C hasta
su utilización.
3.1.4. Hibridaciones in situ.
Embriones de todos los estados fueron colectados en Tritón 0,05% en PBS
(PBTritón), descorionizados con hipoclorito de sodio 50% en PBTritón por 5 minutos,
lavados 3 veces en PBTritón, fijados en una solución 2:1 Heptano: Paraformaldehído
4% en PBS (PP) e incubados 15 min con agitación. Posteriormente, esta solución fue
eliminada, reemplazada con una solución Heptano:metanol (1:1) y los embriones
fueron agitados vigorosamente por 1 min. Finalmente, los embriones desvitelinizados
que caen al fondo del recipiente fueron lavados 3 veces con metanol y luego en tres
soluciones con diferente proporciones (7:3, 1:1 y 3:7) de EGTA al 10% en Metanol
(ME) y PP por 5 min cada vez. Los embriones fueron incubados en PP por 20 minutos
y lavados con PBS. En este punto los embriones fueron guardados deshidratándolos
- 44 -
en sucesivos lavados con Etanol al 30, 50 y 70% en agua libre de nucleasas y
almacenados a -20°C hasta su utilización.
Las hibridaciones in situ fueron realizadas de acuerdo con el protocolo descrito
por Zúñiga y cols (2009).
3.1.5. Generación de anticuerpo α-RhoGEF3.
I.
Generación de proteína recombinante: Utilizando como sustrato cDNA de
embriones, y los partidores DmRhoGEF3-s3 y DmRhoGEF3-a3, se amplificó
mediante PCR un fragmento que contiene la secuencia codificante completa
del gen rhogef3, utilizando. El producto fue ligado al vector inducible pTRcHis
Topo (Invitrogen) para producir una proteína de fusión que contiene un epítope
Myc, para su reconocimiento en inmunoensayos y una cola de 6 histidinas, que
permite su purificación desde columnas de afinidad. Este vector fue utilizado
para transformar células quimiocompetentes E. coli DH5α. Finalmente fue
seleccionado un clon con la orientación correcta mediante digestión con la
enzima de restricción HindIII y el DNA plasmidial fue purificado y secuenciado.
Para obtener el péptido inmunogénico, este clon fue digerido con la enzima
SacI, la cual libera la región que codifica el dominio SH3 y los dominios DH y
PH. La banda de interés del DNA plasmidial digerido fue purificada desde gel y
religada. Este vector recircularizado fue utilizado para transformar células E. coli
DH5α, purificado y secuenciado. Este vector produce una prote
ína de fusión
que contiene solo las regiones amino y carboxilo terminales de RhoGEF3 y
carece de los dominios SH3, DH y PH, presentando una muy
similitud de
secuencia con cualquier proteína anotada de Drosophila.
- 45 -
II.
Expresión y purificación: Para la purificación de proteína recombinante, se
creció 1 L de cultivo del clon seleccionado en el paso anterior a 37ºC con
agitación hasta alcanzar una densidad óptica de 0.6 medida a 600 nm,
momento en el cual fue agregado IPTG a una concentración final de 1 mM, y el
cultivo fue crecido por 5 h. Las bacterias fueron colectadas por centrifugación,
resuspendidas en 10 mL de solución de lisis (6 M Cloruro de Guanidinio, 20 mM
fosfato de sodio, pH 7.8, 500 mM NaCl, Triton X-100
1%), lisadas por
sonicación y criofractura, incubadas con DNAsa I, RNAsa A (10 µg/mL) e
inhibidores de proteasas Aprotinina (10 µg/mL, Sigma), Leupeptina (10 µg/mL,
Sigma), Pepstatina (5 µg/mL, Sigma) y PMSF (100 µg/mL, Calbiochem), por 30
min a 4ºC con agitación. Las bacterias lisadas fueron centrifugadas y el
sobrenadante fue incubado con resina Ni-NTA Agarosa (Invitrogen) durante 2 h
a 4ºC con agitación suave. La resina fue lavada con solución desnaturante de
lavado (8 M Urea, 20 mM fosfato de sodio, pH 7.8, 500 mM NaCl), y la proteína
fue eluida con 1 mL de una solución8 M Urea, 20 mM fosfato de sodio, pH 4.0,
500 mM NaCl. La expresión y purificación de la proteína fue verificada por SDSPAGE y Western Blot.
III.
Inyecciones en conejo: La proteína recombinante purificada fue inyectada en
conejo según el protocolo descrito por Kundsen (1985). Brevemente, fracciones
de proteína purificada fueron electrotransferidas a membranas de Nitrocelulosa
y teñidas con Rojo Ponceau (Sigma), la banda de interés fue cortada, disuelta
en 0.5 mL de DMSO (Sigma) e inyectada en el conejo. Se realizaron 5
inoculaciones cada 15 días. Antes de la inyección se recuperaron 5 mL de
- 46 -
suero preinmune. Luego de la quinta inyección, el conejo fue sangrado para
obtener 40 mL de suero.
IV.
Purificación del anticuerpo por inmunoadsorción: Un mL de suero fue
incubado por 16 h a 4ºC con fragmentos
contenían la
de membranas de PVDF que
proteína recombinante RhoGEF3-GST Luego las membranas
fueron lavadas en PBS 3 veces por 5 minutos cada uno, el anticuerpo unido a
las membranas fue liberado mediante incubación de
las membranas con
Glicina 0.1M pH 2,8 por 1 min, y rápidamente neutralizado con 0,1 volumen de
Tris 1 M pH 8,0.
3.2. Objetivo 2.
3.2.1. Cultivo de células de Drosophila.
Las células S2 y S2R+ fueron cultivadas a 25º C sin CO 2 en placas de 60 mm
en 4 mL de medio Schneider (Gibco) suplementado con Suero Fetal de Bovino (SBF,
inactivado por calor), al 10%, 200 U/mL de Penicilina (Gibco) y 200 µg/mL de
estreptomicina (Gibco). Las células fueron mantenidas en una placa hasta alcanzar
una densidad de 20 x 106 células/mL, momento en el cual fueron lavadas en PBS y
sembradas en placas nuevas a una concentración de 1 x 105 células/mL en medio
fresco.
- 47 -
3.2.2. Construcción de vectores para sobreexpresión de RhoGEF3 en células de
Drosophila.
I.
Vector RhoGEF3-∆N: El extremo carboxilo de la proteína, excluyendo el
dominio SH3 (aa 504 a 1011) fue amplificado por PCR a partir de cDNA de
embriones utilizando los partidores DmRhoGEF-s6 y DmRhoGEF-a3 y fue
clonado en el vector pMT/V5-His-TOPO (Invitrogen) según instrucciones del
fabricante. El partidor 5´ agrega al codón ATG de inicio de la traducción la
secuencia Kosak ACC (Cavener, 1987). Uno o más clones que portaban el
inserto en la orientación correcta fueron secuenciados.
II.
Vector RhoGEF3-V5: La proteína completa (aa 1 a 1011) fue amplificada por
PCR a partir de cDNA de embriones de Drosophila utilizando los partidores
DmRhoGEF-s8 y DmRhoGEF-a3 y fue clonada en el vector pMT/V5-His-TOPO
(Invitrogen) según instrucciones del fabricante. El partidor 5´ agrega la
secuencia Kosak CACC (Cavener, 1987). Uno o más clones que portaban el
inserto en la orientación correcta fueron secuenciados.
III.
Vector RhoGEF3-Myc: La proteína completa (aa 1 a 1011) fue amplificada por
PCR a partir de cDNA de embriones de Drosophila utilizando los partidores
DmRhoGEF-s8 y DmRhoGEF-a3, fue clonada en el vector pCR 2.1 Topo
(Invitrogen), liberado con la enzima de restricción EcoRI (Fermentas) y ligado
con la enzima T4 DNA Ligase (Promega) en el vector pUAST-Myc, el cual
previamente fue linearizado con la enzima de restricción EcoRI (Fermentas) y
desfosforilado. Uno o más clones que portaban el inserto en la orientación
correcta fueron secuenciados.
- 48 -
3.2.3. Generación de RNA de doble hebra (dsRNA).
La síntesis de las hebras de RNA sentido y antisentido fue realizada por
separado, cada una a partir de 5 µg de DNA correspondiente a fragmentos de PCR
amplificados desde vectores de clonamiento con partidores que se alinean con las
secuencias promotoras reconocidas por las RNA polimerasas T7 y SP6. Cada reacción
contenía 2 mM de cada rNTPs (ATP, CTP, GTP y UTP) disueltos en tampón y 40 o 100
Unidades de las polimerasas T7 o SP6 (Fermentas) respectivamente. La mezcla fue
incubada a 37ºC por 2 h en el caso de la polimerasa T7 o por 6 h en el caso de SP6.
Las reacciones fueron tratadas con 5 unidades de DNAsa I (Fermentas) por 30 min a
37ºC, el RNA resultante
fue purificado como se describe en 2.9 y su integridad
verificada mediante electroforesis. La doble hebra se obtuvo a partir del alineamiento
de las hebras sentido y antisentido realizada en un termociclador programado con un
decremento constante de 1 ºC por 1 min desde 94 ºC hasta 37ºC. Los dsRNAs fueron
cuantificados por densitometría y almacenados a -20ºC hasta su utilización.
3.2.4. Transfección de células de Drosophila.
Las células S2 y S2R+ de Drosophila fueron sembradas 3x106 en 2 mL de
medio Schneider (Gibco) suplementado con suero y antibióticos, en placas de 35 mm e
incubadas a 25ºC. Al día siguiente el medio fue reemplazado por 800 µL de medio
Schneider sin suero y las células fueron transfectadas con una mezcla de 10 µL de
Cellfectine (Invitrogen) y 10 µg de DNA en 200 µL de medio sin suero. La mezcla
DNA/Cellfectine fue preincubada por 30 min con el objetivo de permitir la formación de
los complejos DNA/liposomas. Las células fueron incubadas con la mezcla
DNA/Cellfectine por
5-24 horas a 25ºC. El medio de transfección fue removido y
- 49 -
reemplazado con 2 mL de Medio Schneider suplementado con suero al 10% v/v y 2%
de penicilina/Streptomicina. Al tercer día post-transfección las células S2R+ fueron
sembradas sobre cubreobjetos e incubadas en un mL de medio Schneider con suero al
10% v/v y 2% de Penicilina/Streptomicina. Para inducir la producción de proteína
recombinante se agregaron 0.5 mM (en el caso de RhoGEF3-V5) o 1 mM (en el caso
de RhoGEF3-Myc) de CuSO 4. Las células S2 fueron sembradas 24 post-inducción
sobre cubreobjetos tratados previamente con una solución de 0.5 mg/mL de
Concanavalina A (Sigma).
Los experimentos de RNA interferente se realizaron con las siguientes
modificaciones: 3 x 105 células S2R+ fueron sembradas en pocillos de 15 mm y se
dejaron adherir por 36 hrs. Transcurrido este tiempo las células fueron transfectadas
con 5 µg de dsRNA mezclados con 3 µL de Cellfectine (Invitrogen) en 300 µL de medio
sin suero por una hora, tras lo cual fueron agregados 200 µL de medio con suero y
antibióticos, 12 horas mas tardese retiró el medio y se reemplazo por 1 mL de medio
con suero y antibióticos. Las células fueron e incubadas por 7 días antes de examinar
la efectividad del dsRNA. Para los experimentos de sobreexpresión en presencia de
dsRNAi, las células fueron co-transfectadas con 5 µg de dsRNA, 200 ng de vector
pMTGal4, 2 µg de pUAST-RhoGEF3-Myc.
3.2.5. Clonamiento de proteínas fusionadas a GST.
Fragmentos de PCR (50 ng), que contenían las secuencias codificantes
completas de las GTPasas de Drosophila Rho1 (aa 1 a 192), Rac1 (aa 1 a 192) y
CDC42 (aa 1 a 191), además de la secuencia codificante completa de RhoGEF3 (1 a
1011) y la región DHPH de RhoGEF3 (aa 505 a 888) fueron ligados al vector pCR2.1
- 50 -
Topo (Invitrogen, 10 ng) durante 30 min a temperatura ambiente. Veinte ng de esta
ligación fueron usados para transformar células competentes E. coli DH5α (Invitrogen).
Las colonias fueron crecidas y congeladas y su DNA plasmidial fue extraído mediante
lisis alcalina y la presencia de inserto fue verificada mediante digestión con la enzima
de restricción EcoRI (Fermentas). Posteriormente, los fragmentos liberados con la
digestión con EcoRI fueron subclonados en el vector de expresión en bacterias pGEX6P-1 (General Electric). Para ello, 20 µg de DNA plasmidial fue digerido con EcoRI, y
el inserto fue purificado desde gel. En paralelo, el vector fue linearizado con EcoRI,
desfosforilado y purificado. Para cada caso, 50 ng de inserto purificado fue ligado con
10 ng de vector linearizado y desfosforilado, utilizando 10 unidades de T4 DNA ligasa
por 4 horas a 23ºC. 20 ng de estas reacciones fueron usadas para transformar células
E. coli DH5α. El DNA plasmidial de clones seleccionados fue extra
ído mediante lisis
alcalina y la presencia de inserto fue verificada mediante digestión con la enzima de
restricción EcoRI, y la orientación del inserto mediante la digestión con BamHI (Rho1,
Rac1), XhoI (Cdc42) o HindIII (RhoGEF3 completa o el fragmento DHPH) y finalmente
por secuenciación. Los insertos ligados en la orientación correcta fueron seleccionados
para transformar bacterias electrocompetentes E. coli BL21.
3.2.6. Expresión de proteínas fusionadas a GST.
Las condiciones óptimas de producción de proteína recombinante de interés
fueron determinadas para cada cepa particular en experimentos piloto. Las condiciones
óptimas determinadas para cada caso fueron las siguientes: todas las cepas fueron
inoculadas en una proporción 1:50 con cultivo en fase exponencial y crecido a 37ºC
con agitación vigorosa hasta alcanzar una densidad óptica de 0.6 a 600 nm, momento
- 51 -
en que fue agregado IPTG para inducir la expresión de la proteína recombinante, a una
concentración de 1 mM para cada GTPasa y 0.1 mM para las proteínas que codifican
para RhoGEF3. Luego de la inducción, las GTPasas fueron crecidas a 37ºC por 5
horas y las que codifican para RhoGEF3 a 18ºC por 16 horas.
3.2.7. Purificación de proteínas fusionadas a GST.
Todos los pasos de la purificación de proteínas fueron realizados a 4ºC para
evitar su desnaturación. Para el caso de las GTPasas fusionadas a GST, las células
crecidas en 800 mL de cultivo inducido fueron colectadas por centrifugación a 9.000 x g
por 10 minutos y resuspendidas en solución GSH (50 mM Tris-HC1, pH 7.5, 5 mM
MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT), adicionada con Tritón al 1%, GDP 1 µM y los
inhibidores de proteasas Aprotinina (10 µg/mL, Sigma), Leupeptina (10 µg/mL, Sigma),
Pepstatina (5 µg/mL, Sigma) y PMSF (100 µg/mL, Calbiochem), y finalmente RNAsa A
y DNAsaI 10 µg/mL (Winkler). Las células fueron sonicadas en 4 pulsos de 20
segundos cada uno. Las células sonicadas fueron incubadas 30 min con agitación y
centrifugadas a 14.000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante que contiene las
proteínas solubles fue incubado con 1 mL de resina Glutatión-Agarosa (Sigma). La
resina con las proteínas que contiene GST unida fue decantada y el sobrenadante fue
desechado. La resina fue lavada 4 veces la misma solución y 2 veces con solución
GSH adicionada con 1 µM de GDP. Las proteínas unidas a la resina fueron eluídas en
1 mL de solución GSH adicionada con GDP y 10 mM de glutatión reducido.
Finalmente, las proteínas fueron dializadas contra una solución que contiene 20 mM
Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1mM DTT y almacenadas a -80ºC
adicionando 10% de Glicerol.
- 52 -
Con el objetivo de mejorar la pureza de las proteínas purificadas se realizaron
las siguientes modificaciones:
I.
Precipitación con Sulfato de Amonio: los lisados bacterianos fueron
incubados en sulfato de amonio a una concentración final de 60% p/v y
centrifugadas a 13.000 x g durante 30 minutos y luego incubados en la resina
de glutatión agarosa.
II.
Filtración por gel: las proteínas purificadas fueron filtradas por cromatografía
en una columna de 50 cm de alto y 1.5 cm de diámetro pre-empacada con
resina Toyopearl H55 (Tosho Biosciences) y las fracciones fueron colectadas
en volúmenes de 0,5 mL. La concentración de proteína en cada fracción fue
medida en un espectrofotómetro a 280 nm. El procedimiento de purificación de
las proteínas de fusión RhoGEF3-GST y el DHPH-GST fue idéntico al descrito,
excepto que por la adición de GDP. Todos Los resultados de fueron
examinados por SDS-PAGE.
3.2.8. Ensayos de actividad GTPasica.
Las GTPasas-GST purificadas (0.2 y 0.5 mg) fueron incubadas a 37ºC en
presencia de 10 mM de GTP y la generación de fosfato inorgánico a partir de la
hidrólisis de GTP fue medida a 600 nm durante el transcurso de 30 min, gracias a que
la unión del fosfato inorgánico genera un cambio de color al unirse al reactivo Verde
de Malaquita (Sigma). Los datos fueron comparados con una curva estándar
confeccionada de la misma manera utilizando diferentes concentraciones de fosfato
inorgánico (Sigma).
- 53 -
3.2.9. Ensayo de intercambio.
Cada GTPasa-GST (2 µM) fue cargada con 10 mM de GDP (Sigma) en una
solución 10% Glicerol, 50 µg/mL de BSA, 20 mM de Tris pH 7,2, 150 mM de NaCl,
1mM de DTT y 10 mM de MgCl 2 a 37ºC por 30 min. A continuación, fueron agregados
500 nM de Mant-GTP (Molecular Probes), el que fue equilibrado por 5 min a 25ºC y
luego fueron agregados 200 nM de cada GEF ensayada. A partir de la adición de
Mant-GTP, se midió la fluorescencia cada 30 segundos en un espectrofluorímetro
SpectraMax (Molecular Devices Corporation) utilizando una longitud de onda de
excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. Los datos fueron
analizados con el software SoftMax Pro (Versión 4.6, Molecular Devices Corporation).
Como control negativo se uso una reacción sin la adición de GEF.
3.3. Métodos del objetivo 3.
3.3.1. Ensayos de ganancia y pérdida de función de RhoGEF3.
Se generaron 4 líneas transgénicas (Genetics Service, Estados Unidos) que
integraron a su genoma el vector pUAST-RhoGEF3-Myc generado en 3.2.2., el que
porta el marcador fenotípico w+ (color de ojo rojo). Brevemente, embriones inyectados
con el vector fueron cruzados individualmente con moscas w- para propagar la línea.
Una vez propagada, fueron seleccionados machos y hembras vírgenes que poseían el
marcador w+ y cruzados entre ellos por varias generaciones hasta ver solo
descendencia w+, estableciendo una línea homocigota para la inserción.
Para lograr la expresión ectópica de RhoGEF3, se colectaron hembras vírgenes
de cada línea transgénica, las que fueron cruzadas con machos de: las cepas vi-xv
- 54 -
descritas en la sección 1.1. las que dirigen la expresión de la proteína Gal 4 (Brand y
Perrimon, 1993) en todo el embrión o en diferentes tejidos de embriones y adultos.
Para los experimentos de pérdida de función, hembras de una cepa transgénica
que porta la construcción UAS-RNAi-RhoGEF3 (descrita en la sección 1.1) fueron
cruzadas con machos de la línea y1 w*; P{GAL4-nos.NGT}40, de la línea w*; P{matα4 GAL-VP16}V37 y de la línea y1 w*; P{Act5C-GAL4}17bFO1/TM6B, Tb1, que dirigen la
expresión de la proteína Gal4 (Brand y Perrimon, 1993) en todo el embrión. Además,
se utilizó la cepa w1118; Df(3L)BSC126/TM6B, Tb1 que posee una deleción
cromosómica en la región del gen rhogef3. Con el fin de identificar embriones
homocigotos para la deleción, esta cepa fue cruzada con la cepa st1 e1 HemJ4-48/TM6B,
P{ase-lacZF:2.0}PK3, Tb1 (descrita en 1.1). Los embriones homocigotos para la
deleción fueron identificados por carecer de actividad β-galactosidasa, mientras que en
los embriones heterocigotos, la actividad de esta enzima fue revelada mediante la
tinción con X-gal (descrita en 2.19)
3.3.2. PCR inverso (iPCR).
Para determinar el sitio de inserción del vector pUAST-RhoGEF3-myc se utilizó
el protocolo de iPCR descrito en BDGP (http://www.fruitfly.org/). Brevemente, DNA
genómico de 25 moscas homocigotas para la inserción fue extraído como se describe
en 2.14 y digerido con la enzima de restricción Sau3AI y ligado con ligasa T4
(Promega). El DNA ligado fue usado como sustrato en una reacción de PCR utilizando
los partidores P-31, pWiz-F1 y pWiz-R1 que alinean con regiones del vector (ver
esquema en figura 33). La reacción fue fraccionada mediante electroforesis en gel de
agarosa y los productos obtenidos fueron recuperados desde el gel y purificados. Los
- 55 -
productos purificados fueron secuenciados y las secuencias analizadas por BLAST
contra el genoma de D. melanogaster.
3.3.3. Escisión del gen rhogef3.
I.
Generación de eventos de escisión de elemento P: Hembras vírgenes de la
línea 5HA 1662, homocigotas para la inserción del elemento P, fueron cruzadas
con machos de la cepa w*; ry506 Sb1 P{Δ2-3}99B/TM6B, Tb1, portadora de la
transposasa Δ2-3. La descendencia de este cruce (F1) que portaba el marcador
Sb, indicando la presencia de la transposasa, y además poseía ojos mosaicos
de color rojo y blanco, indicativo de eventos de escisión del elemento P en las
células de los omatidios, fue cruzadas con la cepa y1 w*; TM3, y+ Ser1/Sb1, que
portaba un cromosoma 3 balanceador. La descendencia de este cruce (F2) fue
seleccionada por la ausencia de los marcadores w+ y Sb, y fue cruzada
individualmente con la cepa st1 e1 HemJ4-48/TM6B, P{ase-lacZF:2.0}PK3, Tb1,
con el objetivo de estabilizar la mutación originada por un evento único de
escisión. Finalmente, machos y hembras de esta descendencia (F3) fueron
seleccionados por carecer del marcador HemJ4-48 con el objetivo de establecer
una línea (Figura 1). Los descendientes de esta línea (F4) que fueron
homocigotos para la mutación originada por la escisión fueron analizados por
PCR.
- 56 -
Figura 1. Escisión del gen rhogef3. Esquema de los cruces necesarios para movilizar
la inserción única del elemento P en el intrón del gen rhogef3 de la cepa P{RS5}5-HA1662. Los símbolos representan al cromosoma balanceador del cromosoma 3 (TM3 y
TM6), la transposasa (P[∆2 -3]) y marcadores fenotípicos dominantes (Sb1, Ser1, Tb1) y
el transgen P{ase-lacZF}. La movilización del elemento P (P[w+]) se confirma mediante
la pérdida del marcador mini-white (w-). rhogef3+ indica la presencia del gen, y rhogef3-,
posibles alelos producidos por escisión del gen. F denota la descendencia de cada
cruce.
- 57 -
II.
Análisis de deleciones por PCR: DNA genómico de 1 mosca homocigota para
la deleción fue extraído como se describe en 2.14 y se utilizó 2,5 µL de este
DNA para cada ensayo de PCR con la enzima Go Taq Green Master Mix
(Promega). La integridad del DNA fue verificada utilizando los partidores
PromCG6234-s y PromCG6234-a, la presencia de vestigios de los brazos del
vector utilizando los partidores SP1 y DmRhoGEF3-s3 y SPEP1
y
DmRhoGEF3-a2. Para verificar la escisión del vector se utilizaron los partidores
DmRhoGEF3-s3 y DmRhoGEF3-a2, que flanquean el sitio de inserción. Como
control fue utilizado DNA genómico de la cepa original portadora de la inserción
y la cepa silvestre Canton S. Los productos de amplificación que diferían en
tamaño con el control silvestre fueron purificados desde gel y secuenciados.
3.3.4. Análisis de fenotipos.
El análisis de los fenotipos embrionarios se realizó mediante ensayos de
inmunofluorescencias indirectas previamente descritos en Roberts (1998), mientras
que los fenotipos larvales fueron analizados en preparaciones de cutículas. Finalmente,
posibles alteraciones en la organización de epitelios fueron examinados en
preparaciones de alas y ojos de moscas adultas. Para la preparación de las cutículas
larvales, los embriones de cada cruce o línea fueron colectados a intervalos de 12 h e
incubados a 25 °C por 24 h. Los embriones fueron y descorionizados en una solución
al 50% de hipoclorito de sodio por 2 min, lavados dos veces con PBS-Tritón al 0,1% y
luego con una solución 1:9 de metanol:EGTA 50mM (ME). Los embriones fueron
incubados en una mezcla glicerol: ácido acético (1:4) por 1 h a 60 °C. Posteriormente,
los embriones fueron ubicados en portaobjetos de vidrio, se les agregó una gota de
- 58 -
una mezcla glicerol: ácido láctico (1:3), se cubrieron con un cubreobjetos y se
incubaron a 60 °C hasta que los tejidos internos se aclararan. Para observar las alas,
las moscas fueron dormidas con CO 2 , y las alas fueron extraídas mecánicamente con
pinzas, lavadas en PBS-Tritón al 0,1% por 2 horas con agitación
y montadas
cuidadosamente en portaobjetos con una solución de glicerol 80%. Finalmente los ojos
fueron examinados directamente en una lupa (10x de magnificación).
- 59 -
Resultados.
1. Determinar la secuencia completa del cDNA de rhogef3 y la expresión espaciotemporal de su transcrito y de su proteína.
1.1. Caracterización molecular del gen rhogef3.
1.1.1 Inicio de la transcripción del gen rhogef3.
El genoma de Drosophila fue secuenciado y anotado por el consorcio Berkeley
Drosophila Genome Project (BDGP) y los resultados son de dominio público y se
encuentran depositados en la base de datos Flybase (http//flybase.org). Esta base de
datos se encuentra en continua revisión y actualmente se puede acceder a la versión
5.1 de la anotación. En esta versión se encuentra anotado el gen CG1225 con el
nombre rhogef3. De acuerdo a esta anotación computacional, el gen rhogef3 se
encuentra ubicado en la posición 61B3-61C1 (Figura 2, A), en el brazo izquierdo del
cromosoma 3 y presenta 10 variantes de corte y empalme del mRNA, sugiriendo que
existen 10 transcritos distintos o isoformas (Figura 2, B), cuyas principales diferencias
se encuentran en los exones de la región 5´, incluyendo la región 5´ no traducida y los
exones que codifican la región amino-terminal de la proteína. Estos transcritos
codifican para 8 proteínas distintas cuyas variaciones se encuentran exclusivamente al
inicio de la proteína, siendo idénticas en la región central y carboxilo terminal (Figura 2,
C).
Inicialmente, se determinó de forma experimental cuáles eran las isoformas del
transcrito del gen rhogef3 expresadas durante el desarrollo de Drosophila.
Considerando que las diferencias de los transcritos anotados se encuentran en la
- 60 -
Figura 2. Anotación del gen rhogef3. A) Esquema de la región genómica (negro)
donde está ubicado el gen rhogef3 (azul) indicando su posición citológica (izquierda) y
las pares de bases donde se encuentra ubicado (derecha, 3L: brazo izquierdo del
cromosoma 3). B) Esquema de los posibles transcritos derivados del corte y empalme
alternativo, mostrando los exones (rojo). C) Esquema de las regiones codificantes
(amarillo) que dan lugar a 8 proteínas distintas. Las flechas indican la dirección 5´ a 3´.
- 61 -
región 5´, se determinaron los inicios de la transcripción del gen rhogef3 mediante la
técnica RLM-RACE (RNA ligase-mediated rapid amplification of 5´ and 3´ cDNA ends).
Esta técnica consiste en ligar un oligonucleótido de RNA de secuencia conocida
exclusivamente al extremo 5´, de los transcritos completos presentes en una muestra
de RNA total, es decir, aquellos que posean la caperuza de 7-metilguanosina (cap) en
su extremo 5´, descartando aquellos transcritos que pueden estar incompletos o
truncados debido a la manipulación de la muestra. A partir de este RNA se sintetiza
cDNA que sirve de sustrato a una reacción de PCR utilizando un partidor de secuencia
complementaria al oligonucleótido de RNA y un partidor complementario al gen de
interés. Como consecuencia se amplifican solo aquellas secuencias que contienen el
inicio de la transcripción de un gen. Se aplicó esta técnica a una muestra de RNA total
de embriones representativos de todos los estados del desarrollo y el cDNA obtenido
fue utilizado como sustrato para una reacción de PCR utilizando los partidores
GeneRace 5′ Primer, complementario al oligonucleótido, y el partidor DmRhoGEF3 -a,
que alinea con los 10 transcritos anotados del gen rhogef3 y que mediante un análisis
electroforético, permite discriminar entre las 10 isoformas anotadas. Se obtuvo como
resultado un único amplicón de 894 pb (Figura 3, A) el cual fue clonado en el vector
pCR II Topo (Invitrogen) y fue secuenciado. La secuencia de este amplicón (Figura 3,
B) fue sometida a un análisis de BlastN contra la base de datos de los genes anotados
de Drosophila obteniendo un 100% de identidad con todas las isoformas anotadas, sin
embargo, con diferentes coberturas para cada uno de ellas. Las mayores coberturas
obtenidas fueron para la isoforma RhoGEF3-RA (793 pb), RhoGEF3-RF (773 pb),
RhoGEF3-RI (457pb), RhoGEF3-RH (456 pb), RhoGEF3-RG (399 pb) y RhoGEF3-RC
(399). Este resultado indica que la isoforma RhoGEF3-RA es el único transcrito
- 62 -
Figura 3. Inicio de la transcripción del gen rhogef3. RNA total de embriones de
todos los estados del desarrollo fue analizado mediante la técnica RLM-RACE (RNA
ligase-mediated rapid amplification of 5´ and 3´ cDNA ends). A) Electroforesis en gel de
agarosa del producto de PCR obtenido. B) Secuencia del amplicón obtenido, indicando
las bases no codificantes en minúscula y las codificantes en mayúscula, la secuencia
del Oligo de RNA ligado al extremo 5´ en púrpura, la región no anotada como parte del
gen en verde, el primer exón anotado en azul, el inicio de la traducción en negrita y el
partidor gen especifico usado en rojo.
- 63 -
anotado que se expresa durante el desarrollo embrionario y sugiere que existe una
única proteína, RhoGEF3-PA de 1011 aa. En la secuencia obtenida existen 120 pb de
bases en el extremo 5´ (Figura 3, B, letras verdes) entre la secuencia del partidor
GeneRace 5′ Primer y el inicio de la transcripción del transcrito RhoGEF3 -RA. Esta
secuencia fue sometida a un análisis de BlastN contra la base de datos del genoma
completo de Drosophila, que incluye genes anotados y regiones intergénicas,
obteniendo un 100% de identidad con la región inmediatamente río arriba del inicio de
la transcripción anotado, indicando que existe un error en esta anotación y que el inicio
de la transcripción real comienza 120 pb antes. En el subsecuente desarrollo de este
trabajo se utilizaron éstas secuencias para el diseño experimental de sondas y
proteínas recombinantes.
1.1.2. Expresión temporal del transcrito rhogef3.
Se examinó la acumulación del transcrito rhogef3 en diferentes etapas del ciclo
de vida de Drosophila mediante PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR), utilizando
partidores específicos del gen rhogef3 sobre muestras de cDNAs representativas de
embriones en estado de blastodermo sincicial (estados 2 y 3, Campos-Ortega y
Hartenstein, 1985), blastodermo celular (estado 5), gástrula (estados 6 y 7),
postgastrula (estados 10-12), larva en estado 3 y adulto. Con el propósito de comparar
entre las distintas muestras, se utilizó como elemento de referencia la cantidad del
transcrito del gen actina medido en cada muestra, el cual es considerado un transcrito
de expresión constitutiva en todos los estados examinados (housekeeping). La Figura
4 muestra en un gráfico de barras la abundancia del transcrito de rhogef3 normalizada
respecto a la abundancia del transcrito de actina (eje Y) en cada una de las muestras
- 64 -
Figura 4. Expresión del gen rhogef3 durante el ciclo de vida de Drosophila.
Cuantificación de la abundancia relativa del transcrito de rhogef3 mediante PCR
cuantitativo en tiempo real. Las reacciones de PCR fueron realizadas en el Light Cycler
1.5 Instrument (Roche), utilizando como sustratos cDNAs representativos de: E,
embriones de los estados 2-3 (blastodermo sincicial); estado 5 (blastodermo celular);
estados 6 y 7 (gástrula); estados 10, 11 y 12 (post-gastrula); L3, larva en tercer instar y
A, adulto. Se grafican los valores promedio de 2 mediciones y las barras de error
indican la desviación estándar. La abundancia del transcrito fue normalizada, en cada
muestra, respecto de la abundancia del transcrito de actina, cuya expresión no cambia
durante los estados analizados. Las abundancias fueron relativizadas respecto a la
máxima expresión alcanzada, la que toma el valor de 1,0.
examinadas (eje X). Este análisis se realizó por duplicado y la normalización se realizó
con los valores promedio. Las barras de error en el gráfico indican la desviación
estándar. Cada medición fue dividida por el valor máximo alcanzado obteniendo una
escala de valores relativa de 0 a 1. El resultado indica que la abundancia relativa del
transcrito alcanza un mínimo en el blastodermo sincicial (embriones de estados 2-3),
estado en el que se encuentran solo transcritos sintetizados por la madre. La
abundancia aumenta en el blastodermo celular (estado 5), estado en el cual se
- 65 -
enciende la maquinaria transcripcional del cigoto, alcanzando su abundancia máxima
durante la gastrulación (estados 6 y 7). La abundancia de rhogef3 disminuye
paulatinamente después de la gastrulación (estados 8-12) alcanzando el mínimo en
larvas y adultos. Este resultado muestra que la expresión del gen rhogef3 es dinámica
ya que cambia durante el ciclo de vida, y es cigótica debido a que el transcrito no es
aportado por la madre.
1.1.3. Expresión espacio-temporal del transcrito rhogef3.
Se examinó el patrón espacial y temporal de la expresión del gen rhogef3,
mediante experimentos de hibridaciones in situ en embriones de todos los estados del
desarrollo. Para ello se utilizó una sonda complementaria al transcrito RhoGEF3-RA,
utilizando un clon obtenido desde una genoteca de expresión diferencial (Zúñiga y
cols., 2009). El DNA plasmidial de este clon se utilizó como sustrato para la síntesis in
vitro de un cRNA que fue marcado con Digoxigenina, que es reconocida por un
anticuerpo α-Digoxigenina acoplado a Fosfatasa Alcalina, la que reacciona con el
sustrato NBT/BCIP produciendo un precipitado azul donde se encuentra el transcrito.
Las Figuras 5 y 6 muestran imágenes representativas de montajes completos de
embriones hibridados con esta sonda. En concordancia con los experimentos de
qPCR, el transcrito no es detectado en embriones en estado de blastodermo sincicial
(estados 2-3, Figura 5, A) y es detectado por primera vez en embriones en estado de
blastodermo celular (estado 5, Figura 5, B). El transcrito es detectado en bandas
transversales a lo largo del eje antero-posterior del embrión, en las células precursoras
el ectodermo. Este patrón de distribución se mantiene durante la gastrulación (estado
6, Figura 5, C). En este estado, la marca es más intensa en las células del
- 66 -
amnioproctodeo (Figura 5, C´, flecha), que corresponde al primordio del intestino
posterior. En estados posteriores a la gastrulación el transcrito se acumula de manera
más homogénea en el procefalo y en la banda germinal en extensión, desde el estado
8 (Figura 5, D), hasta el estado 9 (Figura 5, E). En este estado la marca es más fuerte
en las células del estomodeo (flecha). Coincidiendo con la medición de qPCR la
intensidad de la marca disminuye en estados tardíos, pero el patrón de expresión se
restringe a estructuras particulares. En embriones de estado 16 (Figura 6, A) el
transcrito es detectado fuertemente en el atrio (Figura 6, B y C, vista dorsal), las
glándulas salivales (Figura 6, A, B y C, vista dorsal) y los espiráculos posteriores
(Figura 6, A y D, vista dorsal). En embriones de estado 17 el transcrito es detectado
claramente en las tráqueas y sus ramificaciones (Figura 6, E y F). En líneas generales,
se confirma la expresión dinámica y preeminentemente cigótica del transcrito del gen
rhogef3. Su patrón de expresión espacial sugiere que este gen es requerido en
procesos particulares de la morfogénesis del embrión de Drosophila melanogaster.
- 67 -
Figura 5. Distribución espacio-temporal del transcrito rhogef3 en estadíos
tempranos del desarrollo. Imágenes representativas de montajes completos de
hibridaciones in situ en embriones de varios estados del desarrollo. Vistas laterales de
embriones orientados desde anterior (A) a posterior (P) de izquierda a derecha y desde
dorsal (D) a ventral (V) de arriba hacia abajo. En cada panel se indica el estado del
desarrollo de cada embrión. Los embriones fueron incubados con una sonda de cRNA
específica para rhogef3, acoplada a Digoxigenina. La Digoxigenina fue detectada con
un anticuerpo α-Digoxigenina conjugado con Fosfatasa Alcalina (Roche, dilución
1:2000) , la cual cataliza la formación de un producto azul insoluble a partir del sustrato
NBT/BCIP (Sigma). Las flechas indican el amnioproctodeo (C`), y el estomodeo (E).
- 68 -
Figura 6. Distribución espacio-temporal del transcrito rhogef3 en estadíos tardíos
del desarrollo. Imágenes representativas de montajes completos de hibridaciones in
situ en embriones de varios estados del desarrollo. En cada panel se indica el estado
del desarrollo de cada embrión. Los embriones fueron incubados con una sonda de
cRNA específica para rhogef3, acoplada a Digoxigenina. Las flechas indican la las
glándulas salivales y los espiráculos (A), el atrio y las glándulas salivales (B: vista
lateral, anterior a la izquierda; C: vista dorsal, anterior a la izquierda) y los espiráculos
(D, vista dorsal, anterior a la izquierda) y el árbol de las tráqueas (E: vista dorsal,
anterior a la izquierda y F: vista lateral, anterior a la izquierda).
- 69 -
1.2. Análisis de la proteína RhoGEF3.
1.2.1. Análisis de la secuencia primaria de RhoGEF3.
Si bien el gen rhogef3 no ha sido previamente caracterizado, la base de datos
de Flybase (http//flybase.org) clasifica a la proteína codificada por él como un potencial
factor intercambiador de nucleótidos de guanina sobre la base de su similitud de
secuencia primaria con proteínas conocidas. Con el fin de agregar información a la
descripción funcional de la proteína codificada por el gen rhogef3, se buscó en la
secuencia primaria de esta proteína patrones representativos de familias proteicas.
Para ello, se utilizó la base de datos InterPro (http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)
que integra varios servidores de predicción de dominios y familias, como por ejemplo
Pfam, ProDom, SMART y Superfamily. La comparación de la proteína RhoGEF3 contra
esta base de datos predice la existencia de un dominio SH3 (Sarc Homology domain,
score: 7,49 x 10-12), un dominio DH (Dbl Homology, score: 6,39 x 10-47) y un dominio
PH (Pleckstrin Homology domain, score: 4,0 x 10-12) (Figura 7, A). El dominio SH3 ha
sido descrito en una gran cantidad de proteínas y participa en la unión proteínaproteína inter e intramolecular, ya que reconoce y se une a regiones ricas en el
aminoácido prolina. El dominio DH es característico de proteínas que intercambian
nucleótidos de guanina de GTPasas de la familia Rho. Es este dominio el responsable
del reconocimiento y la unión a la GTPasa blanco. En las proteínas GEF específicas de
la familia de las RhoGTPasas, este dominio va invariablemente unido a un dominio PH,
que facilita la unión de la proteína a fosfolipidos y es el encargado de localizar la
proteína en la membrana. Estos resultados sugieren que existe una buena probabilidad
de que esta proteína sea un intercambiador de nucleótidos de guanina y posea un
dominio SH3.
- 70 -
1.2.3. Comparación de secuencia con otras proteínas GEF.
Se realizó un BlastP contra bases de datos públicas utilizando la secuencia
aminoacídica del domino DH de RhoGEF3, con el objetivo de encontrar y comparar
otras proteínas de esta familia. Este análisis arrojo un total de 79 secuencias con una
cobertura mínima del 80% y una similitud mayor a E value = 2x10-27, dentro de las que
se incluyen ortólogos de RhoGEF3 de otras especies de Drosophila y otras muchas
proteínas no descritas o hipotéticas de otros organismos. Según este criterio, solo se
encontraron 4 proteínas que han sido descritas en la literatura y en algunas de ellas se
han realizado estudios estructurales: Asef (APC-stimulated guanine nucleotide
exchange factor, Homo sapiens), Collybistin II (Rattus norvegicus), PEM-2 (Ciona
savignyi), P-Rex1 protein (Homo sapiens). Todas estas proteínas han sido descritas
como
activadoras
de GTPasas,
poseen dominios
DH y
PH
y reconocen
específicamente las GTPasas Rac (Asef y P-Rex1, Kawasaki y cols., 2000; Welch y
cols., 2002) o Cdc42 (Pem-2, Collibistin, Satou y Satoh, 1997; Harvey y cols., 2004).
Como se mencionó anteriormente, las proteínas GEF presentan una gran diversidad de
dominios o motivos conocidos contenidos en sus secuencias primarias y es posible
agrupar estas proteínas en base a ellos (Rossman y cols., 2005). Según este punto de
vista, existen dos proteínas representativas que podrían ser agrupadas junto a
RhoGEF3, debido a la presencia del dominio SH3 rio arriba del dominio DH y PH.
Estas son la anteriormente mencionada Asef y la proteína β-Pix perteneciente a la
familia de las Cool/Pix (Cloned out of Library/Pak interactive exchange factor), que son
factores de intercambio específicos de Rac y Cdc42 (Rosenberger y Kutche, 2006).
Con el propósito de examinar la similitud de las secuencias de sus dominios DH y PH
se realizó un alineamiento con estas secuencias. En este análisis se incluyeron
- 71 -
Figura 7. Análisis de la secuencia aminoacídica de la proteína RhoGEF3. A)
Estructura primaria de la proteína RhoGEF3. Esquema de los dominios proteícos
predichos por análisis bioinformáticos: en naranjo se muestra el dominio SH3 (Sarc
Homology domain 3), en rojo el dominio DH (Dbl Homology domain), en azul el dominio
PH (Pleckstrin Homology domain) y en gris, regiones de la proteína que no contienen
dominios descritos. B) Alineamiento, utilizando el algoritmo CLUSTALW, del dominio
DH y PH de RhoGEF3 con dominios equivalentes de otras proteínas GEF.
Alineamiento: Asef (H. sapiens, 37% de identidad), Colibistina II (R. norvergicus, 36%
de identidad), PEM-2 (C. savigni, 33% de identidad), P-Rex1 (H. sapiens, 29% de
identidad), Trio (D. melanogaster, 28% de identidad), Beta-pix (H. sapiens, 20% de
identidad), Pebble (D. melanogaster, 23% de identidad) y DRhoGEF2 (D.
melanogaster, 23% de identidad). Los aminoácidos idénticos se destacan en fondo
negro y los aminoácidos similares en fondo gris. En rojo se indican las regiones
conservadas 1, 2 y 3, características de los dominios DH.
- 72 -
además las secuencias de los dominios DH y PH de las GEF de Drosophila Trio, que
reconoce específicamente a Rac (Bateman y cols., 2000) y además Pebble y
RhoGEF2, ambas reconocen específicamente a la GTPasa Rho1 (Prokopenko y cols.,
1999; Barrett y cols., 1997; Häcker y Perrimon, 1998). La figura 7 B muestra el
resultado de este análisis, brevemente, los porcentajes de identidad entre RhoGEF3 y
las demás proteínas son los siguientes: Asef (37% de identidad), Colibistina II (36% de
identidad), PEM-2 (33% de identidad), P-Rex1 (29% de identidad), Trio (28% de
identidad), β-Pix (20% de identidad), Pebble (23% de identidad) y DRhoGEF2 (23% de
identidad). Este resultado indica que existe una mayor identidad de secuencias con las
proteínas que reconocen específicamente Rac y Cdc42.
A partir de este resultado se dibujo un dendrograma que muestra las relaciones
de similitud entre estas proteínas, aquellas que reconocen Rac y Cdc42 se segregan
de aquellas que reconocen Rho1, aun perteneciendo a especies filogenéticamente
distantes (Figura 8). Según este análisis la proteína RhoGEF3 se agrupa con las
proteínas GEF que reconocen Rac o Cdc42. En conjunto estos resultados permiten
proponer que RhoGEF3 sería un GEF específico de Rac o CDC42, sin embargo esta
hipótesis debe ser demostrada experimentalmente.
- 73 -
Figura 8. Similitud entre diferentes GEF. La Figura muestra un dendrograma del
agrupamiento de las secuencias de los dominios DH-PH de varias proteínas GEF en
base a sus similitudes. El dendrograma fue construido con el software ClustalW.
- 74 -
1.3. Localización de la proteína RhoGEF3.
1.3.1. Producción de anticuerpo anti-RhoGEF3.
Con el objetivo de estudiar la localización de la proteína RhoGEF3 en
embriones de Drosophila, se generó un anticuerpo policlonal dirigido contra esta
proteína mediante la inyección en conejos de una proteína RhoGEF3 recombinante.
Se amplificó por PCR desde cDNA de embriones la secuencia codificante
completa de la proteína RhoGEF3-PA, excepto el codón de termino, y fue clonada en
el vector pTrc/His2 Topo, denominado pTrc-RhoGEF3. Este vector de expresión en
bacterias posee un promotor inducible por IPTG que dirige la expresión de una
proteína recombinante fusionada a un dominio carboxilo-terminal Myc-hexahistidina
que permite su reconocimiento mediante inmunoensayos con anticuerpos α-Myc, y su
purificación por cromatografía de afinidad con columnas de Agarosa-Níquel. Dado que
los dominios DH y PH y principalmente el dominio SH3 de la proteína pueden generar
reactividad cruzada con otras proteínas de Drosophila que poseen estos dominios, se
diseñó un péptido representativo de RhoGEF3 que carece de los dominios SH3, DH y
PH. Con este propósito el vector pTrc-RhoGEF3 fue digerido con la enzima de
restricción SacI para remover una secuencia de 2094 bp que codifica para los dominios
SH3, DH y PH. El vector con las secuencias codificantes de las regiones amino y
carboxilo-terminales de RhoGEF3 fue purificado y recircularizado utilizando los
extremos cohesivos generados por la digestión con SacI para restaurar el marco de
lectura original de la secuencia. El nuevo vector, pTrc-RhoGEF3-∆(SH3-DH-PH), fue
utilizado para transformar células E. coli DH5α, purificado y secuenciado. La Figura 9,
A, muestra un esquema de la proteína RhoGEF3 completa indicando la secuencia
escindida y un esquema de la proteína recombinante resultante denominada
- 75 -
RhoGEF3-∆(SH3-DH-PH)-Myc. Esta proteína no presenta similitud de secuencias
significativa con ninguna proteína anotada de Drosophila.
La figura 9, B, muestra el resultado de la inducción de la expresión de la
proteína recombinante RhoGEF3-∆(SH3-DH-PH)-Myc con 1 mM de IPTG, la cual fue
detectada con el anticuerpo α-Myc en ensayos de western blot. Como control positivo
de la inducción se utilizó el vector pTrc/His2 Topo que contiene el gen Lac-Z y codifica
para una proteína recombinante β-Galactosidasa-Myc. Al momento de agregar el IPTG
ya se detecta la expresión de ambas proteínas (carriles 1 y 4 respectivamente),
indicando que aun antes de inducir la expresión, el promotor posee una actividad
basal. Con 5 horas de inducción se alcanza un alto grado de expresión de la proteína
β-Galactosidasa-Myc (carril 5). Sin embargo, luego de 3 y 5 horas de inducción, aun
cuando se detecta proteína RhoGEF3-∆(SH3-DH-PH)-Myc, el aumento de la expresión
no es tan significativo como en el caso del control positivo. Se probaron otras
condiciones de inducción de la expresión variando parámetros como temperatura de
crecimiento, concentración de IPTG y tiempo de inducción, sin obtener mejores
resultados. Por lo tanto, las condiciones utilizadas para el resultado mostrado en la
figura 9, B, fueron utilizadas para experimentos de purificación mediante cromatografía
de afinidad en columnas de Agarosa-Níquel utilizando 1 L de cultivo inducido. Las
bacterias inducidas fueron lisadas, sonicadas, criofracturadas y centrifugadas y el
sobrenadante, que contiene las proteínas solubles, fue incubado con la resina de
Agarosa-Níquel, logrando la unión de la proteína gracias a la afinidad de las histidinas
con el Níquel. La proteína que permaneció unida a la resina fue desplazada con
Imidazol, que tiene una estructura similar a la histidina y tiene afinidad por el Níquel.
La proteína purificada fue electrotransferida a membranas de nitrocelulosa, las cuales
- 76 -
Fragmento escindido
A
RhoGEF3
N-
SH3
-C
PH
DH
RhoGEF3-D(SH3 DH PH)-Myc
N-
B
myc
RhoGEF3-D(SH3 DH PH)
1
2
3
4
His -C
5
120 kDa
34 kDa
Figura 9. Diseño y expresión de péptido inmunogénico. A) Esquema que
representa la proteína RhoGEF3 indicando los dominios SH3 (naranjo), DH (rojo) y PH
(azul). La secuencia nucleotídica codificante de esta proteína fue digerida con la
enzima de restricción SacI (Promega) liberando la secuencia que codifica la región
indicada por la llave, produciendo la proteína recombinante RhoGEF3-D(SH3 DH PH)Myc que carece de los dominios SH3, DH y PH. B) Lisados bacterianos de cultivos
colectados a las 0 (carril 1 y 4), 3 (carril 2) y 5 (carril 3 y 5) horas post-inducción con 1
mM IPTG, fueron fraccionados en geles de poliacrilamida al 10% y electrotransferidos
a membranas de nitrocelulosa. Las proteínas recombinantes fueron detectadas con un
anticuerpo monoclonal a-MYC (Sigma, dilución 1:500). Carriles 1-3, proteína
recombinante RhoGEF3-D(SH3 DH PH)-Myc (34 kDa); carriles 4-5, control positivo de
inducción, corresponde a la proteína b-galactosidasa fusionada con el epítope myc
(120 kDa).
- 77 -
fueron teñidas con Rojo Ponceau y las bandas correspondientes a la proteína pura
fueron cortadas y utilizadas para inyectar un conejo. El suero obtenido fue purificado y
enriquecido por inmunoadsorción utilizando proteína recombinante RhoGEF3-GST (ver
resultados, sección 2.2.1).
La especificidad del anticuerpo purificado por inmunoadsorción fue evaluada
mediante inmunoensayos contra proteínas RhoGEF3 recombinantes (Figura 10):
i) Se realizó un ensayo de western blot contra la proteína RhoGEF3-∆(SH3-DHPH)-Myc purificada utilizando el anticuerpo α-RhoGEF3 o el anticuerpo α-Myc. Ambos
anticuerpos detectan la misma proteína de 34 kDa (Figura 10, A).
ii) Se realizó un ensayo de western blot contra la proteína RhoGEF3-GST
utilizando el anticuerpo α-RhoGEF3 o el anticuerpo α-GST. Ambos anticuerpos
detectan la misma proteína de 150 kDa, que corresponde al tamaño de la proteína
RhoGEF3-GST (Figura 10, B).
iii) Se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta en células S2R+ de
Drosophila transfectadas con un vector que expresa la proteína recombinante
RhoGEF3-Myc (ver resultados, sección 2.1.3) utilizando el anticuerpoα -RhoGEF3 o el
anticuerpo α-Myc. La figura 10, C, muestra una imagen representativa, se observan 6
células visibles en campo claro y al teñir sus núcleos con la sonda ToPro3-Alexa 624,
que se une a DNA (azul). Una de estas células expresa la proteína recombinante
RhoGEF3-Myc detectada con el anticuerpo α-Myc (verde). El anticuerpo α-RhoGEF3
también detecta la proteína recombinante RhoGEF3-Myc (rojo). Además, es posible
distinguir, aunque con menor intensidad todas las células del campo, sugiriendo que la
proteína RhoGEF3 se expresa en estas células. Estos resultados en su conjunto
indican que el anticuerpo α-RhoGEF3 generado es capaz de reconocer variantes
- 78 -
α -Myc
A
α - RhoGEF3
34 kDa
α-RhoGEF3
B
Ind
no ind
α -GST
ind
no ind
150 kDa
C
α-RhoGEF3
α-Myc
DNA
Campo claro
- 79 -
Figura 10. Caracterización del anticuerpo α-RhoGEF3. A) Proteína recombinante
RhoGEF3-D(SH3-DH-PH)-Myc purificada fue fraccionada en geles de acrilamida al
12% y electrotransferida a membranas de PVDF y utilizada en ensayos de western blot
contra el anticuerpo α-Myc (dilución 1:500) y el anticuerpo purificado por
inmunoadsorción α-RhoGEF3 (dilución 1:100). B) Lisados bacterianos de cultivos
inducidos con 1 mM IPTG (ind) y no inducidos (ni) de bacterias transformadas con un
vector que codifica para una proteína de fusión RhoGEF3-GST (150 kDa). Los lisados
fueron fraccionados en geles de poliacrilamida al 10% y electrotransferidos a
membranas de PVDF. Las proteínas recombinantes fueron detectadas con un
anticuerpo monoclonal anti-GST (1:5000) y con el anticuerpo α-RhoGEF3 (1:100). C)
Imágenes representativas de inmunofluorescencias indirectas de cultivos de células
S2R+ que sobreexpresan una proteína recombinante RhoGEF3-Myc. Las células que
producen la proteína recombinante fueron detectadas con anticuerpo monoclonal αMyc (verde, dilución 1:20) y el anticuerpo α-RhoGEF3 (Rojo, dilución 1:50). Las células
fueron teñidas con la sonda ToPro3, que reconoce el DNA (azul) y se incluye una
imagen en campo claro de estas células. Los pesos moleculares se indican en la
figura.
- 80 -
recombinantes de la proteína RhoGEF3. Finalmente, se realizaron ensayos de western
blot contra proteínas totales de embriones de Drosophila utilizando el anticuerpo αRhoGEF3. Este anticuerpo detecta una proteína de 95 kDa aproximadamente (Figura
11, B) que no es detectada por una dilución similar del suero pre-inmune (Figura 11,
C). Ambos sueros detectan una segunda proteína de aproximadamente 55 kDa, pero
esta señal puede deberse a unión inespecífica del suero ya que al observar el gel
original se distingue una gran concentración de proteína de este tamaño (Figura 11, A).
Este resultado indica que el suero es capaz de reconocer la proteína RhoGEF3
endógena y que esta proteína difiere levemente del tamaño calculado por métodos
bioinformáticos (110 kDa).
- 81 -
Figura 11. Detección de RhoGEF3 en embriones de Drosophila. A) Extractos de
proteína total de embriones (1X y 2X) fueron fraccionados en geles de poliacrilamida al
8%. B) Las proteínas fueron electrotransferidas a membranas de PVDF y sometidas a
ensayos de western blot utilizando el anticuerpo purificado por inmunoabsorción αRhoGEF3 (dilución 1:100). C) Las membranas fueron reutilizadas en ensayos de
western blot utilizando el suero pre-inmune (dilución 1:100).
- 82 -
1.3.2. Localización de la proteína RhoGEF3.
El anticuerpo α-RhoGEF3 purificado por inmunoabsorción fue utilizado en
experimentos de Inmunofluorescencias indirectas en embriones completos con el
objetivo de determinar su localización. La proteína es detectada por primera vez en
embriones durante la gastrulación, en células que componen el proctodeo mientras
este se está internalizando (estado 7, Figura 12, A). En embriones de estado 9 se
detecta una señal en estructuras anteriores, particularmente en la región apical de las
células del estomodeo (Figura 12, B). Esta señal anterior persiste hasta embriones de
estado 15, en el atrio (Figura 12, B). En este estado del desarrollo se detecta además
señales fuertes en el árbol de las tráqueas y en las glándulas salivales (Figura 12, C).
Interesantemente, la señal detectada en las glándulas salivales es consistente a lo
largo de todo su desarrollo: la señal es detectada desde embriones de estado 11 en el
primordio de las glándulas, cuando estas están en etapas tempranas de su
invaginación (Figura 13, A) y persiste hasta la larva (Figura 13, C). La figura 13, B,
muestra en detalle la localización de la proteína RhoGEF3 en las glándulas salivales en
embriones de estado 14, cuando ellas ya han completado su internalización y
migración hacia posterior y están formadas por células epiteliales columnares con su
extremo apical rodeando un lumen central (Myat, 2005). Podemos observar que la
proteína RhoGEF3 posee una distribución apical, tomando como referencia la posición
de los núcleos de estas células, en esta etapa el lumen de la glándula está iniciando su
expansión (Figura 13, B). Esta observación es apoyada mediante el análisis de la
distribución subcelular de RhoGEF3 en las glándulas de larvas de estado 2 (Figura 13,
C), en ellas es detectada en el dominio de expresión de la actina, la cual se encuentra
enriquecida en la membrana apical de estas células (Myat, 2005).
- 83 -
A
Estado 7
P
B
A
E
Estado 9
C
Estado 15
Estado 15
T
GS
Instituto Leloir, Argentina.
Figura 12. Expresión de la proteína RhoGEF3 en embriones de Drosophila.
Imágenes representativas de inmunofluorescencias indirectas de embriones completos
utilizando el anticuerpo α-RhoGEF3 (dilución 1:10) y un anticuerpo secundario
acoplado al fluoróforo Alexa-546 (dilución 1:250, Molecular Probes). Los embriones
están orientados con anterior hacia la derecha y dorsal hacia arriba. En cada panel se
indican en el estado del desarrollo y las estructuras en las cuales se detecta la proteína
RhoGEF3: P: Proctodeo; E: Estomodeo; A: Atrio; GS: Glándulas Salivales; T: Árbol de
las Tráqueas. Las barras indican 20 (A, derecha) y 50 µm.
- 84 -
A
Estado 11
GS
B
Abrams y cols., 2003
DNA
Estado 14
RhoGEF3
GS
Abrams y cols., 2003
C
Larva
RhoGEF3
Actina
Fusión
- 85 -
Figura 13. Expresión de la proteína RhoGEF3 en las glándulas salivales.
Imágenes representativas de inmunofluorescencias indirectas en embriones completos
utilizando el anticuerpo α-RhoGEF3 (dilución 1:10) y un anticuerpo secundario
acoplado al fluoróforo Alexa-546 (Rojo, dilución 1:250, Molecular Probes). El DNA fue
teñido con la sonda ToPro3-Alexa 642-661 (Azul, dilución 1:200, Molecular Probes) y la
actina fue teñida con la sonda Faloidina-Alexa 488 (Verde, dilución 1:200, Molecular
Probes). A) Vistas laterales con los embriones orientados con anterior hacia la
izquierda y dorsal hacia arriba. B) Vistas dorsales con anterior hacia la izquierda. En
cada panel se indica el estado del desarrollo y se incluyen esquemas de la forma y
ubicación de las glándulas salivales. C) Glándulas de larvas fueron extraídas y
montadas sobre portaobjetos. GS: Glándulas Salivales. Barras amarillas indican 20 µm
y barras blancas indican 50 µm.
- 86 -
Inmunofluorescencias indirectas realizadas con el suero pre-inmune confirman que
este patrón es específico de RhoGEF3 ya que en estos experimentos no se detectan
las señales detalladas anteriormente (datos no mostrados).
1.3.3. Distribución de RhoGEF3 respecto a marcadores moleculares.
Con el propósito de estudiar en mayor detalle la localización de RhoGEF3 en
las glándulas salivales de embriones de estado 14, se comparó su localización
subcelular con la localización de la proteína Crumbs, que se expresa en estas
estructuras (Myat y Andrew, 2002). Crumbs participa en la regulación de la adhesión y
la polaridad celular y es detectada en la región apico-lateral de la membrana,
concentrada entre los bordes de las células (Tepass y cols., 1990). Las glándulas
salivales están compuestas por dos grupos de células, las células secretorias y las
células del ducto (Figura 14, A; Myat, 2005; Maybeck y Roper, 2008). Crumbs se
distribuye en ambos tipos celulares, los cuales pueden ser diferenciados por el tamaño
de su lumen (Figura 14, B y C) dejando en evidencia que RhoGEF3 se distribuye
exclusivamente en las células secretorias ya que no es detectada en las células del
ducto (Figura 14, B y C). RhoGEF3 y Crumbs son detectadas en distintos dominios
subcelulares: RhoGEF3 es detectada más cerca del lumen que Crumbs sugiriendo que
RhoGEF3 se encuentra enriquecida en la membrana apical.
En conjunto, los resultados obtenidos sugieren que RhoGEF3 es una proteína
que podría participar en la diferenciación de las glándulas salivales del embrión de
Drosophila y posiblemente de otras estructuras tubulares, tales como tráqueas e
intestino.
- 87 -
A
B
Células secretorias
Crumbs
RhoGEF3
Células
del ducto
Maybeck y Roper, 2008
C
Crumbs
RhoGEF3
Fusión
D
Crumbs
RhoGEF3
Fusión
- 88 -
Figura 14. Comparación de las localización subcelulares de RhoGEF3 y Crumbs
en glándulas salivales del embrión de Drosophila. Imágenes representativas de
Inmunofluorescencias indirectas en embriones completos utilizando los anticuerpo αRhoGEF3 (dilución 1:10) y α-Crumbs (dilución 1:10, DSHB) los cuales fueron
detectados con anticuerpos secundarios acoplados a los fluoróforos Alexa-546 (Rojo,
dilución 1:250, Molecular Probes) y Alexa-488 (Verde, dilución 1:500, Molecular
Probes), respectivamente. A) Esquema que representa una vista dorsal de las
glándulas salivales, indicando las distintas células que la componen. B-D) Vistas
laterales de glándulas salivales de embriones de estado 14, en distintas
magnificaciones. Las barras indican 20 µm.
- 89 -
2. Determinar in vitro la capacidad de la proteína RhoGEF3 de funcionar como
intercambiador de nucleótidos de Rho/Rac GTPasas y de reorganizar el
citoesqueleto de actina.
2.1. Experimentos de pérdida y ganancia de función en líneas celulares.
Con el objetivo de determinar la capacidad de RhoGEF3 de promover cambios
en la reorganización del citoesqueleto de actina, se realizaron experimentos de
ganancia y pérdida de función de RhoGEF3, mediante la transfección de vectores de
expresión y dsRNAs en cultivos de células de S2 y S2R+ de Drosophila.
2.1.1. Sobreexpresión de la región carboxilo-terminal de la proteína RhoGEF3 en
células S2.
Se realizaron experimentos de ganancia de función en células S2 mediante la
sobreexpresión de una proteína recombinante, RhoGEF3-∆N, compuesta por la
porción carboxilo-terminal de la proteína RhoGEF3, que contiene los dominios DH y PH
pero carece del dominio SH3. Este experimento obedece al supuesto de que el
dominio DH por si solo puede funcionar como un factor de intercambio de nucleótidos
constitutivamente activo.
Se amplificó por PCR, a partir de cDNA de embriones, la secuencia codificante
carboxilo-terminal de la proteína RhoGEF3-PA (aminoácidos 504 a 1011, Figura 15, A),
excluyendo el codón de término, y se clonó directamente en el vector pMT/V5/His Topo
(Invitrogen). Este vector de expresión posee el promotor de la metalotioneina, inducible
por CuSO4, y dirige la expresión de una proteína recombinante fusionada a un dominio
carboxilo-terminal V5-hexahistidina que permite su reconocimiento mediante
- 90 -
A
N-
B
PH
DH
1
2
V5
3
-C
4
120 kDa
62 kDa
Figura 15. Optimización de la expresión de la proteína recombinante RhoGEF3DN-V5 en células S2. A) Esquema que muestra los dominios DH (rojo), PH (azul) y el
epítope V5 (Verde) de la proteína recombinante RhoGEF3-DN-V5. B) Lisados de
cultivos de células S2 transfectadas por 5 horas con el vector control (pMT/LacZ,
Invitrogen, carril 1), y transfectadas con el vector de expresión de la proteína
RhoGEF3-DN-V5, por 5 horas (carril 2), 12 horas (carril 3) y 24 horas (carril 4). Las
muestras fueron fraccionadas en geles de poliacrilamida al 12% y electrotransferidas a
membranas de PVDF. Las proteínas recombinantes fueron detectadas con un
anticuerpo monoclonal α-V5 (Sigma, dilución 1:3000). Carril 2-4, proteína recombinante
RhoGEF3-DN-V5 (62 kDa); carriles 1, control positivo de transfección, corresponde a la
proteína b-galactosidasa fusionada con el epítope V5 (120 kDa). Los pesos
moleculares se indican en la figura.
- 91 -
inmunoensayos con anticuerpos α-V5 y su purificación por cromatografía de afinidad
con columnas de Agarosa-Níquel. El fragmento de PCR amplificado incluye un codón
de inicio (ATG) y una secuencia Kosak (ACC) en su extremo 5´, necesaria para la
traducción del transcrito expresado (Cavener, 1987). La orientación del inserto fue
verificada a través de patrones de digestión con enzimas de restricción y los clones
seleccionados fueron secuenciados. Este vector de expresión fue purificado y utilizado
en experimentos de transfección de células S2 con el método de liposomas
policatiónicos. Inicialmente se realizaron experimentos de optimización de la
transfección modificando el tiempo de incubación de las células con el complejo DNAliposoma. Los resultados fueron examinados mediante western blot utilizando el
anticuerpo α-V5 (Figura 15, B). Brevemente, las células se incubaron con el complejo
DNA-liposoma por un tiempo determinado, a continuación las células se incubaron en
medio completo por 2 días y finalmente se indujo la expresión de la proteína
recombinante mediante la incubación en presencia de 0.5 mM de CuSO 4 durante 24 h.
Se realizó un experimento control de la transfección con el vector pMT/LacZ
(Invitrogen), que codifica para una proteína recombinanteβ -galactosidasa fusionada al
epítope V5 de 120 kDa (Figura 15 B, carril 1). Se logró expresar la proteína
recombinante RhoGEF3-∆N-V5 (62 kDa) en todos los tiempos de incubación probados:
5 horas (Figura 15 B, carril 2), 12 horas (Figura 15 B, carril 3), y 24 horas (Figura 15 B,
carril 4). Se concluyó que la incubación de 24 horas con el complejo DNA-liposomas
produce una mayor cantidad de proteína recombinante RhoGEF3-∆N-V5.
Una vez estandarizado el protocolo de transfección se procedió a examinar los
fenotipos
de
células
que
expresan
la
proteína
recombinante
mediante
Inmunofluorescencias indirectas utilizando el anticuerpo α-V5. Transcurridas 24 h de
- 92 -
inducción de la expresión de RhoGEF3-∆N-V5, las células fueron sembradas sobre
cubreobjetos previamente tratados con Concanavalina A (Sigma), lo que permite que
las células S2, que normalmente crecen en suspensión, se adhieran a los
cubreobjetos.
La
Figura
16
muestra
imágenes
representativas
de
Inmunofluorescencias indirectas de células cuya actina polimerizada fue teñida con
Faloidina-Alexa-546 (rojo), y la proteína RhoGEF3-∆N-V5 fue detectada utilizando el
anticuerpo α-V5 y un anticuerpo secundario acoplado a Alexa-488 (verde). Las células
S2 que no expresan la proteína RhoGEF3-∆N-V5 y que han sido sembradas sobre
Concanavalina A, presentan aproximadamente 20 µm de diámetro, se encuentran
completamente extendidas y adheridas al sustrato por una gran lamela que
generalmente rodea de manera homogénea toda la circunferencia de la célula (Figura
16, A, flechas blancas). La expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-∆N-V5 no
genera ninguna diferencia significativa sobre este fenotipo (Figura 16, B, flechas
amarillas). Estas células se adhieren de forma normal y extienden la lamela de manera
similar a las células no transfectadas, indicando que la expresión de esta proteína
recombinante no tiene efectos sobre la morfología de la célula y no es capaz de inducir
cambios evidentes en la reorganización del citoesqueleto de actina.
- 93 -
A
Actina
B
RhoGEF3-ΔN-V5
Figura 16. Expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-ΔN-V5 en células S2.
Imágenes representativas de inmunoflurescencias indirectas de células S2 en cultivo,
transfectadas con el vector de expresión de la proteína RhoGEF3-ΔN-V5. El panel A
muestra las células teñidas con faloidina-Alexa 546 (Molecular Probes, dilución 1:200,
Rojo) y en el panel B las mismas células teñidas con el anticuerpo monoclonal α-V5
(Sigma, dilución 1:500) y el anticuerpo secundario α-Mouse-Alexa 488 (Molecular
Probes, dilución 1:500, Verde). Las flechas blancas indican células que no
sobreexpresan la proteína recombinante y las flechas amarillas señalan una célula que
expresa la proteína recombinante. Las células fueron sembradas sobre Concanavalina
A (Sigma, 0,5 mg/mL) con el objetivo de adherirlas al sustrato, lo que ocasiona que las
células adquieran una forma expandida, lo que facilita la observación del citoesqueleto.
La barra blanca indica 10 µm.
- 94 -
2.1.2. Sobreexpresión de la proteína RhoGEF3-V5 en células S2.
Tomando en cuenta el resultado anterior, es posible proponer que en un modelo
in vivo la proteína RhoGEF3 deba estar completa para conectarse con elementos
situados rio arriba o rio abajo en la cascada de señalización que la contiene. Con el
propósito de evaluar esta hipótesis, se construyó un vector de expresión que codifica la
proteína RhoGEF3 completa. Para ello, se amplificó por PCR, a partir de cDNA de
embriones, la secuencia codificante completa de la proteína RhoGEF3-PA (aa 1 a
1011), excluyendo el codón de término y se clonó en el vector de expresión
pMT/V5/His Topo (Invitrogen). Los procedimientos de transfección e inducción de la
proteína recombinante RhoGEF3-V5 fueron aquellos descritos en 2.1.1. La Figura 17
muestra imágenes representativas de inmunofluorescencias indirectas de células S2
sembradas sobre Concanavalina A. Las células fueron teñidas con Faloidina-Alexa-546
(rojo) para visualizar la actina polimerizada y con el anticuerpo α-V5 para detectar la
proteína RhoGEF3-V5 (verde). Al analizar diferentes planos focales en esta
preparación, es posible observar en una célula que no expresa RhoGEF3-V5 una
concentración subcortical de actina en el borde de la lamela, mientras que al interior de
la célula se distribuye homogéneamente en puntos brillantes que disminuyen
paulatinamente en intensidad y frecuencia hacia el centro de la célula (Figura 17, A).
Además se observa que la fluorescencia se concentra en un solo plano focal. Las
células que expresan la proteína recombinante RhoGEF3-V5 (Figura 17, B), poseen
una lamela de características similares a las descritas para la célula que no expresa la
proteína recombinante. Sin embargo, en la célula que expresa la proteína
recombinante, la fluorescencia se detecta en un mayor número de planos focales que
muestran estructuras complejas de actina polimerizada, en forma de espirales, que
- 95 -
A
Actina
RhoGEF3-V5
Fusión
B
- 96 -
Figura 17. Expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-V5 en células S2.
Imágenes representativas de Inmunoflurescencias indirectas de cultivos de células S2
transfectadas con el vector de expresión de la proteína RhoGEF3-V5, sembradas
sobre Concanavalina A. La columna de la izquierda muestra las células teñidas con
faloidina-Alexa-546 (Molecular Probes, dilución 1:200, Rojo), la columna central
muestra las células teñidas con el anticuerpo monoclonal α-V5 (Sigma, dilución 1:500)
y el anticuerpo secundario α-Mouse-Alexa 488 (Molecular Probes, dilución 1:500,
Verde) y la columna de la derecha muestra la fusión de ambas imágenes. A) Un plano
focal de una célula no transfectada que muestra la distribución de la actina lo que
permite visualizar la lamela característica de las células. B) Tres planos focales (filas)
de una célula que expresa la proteína recombinante RhoGEF3-V5 (verde). La barra
indica 10 µm.
- 97 -
están totalmente ausentes en las células que no expresan RhoGEF3-V5. Este
resultado sugiere que la proteína recombinante RhoGEF3-V5, en un modelo in vivo,
promueve la polimerización de la actina.
2.1.3. Sobreexpresión de RhoGEF3 en células S2R+.
Debido a que las células S2 deben ser sembradas sobre concanavalina A para
lograr su adhesión, es posible que el fenotipo observado luego de la expresión de la
proteína recombinante RhoGEF3-V5 se deba al efecto combinado de la sobreexpresión y del uso de la Concanavalina A. En este sentido, se ha descrito que la
Concanavalina A es un ligando que activa la GTPasa Rac 1 en la célula S2 y debido a
esta activación se forma la lamela que le confiere la adhesión al sustrato (Rogers y
cols., 2003). Con el propósito de evaluar esta posibilidad se realizaron experimentos de
expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-V5 en células S2R+ de Drosophila.
Las células S2R+ derivan de las células S2, pero se caracterizan por ser adherentes y
por lo tanto pueden ser sembradas directamente sobre cubreobjetos sin necesidad de
agregar Concanavalina A. Las células S2R+ fueron transfectadas y la proteína
recombinante RhoGEF3-V5 fue inducida e inmunodetectada de acuerdo con los
protocolos descritos en 2.1.1. El fenotipo de una célula S2R+ que no expresa
RhoGEF3-V5 difiere notablemente de las células S2 sembradas sobre Concanavalina
A. La célula S2R+ carece de lamela y en su lugar se observan filopodios distribuidos
radialmente hacia el exterior de la célula, los cuales pueden diferir en tamaño (Figura
18, A y B). La expresión de la proteína RhoGEF3-V5 provoca notables cambios
morfológicos en estas células (Figura 18, A). En primer término no se observan
filopodios y en su lugar se detecta la formación de una lamela que rodea toda la
- 98 -
circunferencia de la célula, de manera similar a lo observado en células S2 sembradas
sobre Concanavalina A. En estas células se observa nuevamente la aparición de
estructuras de actina localizadas en el centro de la célula y que pueden ser
evidenciadas al realizar una reconstrucción computacional en 3D a partir de varios
planos focales (Figura 18, A).
La transfección con este vector de expresión fue notablemente menos eficiente
que la lograda con el vector de expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-∆NV5. Con el propósito de mejorar la eficiencia de transfección se construyó un nuevo
vector de expresión basado en el sistema UAS-Gal4 de levadura. Este sistema
consiste en la co-transfección de dos vectores: el primero es el vector pMT-Gal4, un
vector de expresión inducible por CuSO 4 que codifica la proteína Gal4, un activador
transcripcional que reconoce las secuencias UAS (Upstream Activation Sequence); el
segundo vector posee secuencias UAS rio arriba de la región codificante de la proteína
que interesa expresar. Para construir un vector que exprese una proteína recombinante
RhoGEF3, bajo el control del sistema UAS-Gal4, se amplificó por PCR desde cDNA de
embriones la secuencia codificante completa de la proteína RhoGEF3-PA, excepto el
codón de término, precedida de una secuencia Kosak (CAAC) en su extremo 5´. Este
amplicón fue clonado en el vector pCR 2.1 Topo y posteriormente fue liberado por
digestión con la enzima de restricción EcoRI y sub-clonado en el sitio EcoRI del vector
pUAST que expresa una proteína recombinante fusionada a un dominio carboxiloterminal Myc-hexahistidina (Zúñiga y cols., 2009). Así, la co-transfección de estos
vectores en una misma célula resulta en la expresión de la proteína recombinante
RhoGEF3-Myc. La transfección de las células y la inducción de la expresión de
RhoGEF3-Myc se llevo a cabo siguiendo el protocolo descrito anteriormente. La Figura
- 99 -
18 B muestra imágenes representativas de inmunofluorescencias indirectas de células
co-tranfectadas con los vectores pMT-Gal4 y pUAS- RhoGEF3-Myc e incubadas con
Faloidina-Alexa-546 (rojo), con el anticuerpo α-Myc (verde) y con la sonda ToPro3Alexa-624 (azul) con el objetivo de visualizar los núcleos de las células. Como se
observa en la Figura 18 B, las células que no expresan la proteína recombinante
poseen una gran cantidad de filopodios, en contraste con la célula que expresa la
proteína recombinante, que presenta una lamela alrededor de toda su circunferencia.
Los resultados son muy similares a los descritos para la proteína recombinante
RhoGEF3-V5, corroborando que los fenotipos observados se deben a la expresión de
la proteína RhoGEF3 recombinante. Estos resultados en su conjunto indican que la
proteína RhoGEF3 es capaz de inducir cambios en la polimerización o remodelación
de la organización del citoesqueleto de actina. Particularmente promueve la formación
de una lamela, sugiriendo que actuaría a través de la activación de la GTPasa Rac1
(Jaffe y Hall, 2005).
- 100 -
A
Actina
RhoGEF3-V5
Fusión
B
Actina
RhoGEF3-Myc
Fusión
- 101 -
Figura 18. Expresión de proteínas recombinantes RhoGEF3 en células S2R+.
Imágenes representativas de Inmunoflurescencias indirectas de cultivos de células
S2R+ transfectadas con el vector de expresión de la proteína RhoGEF3-V5 (A), o el
vector de expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-Myc (B) sembradas
directamente sobre cubreobjetos. La columna de la izquierda muestra las células
teñidas con faloidina-Alexa-546 (Molecular Probes, dilución 1:200, Rojo), la columna
central muestra las células teñidas con el anticuerpo monoclonal α-V5 (Sigma, dilución
1:500) o el anticuerpo monoclonal α-Myc (DSHB, dilución 1:20) y el anticuerpo
secundario (Molecular Probes, dilución 1:500, Verde) y la columna de la derecha
muestra la α-Mouse-Alexa 488 fusión de ambas imágenes y en el B se agrega además
una imagen de las células teñidas con la sonda ToPro-Alexa 642-661 (Molecular
Probes, dilución 1:200) que reconoce el DNA. El fenotipo de las células que no
expresan RhoGEF3-Myc se caracteriza por la presencia de un número variable de
prolongaciones del tipo filopodios. La célula que expresa la proteína recombinante en
cambio es más redondeada y no muestra filopodios, en su lugar, la célula desarrolla
una gran lamela. La barra indica 10 µm.
- 102 -
2.1.4. Pérdida de función en células S2R+.
De forma complementaria se realizaron experimentos de pérdida de función
parcial del rhogef3 en células S2R+ utilizando la tecnología de RNA interferente. En
paralelo, se examinó cual o cuales GTPasas son blancos de la actividad de RhoGEF3,
mediante un análisis del fenotipo celular inducido por el silenciamiento de los genes
que codifican las tres GTPasas principales de Drosophila: Rho1, Rac1 y Cdc42.
Inicialmente se verificó la presencia del transcrito de rhogef3 en células mediante PCR
a partir de cDNA representativo de RNA extraído de células S2R+. Se logró amplificar
un fragmento del tamaño esperado, indicando que el transcrito está presente y por lo
tanto la tecnología de RNA interferente es aplicable a estas células (datos no
mostrados).
Para inducir el fenómeno de interferencia del RNA, las células fueron
transfectadas con RNA de doble hebra (dsRNA) de los genes de interés. Para ello,
fragmentos de PCR que representan la secuencia codificante completa de las
proteínas Rho1, Rac1 y Cdc42 y un fragmento del exón 4 del gen rhogef3 fueron
clonados en el vector pCR 2.1 Topo, que posee las secuencias promotoras de las
polimerasas SP6 y T7 flanqueando la región de clonamiento. Estos vectores fueron
utilizados como sustrato para generar productos de PCR con partidores que alinean en
las regiones promotoras. Los fragmentos de PCR fueron purificados y utilizados como
sustrato en reacciones de síntesis de RNA in vitro con las polimerasas SP6 y T7,
generando RNAs de hebra simple, sentido y antisentido, por separado. Finalmente
estas hebras fueron alineadas para formar el dsRNA.
Inicialmente el dsRNA dirigido contra rho1 permitió estandarizar la técnica
debido a que el fenotipo celular inducido por el silenciamiento de este gen ha sido
- 103 -
descrito y es fácilmente reconocible (Kiger y cols., 2003). Además es posible evaluar
fácilmente la efectividad del silenciamiento a nivel de acumulación de proteína ya que
existen anticuerpos comerciales dirigidos contra la proteína Rho1 de Drosophila. En
este experimento, se co-transfectaron las células S2R+, mediante la técnica de
liposomas policationicos, con una mezcla de 5 µg de dsRNA de rho1, 100 ng del vector
pMT-Gal4 y 1 µg el vector pUASp-GFP que expresa la proteína GFP, con el propósito
de detectar las células transfectadas. Luego de una incubación en presencia del
complejo formado por el dsRNA, DNA y liposomas, las células fueron incubadas en
medio completo durante 7 días para lograr el silenciamiento de rho1. Al cabo de este
tiempo, una fracción de células fue sembrada sobre cubreobjetos y utilizadas para
ensayos de tinción con sondas fluorescentes y otra fue tratada para ensayos de
western blot. Como control se utilizó un cultivo de células transfectadas en paralelo con
los vectores pMT-Gal4 y pUASp-GFP pero sin el dsRNA dirigido contra rho1. Ensayos
de western blot con extractos de proteínas totales de células control (-dsRNA) y
tratadas (+dsRNA) y un anticuerpo monoclonal α-Rho1 (DSHB, Developmental Studies
Hybridoma Bank) muestran que la proteína Rho1, de 21 kDa es detectada en las
células control, pero no es detectada en las células tratadas con el dsRNA de rho1
(Figura 19, A). Para verificar que la cantidad de proteína total en ambas muestras era
equivalente las membranas fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal α-Tubulina
(DSHB). Este resultado indica que el dsRNA utilizado es capaz de suprimir la expresión
del transcrito de rho1 y que al cabo de 7 días de tratamiento no existen niveles
detectables de proteína Rho1. La observación de los fenotipos de las células controles
y tratadas verifica el resultado del análisis de western blot. La pérdida de función de la
proteína Rho1 inhibe la formación de anillos contráctiles de actina alrededor de la
- 104 -
célula impidiendo la división celular y generando células multinucleadas (Kiger y cols.,
2003). Este fenotipo es evidente al comparar células control con células tratadas en las
placas de cultivo (Figura 19 B, panel superior, campo claro). Células fijadas y teñidas
con las sondas Faloidina-Alexa-546 (rojo) y ToPro3-Alexa-642-611 (azul) permiten
observar que las células tratadas son de mayor tamaño, efectivamente poseen a lo
menos dos núcleos por célula y aun conservan filopodios similares a los detectados en
células control (Figura 19 B, panel inferior). Si bien solo una fracción de las células
expresa la proteína GFP, detectada por la emisión de fluorescencia a 488 nm (verde),
todas las células tratadas con el dsRNA muestran el fenotipo multinucleado, indicando
que con este protocolo el dsRNA logra una mayor eficiencia de transfección respecto al
DNA plasmidial. Estos resultados indican que la tecnología de interferencia de RNA
funciona de manera adecuada, logrando disminuir la cantidad de proteína y
provocando cambios característicos en la morfología celular (Kiger y cols., 2003).
En una segunda etapa se examinaron los fenotipos producidos por la
transfección de dsRNAs dirigidos contra las GTPasas Cdc42 y Rac1 y contra
RhoGEF3. Siguiendo el protocolo anteriormente descrito, se transfectaron células solo
con liposomas policatiónicos, para evaluar el efecto del vehículo de transfección sobre
el fenotipo de las células (Figura 20, A), y complejos liposomas-dsRNA dirigidos contra
cdc42 (Figura 20, B), contra rac1 (Figura 20, C) y contra rhogef3 (Figura 20, D). Las
células fueron sembradas sobre cubreobjetos y teñidas con las sondas FaloidinaAlexa-546 para visualizar la actina polimerizada (rojo) y ToPro3-Alexa-642-611 para
visualizar el DNA (azul). Las células tratadas solo con liposomas presentan un fenotipo
absolutamente normal, las células están adheridas y poseen numerosos filopodios de
aspecto y tamaño normal (Figura 20, A). El silenciamiento del gen cdc42 provoca
- 105 -
- dsRNA
A
+ dsRNA
α-Rho1
21 kDa
α-Tubulina
47 kDa
B
Campo
Claro
Actina
DNA
GFP
Figura 19. Transfección con dsRNA dirigido contra rho1. Células S2R+ fueron
transfectadas con un RNA de doble hebra (dsRNA) dirigido contra el transcrito del gen
rho1. A) Lisados de células control (-dsRNA) y tratadas (+dsRNA) fueron fraccionados
en geles de poliacrilamida al 15%, electrotransferidas a membranas de PVDF y
utilizadas en ensayos de western blot con los anticuerpos α-Rho1 (DSHB, dilución
1:50) y α-Tubulina (DSHB, dilución 1:50) de Drosophila. B) Imágenes representativas
de células en cultivo (arriba) y células fijadas (abajo) teñidas con faloidina-Alexa-546
(Molecular Probes, dilución 1:200, Rojo), ToPro3-Alexa 642-611 (Molecular Probes,
dilución 1:200 (abajo). En verde la proteína GFP. La barra indica 10 µm.
- 106 -
cambios sobre la morfología celular, particularmente en el número y tamaño de los
filopodios. Estos están presentes en menor número y de mayor tamaño, y además la
fluorescencia es más intensa sugiriendo una mayor concentración de actina
polimerizada, especialmente en puntos discretos dentro del filopodio (Figura 20 B,
panel izquierdo, flechas amarillas). En el caso del silenciamiento del gen rac1, las
diferencias con las células control son más sutiles y se manifiestan principalmente en
un mayor número de filopodios, y aunque su morfología general es similar a las células
control, la actina polimerizada parece estar más concentrada en los filopodios, de
manera homogénea que en el caso del silenciamiento de cdc42 (Figura 20, C).
Interesantemente, este fenotipo, aunque sutil, es similar al silenciamiento de rhogef3
(Figura 20, D). Con el propósito de verificar el silenciamiento del transcrito rhogef3, se
realizó una medición mediante qPCR utilizando como sustrato cDNA sintetizado a
partir de RNA total de células control y tratadas con el dsRNA de RhoGEF3. El
resultado indica que la abundancia relativa del transcrito rhogef3 disminuye a menos
del 10% en células tratadas respecto a células control, indicando que se logra el
silenciamiento del gen rhogef3 (datos no mostrados).
Considerando que el fenotipo de sobreexpresión de RhoGEF3 sugiere la
activación de Rac1 y la similitud de fenotipos resultantes del silenciamiento de los
genes rac1 y rhogef3, se examinó el efecto sobre el fenotipo del silenciamiento de
estos genes en células S2R+ sembradas sobre concanavalina A, es decir, células que
tengan activada la GTPasa Rac1, bajo el supuesto de que si participan en la misma
vía, en estas condiciones deberían tener efectos similares sobre las células. Como
control negativo de este experimento se utilizó un dsRNA dirigido contra el gen
bacteriano pLys, que no está presente en las células de Drosophila. El recuento de
- 107 -
Actina DNA
Actina DNA
A
B
C
D
- 108 -
Figura 20. Transfección de dsRNAs dirigidos contra cdc42, rac1 y rhogef3 en
células S2R+. Imágenes representativas de células sembradas sobre cubreobjetos,
fijadas y teñidas con faloidina-Alexa 546 (Molecular Probes, dilución 1:200, rojo) y
ToPro3-Alexa-642-611 (Molecular Probes, dilución 1:200, azul). Los filas corresponden
a células control transfectadas sin dsRNA (A), transfectadas con dsRNA dirigido contra
el transcrito de cdc42 (B), transfectadas con dsRNA dirigido contra el transcrito de rac1
(C) y transfectadas con dsRNA dirigido contra el transcrito de rhogef3 (D). La barra
indica 10 µm. Las flechas amarillas indican una acumulación de actina en los
filopodios de células transfectadas con dsRNA dirigido contra cdc42.
- 109 -
células viables con el método de tinción por azul tripán reveló que 7 días después de la
transfección con los dsRNAs, el número de células viables tratadas con el dsRNA
control es dos veces mayor que el número inicial de células transfectadas (300.000).
En contraste, el número de células viables tratadas con el dsRNA de rac1 disminuyó a
la mitad (140.000), mientras que el número de células viables tratadas con el dsRNA
de rhogef3 disminuyó a un tercio (110.000). Igual número de células viables de cada
tratamiento fueron sembradas sobre cubreobjetos tratados con Concanavalina A, 60
minutos antes de ser fijadas. Las células fueron teñidas con Faloidina-Alexa-546 y
ToPro3-Alexa-642-611. La Figura 21 muestra imágenes representativas de células
tratadas con el dsRNA control (Figura 21, A), tratadas con el dsRNA de Rac1 (Figura
21, B) y dsRNA de RhoGEF3 (Figura 21, C). En las imágenes se observa que la
mayoría de las células tratadas con el dsRNA control extienden una lamela normal,
aunque una minoría de células presenta problemas de adhesión, es decir células con
la lamela no completamente extendida o bien carentes de ella (Figura 21, A). En el
caso de las células tratadas con dsRNA dirigido contra rac1 ocurre lo contrario: las
células que poseen una lamela bien extendida son un pequeño porcentaje respecto a
células que muestran lamelas parcialmente extendidas o carecen completamente de
ellas (Figura 21, B). Esta distribución se repite en las células tratadas con el dsRNA
dirigido contra rhogef3, (Figura 21, C). Un examen más detallado de estas células
permite distinguir tres fenotipos: el primero, una célula con una lamela rodeando al
menos el 50% de la célula (Figura 22 A, izquierda), el segundo se manifiesta por una
lamela irregular que cubre menos del 50% de la circunferencia de la célula (Figura 22
A, centro) y un tercer fenotipo ausente de lamela (Figura 22 A, derecha). En el caso de
las células tratadas con el dsRNA control, de un total de 189 células examinadas, el
- 110 -
Actina
DNA
A
B
C
- 111 -
Figura 21. Transfección de dsRNAs dirigidos contra rac1 y rhogef3 en células
S2R+ sembradas sobre concanavalina A. Imágenes representativas de células
transfectadas con dsRNA control dirigido contra el transcrito bacteriano plys (A),
dsRNA dirigido contra el transcrito del gen rac1 (B) y dsRNA dirigido contra el transcrito
del gen rhogef3 (C). Las células fueron fijadas, sembradas sobre cubreobjetos tratados
con 0.5 mg/mL de Concanavalina A (Sigma) y teñidas con faloidina-Alexa-546
(Molecular Probes, dilución 1:200, columna izquierda) y ToPro3-Alexa-624 (Molecular
Probes, dilución 1:200, columna derecha). La barra indica 50 µm.
- 112 -
67% de ellas presenta un fenotipo normal, un 23% presenta una lamela irregular y un
10% carece de lamela. En el caso de las células tratadas con el dsRNA de rac1, de un
total de 184 células examinadas, solo un 30% muestra un fenotipo normal, un 46%
presenta una lamela irregular y un 24% no posee lamela. Interesantemente, en el caso
de las células tratadas con el dsRNA dirigido contra rhogef3, de un total de 195 células
examinadas, un 29% de ellas presenta un fenotipo normal, un 44% presenta una
lamela irregular, y un 28% no posee lamela. La Figura 22 B muestra un histograma que
resume este análisis. Estos resultados sugieren que tanto el silenciamiento del gen
rac1, así como el silenciamiento del gen rhogef3 afectan el mismo proceso celular, en
este caso, la formación de una lamela (P<0.05).
- 113 -
A
Lamela Normal
Lamela irregular Ausencia de lamela
B
12
Número de células
10
8
6
Lamela normal
Lamela irregular
4
Ausencia de lamela
2
0
dsRNA plys
dsRNA rac1
dsRNA rhogef 3
Tratamiento
- 114 -
Figura 22. Fenotipos observados en respuesta al tratamiento con dsRNAs. A)
Fenotipos observados en las preparaciones de células tratadas con los dsRNAs
dirigidos contra los transcritos de los genes plys (control), rac1 y rhogef3. Se observan
3 fenotipos distinguibles: lamela normal, que rodea mas del 50% de la circunferencia
de la célula (izquierda), fenotipo de lamela irregular, esta no alcanza a extenderse en el
50% de la circunferencia de la célula (centro) y una célula con ausencia de lamela
(derecha). Las células fueron fijadas, sembradas sobre cubreobjetos tratados con 0.5
mg/mL de Concanavalina A (Sigma) y teñidas con faloidina-Alexa-546 (Molecular
Probes, dilución 1:200, columna izquierda) y ToPro3-Alexa-642-661 (Molecular Probes,
dilución 1:200, columna derecha). La barra indica 10 µm. B) Histograma de frecuencias
en cada imagen adquirida (eje Y) de los tres fenotipos descritos en las distintas
condiciones (eje X). En total se examinaron 189 células tratadas con dsRNA dirigido
contra plys, 184 células tratadas con el dsRNA dirigido contar rac1 y 195 células
tratadas con el dsRNA dirigido contra rhogef3. El resultado de un análisis estadístico
ANOVA indica que para cada fenotipo observado las diferencias entre cada tratamiento
respecto al control son significativas (P<0.05).
- 115 -
Finalmente se examinó el efecto del silenciamiento del gen rac1 sobre el
fenotipo de células que sobre-expresan la proteína recombinante RhoGEF3-Myc. Para
ello se co-transfectó el dsRNA de rac1 y los vectores pMT-Gal4 y pUAST-RhoGEF3Myc en células S2R+. Las células fueron sembradas sobre cubreobjetos, fijadas y
teñidas con Faloidina-Alexa-546 (rojo), ToPro3-Alexa-624 (azul) y con el anticuerpo αMyc para detectar la proteína recombinante RhoGEF3-Myc (verde). Como se observa
en la Figura 23, el fenotipo de la célula que expresa RhoGEF3-Myc es indistinguible de
una célula que no la expresa, es decir, no se observa la formación de una lamela y en
su lugar se observan los filopodios típicos de una célula S2R+. Por el contrario, la
sobre-expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-Myc en células en las cuales
se silenció el gen cdc42 induce la formación de lamelas (Figura 24). Estos resultados
indican que la falta de función de Rac1, suprime el fenotipo de la expresión de
RhoGEF3-Myc y apoya el supuesto de que la proteína RhoGEF3 participa en la vía de
señalización de Rac1 en este modelo celular.
- 116 -
Actina
RhoGEF3-Myc DNA
Fusión
Figura 23. Expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-Myc en presencia del
dsRNA dirigido contra rac1 en células S2R+. Células co-transfectadas con el vector
de expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-Myc y el dsRNA dirigido contra el
transcrito del gen rac1. Las células fueron fijadas, sembradas sobre cubreobjetos y
teñidas con faloidina-Alexa-546 (Molecular Probes, dilución 1:200, columna izquierda) y
ToPro3-Alexa-642-611 (Molecular Probes, dilución 1:200, columna derecha) y la
proteína recombinante fue detectada con el anticuerpo monoclonal α-Myc (DSHB,
dilución 1:20) el cual fue detectado con al anticuerpo α-Mouse-Alexa-488 (verde,
Molecular Probes, dilución 1:500). La barra indica 10 µm.
- 117 -
Actina
RhoGEF3-Myc DNA
Fusión
Figura 24. Expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-Myc en presencia del
dsRNA dirigido contra cdc42 en células S2R+. Células co-transfectadas con el
vector de expresión de la proteína recombinante RhoGEF3-Myc y el dsRNA dirigido
contra el transcrito del gen cdc42. Las células fueron fijadas, sembradas sobre
cubreobjetos y teñidas con faloidina-Alexa-546 (Molecular Probes, dilución 1:200,
columna izquierda) y ToPro3-Alexa-642-611 (Molecular Probes, dilución 1:200,
columna derecha) y la proteína recombinante fue detectada con el anticuerpo
monoclonal α-Myc (DSHB, dilución 1:20) el cual fue detectado con al anticuerpo αMouse-Alexa-488 (verde, Molecular Probes, dilución 1:500). La barra indica 10 µm.
- 118 -
2.2.1. Ensayo de intercambio de GTP.
Con el propósito de verificar la especificidad de la proteína RhoGEF3 por la
GTPasa Rac1 se realizó un ensayo in vitro de intercambio de GTP. En este ensayo la
GTPasa se carga con GDP y se incuba con el factor de intercambio en presencia del
análogo de GTP, mant-GTP, que emite fluorescencia en la longitud de onda de 480 nm
al unirse a la GTPasa. La aparición de fluorescencia indica que el factor de intercambio
evaluado promueve el intercambio de GDP por GTP en el bolsillo de unión a nucleótido
de la GTPasa (Rojas y cols., 2003).
Para este ensayo se produjeron proteínas recombinantes de las GTPasas de
Drosophila y variantes de la proteína RhoGEF3 y de la proteína RhoGEF2, que se
utilizó como control positivo. Inicialmente se amplificaron por PCR a partir de cDNA de
embriones de Drosophila, las secuencias codificantes completas de las GTPasas
Rho1, Rac y Cdc42 y se clonaron en el vector pCR 2.1 Topo (Invitrogen). Los
fragmentos clonados fueron liberados mediante digestión con la enzima EcoRI y
purificados desde gel para separarlos del vector. Estos fragmentos fueron subclonados en el sitio EcoRI del vector de expresión en bacterias pGEX-6P1 (General
Electric). Este vector posee un promotor inducible por IPTG y dirige la expresión de
una proteína de fusión a la proteína GST (Glutation S-transferasa). El dominio GST
permite la purificación de la proteína recombinante mediante cromatografía de afinidad
en columnas de Agrosa-Glutation. La orientación de los fragmentos clonados fue
verificada mediante análisis de restricción y los clones seleccionados fueron
secuenciados. Utilizando una estrategia similar, se generaron dos vectores de
expresión: el primero posee un fragmento que codifica la proteína RhoGEF3 completa
(aa 1 a 1011) denominada RhoGEF3-GST, y el segundo, un fragmento que codifica
- 119 -
exclusivamente los dominios DH y PH (aa 505 a 888), denominada RhoGEF3-DHPHGST. Finalmente, se obtuvo un vector de expresión que codifica los dominios DH y PH
de la proteína RhoGEF2 fusionada a GST (Grosshans y cols. 2005). Estos vectores de
expresión fueron utilizados para transformar bacterias E. coli de la cepa BL21, que es
una cepa genéticamente modificada para suprimir la expresión de proteasas
endógenas, lo que permite obtener mayores cantidades de proteína recombinante
respecto de otras cepas de E. coli. Se determinó, para cada una de los vectores
generados, las condiciones óptimas de expresión de la proteína recombinante variando
la temperatura de crecimiento, concentración de IPTG, y tiempo de inducción. Una vez
estandarizados estos parámetros para cada una de las GTPasas (Figura 25, A) y de
las proteínas GEF (Figura 25, B), se procedió a la purificación de las proteínas
recombinantes mediante cromatografías de afinidad con columnas de AgarosaGlutatión, a partir de 1 L de cultivo inducido. Muestras de proteínas purificadas fueron
fraccionadas en geles de acrilamida y teñidas con azul de coomasie para visualizar las
GTPasas (Figura 26, A) y las proteínas GEF (Figura 26, B). Mediante esta técnica se
obtuvo un éxito relativo, si bien existen proteínas contaminantes, en la mayoría de los
casos la proteína de interés representa más del 90% de la proteína total obtenida. Los
mejores rendimientos se obtuvieron con las GTPasas (aproximadamente 4 mg/mL), sin
embargo para ambas proteínas RhoGEF3 el rendimiento fue menor (inferior a 0.5
mg/mL), debido principalmente a que la inducción de la expresión también fue menor
para estas proteínas.
En un primer ensayo de intercambio se utilizaron 40 pmoles de cada GTPasa,
las que fueron previamente incubadas en presencia de 10 µM de GDP, y en ausencia o
presencia de 5 pmoles de RhoGEF3-DHPH-GST. La Figura 27 A, muestra la emisión
- 120 -
A
PM
Rho1-GST
Rac1-GST
ni
ni
i
Cdc42-GST
i
ni
i
55 kDa
40 kDa
B
RhoGEF3-DHPH-GST
ni
i
RhoGEF3-GST
ni
RhoGEF2-DHPH-GST
i
ni
i
130 kDa
70 kDa
70 kDa
Figura 25. Expresión de proteínas recombinantes fusionadas a GST. Las
secuencias codificantes de las GTPasas de Drosophila Rho1, Rac1 y Cdc42 (A), y las
secuencias codificantes de la proteína RhoGEF3, de los dominios DH y PH de
RhoGEF3 (RhoGEF3-DHPH-GST) y de los dominios DH y PH de RhoGEF2
(RhoGEF2-DHPH-GST) (B) fueron clonadas en el vector de expresión pGEX para
generar proteínas de fusión con GST (Glutatión-S-Transferasa). Los vectores
producidos fueron usados para transformar bacterias E. coli BL21. Muestras de cultivos
de bacterias transformadas, inducidos (i) y no inducidos (ni) con IPTG, fueron
fraccionadas en geles de acrilamida al 10% y teñidos con azul de Coomasie. Los pesos
moleculares se indican en la figura.
- 121 -
PM
A
Rho1-GST
Rac1-GST
Cdc42-GST
55 kDa
40 kDa
B
RhoGEF3-GST RhoGEF3-DHPH-GST RhoGEF2-DHPH-GST
130 kDa
70 kDa
70 kDa
Figura 26. Purificación de proteínas recombinantes fusionadas a GST. Las
proteínas recombinantes Rho1-GST, Rac1-GST, Cdc42-GST (A), RhoGEF3-GST,
RhoGEF3-DHPH-GST y RhoGEF2-DHPH-GST (B) fueron purificadas a partir de
cultivos de bacterias E. coli BL21 transformadas con los respectivos vectores de
expresión. La expresión de las proteínas recombinantes fue inducida con IPTG. Luego
las bacterias fueron lisadas y la proteína soluble fue incubada con resina de AgarosaGlutatión. La resina fue lavada y las proteínas unidas a la resina fueron desplazadas
con Glutation 10 mM, colectadas en fracciones de 1 mL y dializadas contra tampón
para eliminar el Glutatión. Las proteínas purificadas fueron fraccionadas en geles de
Acrilamida al 10% y teñidas con azul de Coomasie. Los pesos moleculares se indican
en la figura.
- 122 -
de fluorescencia a 480 nm (eje Y) del mant-GTP medida durante el transcurso de 30
minutos de incubación (eje X). Como se observa en el gráfico, no se detecta cambio en
la fluorescencia en todas las mediciones en ausencia de la proteína recombinante
RhoGEF3-DHPH-GST, y tampoco en las reacciones correspondientes al control
negativo (ausencia de GTPasa) y a las GTPasas Rho1 y Cdc42 en presencia de la
proteína
recombinante
RhoGEF3-DHPH-GST.
En
cambio,
en
la
reacción
correspondiente a la GTPasa Rac1 incubada en presencia de la proteína recombinante
RhoGEF3-DHPH-GST se detectó un aumento de la fluorescencia emitida. Con estos
datos se estimó las veces de estimulación de intercambio de GTP por la proteína
recombinante RhoGEF3-DHPH-GST para cada GTPasa (Oleksy y cols., 2006),
calculada como la razón de cambio de fluorescencia durante los primeros 5 minutos de
medición en presencia de RhoGEF3-DHPH-GST respecto a la medición en ausencia
de RhoGEF3-DHPH-GST (Figura 27, B). Este análisis indica que el valor de veces de
estimulación de RhoGEF3-DHPH-GST sobre las GTPasas Rho1 y Cdc42 es similar al
obtenido para el control negativo y las veces de estimulación de intercambio de
RhoGEF3-DHPH-GST sobre la GTPasa Rac1 es de 80 veces. Este resultado indica
que el dominio DH de RhoGEF3 reconoce específicamente la GTPasa Rac1.
Sin embargo, este resultado corresponde a un único ensayo y no fue posible
reproducirlo. Además, el control positivo del ensayo, la estimulación del intercambio
para Rho1 por RhoGEF2-DHPH-GST tampoco fue detectada. Se barajaron dos
posibles explicaciones: la primera es que la estabilidad de las proteínas recombinantes
es muy baja y la segunda es que las proteínas no alcanzaron el grado de pureza
adecuado. Se realizaron nuevas purificaciones y las proteínas recuperadas fueron
almacenadas en distintas concentraciones de glicerol con el propósito de otorgarles
- 123 -
A
900
Rho1
800
Fluorescencia
(unidades arbitrarias)
Rho1 + RhoGEF3
700
Rac1
600
Rac1 + RhoGEF3
500
400
Cdc42
300
Cdc42 + RhoGEF3
200
Amortiguador
Tampón
100
Tampón + +
Amortiguador
RhoGEF3
RhoGEF3
0
0
500
1000
1500
B
Veces de estimulación
Tiempo (segundos)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Rho1-GST
Rac1-GST
Cdc42-GST
Tampón
amortoguador
Figura 27. Ensayo de intercambio de GDP in vitro. Cada GTPasa (40 pmol)
precargada con GDP fue incubada en presencia y ausencia de 5 pmol de proteína
recombinante RhoGEF3-DHPH-GST. A) Curso temporal de la fluorescencia emitida
como resultado de la unión de mant-GTP (Molecular Probes, 500 nM) a las GTPasas.
B) Veces de estimulación del intercambio de GDP por GTP en respuesta a RhoGEF3DHPH-GST calculada como la razón entre las pendientes de las mediciones de
fluorescencia en presencia y ausencia de proteína RhoGEF3-DHPH-GST, mostrados
en A, durante los primeros 360 s de ensayo. Las mediciones de fluorescencia fueron
realizadas en un espectrofotómetro SpectraMax (Molecular Devices Corporation)
utilizando una longitud de onda de exitación de 360 nm y una longitud de onda de
emisión de 460 nm. Los datos fueron analizados con el software SoftMax Pro (Versión
4.6, Molecular Devices Corporation).
- 124 -
mayor estabilidad, sin embargo nuevos ensayos de intercambio con estas proteínas no
reprodujeron el resultado obtenido.
Con el objetivo de evaluar la segunda posibilidad se realizaron una serie de
modificaciones al protocolo de purificación de las proteínas recombinantes. Aquí se
muestra como ejemplo lo realizado para la GTPasa Cdc42, sin embargo, estas
modificaciones se realizaron para todas las proteínas recombinantes:
i) La precipitación con Sulfato de Amonio desfavorece la interacción de la
proteína con el solvente, lo que provoca que la proteína estabilice su estructura
terciaria y finalmente se haga insoluble y precipite. La concentración de Sulfato de
Amonio necesaria para precipitar una proteína en particular varía entre distintas
proteínas, lo que permite enriquecer una fracción con la proteína de interés en
desmedro de posibles contaminantes, a una determinada concentración de la sal. Para
determinar la concentración óptima de Sulfato de Amonio para precipitar la proteína
Cdc42-GST, fracciones de proteínas totales provenientes de cultivos bacterianos
inducidos fueron sometidos a diferentes concentraciones de Sulfato de Amonio (2070%) y centrifugadas. Las muestras fueron separadas en una fracción sobrenadante y
una fracción precipitada, la cual fue resuspendida en un volumen equivalente de
tampón y dializadas contra esta solución. Muestras de ambas fracciones fueron
analizadas mediante electroforesis en geles de Acrilamida (Figura 28) pudiendo
observarse que a una concentración de 20% de Sulfato de Amonio son pocas las
proteínas recuperadas en el precipitado y la mayoría de las proteínas se encuentran en
el sobrenadante y a 70% de Sulfato de Amonio la mayoría de las proteínas se
encuentra en el precipitado. A una concentración de 50% de Sulfato de Amonio toda la
proteína Cdc42-GST se encuentra en el precipitado, dejando una fracción de proteínas
- 125 -
20%
PM ni
i
s
p
30%
s
p
40%
s
p
Cdc42-GST
50%
PM
s
p
60%
s
p
70%
s
p
Cdc42-GST
Figura 28. Precipitación por Sulfato de Amonio. Cultivos de bacterias E. coli BL21
transformadas con el vector de expresión Cdc42-GST fueron inducidos con IPTG. Las
bacterias fueron lisadas y las proteínas solubles fueron incubadas en concentraciones
crecientes de Sulfato de Amonio. Las proteínas fueron centrifugadas y los precipitados
fueron resuspendidos en un volumen equivalente de tampón. Muestras de los
precipitados resuspendidos y los sobrenadantes de cada condición probada fueron
fraccionados en geles de Acrilamida al 10% y teñidas con Azul de Coomasie. Se
incluyeron además muestras de los cultivos originales no inducidos (ni) e (i) para
verificar la inducción de Cdc42-GST, la cual se indica con una flecha. PM: peso
molecular.
- 126 -
en el sobrenadante, por lo que se definió esta concentración de Sulfato de Amonio
como la concentración óptima.
ii) Posterior a la purificación por cromatografía de afinidad con la resina de
Agarosa-Glutatión, la proteína purificada fue sometida a una segunda purificación
mediante cromatografía de filtración por gel. La Figura 29 muestra el cromatograma
resultante, en él se midió la concentración de proteína por absorbancia a 280 nm (eje
Y) de las distintas fracciones colectadas (eje X, Ve, volumen de elusión). Se observa
un único máximo de absorbancia, entre las fracciones 17 y 30 aproximadamente,
sugiriendo que existe una sola proteína mayoritaria en la muestra.
Con el propósito de evaluar la efectividad de los protocolos implementados,
muestras tomadas de las distintas etapas de purificación fueron fraccionadas mediante
electroforesis en geles de acrilamida (Figura 30). En primer lugar se verificó la
inducción de la expresión de la proteína recombinante Cdc42-GST, al comparar
muestras de cultivo no inducido (ni) e inducido (i); a continuación se observa la pureza
obtenida en dos fracciones eluidas de la cromatografía de afinidad con AgarosaGlutatión (E1 y E2), a partir de proteínas previamente precipitadas con 50% de Sulfato
de Amonio, y la muestra dializada (D) que se utilizó para cargar la columna de filtración
por gel. A continuación se muestran alícuotas de distintas fracciones resultantes de
esta purificación (fracciones 9, 15, 17, 19, 21, 22, 25, 27, 30 32 y 35). Se observa una
proteína de mayor pureza, sin embargo aun persiste un contaminante de menor
tamaño que está presente en todas las fracciones analizadas, y que no fue separado
por la filtración, posiblemente por la similitud de tamaño con Cdc42-GST. Sin embargo,
se logró un mayor grado de pureza de la proteína recombinante Cdc42. El resto de las
proteínas recombinantes fueron purificadas siguiendo este nuevo protocolo. Estas
- 127 -
0.2
Absorvancia 280 nm
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
-0.02
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64
Ve
Figura 29. Purificación de Cdc42-GST por filtración por gel. Proteína recombinante
Cdc42-GST fue obtenida a partir de 1 litro de cultivo de células inducidas con IPTG, las
cuales fueron lisadas y las proteínas solubles fueron precipitadas con 50% de Sulfato
de Amonio y posteriormente purificadas por cromatografía de afinidad utilizando resina
Agarosa-Glutatión. La fracción obtenida fue filtrada por en una columna de 50 cm de
alto y 1.5 cm de diámetro pre-empacada con resina Toyopearl H55 (Tosho
Biosciences) y se colectaron fracciones de 0,5 mL. La figura muestra un cromatograma
de las fracciones (eje X, Ve: volumen de elusión) examinadas en un espectrofotómetro
a una longitud de onda de 280 nm (eje Y).
- 128 -
ni
i PM
E1
E2 D
9
15 17 19
Cdc42-GST
PM 21
22
25
27
30
32
35
Cdc42-GST
Figura 30. Resumen de la nueva purificación de Cdc42-GST. Muestras de distintos
pasos de la purificación de proteínas recombinantes fueron fraccionadas en geles de
Acrilamida al 10% y teñidas con azul de coomasie. PM: peso molecular; ni: muestra de
cultivo de bacterias no inducidas; i: muestra de cultivo de bacterias inducidas con
IPTG; E1 y E2: fracciones eluÍdas de la columna de Agarosa-Glutation; D: dializado
luego de la precipitación con Sulfato de Amonio; los números indican las distintas
fracciones obtenidas luego de la filtración por gel. La proteína Cdc42-GST se indica
con una flecha.
- 129 -
proteínas se usaron en nuevos ensayos de intercambio, no obstante, no se logró
reproducir el resultado obtenido, pues no se observa cambio en la fluorescencia en
ninguna condición. Se variaron de forma independiente otros parámetros del ensayo:
concentración de GDP, GTP, Mant-GTP, EDTA, MgCl 2 , concentración de proteínas, y
además se realizaron con ambas proteínas recombinantes RhoGEF3-DHPH-GST y
RhoGEF3-GST, sin embargo no hubo cambio en la fluorescencia. Tampoco se observó
cambios de la fluorescencia en el control positivo preparado de la misma manera. Por
último, para verificar el correcto plegamiento de las GTPasas, mediante un ensayo
colorimétrico se midió la actividad GTPasica intrínseca de las GTPasas recombinantes.
Este ensayo consiste en incubar la GTPasa en presencia de GTP y medir en un lapso
de tiempo determinado la liberación de fosfato inorgánico producto de la hidrólisis del
GTP, mediante la formación de un complejo entre el fosfato inorgánico y el reactivo
Verde de Malaquita, el cual se puede detectar a una longitud de onda de 595 nm. La
Figura 31 muestra esta ensayo realizado con la proteína recombinante Cdc42-GST. Si
bien se observa un aumento de fosfato inórganico en presencia de la proteína
recombinante, la pendiente de la curva es idéntica a la liberación de fosfato inorgánico
del control negativo, el cual no lleva proteína recombinante, indicando que la actividad
GTPasica de Cdc42-GST es prácticamente nula. Este resultado sugiere que la proteína
recombinante no es capaz de plegarse de manera correcta y por lo tanto pierde la
capacidad de hidrolizar el GTP. A la luz de estos resultados es probable que ninguna
proteína recombinante, especialmente las GTPasas, se estén plegando de manera
correcta y eso puede explicar los resultados negativos obtenidos en los ensayos de
intercambio.
- 130 -
Pi Libre
0.40
Absorbancia 595 nm
0.35
0.30
0.25
0.20
Cdc42 0.5
mg/mL
0.15
Tampón
amortiguador
0.10
0.05
0.00
0
20
40
60
80
100
Tiempo (min)
Figura 31. Actividad GTPasica de Cdc42-GST. 0.5 mg de proteína recombinante
Cdc42-GST fue incubada con GTP a 37ºC. Se retiraron alícuotas a distintos tiempos
deteniendo la reacción de hidrólisis con Citrato de Sodio e incubadas con el reactivo
Verde de Malaquita, el cual se une al fosfato inorgánico generando un cambio de color
de la solución. El gráfico muestra mediciones de absorbancia a 595 nm de longitud de
onda (Eje Y) de muestras colectadas a distintos tiempos (Eje X).
- 131 -
3. Analizar el papel que cumple RhoGEF3 en estados tempranos del desarrollo, a
través de la generación de mutantes de pérdida y ganancia de función.
3.1. Ganancia de función.
Con el objetivo de realizar experimentos de ganancia de función en tejidos
específicos del embrión y del adulto se utilizó el sistema Gal4-UAS de levaduras que
ha sido ampliamente usado en Drosophila melanogaster (Brand y Perrimon, 1993,
Figura 32), utilizando vectores basados en elementos P, que son transposones
naturales de Drosophila. Brevemente, el sistema consta de dos cepas de moscas
transgénicas: la primera lleva una construcción de una región reguladora de un gen de
Drosophila y dirige la expresión de un transcrito que codifica para la proteína Gal4.
Esta proteína es un activador transcripcional y reconoce regiones UAS (Upstream
activation Sequence) activando la transcripción de un gen ubicado rio abajo de la
región UAS. La segunda cepa lleva una construcción con una región UAS rio arriba del
gen de interés. El cruzamiento de estas dos cepas (Figura 32, A) produce una
descendencia que porta ambas construcciones en todos sus núcleos, y permite
expresar el gen de interés bajo la dirección de la región reguladora que dirige la
expresión de la proteína Gal4 (Figura 32, B). La principal ventaja de esta técnica radica
en que se necesita solo una cepa portadora de la construcción UAS, la que puede
cruzarse
con
distintas
cepas
Gal4,
que
están
disponibles
en
centros
de
almacenamiento de acceso público.
- 132 -
♀ pUAS
A
♂
X
GAL4
B
5´
promotor
gal4
5´
3´
AAAAAAA 3´
Gal4
Gal4
5´
UAS
rhogef3
5´
3´
AAAAAAA 3´
RhoGEF3
Figura 32. Sistema UAS-Gal4. A) Hembras vírgenes transgénicas que portan el vector
de expresión UAS se cruzan con machos transgénicos que portan el vector de
expresión Gal4. B) Todas las células de los individuos de la F1 portan ambos vectores
en sus núcleos. Cuando esto ocurre, el promotor dirige la expresión del transcrito gal4,
que codifica para un activador transcripcional. La proteína Gal4 reconoce y se une a
las secuencias UAS (Upstream Activation Sequence) del segundo vector encendiendo
la expresión del transcrito rhogef3. Como resultado se expresa la proteína RhoGEF3
en los tejidos en que el promotor que dirige la expresión de gal4 se encuentre activo.
- 133 -
3.1.1. Generación de animales transgénicos y mapeo de inserción.
Se generaron cepas transgénicas mediante la microinyección del vector
pUAST-RhoGEF3-Myc (Ver 2.1.3) y un segundo vector denominado helper que
codifica para la transposasa ∆2-3, en la zona que dará origen a las células polares de
embriones en estado de blastodermo sincicial, obtenidos de moscas que portan un
alelo mutante recesivo del gen White (color de ojos blanco). Se aislaron 4 líneas que
representan eventos únicos de inserción en homocigosis y que son reconocidas por la
expresión del gen marcador white+ que porta el vector introducido, y se manifiesta por
el color rojo de los ojos. Estas líneas fueron analizadas con el propósito de determinar
el sitio de inserción de cada vector y verificar que no interrumpe la expresión de algún
gen que enmascare el posible fenotipo generado por la expresión ectópica de
RhoGEF3. Para ello, para cada cepa se extrajo DNA genómico a partir de 25 moscas y
fue digerido con la enzima de restricción Sau3AI, de corte frecuente y que además
corta en el interior del vector en sitios conocidos. El DNA fue purificado y ligado con el
objetivo de circularizar los fragmentos digeridos mediante la ligación intramolecular de
los extremos cohesivos generados por el corte con Sau3AI. El DNA ligado fue utilizado
como sustrato para 2 reacciones de PCR, la primera (reacción A), con los partidores
P31 y pWIZ-F1 y la segunda (reacción B), con los partidores P31 y pWIZ-R1 (Figura
33, A). La primera reacción amplifica la región genómica rio arriba del vector integrado
y la segunda reacción amplifica la región genómica rio abajo del vector integrado. Los
amplicones resultantes fueron fraccionados en geles de agarosa (Figura 33 B),
obteniéndose, en general, un producto único de amplificación para cada reacción, los
que fueron purificados y secuenciados. Las secuencias obtenidas fueron analizadas
mediante BlastN contra las bases de datos de FlyBase y se determinó el sitio de
- 134 -
A
Sau3AI
Sau3AI
5´
Sau3AI
Sau3AI
UAS-RhoGEF3-Myc
P31
pWIZ-F1
pWIZ-R1
PM
P31
Reacción B
Reacción A
B
3´
Línea 1
Línea 2
A
A
B
B
Figura 33. Caracterización de los sitios de inserción del vector UAS-RhoGEF3Myc. A) Esquema de la estrategia experimental. La flecha negra corresponde al DNA
genómico y la flecha azul corresponde al vector UAS-RhoGEF3-Myc orientados de 5´a
3´. Se indican los sitios de corte de la enzima de restricción de corte frecuente Sau3AI
(flechas verdes) en el vector y en el DNA genómico. El DNA digerido es circularizado,
ligando los sitios cohesivos Sau3AI intramoleculares, y utilizado como sustrato para
reacciones de PCR utilizando partidores que alinean en el vector (Flechas azul, naranja
y rojo), amplificando las secuencias de DNA genómico que se encuentran adyacentes
al vector, las cuales son secuenciadas y comparadas con la anotación del genoma
mediante BlastN. B) Productos de PCR de las reacciones A y B fraccionados en geles
de Agarosa para 2 de las líneas probadas.
- 135 -
inserción del vector en las cuatro líneas analizadas. La línea 1 porta el vector en el
brazo derecho del cromosoma 3 en la posición citológica 91F4, en la región reguladora
del gen CG5629; la línea 2 porta el vector en el brazo derecho del cromosoma 2, en la
posición citológica 48F1, en un intrón del gen calmodulin; la línea 3 porta el vector en el
brazo derecho del cromosoma 3, en la posición citológica 86E18, cerca del inicio de la
transcripción del gen Lk6; la línea 4 porta el vector en el brazo derecho del cromosoma
2, en la posición citológica 58D4, cerca del inicio de la transcripción del gen CG3624
(Figura 34).
- 136 -
Línea 1: Cromosoma 3, brazo derecho: 91F4, nucleótido Nº 14.973.184
5´
CG5926
UAS-RhoGEF3-Myc
CG11779
3´
Línea 2: Cromosoma 2, brazo derecho: 48F1, nucleótido Nº 8.148.656
5´
calmodulina
UAS-RhoGEF3-Myc
calmodulina
3´
Línea 3: Cromosoma 3, brazo derecho: 86E18, nucleótido Nº 7.590.191
5´
Lk6
UAS-RhoGEF3-Myc
3´
Línea 4: Cromosoma 2, brazo derecho: 58D4, nucleótido Nº 18.289.592
5´
CG3624
UAS-RhoGEF3-Myc
CG6044
3´
Figura 34. Sitios de inserción del vector UAS-RhoGEF3-Myc. El esquema muestra
la ubicación de las inserciones del vector en cada una de las líneas transgénicas
generadas. Las flechas indican la dirección 5´a 3´. En azul se muestra el vector, en
naranjo los genes adyacentes y en rojo los exones de un mismo gen. Se indica el
brazo del cromosoma, la posición citológica y el nucleótido donde se encuentra inserto
cada vector.
- 137 -
3.1.2. Sobreexpresión en distintos tejidos del embrión y el adulto.
Se realizaron experimentos de expresión ectópica de la proteína recombinante
RhoGEF3-Myc mediante la cruza de moscas de las líneas generadas en 3.1.1 con
líneas que dirigen la expresión de la proteína Gal4 en diferentes tejidos embrionarios y
adultos.
Los tejidos de los discos imaginales de ala y ojo de la larva de Drosophila están
compuestos por células epiteliales ordenadas, por lo que cualquier alteración en la
organización del citoesqueleto de actina en estas células debería interrumpir este
ordenamiento y manifestarse en el tejido del adulto. Se examinó el efecto de la
sobreexpresión de la proteína recombinante RhoGEF3-Myc en estos tejidos, mediante
el cruce de las líneas transgénicas generadas en 3.1.1 con las líneas Hh-Gal4 y eyGal4, las que portan, respectivamente, un transgen con la región reguladora del gen
Hedgehog que dirige la expresión de la proteína Gal4 en el segmento posterior del
disco imaginal del ala (Tanimoto y cols., 2000) y un transgen con la región reguladora
del gen eyeless que dirige la expresión en el disco imaginal de ojo. Los efectos fueron
examinados en montajes de alas y ojos de los adultos descendientes de este cruce,
evaluando la morfología y ordenamiento de los omatidios y la orientación de los pelos
de las alas. En ninguno de los tejidos examinados se observaron cambios evidentes en
comparación con los individuos silvestres.
A continuación se examinó el efecto de la expresión de RhoGEF3 en tejidos
particulares del embrión. Para ello, moscas de las líneas transgénicas que portan el
vector UAS-RhoGEF3-Myc fueron cruzadas con moscas de las líneas Kr-Gal4, que
dirige la expresión de la proteína Gal4 en la región central respecto al eje anteroposterior en embriones tempranos mediante la región reguladora del gen krüppel, y la
- 138 -
línea twi-Gal4 que dirige la expresión de la proteína Gal4 en la región ventral en
embriones tempranos, mediante la región reguladora del gen twist. Los embriones
provenientes
de
estos
cruces
fueron
examinados
mediante
ensayos
de
inmunofluorescencias indirectas utilizando anticuerpos dirigidos contra las proteínas
actina y tubulina, sin embargo, no se encontraron alteraciones evidentes en la
morfología del embrión o en la morfología y distribución de las células. Para verificar la
expresión de la proteína recombinante en estas células, se realizaron ensayos de
inmunofluorescencias indirectas de estos embriones con un anticuerpo α-Myc, sin
embargo, en estos ensayos la proteína recombinante RhoGEF3-Myc no fue detectada.
Este resultado indica que la falta de fenotipos mutantes evidentes puede deberse a la
baja expresión de la proteína recombinante.
Con el propósito de evaluar esta hipótesis, se realizaron cruces con líneas que
expresan mayores cantidades de la proteína Gal4. Para ello, moscas de las líneas
transgénicas que portan el vector UAS-RhoGEF3-Myc fueron cruzadas con la línea
act5C-Gal4, que posee la región reguladora del gen actina5C y dirige la expresión de la
proteína Gal4 en todo el embrión, con la línea matα-VP16-Gal4, que posee la región
reguladora del gen αTubulina67C y un dominio de transactivación de VP16 (herpes
simplex virus protein VP16) lo que dirige la expresión en los ovocitos y aumenta el nivel
de expresión y finalmente la línea nanos-Gal4, que posee parte de la región reguladora
del gen nanos y dirige la expresión del transgen en todo el embrión. Los embriones
provenientes
de
estos
cruces
fueron
examinados
mediante
ensayos
de
inmunofluorescencias indirectas utilizando anticuerpos dirigidos contra las proteínas
actina y tubulina. En este caso tampoco se observaron cambios evidentes en la
morfología de los embriones ni en la distribución de ambas proteínas respecto a
- 139 -
embriones silvestres, aun en los estados más tardíos. Estos embriones fueron
analizados por western blot utilizando el anticuerpo α-Myc sobre extractos de proteína
total, sin embargo, no se detectó proteína RhoGEF3-Myc. Este resultado indica que
aun cuando los vectores están integrados en regiones transcripcionalmente activas del
genoma, la proteína recombinante no se expresa a niveles detectables.
3.2. Pérdida de Función.
Con el propósito de evaluar la función del gen rhogef3 en el desarrollo de
Drosophila, se analizaron los efectos de una pérdida de la expresión del gen. Para ello
se abordaron tres estrategias: la primera consta de la generación de un mutante por
deleción del gen rhogef3, la segunda mediante el silenciamiento del gen por RNA
interferente y la tercera mediante el análisis de una deleción cromosómica de una
región que contiene al gen rhogef3.
3.2.1. Escisión imprecisa de elemento P.
Con el objetivo de generar un alelo mutante del gen rhogef3, se realizaron
experimentos conducentes a obtener una deleción parcial o total del gen mediante la
movilización de un elemento P, denominado P{RS5}5, el cual está inserto en el último
intrón de rhogef3 en moscas de la Línea 5HA1662 (Figura 35, A). Esta cepa fue
cruzada con moscas que portan la transposasa ∆2-3 (el esquema del cruce de detalla
en materiales y métodos, Figura 1), la cual reconoce los sitos P del vector y lo escinde
del DNA genómico (Figura 35, B). En la mayoría de los casos la transposasa escinde el
vector de manera precisa dejando la secuencia original del cromosoma intacta, en
otros, deja un trozo de vector, sin embargo, debido a fallas en el mecanismo de
- 140 -
A
Gen rhogef3
w+
P
P
P{RS5}5-HA-1662
B
♀ Δ2-3
X
♂ P{RS5}
F2
Figura 35. Escisión imprecisa del gen rhogef3. A) La figura ilustra la organización
del gen rhogef3, indicando los exones en cajas rojas, y el inicio y sentido de la
transcripción con una flecha. La flecha azul indica el elemento P{RS5}5-HA-1662, el
cual se encuentra en la región 61C1 del cromosoma 3L, en la base nucleotídica
286259, dentro del ultimo intrón del gen rhogef3. En el detalle inferior se muestra un
esquema simplificado de la estructura de este elemento, indicando en cajas verdes, los
extremos 5 y 3´ propios del elemento P, en cajas blancas los exones 5´ y 3´ del gen
mini-white y en cajas azules las secuencias P. B) El cruce de hembras portadoras de la
transposasa D2-3 con machos portadores de la inserción genera en la F2 individuos en
los cuales el elemento P ha sido escindido. Estos individuos son reconocidos por la
falta del marcador mini-white que porta la inserción y confiere el color de ojos rojos. Un
esquema detallado de este cruce se incluye en la Figura 1, y materiales y métodos,
sección 3.3.3.
- 141 -
reparación del DNA, este evento de escisión provoca que parte de las regiones
adyacentes al sitio de inserción del vector sean eliminadas, provocando un evento de
deleción del DNA genómico, denominado escisión imprecisa, que puede variar de
tamaño entre 1 a 10 kb y ocurre aproximadamente en el 1% de los casos (Adams y
Sekelsky, 2002). Los descendientes de este primer cruce fueron cruzados con moscas
que portan cromosomas balanceadores que impiden la reparación del cromosoma. Los
eventos de escisión son reconocidos en esta etapa por la pérdida del gen marcador
white+ que porta el vector escindido y confiere el color de ojos rojos. Por lo tanto, los
descendientes que perdieron el vector fueron seleccionados debido a que poseen ojos
de color blanco (Figura 35, B). Estas moscas fueron cruzadas individualmente con
líneas que portan cromosomas balanceadores, estableciendo en cada caso una línea
que representa un evento único de escisión del vector. En el transcurso de este trabajo
se obtuvieron un total de 404 líneas que representan 404 eventos de escisión. Se
realizó un análisis molecular con el propósito de caracterizar cada evento de escisión
del vector mediante PCR a partir de DNA genómico extraído de moscas homocigotas
de cada línea. La Figura 36 A esquematiza la estrategia de análisis: inicialmente se
determina si parte de la secuencia del vector permanece en el DNA genómico
mediante la amplificación con partidores específicos del elemento P (PP) y partidores
específicos del gen rhogef3 (PG) denominadas reacciones a y b para cada extremo del
elemento P. Luego se determinó la presencia del gen rhogef3 en DNA genómico
amplificandolo con los partidores específicos del gen (reacción c). Las Figuras 36 B, C
y D muestran algunos ejemplos de este análisis. Se utilizó DNA genómico de una línea
silvestre (Cs) y de la cepa parental 5HA1662 como control de estas reacciones y la
reacción x corresponde a la amplificación del gen CG13427 que se encuentra en el
- 142 -
segundo cromosoma y fue utilizada para evaluar la calidad del DNA extraído. La Figura
36 B muestra los resultados de las reacciones x, a y b para las líneas 1 a 5. En las
líneas 1, 2 y 3 aun permanecen ambos extremos del vector, ya que se detectan los
mismos amplicones que se detectan en el control con la línea 5HA1662, en la línea 4
en cambio no se detectan secuencias del vector, al igual que la cepa silvestre y la línea
5 aun posee un brazo del vector; todas amplifican la reacción x permitiendo confirmar
que el DNA genómico es de buena calidad. La reacción c desde DNA genómico de las
líneas 4 y 5 indica que la línea 4 es un ejemplo de escisión precisa del vector ya que
amplifica una región del gen rhogef3 de igual manera que el control silvestre, la línea 5
también amplifica con los partidores del gen indicando que no hubo deleción y la
diferencia de tamaño en al amplicón c es debido a que aún conserva un extremo del
vector, de aproximadamente 1300 pb (Figura 36, C). La Figura 36 D muestra
resultados de la amplificación de la reacción c en otras líneas y en ella se observa que
la línea 179 amplifica un fragmento de DNA de tamaño ligeramente distinto al control
de la línea silvestre. Este amplicón fue secuenciado pero muestra una escisión precisa
que provoca una repetición de una secuencia del intrón dentro del mismo intrón, y que
no afecta los exones. En las 404 líneas analizadas no se detectaron eventos de
escisión imprecisa y todas corresponden a escisión precisa o dejan secuencias del
vector pero no provocan deleciones del gen.
- 143 -
A
Gen rhogef3
5´
3´
P{RS5}5-HA-1662
PG-s
PP-a
PP-s
a
(1173 pb)
PG-a
b
(1252 pb)
c
(2228 pb)
B
Cs
5HA1662
pm x
a b
x
a b
002
001
x
a b
x
004
003
a b
x
a b
x
a b
005
x a b
1252 pb
1173 pb
312 pb
C
pm
D
Cs
c
004
c
Cs
pm c
005
c
pm
Cs 171
c
c
178 179
c
c
180
c
3500 pb
2228 pb
2228 pb
- 144 -
Figura 36. Análisis de alelos generados por escisión de elemento P. A) Esquema
representando la estrategia del análisis por PCR indicando los partidores utilizados, y
los tamaños esperados de los amplicones (letras minúsculas). En rojo los exones del
gen rhogef3 y en azul, el elemento P. B) Ejemplos de resultados obtenidos en las
reacciones (a), y (b) para 5 líneas transformantes, además de la cepa silvestre Cs
(control negativo) y la cepa parental 5HA 1662 (control positivo). La reacción (x) verifica
la calidad del sustrato. C) Ejemplo de resultado obtenido en la reacción (c) para las
líneas 004 y 005 además de la cepa silvestre (control positivo). D) Resultado obtenido
en la reacción (c) para otras líneas además de la cepa silvestre (control positivo). Pm =
peso molecular. Los productos de PCR fueron fraccionados en geles de agarosa al 1%.
- 145 -
3.2.2. RNAi.
Se obtuvo una mosca transgénica, UAS-RNAi-RhoGEF3, que porta un vector
UAS con un inserto que corresponde a una secuencia repetida invertida del gen
rhogef3 que al expresarse forma una horquilla de RNA de doble hebra dirigido contra el
transcrito del gen (Dietzl y cols., 2007). Esta línea se cruzó con la línea nanos-Gal4,
que porta un vector de expresión de la proteína Gal4 bajo el control de la región
reguladora del gen nanos, que dirige la expresión de Gal4 en todo el embrión desde
estados tempranos del desarrollo. Con el objetivo de verificar el silenciamiento del gen
rhogef3 se extrajo RNA total de embriones procedentes de este cruce y se utilizó como
sustrato para la síntesis de cDNA desde el cual se midió la abundancia del transcrito
rhogef3 mediante qPCR. Como control se utilizó RNA total de embriones de la línea
parental UAS-RNAi-RhoGEF3. La Figura 37 muestra en un gráfico de barras la
abundancia del transcrito de rhogef3 (eje Y) en cada una de las muestras examinadas
(eje X). La abundancia del transcrito rhogef3 fue normalizada respecto de la
abundancia del transcrito del gen pLys, el que fue sintetizado in vitro y agregado en
iguales proporciones a cada muestra. Este análisis se realizó por triplicado y la
normalización se realizó con los valores promedio. Las barras en el gráfico indican la
desviación estándar. Cada medición fue dividida por el valor máximo alcanzado
obteniendo una escala de valores relativos entre 0 y 1. El resultado indica que la
abundancia relativa del transcrito rhogef3 disminuye a menos del 40% en embriones
que expresan el hRNA respecto a embriones control, indicando que se logra un
silenciamiento parcial del gen rhogef3. Embriones provenientes de estos cruces fueron
examinados mediante Inmunofluorescencias indirectas utilizando anticuerpos dirigidos
contra las proteínas actina y tubulina. En estos embriones no se observan cambios
- 146 -
morfológicos evidentes o redistribución de estas proteínas respecto a embriones
silvestres. También se examinó un posible efecto morfológico examinando las cutículas
de embriones y larvas provenientes de este cruce, sin embargo, tampoco se
encontraron defectos morfológicos en estos individuos. Además se realizaron varios
cruces adicionales de la cepa UAS-RNAi-RhoGEF3 con cepas que expresan Gal4 en
diversos tejidos del embrión sin obtener resultados positivos.
- 147 -
1.20
Abundancia relativa
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
Parental 31718
UAS-RNAi-RhoGEF3
31718 x nanos
UAS-RNAi-RhoGEF3 x nanos-Gal4
Figura 37. Verificación del silenciamiento del gen rhogef3 en embriones.
Cuantificación de la abundancia relativa del transcrito de rhogef3 mediante PCR
cuantitativo en tiempo real. Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en el Light
Cycler 1.5 Instrument (Roche), utilizando como sustratos cDNAs representativos de
embriones de la cepa UAS-RNAi-RhoGEF3 y del cruce UAS-RNAi-RhoGEF3 x nanosGal4 que expresa un hRNA dirigido contra rhogef3. Se grafican los valores promedio
de 3 mediciones y las barras de error indican la desviación estándar. La abundancia
del transcrito fue normalizada, en cada muestra, respecto de la abundancia del
transcrito de pLys, el cual fue sintetizado in vitro y agregado en iguales proporciones a
ambas muestras. Las abundancias fueron relativizadas respecto a la máxima expresión
alcanzada, la que toma el valor de 1,0.
- 148 -
3.2.3. Deleción cromosómica.
La cepa w1118; Df(3L)BSC126/TM6B, Tb1 posee una deleción en la región del
cromosoma 3 en la que se encuentra el gen rhogef3 lo que genera un mutante de
pérdida de función de rhogef3. La región delecionada porta además otros 7 genes y
parte de un octavo gen (Figura 38). Entre los genes delecionados se encuentran 4
genes no caracterizados, uno de los cuales presentan dominios conocidos en su
secuencia aminoacídica, y 3 han sido estudiados en algún nivel (Sugiyama y cols.,
2007; Englund y cols., 2006; Brill y cols., 2000). Esta información sugiere que es poco
probable que la falta de función ellos debería ocasionar un fenotipo en estadíos
tempranos del embrión o en las regiones donde se expresa rhogef3. En esta cepa, el
cromosoma delecionado se encuentra estabilizado con un cromosoma balanceador
TM6B que porta un marcador de expresión en la larva. Con el objetivo de poder
distinguir aquellos embriones homocigotos para la deleción de los que portan el
cromosoma balanceador, que lleva una copia silvestre del gen rhogef3, y poder
analizar su fenotipo, esta cepa fue rebalanceada con la cepa cepa st1 e1 HemJ4/TM6B, P{ase-lacZF:2.0}PK3, Tb1, que posee un cromosoma balanceador TM6B que
48
porta un marcador de expresión embrionaria. Este marcador es un transgen que
expresa la proteína β -galactosidasa bajo la dirección de la región reguladora del gen
asense (ase) y dirige la expresión de
β
-galactosidasa en el sistema nervioso. En la
actualidad nos encontramos examinando posibles fenotipos en embriones de esta cepa
mediante ensayos de inmunofluorescencias indirectas, incorporando la información que
poseemos de la expresión de RhoGEF3 en este análisis.
- 149 -
61B3
5´
61C1
miple2
CG42377
CG32845
rhogef3
fwd
CG32344
CG32343
3´
CG34264
ttm2
Deleción cromosómica
Figura 38. Deleción de la región cromosómica del gen rhogef3. El esquema
muestra los genes (flechas verdes) contenidas en la región genómica del gen rhogef3
(flecha azul). La caja roja indica la región del cromosoma que fue escindida (Posición
citológica 61B3, 61C1).
- 150 -
Discusión
La era de la genómica, iniciada con la obtención de la secuencia de genomas
completos y luego complementada con estudios de expresión génica a gran escala, ha
permitido establecer nuevos paradigmas. La genética clásica busca explicar un
fenotipo mediante la acción de un gen, la genómica funcional en cambio busca explicar
la existencia de un gen mediante la búsqueda de un fenotipo, o en términos más
sencillos, busca otorgarle un contexto biológico a una secuencia de nucleótidos.
Existen casos en los que estas secuencias poseen un alto grado de similitud con
genes conocidos y de función descrita, y otros en los cuales genes comparten
información que sugiere su participación en procesos biológicos particulares. Este es el
caso del gen rhogef3, cuya secuencia de nucleótidos porta información que permite
clasificar a su producto génico como un miembro de una familia de proteínas
intercambiadoras de nucleótidos de guanina (GEF), que cumplen un rol fundamental en
un contexto particular, el remodelamiento del citoesqueleto de actina (Mackay y Hall,
1998, Takai y cols, 2001). El objetivo de este trabajo es conocer la función que cumple
RhoGEF3 en el desarrollo de Drosophila.
1. Caracterización de RhoGEF3: bioinformática, otras GEF y ensayos de
intercambio.
La anotación del genoma de Drosophila busca cumplir dos tareas principales:
Predicción de secuencias de transcritos y proteínas y predicción de funciones para
cada una de estas proteínas (Adams y cols., 2000). Esta anotación ha sido corregida
en varias oportunidades desde la primera publicación de la secuencia eucromática en
- 151 -
el año 2000 (Adams y cols., 2000). La anotación se llevó a cabo mediante la utilización
de distintos softwares como Genie (Reese y cols., 2000) y Genscan (Burge y Karlin,
1997), sin embargo los algoritmos en los que estos se basan, que incluyen criterios
tales como: secuencias límites de intrones y exones, porcentaje de CG y uso de los
codones, además de la información disponible respecto a homología de secuencias y
alineamiento con ESTs (Expressed Sequence Tag), fallan principalmente en detectar
los extremos 3` y 5` de los transcritos. El análisis del gen rhogef3 apoya esta
afirmación considerando que su anotación predice la existencia de 10 transcritos
distintos que codifican 8 proteínas diferentes. En el presente trabajo se determinó la
existencia de un solo transcrito, lo que permite suponer que existe solo una isoforma
de la proteína RhoGEF3 que se expresa durante el desarrollo de Drosophila. Si bien
existen otros enfoques experimentales para enfrentar este problema, como los análisis
de Northern Blots, la aplicación de la técnica de RLM-RACE utilizada aquí confiere un
mayor grado de resolución a nivel molecular y permite determinar con precisión el
origen de la transcripción del gen. Este resultado contribuye a la anotación del gen y
permitió establecer un marco teórico para el diseño de otros experimentos,
especialmente aquellos que involucran el diseño de proteínas recombinantes. En el
presente trabajo solo se abordó el análisis del extremo 5´del gen ya que al momento de
iniciar este estudio, la anotación del gen indicaba que no había variabilidad en el
extremo 3´ de los transcritos esperados (http//flybase.org); si bien es cierto que esta
situación ha cambiado, a nivel de proteína esto sigue siendo válido ya que todas las
isoformas son idénticas en su extremo carboxilo terminal.
Las proteínas GEF conforman una familia diversa de proteínas cuya
característica estructural común es la presencia del dominio DH. Este dominio participa
- 152 -
en el reconocimiento específico de la GTPasa y en su unión, lo que antecede al
intercambio del nucleótido. Además, en el caso de los GEFs que activan RhoGTPasas,
existe un dominio PH se encuentra bien conservado (Schmidt y Hall, 2002). Las
proteínas GEFs difieren en todo el resto de su estructura primaria, desde el tamaño de
la proteína, hasta la aparición de otros dominios proteicos en su secuencia primaria,
dentro de los cuales podemos encontrar dominios SH2, SH3, PDZ. Sobre la base de
estas características estructurales de los GEFs, los análisis bioinformáticos
presentados en este trabajo refuerzan la idea de que RhoGEF3 pertenece, a la familia
de proteínas GEF. Más aún, el dominio DH de RhoGEF3 exhibe entre un 33% y un
37% de similitud con los correspondientes dominios de las proteínas Asef (Kawasaki y
cols., 2000), Colibistina II (Harvey y cols., 2004) y PEM-2 (Satou y Satoh, 1997), las
que actúan como factores de intercambio específicos de las GTPasas Rac y Cdc42. En
general se ha reportado que existe algún grado de promiscuidad entre las proteínas
GEF que reconocen Rac y Cdc42, posiblemente debido a que existe mayor similitud
entre estas dos GTPasas que con la GTPasa Rho1 (Mackay y Hall, 1998; Takai y cols.,
2001). La Figura 7 ilustra el alineamiento de los dominios DH de estas proteína e indica
la posición de las regiones conservadas CR1-3, cada una de ellas posee una
conformación de α –hélice extendida y, en particular, CR1 y CR3 forman los puntos
primarios de contacto con la GTPasa. Si bien RhoGEF3 presenta una inserción de 29
aminoácidos, que no está presente en los dominios DH de los otras proteínas, esta
inserción se encuentra en el extremo C-terminal del dominio y no altera el alineamiento
de la región conservada CR3. Así, este análisis sugiere que RhoGEF3 podría regular la
actividad de Rac y/o Cdc42. Del mismo modo, el dendrograma de la figura 8 revela que
RhoGEF3 agrupa con GEFs de diferentes organismos cuya característica común es la
- 153 -
capacidad de activar a las GTPasas Rac1 y Cdc42 y no lo hace con las proteínas de
Drosophila que son activadoras específicas de Rho1. Aun cuando las proteínas GEF
específicas de una GTPasa particular pertenecen a organismos evolutivamente
distantes, la similitud de secuencia entre ellas es más estrecha que entre GEFs de
distintas especificidades que provienen de un mismo organismo, indicando un alto
grado de conservación de las secuencias de los dominios DH. En consecuencia, este
resultado apoya la predicción de que RhoGEF3 activaría Rac y/o Cdc42 en lugar de
Rho1.
Por otra parte, análisis de la naturaleza y organización de los dominios
funcionales que acompañan a los dominios DHPH, han permitido agrupar proteínas
GEF que se encuentran funcionalmente relacionadas (Rossman y cols., 2005). En
nuestro caso, RhoGEF3, presenta una organización de dominios similar a Asef, una
proteína que cumple funciones importantes en la migración y adhesión celular
(Kawasaki y cols., 2000). Tanto RhoGEF3 como Asef poseen un dominio SH3
localizado en el extremo N-terminal. En el caso de Asef, el dominio SH3 actúa como un
dominio de auto-inhibición, a través de su interacción con el dominio DH, lo que impide
la unión a la GTPasa (Murayama y cols., 2007). Esta auto-inhibición se inactiva luego
de la interacción de Asef con la proteína supresora de tumores APC (adenomatous
polyposis coli). De este modo, la interacción con APC restaura la actividad de Asef, y
conduce a la activación Cdc42 y/o de Rac1, y a la reorganización del citoesqueleto de
actina en el frente de migración (Kawasaki y cols., 2003). Finalmente, cabe destacar
que la comparación hecha sobre las proteínas que comparten estructuras de dominios
solo sirve para inferir su especificidad y un mecanismo de regulación pero no permite
plantear hipótesis de ortología entre sus genes debido a que ellos codifican proteínas
- 154 -
de distinto tamaño y que más allá de los dominios DH y PH comparten muy poca
similitud de secuencia.
En este trabajo, nos planteamos confirmar experimentalmente la hipótesis de
que RhoGEF3 podría activar Rac1 y/o Cdc42 mediante un ensayo in vitro de
intercambio de GDP/GTP. Este ensayo indica que la especificidad de RhoGEF3 in vitro
corresponde a Rac1 y descarta una participación con Cdc42 o Rho1. Sin embargo,
estos resultados son sólo preliminares debido a que no fue posible reproducirlo en las
mismas condiciones, debido probablemente a la poca estabilidad de las proteínas
recombinantes. Para solventar este problema probamos purificar más proteínas, sin
embargo, el nivel de contaminantes aumento, debido probablemente a la disminución
paulatina de las resinas debido al uso. Con el objetivo de mejorar estas purificaciones
se establecieron nuevos métodos de purificación, sin embargo, estos no dieron los
resultados esperados pues todos ellos implicaban una mayor manipulación de las
muestras y esto podría afectar nuevamente la estabilidad de las proteínas purificadas
de esta manera. En el futuro, estos experimentos serán reemplazados por ensayos de
pull-down, técnica que creemos es más reproducible.
2. Expresión de RhoGEF3 en líneas celulares de Drosophila.
Las
líneas
celulares
de
Drosophila
se
han
convertido
en
sistemas
experimentales ampliamente utilizados para la observación de variados procesos
biológicos, entre ellos, la regulación de la morfología celular y en particular, la
regulación de la reorganización del citoesqueleto de actina (Rogers y cols. 2003, Kiger
y cols., 2003, Bakal y cols., 2007, Liu y cols., 2009). El uso de estas líneas celulares
presenta ventajas comparativas dado que ellas derivan de un organismo modelo
- 155 -
ampliamente utilizado, con genoma secuenciado y baja redundancia genética.
Además, existe un gran volumen de información que aborda aspectos de la genética
de Drosophila y de la expresión y función de genes a lo largo de su ciclo de vida, ello
permite contrastar los resultados obtenidos y disecar vías de señalización completas.
Por estas razones, se escogió este sistema para iniciar el estudio de la función de
RhoGEF3 en un modelo más simple que el organismo completo.
La línea celular S2 proviene de cultivos primarios de células de embriones
tardíos, presumiblemente de tejidos de la hemolinfa (Schneider, 1972) y en cultivo a
25ºC y sin suplemento de CO 2 , estas células crecen en suspensión. Sin embargo las
células S2 pueden ser sembradas sobre la lectina Concanavalina A, lo que estimula su
adhesión al sustrato. En estas condiciones las células se extienden formando una gran
lamela, facilitando la observación de fenómenos relacionados a la regulación del
citoesqueleto de actina (Rogers y cols., 2002. Rogers y cols., 2003).
Bajo el supuesto de que la región SH3 de RhoGEF3 podría ser parte de un
mecanismo auto-inhibitorio similar al descrito para la proteína Asef, en una primera
etapa de este trabajo, se generó una proteína recombinante RhoGEF3-∆N que carece
del extremo N-terminal, con el propósito de obtener una proteína constitutivamente
activa, (Murayama y cols., 2007). Sin embargo, cuando se estudió el efecto de la
expresión de RhoGEF3-∆N sobre la morfología de las células S2, los resultados
indicaron que la proteína recombinante no ejercía el efecto esperado para un GEF
constitutivamente activo. Este resultado sugiere dos alternativas, la proteína
recombinante RhoGEF3-∆N podría tener problemas de plegamiento y por lo tanto ser
incapaz de activar a su GTPasa, alternativamente, el dominio SH3 podría ser necesario
para su actividad. Este tipo de regulación ha sido descrito para una proteína homologa
- 156 -
a Asef1, denominada Asef2. En este caso, el dominio SH3 es fundamental para la
activación de la GTPasa blanco, ya que es fundamental para la unión de Asef2 con
APC, una proteína que se encuentra rio arriba en la señalización (Hamann y cols.,
2007). Según nuestros resultados, el dominio SH3 y tal vez parte de la región Nterminal son necesarios para la activación de RhoGEF3, situándonos en un modelo
más similar al descrito para Asef2.
Tomando en cuenta los resultados discutidos más arriba, el siguiente paso en la
caracterización funcional de RhoGEF3 consistió en sobre-expresar la proteína
completa en células S2. Como resultado de ésta sobre-expresión se observó la
formación de estructuras atípicas de filamentos de actina, tales como las espirales
generadas en las células que expresan RhoGEF3-V5 y que están completamente
ausentes en células control (Figura 17). Debido a que estas células son sembradas
sobre Concanavalina A, que es un activador de la GTPasa Rac1 (Rogers y cols.,
2003), es posible suponer que el fenotipo generado por una sobre-expresión de
RhoGEF3 se encuentre enmascarado por una activación exacerbada de esta GTPasa.
Esta posibilidad fue analizada mediante la utilización de la línea S2R+, cercanamente
relacionada con las células S2, pero capaz de adherirse al sustrato en ausencia de
Concanavalina A. En estas células, la expresión de RhoGEF3-V5 y de la proteína
recombinante RhoGEF3-Myc, que solo difiere en el tag fusionado a la proteína, causan
el mismo efecto, esto es, la generación de una lamela que rodea enteramente a la
célula, además de la formación de estructuras filamentosas de actina similares a las
observadas en las células S2. Si bien estas estructuras son indicativas de que, en
respuesta a la expresión de RhoGEF3, existe un desbalance en el equilibrio entre
actina polimerizada y des-polimerizada que favorece la formación de filamentos de
- 157 -
actina, ellas son difíciles de interpretar en un contexto funcional. En el caso de la
formación de la lamela, si podemos interpretarla en un contexto funcional ya que ésta
corresponde a una respuesta celular estereotipada frente a la activación de Rac1
(Mackay y Hall, 1998: Takai y cols., 2001).
Para poder interpretar estos fenotipos es necesario recordar que las GTPasas
regulan el citoesqueleto de actina a varios niveles: polimerización de actina y
organización de los filamentos. La formación de filamentos de actina depende de dos
factores de polimerización, la Formina y el complejo ARP 2/3, y depende del equilibrio
entre la adición de monómeros de actina en el extremo + y la liberación de monómeros
en el extremo –. Tanto Rac como Cdc42 actúan a través de la activación del complejo
ARP 2/3, que es un complejo heptamérico que inicia la polimerización en fibras ya
formadas y permite la ramificación del filamento. Ambas GTPasas activan al complejo
ARP 2/3 indirectamente a través de miembros de la familia de proteínas WASP
(Wiskott-Aldrich syndrome protein). Rac además activa a ARP 2/3 a través de
miembros de la familia WAVE, que está relacionada estructuralmente a la familia
WASP. Rho, en cambio estimula la formación de filamentos de actina a través de
Formina, la cual es un blanco directo de Rho y promueve la adición del complejo
actina-Profilina al extremo + del filamento en formación. La proteína Cofilina corta los
filamentos de actina (severing) en el extremo – y promueve el desensamblaje de
monómeros en el extremo +. La Cofilina es inactivada por fosforilación a través de la
proteína quinasa LIM (LIMK) que es activada por la quinasa PAK, un blanco directo de
Rac y Cdc42 y también por la acción de otra quinasa, ROCK, que es blanco directo de
Rho (Jaffe y Hall, 2005; Takai y cols., 2001). Además de la elongación de los
filamentos de actina, las GTPasas tienen un efecto sobre la organización de estos
- 158 -
filamentos. La formación de filamentos contráctiles de actina-miosina es consecuencia
de la activación de ROCK, la cual inactiva la fosfatasa de la cadena liviana de la
miosina, lo que conduce a un aumento en la fosforilación de la miosina que promueve
la unión de la miosina a la actina. El mecanismo de formación de lamelipodios y
filopodios aun no está del todo resuelto pero dependería de la activación de ARP 2/3 y
de otras proteínas involucradas en la estabilización de los extremos + (capping) y de
proteínas de unión a actina que promueven el entrecruzamiento de los filamentos,
como la proteína Fascina (Jaffe y Hall, 2005; Takai y cols., 2001). Congruentemente, y
en concordancia con la observación de que la expresión de RhoGEF3 favorece la
formación de filamentos de actina, el fenotipo de formación de estructuras atípicas de
filamentos de actina fue observado mediante la pérdida de función del gen que codifica
para la proteína CPB (Capping Protein B), que estabiliza los polímeros de actina en su
extremo +, impidiendo la adición de nuevos monómeros (Rogers y cols., 2003), es
decir, esta proteína regula negativamente la formación de nuevos filamentos,
sugiriendo que el fenotipo observado es debido a que estos filamentos empujan la
membrana hasta que estas fuerzas compresivas son mayores que la rigidez de los
filamentos causando que ellos se tuerzan y causen que la membrana se retraiga una y
otra vez (Rogers y cols., 2003). Además, este estudio, que involucra el silenciamiento
de otros genes involucrados en la regulación del citoesqueleto de actina, mediante
RNAi en células S2 de Drosophila, revela que la maquinaria de formación de lamelas
comprende unas pocas proteínas bien caracterizadas, entre ellas las proteínas Rac1,
Scar (una proteína de la familia WAVE) y el complejo ARP 2/3, que participan en una
misma vía de señalización (Rogers y cols., 2003). Del mismo modo, en células BG2, de
origen neuronal, la activación exacerbada de Rac1, a través de la expresión del
- 159 -
mutante constitutivamente activo RacV12 da como resultado la formación de lamelas
(Bakal y cols., 2007).
En conjunto, la observación de los fenotipos celulares permite proponer que
RhoGEF3 activa a la GTPasa Rac1 en células de Drosophila y promueve la reorganización del citoesqueleto de actina. Si bien es difícil extrapolar la formación de
lamelas al contexto del embrión en desarrollo, si podemos suponer que RhoGEF3
regula a Rac1 en alguno de los procesos que requieren de su activación durante la
embriogénesis de Drosophila, en particular y dado el patrón de expresión de la proteína
RhoGEF3 en el embrión, en esta tesis centraremos la discusión en el proceso de
formación de la glándula salival y en otros relacionados con el fenómeno de
tubulogénesis (Pirraglia y cols., 2006).
En relación con nuestros estudios de pérdida de función, el silenciamiento de
RhoGEF3 genera alteraciones en la adhesión de las células sembradas sobre
Concanavalina A que son equivalentes a las detectadas utilizando un RNAi contra
Rac1. Si bien, tanto en las células tratadas con el dsRNA control como en aquellas
tratadas con los dsRNAs contra rac1 y rhogef3 puede apreciarse tres morfologías
diferentes: lamela normal, lamela incompleta y ausencia de lamela (Figuras 23 y 24),
su frecuencia de aparición cambia significativamente en función del dsRNA utilizado.
De esta manera, el silenciamiento de rac1 y rhogef3 se correlaciona con un aumento
en el número de células con lamelas defectuosas, sugiriendo que Rac1 y RhoGEF3
pertenecerían a la misma vía de señalización y corroborando los resultados discutidos
más arriba. Más aún, cuando expresamos la proteína recombinante RhoGEF3-Myc en
un contexto de rac1 silenciado, no se observan los cambios generados como
consecuencia una sobre-expresión de RhoGEF3-Myc, es decir, el fenotipo de sobre-
- 160 -
expresión se suprime en ausencia de Rac1. Estos resultados sugieren que Rac1 se
encuentra rio abajo en la misma vía de señalización de RhoGEF3. En experimentos
similares, en los que cdc42 fue silenciado fue posible observar que la lamela se forma
normalmente, sugiriendo que no hay interacción entre RhoGEF3 y Cdc42 en estas
células. Una potencial interacción entre Rho1 y RhoGEF3 fue descartada
tempranamente debido a que el fenotipo del silenciamiento de rho1 (Kiger y cols.,
2003) fue muy diferente al fenotipo observado para el silenciamiento de rhogef3.
Evidencias adicionales de la función de RhoGEF3 en células provienen del
trabajo de Bakal y cols. (2007) en células BG2 de Drosophila. En este estudio se
determinó que el fenotipo resultante del tratamiento con dsRNAs dirigidos contra varios
genes, entre ellos los que codifican para las proteínas RhoGEF3, Ankyrin, Armadillo,
que es la proteína β-catenina, p190RhoGAP, involucrada en la regulación de la
adhesión celular a través de integrinas en células de mamífero (Arthur y Burridge,
2001), SCAR, la proteína de la familia WAVE que activa el complejo Arp2/3, Slingshot,
la fosfatasa de la cofilina, y Sop2, un supresor de profilina, (Bakal y cols., 2007), consta
de células redondeadas con casi ninguna protrusión de membrana respecto a las
células no tratadas con dsRNAs. Además se obtuvo un fenotipo similar silenciando
genes de la vía de RAP, una GTPasa que participa en la formación de uniones
adherentes y es necesaria para la migración de los macrófagos en Drosophila
(Huelsmann y cols., 2006). Todos estos genes fueron agrupados en virtud de la
similitud de los fenotipos observados en los experimentos con dsRNAs como
componentes de la maquinaria que regula la adhesión celular, relacionando a
RhoGEF3 con este proceso celular y apoyando los resultados obtenidos en nuestros
experimentos con células S2R+.
- 161 -
En resumen, los resultados obtenidos en los experimentos de pérdida y
ganancia de función en células de Drosophila, sumados a los descritos en la literatura,
sugieren que RhoGEF3 participa en la activación de Rac1, presumiblemente en la
formación de lamelas o en la formación y remodelamiento de uniones adherentes.
Estos resultados, además, permiten plantear nuevas hipótesis respecto a la función del
gen permitiendo diseñar experimentos tales como la obtención de dobles mutantes o el
estudio de la localización de proteínas entre ellas Scar, E-cadherinas o β-catenina
(Armadillo) y β-integrinas en embriones mutantes de rhogef3.
3. Expresión del gen y de la proteína.
En trabajos anteriores se detectó el transcrito del gen rhogef3 en un contexto
bien definido y acotado, el desarrollo embrionario temprano, brindándonos un
escenario sobre el cual situar nuestro estudio (Hicks y cols., 2001; Zúñiga y cols.,
2009). En el presente trabajo se estudió en detalle la expresión de este gen, en primer
lugar se obtuvo una visión más amplia de la expresión del gen incluyendo material
biológico representativo de todo el ciclo de vida de Drosophila, pero haciendo énfasis
en el desarrollo embrionario, mediante la técnica PCRs cuantitativos. Este enfoque
circunscribe la expresión del gen estrictamente al desarrollo embrionario en desmedro
de otras etapas del ciclo de vida, y aun dentro del desarrollo del embrión esta
expresión es dinámica y variable en el tiempo, alcanzando un máximo durante la
gastrulación. El estudio de su expresión espacio-temporal es aun más informativo,
debido a que su expresión no es ubicua sino que se restringe a tejidos particulares.
Utilizando una sonda de cRNA sintetizada a partir de un EST (Zúñiga y cols., 2009) se
determinó un patrón de expresión bien particular que coincide, en las etapas
- 162 -
tempranas del desarrollo, con el reportado por Hicks y cols. (2001). En ambos trabajos
el transcrito es detectado en tejidos de origen ectodérmico desde embriones de estado
5 a 10. En el presente trabajo se detectó el transcrito del gen rhogef3 en estructuras
tubulares, como las glándulas salivales y las tráqueas en embriones de estados 14 al
16, ambas estructuras derivadan de tejidos ectodérmicos, lo cual es coherente con la
expresión detectada en embriones más tempranos. En este sentido, la expresión de
rhogef3 es muy similar a la expresión del gen blot (bloated tubules), que es detectado
en embriones tempranos en el ectodermo en bandas distribuidas a lo largo del eje
antero-posterior y finalmente su expresión se refina a estructuras tubulares en
embriones tardíos (Johnson y cols., 1999).
Considerando que las GTPasas poseen una expresión espacial y temporal
ubicua durante el desarrollo de Drosophila (Luo y cols., 1994; Magie y cols., 1999), es
posible pensar que la regulación de la activación de estas proteínas depende de la
presencia y activación de las proteínas GEF. En este escenario, la expresión dinámica
y estrictamente cigótica del gen rhogef3 siguiere que este gen es necesario en
procesos bien particulares dentro de este período. Finalmente, su distribución espaciotemporal lo distingue de la mayoría de los genes que codifican proteínas GEF descritos
a la fecha, como rhogef2, pebble y trio, cuyos transcritos en primer término son
aportados por la madre y la expresión cigótica, si existe, es espacialmente ubicua, al
menos en los estados más tempranos del desarrollo (Häcker y Perrimon, 1998; Barrett
y cols., 1997; Prokopenko y cols., 2000; Bateman y cols., 2000). La única excepción a
la fecha la constituye el gen gefmeso, cuya expresión se circunscribe al mesodermo,
durante la invaginación del surco ventral, en embriones de estados 5-6 (Blanke y
Jäckle, 2006).
- 163 -
Utilizando el anticuerpo generado en este trabajo, se logró detectar la proteína
RhoGEF3 en algunos tejidos embrionarios. Según lo señalado anteriormente, la
expresión de rhogef3 se detecta con mayor intensidad en embriones de estado 6 en el
primordio del amnioproctodeo. La proteína se detecta por primera vez un poco más
tarde, en embriones de estado 7 en el proctodeo, que es un tejido que surge de la
diferenciación del amnioproctodeo una vez que este se ha internalizado. Su
distribución sugiere que forma parte de una estructura tubular en formación, el
proctodeo, que dará forma al intestino posterior tardíamente en el desarrollo (CamposOrtega y Hartenstein, 1985), En embriones de este estado también es posible detectar
la proteína en células del estomodeo, una estructura que forma parte del intestino
anterior (Campos-Ortega y Hartenstein, 1985). A partir del estado 11 del desarrollo
embrionario la proteína es detectada claramente en las glándulas salivales en
diferenciación y persiste en estas estructuras aun en estadíos larvales. Si bien, según
nuestro análisis de qPCR, el transcrito no es detectado en embriones tardíos ni en
larvas, esto puede deberse a que en estos estadíos la acumulación del transcrito se
circunscribe a unos pocos grupos de células y por lo tanto podemos estar
subestimando su expresión. Lo mismo puede estar pasando con la larva, considerando
que solo se incluyeron larvas de estado 3 en el análisis de qPCR. Es evidente que el
patrón de expresión de la proteína RhoGEF3 no reconstruye la totalidad del patrón
observado en las hibridaciones in situ. Sin embargo, este anticuerpo reconoce
específicamente RhoGEF3 ya que es capaz de detectar todas sus proteínas
recombinantes, tanto en bacterias como en células y la proteína RhoGEF3 endógena
en extractos de embriones. Además, es posible suponer que el suero inmunoadsorbido
posee un título muy bajo de anticuerposα -RhoGEF3, de manera que solo nos permite
- 164 -
detectar la proteína en aquellos dominios celulares donde existe una mayor
acumulación de RhoGEF3.
Dado que el proceso de morfogénesis de la glándula salival de Drosophila se ha
transformado en un modelo ampliamente utilizado para el estudio de la morfogénesis
epitelial y que algunos de los mecanismos que sustentan su desarrollo se encuentran
descritos (Myat, 2005; Andrew y Ewal, 2009), decidimos centrarnos en esta estructura
para analizar con mayor detalle la expresión de RhoGEF3 y su función. En primer
término comparamos la distribución subcelular de RhoGEF3 y Crumbs, una proteína
que es esencial para el desarrollo de epitelios (Tepass y cols., 1990; Myat y Andrew,
2002). Los resultados indican que estas dos proteínas localizan en dominios celulares
diferentes: concordante con la literatura, Crumbs es detectada en las uniones
adherentes, en un dominio sub-apical de las células (Myat y Andrew, 2002), mientras
que RhoGEF3 se localiza en un dominio más cercano a la membrana apical (Figura
14). Esta distribución se confirma al observar los núcleos de una glándula de estado 14
(Figura 13, B) y al comparar la distribución de RhoGEF3 con aquella de la actina en
glándulas salivales de larva (Figura 13, C). En este caso, ambas proteínas se
distribuyen en dominios similares, esto es, en la cara apical de las células, que enfrenta
el lumen de las glándulas. En su conjunto, tanto la expresión del transcrito como la
proteína sugieren que RhoGEF3 participa en la diferenciación de estructuras tubulares,
particularmente formando parte de células secretorias (Figura 14), dado que no se
detecta la presencia de RhoGEF3 en las células del ducto de la glándula que
corresponden a un tipo celular diferente (Myat, 2005; Andrew y Ewal, 2009).
- 165 -
4. Morfogénesis de las glándulas salivales y posibles funciones de RhoGEF3.
Las glándulas salivales están compuestas por dos tipos celulares, las células
secretoras, que son células epiteliales columnares que sintetizan y secretan grandes
cantidades de proteínas, y las células del ducto, que son células cuboidales que
forman tubos simples conectando las células secretorias con las estructuras de la boca
de las larvas. Las glándulas salivales surgen de dos placas ectodermales ventrales de
aproximadamente 100 células cada una, denominadas placodas, en la región posterior
de la cabeza. En embriones de estado 12, las células de la placoda experimentan
constricciones apicales, cambian su forma de columnar a piramidal al mismo tiempo
que sus núcleos se mueven a una posición más basal y comienzan a invaginar (Myat y
Andrew, 2000a; Myat y Andrew, 2000b). El resultado es la formación de un tubo que se
extiende en dirección dorsal hasta que las células del extremo distal de la glándula
contactan al mesodermo visceral e inician su migración hacia el extremo posterior a
medida que las células del extremo distal adquieren un fenotipo migratorio, generando
proyecciones y extendiéndose en la dirección del movimiento. Hacia el final de la
embriogénesis, las células de la glándula salival han alcanzado la mitad del tercer
segmento torácico, posicionando la región secretora de la glándula paralela al eje
antero-posterior del embrión. La especificación de las glándulas salivales obedece a un
fino programa transcripcional dirigido por los reguladores Sex combs reduced (Scr),
Abdominal-B (Abd-B), teashirt (tsh) extradenticle (exd) y homothorax (hth) y por las
vías de transducción activadas por Dpp y EGF (Andrew y cols., 2000).
Durante la invaginación de la glándula salival, la GTPasa Rho1 es responsable
de la constricción apical y del cambio de forma de las células a través de la activación
de la quinasa Rho en la superficie apical de éstas (Xu y cols., 2008). Además, Rho 1
- 166 -
mantiene la localización apical de Crumbs. Mutaciones tanto en Crumbs como en
Klarsicht (klar), una proteína que regula con el transporte de membrana a la región
apical de la célula han demostrado que la elongación de la glándula salival, un proceso
sustentado únicamente en el cambio de forma celular, requiere de la síntesis y
transporte de membrana a la zona apical de las células (Myat y Andrew, 2002). Por su
parte, la migración de la glándula hacia el extremo posterior es regulada por Ribbon
(Rib) una proteína nuclear con un dominio BTB/POZ y requiere de la integridad del
mesodermo visceral y de la actividad de las α-integrinas PS1 y PS2 (Kerman y cols.,
2008). La GTPasa Rac1 también se encuentra involucrada en la morfogénesis de la
glándula salival y mutaciones en los tres genes rac de Drosophila (rac1, rac2 y mtl)
indican que esta GTPasa modula la plasticidad de las adhesiones celulares mediadas
por Cadherinas a través de una regulación de la endocitosis de Cadherinas
dependiente de Dinamina (Pirriaglia y cols., 2006). En mutantes de los tres genes Rac,
se observan, además, fallas en la migración celular y en la formación correcta del
lumen (Pirriaglia y cols., 2006). De manera similar, estudios realizados con mutantes
de rac1 y rac2 durante la formación de las tráqueas sugieren una regulación negativa
de Rac1 sobre la adhesión celular mediada por Cadherinas, dado que en ellos se
detecta una acumulación de E-Cadherinas y α y β-cateninas (Chihara y cols., 2003).
Además los embriones muestran varios defectos de migración y diferenciación de las
tráqueas (Chihara y cols., 2003). Estos fenotipos son observados además en mutantes
de pak, un efector de Rac, y elementos de la vía de FGF, indicando que existe una
interacción génica entre ellos y Rac (Chihara y cols., 2003). Las tres GTPasas
participan en el ensamblaje de uniones adherentes de células epiteliales compuestas
por Cadherinas. La inhibición de Rho o Rac impide la formación de estas uniones en
- 167 -
queratinocitos (Braga y cols., 1997). Además, la proteína Tiam-1, un GEF de Rac es
imprescindible para la formación y mantención de este tipo de uniones en células
MDCK (Malliri y cols., 2004). La unión de Cadherinas conlleva al reclutamiento de Rac
activada a los sitios de adhesión para estabilizar la unión a través del ensamblaje de
filamentos de actina. La proteína IQGAP, un blanco de Rac ha sido implicada en el
ensamblaje de actina en las uniones, sin embargo, se ha sugerido que IQGAP podría
secuestrar β-catenina y que la acción de Rac y Cdc42 puede desestabilizar este
complejo permitiendo la participación deβ -catenina en el ensamblaje de las uniones
(Kuroda y cols., 1999; Noritake y cols., 2004). Por otra parte, la sobreactivación de Rac
en queratinocitos conlleva al desensamblaje de uniones, y en células MDCK promueve
la migración de las células más que la unión célula-célula (Braga y cols., 2000; Sander
y cols., 1998). Considerando que Rac parece participar en dos funciones
contrapuestas, migración y unión célula-célula, es probable que sus efectos sean
influenciados por factores ambientales y tipos celulares distintos. Se ha observado que
el ensamblaje de uniones adherentes es precedido por la inducción localizada de
filopodios y lamelipodios y que estas estructuras son las responsables de establecer,
en primer término, los contactos entre células adyacentes (Ehrlich y cols., 2002; Jacinto
y cols., 2000; Vasioukhin y cols., 2000). La formación de estas estructuras puede ser
iniciada, en una etapa temprana, por interacciones de Cadherinas que activarían Rac y
Cdc42, lo que generaría un circuito de retroalimentación positiva (Noritake y cols.,
2004). Sin embargo, una hipótesis alternativa ha surgido con la caracterización de una
nueva familia de proteínas de adhesión, las Nectinas, que son proteínas de
transmembrana que forman interacciones homo y heteromoleculares, lo que sugiere su
participación en el ensamblaje de uniones basadas en Cadherinas. La interacción
- 168 -
Nectina-Nectina activa a Rac y a Cdc42 y ello podría activar
la formación de
estructuras localizadas necesarias para establecer la adhesión basada en Cadherinas
(Jaffe y Hall, 2005).
¿Qué papel podría cumplir RhoGEF3 en el contexto del desarrollo y
diferenciación de las glándulas salivales? Para responder esta pregunta, en primer
término analizamos el fenotipo de embriones que expresan un RNAi interferente
dirigido contra rhogef3, sin embargo no obtuvimos resultados que permitieran inferir
una función de este gen, si bien las mediciones por qPCR indican una disminución del
40% en la abundancia de su transcrito, ésta no fue suficiente para generar alteraciones
morfológicas en las glándulas salivales. En este punto es importante recordar que la
observación de fenotipos tanto en glándulas salivales como en células se logró
mediante la pérdida de función de más de un gen de la familia rac, sugiriendo que
existe una redundancia genética en su función (Pirriaglia y cols., 2006; Kiger y cols.,
2003). Más aún, mutaciones en las GTPasas provocan fenotipos más severos que
mutaciones en las GEF que las regulan, sugiriendo que las GTPasas participarían en
un mayor número de procesos, como es el caso de Rho1 y DRhoGEF2 (Barret y cols.,
1997; Häcker y Perrimon, 1998; Magie y cols., 1999).
Teniendo esto en consideración, en la actualidad nos encontramos analizando
los fenotipos embrionarios de una cepa portadora de una deleción cromosómica que
remueve el gen rhogef3 y otros 7 genes. Si bien hemos encontrado alteraciones en el
fenotipo de las glándulas salivales, estos estudios son aún preliminares y por motivos
de tiempo, no serán incluidos en el presente trabajo. Ciertamente, evidencias
adicionales son necesarias para proponer un mecanismo que dé cuenta de la función
de RhoGEF3 durante la morfogénesis de la glándula salival. Sin embargo, los
- 169 -
resultados obtenidos hasta la fecha nos permiten situar a RhoGEF3 en un proceso
particular de la morfogénesis embrionaria y a partir del conocimiento adquirido
podemos plantearnos preguntas y elaborar estrategias que permitan abordar un
estudio más detallado de su función.
Conclusiones.
Los estudios de expresión génica a gran escala proveen una gran cantidad de
información respecto a un proceso celular, especialmente información descriptiva que
es posible correlacionar de una manera coherente. Sin embargo, esta información
debe ser complementada con estudios funcionales que deriven en la determinación de
mecanismos moleculares que dirigen los procesos en estudio. Este es el propósito de
este trabajo. Durante el presente estudio hemos avanzado en la caracterización del
gen rhogef3. Hemos determinado su dinámica de expresión y la localización subcelular
de la proteína codificada con él. En términos de su función, nos hemos aproximado a
entender los mecanismos moleculares en los cuales participa, utilizando el modelo de
células en cultivo, sin embargo, aun no hemos logrado determinar su función en el
organismo completo, debido principalmente a la alta complejidad que esto implica y
como hemos discutido, su función puede ser redundante o muy específica y
alteraciones en su función podrían ser sutiles. Sin embargo, creemos que estamos en
el buen camino y esperamos poder determinar en el corto plazo estas funciones.
- 170 -
Bibliografía
Adams M., Celniker SE, Holt RA, Evans CA, Gocayne JD, y cols. 2000. The Genome
Sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287:2185-2195.
Adams MD, Sekelsky JJ. 2002. From sequence to phenotype: reverse genetics in
Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3(3):189-98.
Andrew DJ, Ewald AJ. 2009. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube
formation, elongation, and elaboration. Dev Biol. 2009 Sep 22.
Andrew DJ, Henderson KD, Seshaiah P. 2000. Salivary gland development in
Drosophila melanogaster. Mech Dev. 92(1):5-17.
Aracena J, González M, Zúñiga A, Méndez MA, Cambiazo V. 2006. Regulatory network
for cell shape changes during Drosophila ventral furrow formation. J. Theor. Biol.
239:49-62.
Arthur WT, Burridge K. 2001. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell
spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Mol Biol Cell.
12(9):2711-20.
Awasaki T, Saito M, Sone M, Suzuki E, Sakai R, Ito K, Hama C. 2000. The Drosophila
Trio Plays an Essential Role in Patterning of Axons by Regulating Their Directional
Extension. Neuron. 26:119-131
Bakal C, Aach J, Church G, Perrimon N. 2007. Quantitative morphological signatures
define local signaling networks regulating cell morphology. Science. 316(5832):1753-6.
Barrett K, Leptin M, Settleman J. 1997. The Rho GTPase and a putative RhoGEF
mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell.
91(7):905-15.
Bateman J, Shu H, Van Vactor D. 2000. The guanine nucleotide exchange factor trio
mediates axonal development in the Drosophila embryo. Neuron. 26(1):93-106.
Bertet C, Sulak L, Lecuit T. 2004. Myosin-dependent junction remodelling controls
planar cell intercalation and axis elongation. Nature. 429:667-671.
Blanke S, Jäckle H. 2006. Novel guanine nucleotide exchange factor GEFmeso of
Drosophila melanogaster interacts with Ral and Rho GTPase Cdc42. FASEB J.
20(6):683-91.
Bloor JW, Kiehart DP. 2002. Drosophila RhoA regulates the cytoskeleton and cell-cell
adhesion in the developing epidermis. Development. 129:3173-3183.
- 171 -
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72:24854.
Braga VM, Betson M, Li X, Lamarche-Vane N. 2000. Activation of the small GTPase
Rac is sufficient to disrupt cadherin-dependent cell-cell adhesion in normal human
keratinocytes. Mol Biol Cell. 11(11):3703-21.
Braga VM, Machesky LM, Hall A, Hotchin NA. 1997. The small GTPases Rho and Rac
are required for the establishment of cadherin-dependent cell-cell contacts. J Cell Biol.
137(6):1421-31.
Brand AH, Perrimon N. 1993. Targeted gene expression as a means of altering cell
fates and generating dominant phenotypes. Development. 118(2):401-15.
Brill JA, Hime GR, Scharer-Schuksz M, Fuller MT. 2000. A phospholipid kinase
regulates actin organization and intercellular bridge formation during germline
cytokinesis. Development. 127(17):3855-64.
Burge C, Karlin S. 1997. Prediction of complete gene structures in human genomic
DNA. J. Mol. Biol. 268:78-94.
Campos-Ortega J. Hartenstein V. 1985. The Embryonic Development of Drosophila
melanogaster. Spring-Verlag.
Campos-Ortega J. Hartenstein V. 1997. The Embryonic Development of Drosophila
melanogaster. Spring-Verlag. Segunda Edicion.
Cavener DR. 1987. Comparison of the consensus sequence flanking translational start
sites in Drosophila and vertebrates. Nucleic Acids Res. 15(4):1353-61.
Chihara T, Kato K, Taniguchi M, Ng J, Hayashi S. 2003. Rac promotes epithelial cell
rearrangement during tracheal tubulogenesis in Drosophila. Development. 130(7):141928.
Costa M, Sweeton D, Wieschaus E. 1993. Gastrulation in Drosophila: cellular
mechanisms of morphogenetic movements, in: Bate, M., Martinez-Arias,A. (Eds), The
Development of Drosophila. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York.
Costa M, Wilson E, Wieschaus E. 1994. A putative cell signal encoded by the folded
gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell.
76:1075-1089.
Dawes-Hoang RE, Parmar KM, Christiansen AE, Phelps CB, Brand AH, Wieschaus E.
2005. folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization.
Development. 132:4165-4178.
- 172 -
Dietzl G, Chen D, Schnorrer F, Su KC, Barinova Y, Fellner M, Gasser B, Kinsey K,
Oppel S, Scheiblauer S, Couto A, Marra V, Keleman K, Dickson BJ. 2007. A genomewide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature.
448(7150):151-6.
Eaton S,Wepf R, Simons K. 1996. Roles for Rac1 and Cdc42 in planar polarization and
hair outgrowth in the wing of Drosophila. J. Cell Biol. 135:1277–1289.
Ehrlich JS, Hansen MD, Nelson WJ. 2002. Spatio-temporal regulation of Rac1
localization and lamellipodia dynamics during epithelial cell-cell adhesion. Dev Cell.
3(2):259-70.
Englund C, Birve A, Falileeva L, Grabbe C, Palmer RH. 2006. Miple1 and miple2
encode a family of MK/PTN homologues in Drosophila melanogaster. Dev Genes Evol.
216(1):10-8.
Fanto M, Weber U, Strutt DI, Mlodzik M. 2000. Nuclear signaling by Rac and Rho
GTPases is required in the establishment of epithelial planar polarity in the Drosophila
eye. Curr. Biol. 10:979–988.
Fukata M, Watanabe T, Noritake J, Nakagawa M, Yamaga M, Kuroda S, Matsuura Y,
Iwamatsu A, Perez F, Kaibuchi K. 2002. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through
IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109(7):873-85.
Genova JL, Jong S, Camp JT, Fehon RG. 2000. Functional analysis of Cdc42 in actin
filament assembly, epithelial morphogenesis, and cell signaling during Drosophila
development. Dev. Biol. 221:181–194.
González-Agüero M, Zúñiga A, Pottstock H, Del Pozo T, González M, Cambiazo V.
2005. Identification of genes expressed during Drosophila melanogaster gastrulation by
using subtractive hybridization. Gene. 345(2):213-24. .
Grosshans J, Wenzl C, Herz HM, Bartoszewski S, Schnorrer F, Vogt N, Schwarz H,
Müller HA. 2005. RhoGEF2 and the formin Dia control the formation of the furrow canal
by directed actin assembly during Drosophila cellularisation. Development.
132(5):1009-20.
Häcker U, Perrimon N. 1998. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of
oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes
Dev. 12(2):274-84.
Hakeda-Suzuki S, Ng J, Tzu J, Dietzl G, Sun Y, Harms M, Nardine T, Luo L, Dickson
BJ. 2002. Rac function and regulation during Drosophila development. Nature 416:438442.
Hamann MJ, Lubking CM, Luchini DN, Billadeau DD. 2007. Asef2 functions as a Cdc42
exchange factor and is stimulated by the release of an autoinhibitory module from a
concealed C-terminal activation element. Mol Cell Biol. 27(4):1380-93.
- 173 -
Harden N, Loh HY, Chia W, Lim L. 1995. A dominant inhibitory version of the small
GTP-binding protein Rac disrupts cytoskeletal structures and inhibits developmental
cell shape changes in Drosophila. Development. 121:903-914.
Harden N, Ricos M, Ong YM, Chia W, Lim L. 1999. Participation of small GTPases in
dorsal closure of the Drosophila embryo: distinct roles for Rho subfamily proteins in
epithelial morphogenesis. J. Cell Sci. 112:273-284.
Harden N. 2002. Signaling pathways directing the movement and fusion of epithelial
sheets: lessons from dorsal closure in Drosophila. Differentiation. 70(4-5):181-203.
Harlow E, Lane D. 1999. Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.
Harvey K, Duguid IC, Alldred MJ, Beatty SE, Ward H, Keep NH, Lingenfelter SE,
Pearce BR, Lundgren J, Owen MJ, Smart TG, Lüscher B, Rees MI, Harvey RJ. 2004.
The GDP-GTP exchange factor collybistin: an essential determinant of neuronal
gephyrin clustering. J Neurosci. 24(25):5816-26.
Hicks MS, O'Leary V, Wilkin M, Bee SE, Humphries MJ, Baron M. 2001. DrhoGEF3
encodes a new Drosophila DH domain protein that exhibits a highly dynamic embryonic
expression pattern. Dev Genes Evol. 211(5):263-7.
Hoffman GR, Cerione RA. 2002. Signaling to the Rho GTPases: networking with the
DH domain. FEBS Lett. 513:85-91.
Huelsmann S, Hepper C, Marchese D, Knöll C, Reuter R. 2006. The PDZ-GEF dizzy
regulates cell shape of migrating macrophages via Rap1 and integrins in the Drosophila
embryo. Development. 133(15):2915-24.
Irvine KD, Wieschaus E. 1994. Cell intercalation during Drosophila germband extension
and its regulation by pair-rule segmentation genes. Development. 120:827-841.
Jacinto A, Baum B. 2003. Actin in development. Mech. Dev. 120:1337-1349.
Jacinto A, Wood W, Balayo T, Turmaine M, Martinez-Arias A, Martin P. 2000. Dynamic
actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure.
Curr Biol. 10(22):1420-6.
Jacinto A, Woolner S, Martin P. 2002. Dynamic analysis of dorsal closure in Drosophila:
from genetics to cell biology. Dev. Cell. 3:9-19.
Jaffe AB, Hall A. 2005. Rho GTPases: biochemistry and biology. Annu Rev Cell Dev
Biol. 21:247-69.
Johnson K, Knust E, Skaer H. 1999. bloated tubules (blot) encodes a Drosophila
member of the neurotransmitter transporter family required for organisation of the apical
cytocortex. Dev Biol. 212(2):440-54.
- 174 -
Kawasaki Y, Sato R, Akiyama T. 2003. Mutated APC and Asef are involved in the
migration of colorectal tumour cells. Nat Cell Biol. 5(3):211-5.
Kawasaki Y, Senda T, Ishidate T, Koyama R, Morishita T, Iwayama Y, Higuchi O,
Akiyama T. 2000. Asef, a link between the tumor suppressor APC and G-protein
signaling. Science. 289(5482):1194-7.
Kerman BE, Cheshire AM, Myat MM, Andrew DJ. 2008. Ribbon modulates apical
membrane during tube elongation through Crumbs and Moesin. Dev Biol.320(1):27888.
Kiger AA, Baum B, Jones S, Jones MR, Coulson A, Echeverri C, Perrimon N. 2003. A
functional genomic analysis of cell morphology using RNA interference. J Biol. 2(4):27.
Kundsen KA. 1985. Proteins tranferred to nitrocellulose for use as immunogens. Anal.
Biochem. 147, 285-288.
Kuroda S, Fukata M, Nakagawa M, Kaibuchi K. 1999. Cdc42, Rac1, and their effector
IQGAP1 as molecular switches for cadherin-mediated cell-cell adhesion. Biochem
Biophys Res Commun. 262(1):1-6.
Lemmon MA, Ferguson KM, Abrams CS. 2002. Pleckstrin homology domains and the
cytoskeleton. FEBS Lett. 513:71-76.
Leptin M, Grunewald B. 1990. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila.
Development. 110:73-84.
Leptin M. 1995. Drosophila Gastrulation: From Pattern Formation to Morphogenesis.
Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11:189-212.
Leptin M. 1999. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms.
EMBO J. 18:3187-3192.
Leptin M.,1991. twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila
mesoderm development. Genes Dev. 5:1568-1576.
Liu T, Sims D, Baum B. 2009. Parallel RNAi screens across different cell lines identify
generic and cell type-specific regulators of actin organization and cell morphology.
Genome Biol. 10(3):R26.
Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25(4):402-408.
Luo L, Liao YJ, Jan LY, Jan YN. 1994. Distinct morphogenetic functions of similar small
GTPases: Drosophila Drac1 is involved in axonal outgrowth and myoblast fusion.
Genes Dev. 8(15):1787-802.
Mackay D. Hall A. 1998. Rho GTPases. J Biol Chem, Vol. 273(33):20685-20688.
- 175 -
Magie CR, Meyer MR, Gorsuch MS, Parkhurst SM. 1999. Mutations in the Rho1 small
GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila
development. Development. 126(23):5353-64.
Magie CR, Parkhurst SM. 2005. Rho1 regulates signaling events required for proper
Drosophila embryonic development. Dev. Biol. 278:144-154.
Magie CR, Pinto-Santini D, Parkhurst SM. 2002. Rho1 interacts with p120ctn and
alpha-catenin, and regulates cadherin-based adherens junction components in
Drosophila. Development. 129(16):3771-82.
Malliri A, van Es S, Huveneers S, Collard JG. 2004. The Rac exchange factor Tiam1 is
required for the establishment and maintenance of cadherin-based adhesions. J Biol
Chem.279(29):30092-8.
Maruyama K. Sugano S. 1994. Oligo-Capping: A Simple Method to Replace the Cap
Structure of Eukaryotic mRNAs with Oligoribonucleotides. Gene 138, 171-174.
Maybeck V, Röper K. 2008. A targeted gain-of-function screen identifies genes affecting
salivary gland morphogenesis/tubulogenesis in Drosophila. Genetics. 181(2):543-65.
Merrill PT, Sweeton D, Wieschaus E. 1988. Requirements for autosomal gene activity
during precellular stages of Drosophila melanogaster. Development. 104(3):495-509.
Morize P, Christiansen AE, Costa M, Parks S, Wieschaus E. 1998. Hyperactivation of
the folded gastrulation pathway induces specific cell shape changes. Development.
125:589-597.
Murayama K, Shirouzu M, Kawasaki Y, Kato-Murayama M, Hanawa-Suetsugu K,
Sakamoto A, Katsura Y, Suenaga A, Toyama M, Terada T, Taiji M, Akiyama T,
Yokoyama S. 2007. Crystal structure of the rac activator, Asef, reveals its autoinhibitory
mechanism. J Biol Chem. 282(7):4238-42.
Myat MM, Andrew DJ. 2000a. Organ shape in the Drosophila salivary gland is
controlled by regulated, sequential internalization of the primordia. Development.
127(4):679-91.
Myat MM, Andrew DJ. 2000b. Fork head prevents apoptosis and promotes cell shape
change during formation of the Drosophila salivary glands. Development. 2000
Oct;127(19):4217-26.
Myat MM, Andrew DJ. 2002. Epithelial tube morphology is determined by the polarized
growth and delivery of apical membrane. Cell. 111(6):879-91.
Myat MM. 2005. Making Tubes in the Drosophila Embryo. Dev Dyn. 232:617–632.
- 176 -
Nikolaidou KK, Barrett K. 2004. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively
in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Curr. Biol.
14:1822-1826.
Noritake J, Fukata M, Sato K, Nakagawa M, Watanabe T, Izumi N, Wang S, Fukata Y,
Kaibuchi K. 2004. Positive role of IQGAP1, an effector of Rac1, in actin-meshwork
formation at sites of cell-cell contact. Mol Biol Cell. 15(3):1065-76.
Oleksy A, Opaliński Ł, Derewenda U, Derewenda ZS, Otlewski J. 2006. The molecular
basis of RhoA specificity in the guanine nucleotide exchange factor PDZ-RhoGEF. J
Biol Chem. 281(43):32891-7.
Padash Barmchi M, Rogers S, Häcker U. 2005. DRhoGEF2 regulates actin
organization and contractility in the Drosophila blastoderm embryo. J. Cell Biol.
168:575-585.
Parks S, Wieschaus E. 1991. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G
alpha-like protein. Cell. 64:447-458.
Pirraglia C, Jattani R, Myat MM. 2006. Rac function in epithelial tube morphogenesis.
Dev Biol. 290(2):435-46.
Prokopenko S. N., Brumby A., O'Keefe L., Prior L., He Y., Saint R., Bellen H. J. 1999. A
putative exchange factor for Rho1 GTPase is required for initiation of cytokinesis in
Drosophila. Genes Dev. 13:2301-2314.
Prokopenko SN, Saint R, Bellen HJ. 2000. Tissue distribution of PEBBLE RNA and
pebble protein during Drosophila embryonic development. Mech Dev. 90(2):269-73.
Reese MG, Kulp D, Tammana H, Haussler D. 2000. Genie-gene finding in Drosophila
melanogaster. Genome Res. 10:529-538.
Ribeiro C, Neumann M, Affolter M. 2004. Genetic control of cell intercalation during
tracheal morphogenesis in Drosophila. Curr Biol. 14(24):2197-207.
Roberts DB. 1998. Drosophila, a practical approach. Oxford University Press. Oxford
University Press Inc. NY.
Rogers SL, Rogers GC, Sharp DJ, Vale RD. 2002. Drosophila EB1 is important for
proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol.
158(5):873-84.
Rogers SL, Wiedemann U, Stuurman N, Vale RD. 2003. Molecular requirements for
actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells. J Cell Biol. 162(6):1079-88.
Rojas RJ, Kimple RJ, Rossman KL, Siderovski DP, Sondek J. 2003. Established and
emerging fluorescence-based assays for G-protein function: Ras-superfamily GTPases.
Comb Chem High Throughput Screen. 6(4):409-18.
- 177 -
Rosenberger G., Kutsche K. 2006. αPIX and βPIX and their role in focal adhesion
formation. Eur. J. Cell Biol. 85:265-274.
Rossman KL, Der CJ, Sondek J. 2005. GEF means go: turning on RHO GTPases with
guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6(2):167-80.
Ryder E. y cols. 2004. The DrosDel collection: a set of P-element insertions for
generating custom chromosomal aberrations in Drosophila melanogaster. Genetics.
167(2):797-813.
Sahai E, Marshall CJ. 2002. ROCK and Dia have opposing effects on adherens
junctions downstream of Rho. Nat. Cell Biol. 4:408-415.
Sander EE, van Delft S, ten Klooster JP, Reid T, van der Kammen RA, Michiels F,
Collard JG. 1998. Matrix-dependent Tiam1/Rac signaling in epithelial cells promotes
either cell-cell adhesion or cell migration and is regulated by phosphatidylinositol 3kinase. J Cell Biol. 143(5):1385-98.
Satou Y, Satoh N. 1997. Posterior end mark 2 (pem-2), pem-4, pem-5, and pem-6:
maternal genes with localized mRNA in the ascidian embryo. Dev Biol. 192(2):467-81.
Sawyer JK, Harris NJ, Peifer M. 2009. Morphogenesis: Multitalented GTPases Seeking
New Jobs. Curr Biol. 19(21):R985-R987.
Schaefer BC. 1995. Revolutions in Rapid Amplification of cDNA Ends: New Strategies
for Polymerase Chain Reaction Cloning of Full-Length cDNA Ends. Anal. Biochem. 227,
255-273.
Schmidt A, Hall A. 2002. Guanine nucleotide exchange factors for Rho GTPases:
turning on the switch. Genes Dev. 16(13):1587-609.
Schneider I. 1972. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila
melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27(2):353-65.
Schöck F, Perrimon N. 2002. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis.
Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18:463-93.
Settleman J. 2001. Rac 'n Rho: the music that shapes a developing embryo. Dev. Cell.
1:321-331.
Smallhorn M, Murray MJ, Saint R. 2004. The epithelial-mesenchymal transition of the
Drosophila mesoderm requires the Rho GTP exchange factor Pebble. Development.
131:2641-2651.
Sugiyama S, Moritoh S, Furukawa Y, Mizuno T, Lim YM, Tsuda L, Nishida Y. 2007.
Involvement of the mitochondrial protein translocator component tim50 in growth, cell
proliferation and the modulation of respiration in Drosophila. Genetics. 176(2):927-36.
- 178 -
Takai Y, Sasaki T, Matozaki T. 2001. Small GTP-binding proteins. Physiol Rev.
81(1):153-208.
Tanimoto H, Itoh S, ten Dijke P, Tabata T. 2000. Hedgehog creates a gradient of DPP
activity in Drosophila wing imaginal discs. Mol Cell. 5(1):59-71.
Tepass U, Theres C, Knust E. 1990. crumbs encodes an EGF-like protein expressed on
apical membranes of Drosophila epithelial cells and required for organization of
epithelia. Cell. 61(5):787-99.
Thomas GH, Kiehart DP. 1994. β heavy-spectrin has a restricted tissue and subcellular
distribution during Drosophila embryogenesis. Development. 120:2039-2050.
VanHook A, Letsou A. 2008. Head involution in Drosophila: genetic and morphogenetic
connections to dorsal closure. Dev Dyn. 237(1):28-38.
Vasioukhin V, Bauer C, Yin M, Fuchs E. 2000. Directed actin polymerization is the
driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell.100(2):209-19.
Volloch V, Schweitzer B, Rits S. 1994. Ligation-Mediated Amplification of RNA from
Murine Erythroid Cells Reveals a Novel Class of Beta-Globin mRNA with an Extended
5'-Untranslated Region. Nucleic Acids Res. 22, 2507-2511.
Welch HC, Coadwell WJ, Ellson CD, Ferguson GJ, Andrews SR, Erdjument-Bromage
H, Tempst P, Hawkins PT, Stephens LR. 2002. P-Rex1, a PtdIns(3,4,5)P3- and
Gbetagamma-regulated guanine-nucleotide exchange factor for Rac. Cell. 108(6):80921.
Wieschaus E, Sweeton D. 1988. Requirements for X-linked zygotic gene activity during
cellularization of early Drosophila embryos. Development. 104(3):483-93.
Xu N, Keung B, Myat MM. 2008. Rho GTPase controls invagination and cohesive
migration of the Drosophila salivary gland through Crumbs and Rho-kinase. Dev Biol.
321(1):88-100.
Yanagawa S, Lee JS, Ishimoto A. 1998. Identification and characterization of a novel
line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling. J Biol Chem.
273(48):32353-9.
Young PE, Pesacreta TC, Kiehart DP. 1991. Dynamic changes in the distribution of
cytoplasmic myosin during Drosophila embryogenesis. Development. 111:1-14.
Young PE, Richman AM, Ketchum AS, Kiehart DP. 1993. Morphogenesis in Drosophila
requires nonmuscle myosin heavy chain function. Genes Dev. 7(1):29-41.
Zallen JA, Wieschaus E. 2004. Patterned gene expression directs bipolar planar
polarity in Drosophila. Dev. Cell. 6:343-55.
- 179 -
Zúñiga A, Hödar C, Hanna P, Ibáñez F, Moreno P, Pulgar R, Pastenes L, González M,
Cambiazo V. 2009. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are
temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.
BMC Biol. 7:61.
- 180 -