Técnicas para la determinación de compuestos

Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –
ISSN: 1989-9041, Autodidacta ©
TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE
COMPUESTOS ANTIOXIDANTE EN ALIMENTOS.
Laura Agudo Medina
[email protected]
1.- RADICALES LIBRES Y COMPUESTOS ANTIOXIDANTES
Radical libre (RL) es cualquier especie química capaz de existir de forma
independiente y que presenta uno o más electrones desapareados en su estructura.
Como consecuencia, son altamente reactivos lo que hace que tengan una vida media
del orden de milisegundos, aunque varía según el tipo de radical libre (Halliwell y col.,
1992).
Los radicales libres también son conocidos como especies reactivas
oxigénicas o del oxígeno, ROS, y especies reactivas del nitrógeno, RNS.
A bajas concentraciones los radicales libres son necesarios para el buen
funcionamiento celular pudiendo actuar como segundos mensajeros estimulando la
proliferación celular y/o actuando como mediadores para la activación de las células.
Sin embargo, un exceso de los mismos puede acumularse hasta niveles tóxicos dando
como resultado que se produzcan diversas acciones sobre el metabolismo de los
principios inmediatos, que pueden ser origen del daño celular (Davies, 1995).
La capacidad que tenga cada radical libre para actuar como agente oxidante está
determinada por factores como su reactividad, especificidad, selectividad y
difusibilidad. Son responsables del daño oxidativo de macromoléculas biológicas como
el DNA, lípidos, carbohidratos y proteínas. Participan en los mecanismos
fisiopatológicos de muchas enfermedades, como algunos tipo de cáncer, diabetes,
patologías cardiovasculares, procesos reumáticos, patologías gastroentéricas,
afecciones broncopulmonares o procesos neurodegenerativos. También están
implicados en procesos fisiológicos como el envejecimiento, el daño causado por el
ejercicio físico agotador y otros.
Aunque se produce un gran daño oxidativo, el organismo ha desarrollado un
sistema de defensa antioxidante que intenta evitar o neutralizar la agresión. Un
antioxidante es “cualquier sustancia que en presencia de un sustrato oxidable retrasa
o inhibe la oxidación del mismo” (Mataix y Battino, 2002). Se caracterizan por ser muy
heterogéneos, pueden ser hidrosolubles y liposolubles, localizarse intra y
extracelularmente, y proceder de diferentes fuentes ya que algunos son nutrientes o
proceden de éstos y otros son productos del metabolismo.
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Los antioxidantes pueden actuar:
A.
Previniendo la formación de ROS.
B.
Interceptando el ataque de ROS.
C. Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtiéndolos en moléculas menos
reactivas.
D.
Facilitando la reparación del daño causado por ROS.
E.
Manteniendo un ambiente favorable para la actuación de otros antioxidantes.
F.
Amplificando la resistencia de las dianas biológicas sensibles al ataque de ROS.
Según el modo de acción, los antioxidantes se clasifican en primarios, secundarios
ó terciarios:
 Primarios: Impiden la formación de radicales libres, frenan la reacción en
cadena de los radicales libres, especialmente de las especies reactivas del oxígeno
(ROS) ó son quelantes de metales de transición. Se comportan como captadores de
estos ROS.
 Secundarios: Interrumpen la reacción de propagación de los radicales libres ó
desplazan las especies reactivas del oxígeno (ácido ascórbico, carotenoides, glutation
y la mayoría de las enzimas antioxidantes).
 Terciarios: Reparan el daño causado a las moléculas por los radicales libres ó
eliminan aquéllas que se han estropeado.
En el organismo humano los radicales libres están controlados mediante un amplio
espectro de antioxidantes de origen endógeno (enzimas antioxidantes, glutatión,
albúmina, transferrina, ácido úrico, bilirrubina) y exógenos a través de la dieta
(vitamina E y C, carotenoides, selenio, compuestos fenólicos) (Gutteridge, 1995). Entre
los componentes del sistema antioxidante endógeno destacan las enzimas
antioxidantes: catalasa,
superóxido dismutasa (SOD) y glucosa fosfato
deshidrogenasa. La SOD es una enzima distribuida en todo el organismo. Hay dos
tipos intracelulares de SOD: la que está presente en la mitocondria, que contiene
manganeso en su centro activo (Mn-SOD) y la del citosol, que tiene iones de cobre y
zinc (Cu-Zn-SOD). La Catalasa es una enzima intracelular que se localiza en el interior
de los glóbulos rojos. El equilibrio entre la actividad de la Catalasa respecto de SOD es
fundamental para mantener el balance REDOX. La GPx es un complejo enzimático,
existen cuatro formas diferentes de esta enzima y todas ellas tienen selenio en su
centro activo (Holben DH y col., 1999).
Cuando la agresión supera las defensas se habla de estrés oxidativo, es decir, el
balance oxidativo entre la producción de radicales libres y las defensas antioxidantes
se rompe. Si esto ocurre las especies reactivas generadas pueden iniciar procesos
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patológicos graves
envejecimiento.
como
diabetes,
cáncer,
enfermedades
cardiovasculares,
2.- BENEFICIOS QUE SE OBTIENEN DE UNA DIETA RICA EN POLIFENOLES.
Son numerosos los estudios que han mostrado que los polifenoles poseen
propiedades antioxidantes, inhibiendo la peroxidación lipídica y captando radicales
libres hidroxilo, supéroxido y alcoxi (Sichel et al., 1991). Protegen de la oxidación a las
lipoproteínas de baja densidad (LDL) desempeñando un papel clave en la prevención
de la aterosclerosis. También pueden prevenir la trombosis, inhibiendo la agregación
plaquetaria, la permeabilidad y fragilidad capilar (Mazza, 2000). Son considerados
reguladores del sistema inmune y como antiinflamatorios, probablemente debido a la
modulación del metabolismo del ácido araquidónico, reduciendo los niveles de
tromboxano. Modulan la actividad enzimática de la ciclooxigenasa, lipoxigenasa,
fosfolipasa A2, hialuronidasa, e inhiben la acción de la angiotensina convertasa,
mieloperoxidasa (que produce el hipoclorito y otros prooxidantes) y xantinooxidasa
(que produce los radicales superóxido). Hay que destacar
el potencial
anticarcinógeno, ya que pueden estimular el bombeo de ciertos agentes cancerígenos
hacia el exterior de las células o bien activar a las enzimas de detoxificación (Mazza,
2000).
3.- EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTES DE LOS ALIMENTOS
Los compuestos antioxidantes de los alimentos se extraen con disolventes de
diferentes polaridades de acuerdo con el carácter hidrofílico o lipofílico de los
compuestos que se desean evaluar. El disolvente más comúnmente utilizado en la
obtención de extractos lipofílicos es el hexano. También se han utilizado el eter
dietílico y cloruro de metileno entre otros. Para la extracción de compuestos con
carácter hidrofílico se han utilizado metanol, etanol, mezclas de etanol/agua,
acetona/agua y metanol/agua así como extracción en medio ácido (pH=2) con
metanol/agua, seguida de acetona/agua y agua/acetonitrilo en medio ácido, todos ellos
ensayados en diferentes proporciones. Recientemente se ha observado que el tipo de
disolvente y la polaridad puede afectar a la transferencia del electrón singlete y a la del
átomo de hidrogeno, los cuales son esenciales en la medida de la capacidad
antioxidante. Asimismo, la presencia de compuestos no antioxidantes (ciertos
aminoácidos y ácidos uránicos) en los extractos ensayados, también pueden afectar a
estos resultados. Esto sugiere que la comparación de resultados sea solo llevada a
cabo en muestras en las que se utiliza el mismo método y el mismo disolvente de
extracción y que las sustancias interferentes deben ser comprobadas. (Pérez Jimenez
y col, 2006).
3.1. Técnicas para la determinación de la actividad antioxidante
La determinación de la actividad antioxidante de los alimentos es importante para
predecir el potencial antioxidante in vitro de los mismos antes de ser ingeridos; así
mismo, nos permite determinar la protección frente a la oxidación y el deterioro del
alimento que disminuye su calidad y valor nutricional.
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Los métodos de determinación de la actividad antioxidante se basan en distintos
sistemas generadores de radicales libres. Dichos radicales reaccionarían con la
muestra y en virtud de la capacidad antioxidante de esta se inhibiría la generación de
los primeros. Así, lo que se determina realmente es el efecto antioxidante ya que la
actividad antioxidante no se puede medir de forma directa. Lo ideal seria medir la
actividad antioxidante de cada componente de la muestra por separado, sin embargo,
y sobre todo en el caso de muestras naturales, es muy difícil determinar el número y
concentración de los compuestos antioxidantes presentes en la muestra.
En la actualidad, debido a la complejidad de los procesos de oxidación, no existe un
método que refleje de forma completa el perfil antioxidante de una muestra, por tanto,
es bueno trabajar con varios métodos para facilitar la comparación e interpretación de
los resultados. Las características “ideales” que debe reunir un método de
determinación de capacidad antioxidante son: sencillez, mecanismo químico definido y
punto final fijo, reproducibilidad, adaptabilidad a sustancias antioxidantes hidrofílicas y
lipofílicas y elevado rendimiento de análisis.
Las medidas de la actividad antirradicalaria se pueden realizar mediante dos
estrategias distintas, en función de la información que se desea obtener (SánchezMoreno, 2002):
● Determinación directa: El radical se emplea como un factor de cuantificación
(produce una señal analítica). La adición del antioxidante, antes o después de la
generación del radical, provoca una disminución de la señal. En el ensayo de postadición se forma el radical en ausencia de la muestra y así, cuando se añade la
sustancia antioxidante se produce un descenso en la señal debido a la disminución de
la concentración del radical. En ensayos de inhibición, la muestra se añade a los
sustratos de oxidación antes que sea generado el radical, La reacción comienza con la
adición del oxidante (ABTS●+, DPPH, etc).
 Determinación indirecta: La presencia de radicales libres produce la pérdida o
aparición de un reactivo, y por tanto, en presencia de un antioxidante se provoca el
aumento o disminución de la señal (métodos, ORAC, FRAP, etc).
3. 1. 1.sulfónico).
Método del ABTS●+ (Ácido 2,2’-azinobis (3- etilbenzotiazolín)-6-
El radical ABTS●+ se genera a partir de su precursor el Ácido 2,2’-azinobis (3etilbenzotiazolín)-6-sulfónico (ABTS), ver figura 11 (Ronald L. Prior, 2005). El radical
catiónico obtenido es un compuesto de color verde-azulado, estable y con un espectro
de absorción en el UV-visible.
Es un radical artificial que no mimetiza bien la situación in vivo,
termodinámicamente puede ser reducido por compuestos que tengan un potencial
redox menor que el del ABTS (0.68V), pudiendo reaccionar con el radical, muchos
compuestos fenólicos con un potencial más bajo. El punto final de la reacción lo marca
la sustancia antioxidante empleada, fijando tiempos cortos o muy elevados que
pueden interferir en los resultados finales, lo cual, es un inconveniente.
La ventaja de este ensayo es que puede realizarse tanto en muestras hidrosolubles
como liposolubles, eligiendo el disolvente apropiado en cada caso.
Existen varios métodos de generación del radical ABTS●+:
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-
Enzimáticamente (mioglobina, peroxidasa de rábano).
-
Químicamente (Dióxido de manganeso, persulfato potásico, radicales peroxilo).
-
Electroquímicamente.
En el presente estudio, se ha realizado el método ABTS●+ generando el radical
químicamente utilizando persulfato potásico.
La oxidación con persulfato potásico se lleva a cabo a temperatura ambiente, en
ausencia de luz, en un tiempo de 12 a 16 h. El persulfato potásico y el ABTS
reaccionan estequiométricamente (1:0.5). Una vez generado el radical la medida se
realiza mediante un ensayo de post-adición. Este método se aplica en la
determinación de la actividad antioxidante de frutas, verduras, bebidas estimulantes.
Preparación de reactivos:
- ABTS 7mM. Para 10 ml Disolver 0,0384 g de sal amónica cristalizada de ABTS en 10 ml de
agua destilada.
- Solución persulfato potásico 2,45mM. Para 100 ml Disolver 0,0662 g del reactivo en 100
ml de agua destilada.
-Etanol al 96 % v/v.
- Preparación radical ABTS*. Mezclar a partes iguales la solución de ABTS 7mM y la de
persulfato pototásico 2,45mM. La mezcla se mantiene en oscuridad a temperatura ambiente
durante 16 horas para la formación del radical. Esta solución es estable durante dos días. La
solución de ABTS* se diluye con etanol para obtener una absorbancia de 0,8 730 nm. Esto se
consigue mezclando 2,5 ml de la solución del radical con aproximadamente 100 ml de etanol.

Recta de calibración con la disolución de TROLOX. La solución madre se prepara
disolviendo 0,01gr de Trolox en 5 ml de metanol y 5ml de agua destilada. A partir de esta
solución se hacen las diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unas
concentraciones de 19, 39, 59, 79, 99, 119, 159 y 199 µM.
3.1.2.- Método FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power).Benzi y strain,
1996; Pulido y col; 2000
En este método se determina la capacidad antioxidante de forma indirecta. Se basa
en el poder que tiene una sustancia antioxidante para reducir el Fe 3+ a Fe2+ que es
menos antioxidante. El complejo férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incoloro es
reducido al complejo ferroso coloreado.
Se trata de un método espectrofotométrico ya que se mide la absorbancia del Fe 2+.
Así, cuanto más antioxidante es la sustancia objeto de estudio, mayor es la reducción
y mayor la concentración de Fe2+ y más alta la señal de absorbancia. El complejo va a
poder ser reducido por productos con potenciales redox menores a 0,7 V (potencial
redox del Fe3+ -TPTZ).
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Debido a que el potencial redox del Fe3+-TPTZ es comparable con el del ABTS se
pueden analizar compuestos similares con ambos métodos aunque las condiciones de la
reacción sean distintas. El mecanismo del FRAP es de transferencia de electrones, a
diferencia de otros métodos donde se produce captura de radicales libres, según esto, el
FRAP puede ser útil, en combinación con otros métodos, en la determinación de la
capacidad antioxidante de productos que contengan distintos tipos de antioxidantes.
Preparación de reactivos:
- Ácido clorhídrico (HCl) 40mM. Diluir 535 µl de HCl (37%) en 100 ml de agua destilada.
- Solución TPTZ 10 mM. Pesar 0,0312 g del reactivo TPTZ y disolverlos en un matraz de 10
ml con HCl 40 mM.
- Solución FeCl3-6H2O 20 mM. Disolver 0,1352 g de FeCl3-6H2O en 25 ml de agua destilada.
- Tampón acetato 0,3 mM pH 3,6. Para 250 ml, disolver 0,0061 g de acetato sódico (NaAc)
en 200 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 3,6 utilizando HCl 40mM, y completar hasta los
250 con agua destilada.
- Solución de trabajo diario FRAP: Esta solución de trabajo deberá de prepararse a diario.
Mezclar 2,5 ml de solución TPTZ con 2,5 ml de solución FeCl3-6H2O 20 mM y 25 ml de tampón
acetato. Esta preparación debe mantenerse durante todo el proceso en el baño a 37ºC.

Recta de calibración con la disolución de TROLOX. La solución madre se prepara
disolviendo 0,01g de Trolox en 5 ml de metanol y 5ml de agua destilada. A partir de esta
solución se hacen diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unas
concentraciones de 79, 119, 159, 199, 239, 279, 319, 359 y 399 µM.
3.1.3.- Método ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity).
El fundamento del método ORAC se basa en la habilidad que tienen los
compuestos antioxidantes para bloquear radicales libres por donación de un átomo de
hidrógeno:
X + AH
XH + A●
En este método, el radical artificial AAPH (2,2’-Azobis-(2-aminopropano)dihidrocloruro) oxida a la fluoresceína de forma que esta pierde su fluorescencia. De
esta forma, las sustancias antioxidantes presentes en el extracto obtenido a partir del
alimento disminuirían dicha pérdida de fluorescencia.
Preparación de soluciones
 Disolución reguladora de fosfato 75mM pH 7,4. Para 1000 ml, disolver 10,35 g de
NaH2PO4, H2O en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,4 y completar hasta 1 litro.
 Solución de AAPH 300 mM. Para 10 ml, disolver 0,8136 g de dihidrocloruro de 2,2´azobis-2-amidinopropano en 10 ml de disolución reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4.
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 Solución de fluoresceina patrón 7,0 mM. Para 10 ml, disolver 0,0263 g de fluoresceina
en 10 ml de disolución reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4.
 Solución diaria de trabajo de fluoresceina 70 mM. Para 50 ml, diluir 10 µl de la
solución patrón en disolución reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4 y completar hasta 10 ml.
De aquí se toman 500 µl y se llevan hasta 50 ml con la misma disolución reguladora.

Recta de calibración con la disolución de TROLOX. La solución madre se prepara
disolviendo 0,01g de Trolox en 5 ml de metanol y 5 ml de agua destilada. A partir de esta se
hacen diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unas concentraciones de 10,
20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 µM.
Método Folin-Ciocalteau
La medida del contenido de fenoles totales se realiza utilizando el método de Folin–
Ciocalteau (Singleton, y col., 1999), que determina la capacidad que tienen los polifenoles para
reducir el Mo(VI) a Mo (V), como resultado de tal reacción, el reactivo de color amarillo
adquiere un intenso color azul que se mide con el espectrofotómetro.
Preparación de reactivos:

Reactivo de Folin-Ciocalteau (Sigma- Aldrich)
 Reactivo de Carbonato sódico al 10%. Disolver 10g de Na2CO3 en 100ml de agua
bidestilada.
 Recta de calibración con la disolución de Ácido gálico. La solución madre se prepara
disolviendo 0,01g de ácido gálico en 10ml de agua bidestilada. A partir de esta solución se
hacen diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unas concentraciones de 10,
20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 ppm.
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