Practica # 6
CUANTIFICACION DE CLOROFILA DE HOJAS DE JITOMATE
INTRODUCCIÓN
Los pigmentos vegetales, pueden dividirse en dos grandes grupos, en base a su
solubilidad: a) Solubles en agua: antocianinas y antoxantinas, que se encuentran
en el jugo vacuolar. b) Solubles en solventes orgánicos: clorofilas "a" y "b" y
carotenoides (rojo, naranja y amarillo), que se encuentran en las granas y
tilacoides de los cloroplastos. Son los responsables de la captación de la energía
luminosa en el proceso de la fotosíntesis.
Las clorofilas poseen unas estructura porfirínica, formada por cuatro anillos
pirrólicos con un átomo de magnesio en su centro, un anillo de ciclopentanona y
un éster de fitol unido a uno de los anillos de pirrol que provee a la molécula de
una cola lipófila. La diferencia entre las distintas clorofilas existentes (se conocen
al menos siete) se encuentran en los sustituyentes que se presentan; así la
clorofila "a" (verde azulada) presenta un grupo metilo (-CH3) en el carbono 3, y la
"b" (verde amarillenta) un grupo aldehido (-CHO) en la misma posición. Existen
plantas que contienen solamente clorofila "a", como las algas azules, las
diatomeas, las algas rojas y las pardas. Sin embargo muchas de ellas contienen
en los plastidios, pigmentos adicionales tales como otras clorofilas (c, d, e),
fucoxantinas (amarillo pardo) y ficocianina (azulado), que comunican sus
respectivos colores a las algas. Entre los carotenoides se encuentran los
carotenos (anaranjados), cadenas hidrocarbonadas de unos cuarenta átomos de
carbonos, y las xantofilas (amarillas u ocre), que son derivados oxigenados de
aquellos.
La clorofila absorbe la energía solar necesaria para iniciar el ciclo fotosintético de
muchas plantas y bacterias. La principal propiedad fisicoquímica responsable de
este hecho es la elevada absorbancia que presenta la clorofila en el intervalo de
longitudes de onda entre 400 nm y 700 nm. La molécula de clorofila puede
absorber un fotón de estas longitudes de onda al excitar un electrón de los que
ocupan los orbitales moleculares que forman los dobles enlaces conjugados C=C
y C=N de la estructura central que rodea al átomo de magnesio. Existen dos tipos
principales de clorofila, la clorofila a y la clorofila b, que se diferencian por la
presencia de un grupo CH3 o CHO, respectivamente, en uno de los anillos C4N.
La presencia de este grupo funcional altera ligeramente la estructura y energía de
los dobles enlaces conjugados, dando lugar a espectros de absorción distintos
para cada tipo de clorofila. Así, la clorofila a en disolución alcohólica presenta
máximos de absorción en 430 nm y 662 nm, mientras que la clorofila b los
presenta en 453 nm y 642 nm. La posición exacta de estos máximos depende del
disolvente que se utilice.
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar
la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas
absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz
absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de
medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la
longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz
absorbida por la misma.
OBJETIVOS
El alumno comprenderá los siguientes conceptos:
Extracción de pigmentos por maceración.
Coeficiente de extinción
Espectrofotometría.
Longitud de onda.
MATERIALES Y METODOS
Materiales
Matraz
Pipeta
Hoja verde y hoja amarilla
Etanol
Espectrofotómetro
Pistilo
Mortero
Balanza analítica digital
Celdas para espectrofotómetro
PROCEDIMIENTO
1. Preparación de etanol al 80%
2. Pesar exactamente 0.05 g de hojas (de jitomate) verdes y 0.05 g de hojas
amarillentas.
3. Colocar las hojas en dos morteros y en cada caso adicionar 10 mL de
etanol 80%
4. Macerar hasta obtener una solución uniforme y homogénea.
5. Transferir el extracto a un tubo de ensayo y centrifugar a 5000 rpm durante
2 minutos
6. Transferir el sobrenadante a una celda y leer la absorbancia a 645 y 663
nm en el espectrofotómetro usando etanol 80% como blanco. Calcular la
concentración de clorofilas mediante la siguientes ecuaciones:
(
)
(
)
(
)
(
)
Dónde:
A645 = lectura de la absorbancia a 645 nm.
A663 = lectura de la absorbancia a 663 nm.
REPORTE DE RESULTADOS
Elaborar una gráfica con las concentraciones contra los valores de absorbancia
para la obtención de una curva de calibración, así como la ecuación de la recta (en
caso de obtener un comportamiento lineal) de lo contrario ajustar los puntos a la
función que se adecue a los resultados de absorbancias. Expresar la
concentración de clorofilas en µgg-1 de peso fresco.
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