Los medicamentos son metabolizados (biotransformados) en

TEMA 6
Polimorfismos genéticos humanos.
Su importancia en farmacología y toxicología.
Asociación con cáncer.
Bases Bioquímicas de la Toxicología Clínica
Ramiro Jover
Los medicamentos
son metabolizados
(biotransformados)
en nuestro organismo
El hígado es el
órgano más
importante en la
metabolización
1
Metabolismo de medicamentos en el hígado
Los FÁRMACOS
llegan al hígado por
la vena porta
HEPATOCITOS
Los METABOLITOS
salen por la vena cava
inferior o por la bilis
Los medicamentos se metabolizan en los hepatocitos
METABOLITOS
ESTABLES
FARMACO
2
FASE I
XENOBIOTICOS
ELIMINACION
FASE II
Metabolismo de Fármacos - Fase I y Fase II
Xenobiótico
Fase I
Metabolito
Fase II
Hidroxilación
Epoxidación
Desalquilación
Desaminación
S- y N-oxidación
+ polar
+ reactivo
Glucuronidación
Glucosilación
Metilación
Acetilación
Conjugación con Sulfato
Conjugación con GSH
Conjugación con AAs
CYP
&
MEH
Citotoxicidad DETOXIFICACION
3
Metabolismo de fármacos - Fase I y Fase II
5
4
6
3
NH
NH
NH
Cl
Cl
Cl
Cl
Conj.
Sulfato
3'
4'
Cl
Cl
CYP
- 2C9
5'
COOH
COOH
COOH
OH
-O
O
S
O
O
Metabolización del diclofenac (ruta principal)
Metabolismo de xenobióticos - bioactivación
Estimación del número de xenobióticos
• Pesticidas
1500
• Medicamentos
6000
• Aditivos de alimentos
- con valor nutricional 2500
- conservantes
3000
• Productos industriales 50000
Xenobiotic
M
Detoxification
Elimination
P450
Bioactivation
Cytotoxicity
Genotoxicity
“Up to 80% of all human cancers
are thought to arise from exposure
to environmental agents”
(Doll & Peto, 1981)
4
XENOBIOTIC
BIOTRANSFORMATION
Reactive metabolite
Stable metabolite
GSH
CONJUGATION DEPLETION
Detoxification
Redox cycling
Oxidative stress
Lipid
peroxidation
Alteration of
Ca2+ homeostasis
Covalent
binding
Metabolic
alterations
ELIMINATION
APOPTOSIS NECROSIS
IMMUNE
RESPONSE
&
GENOTOXICITY
5
Metabolismo de xenobióticos - bioactivación
Estimación del número de xenobióticos
• Pesticidas
1500
• Medicamentos
6000
• Aditivos de alimentos
- con valor nutricional 2500
- conservantes
3000
• Productos industriales 50000
M
Xenobiotic
Detoxification
Elimination
P450
Bioactivation
“Up to 80% of all human cancers
are thought to arise from exposure
to environmental agents”
(Doll & Peto, 1981)
Cytotoxicity
Genotoxicity
Funciones del citocromo P450 (CYP) en el metabolismo
Fármacos
Hormonas
esteroides
Ácidos grasos
Bioactivación.
Carcinogénesis
química.
Xenobióticos
CYP
Vitaminas
Liposolubles
AyD
Sales biliares
6
Citocromo P450 (CYP) - Componentes del sistema
NADPH
eCitoplasma
e-
Citocromo
P450
reductasa
Fe
FMN
FAD
Citocromo
b5
P450
Retículo endoplásmico
RH + O2 + NADPH+ H+
ROH + H2O + NADP+
CYPs - Isoenzimas y nomenclatura
Familias
> 40%
1
Subfamilias 1A1 1B1
> 55%
1A2
2
3
4
3A4
3A5
3A7 4A9
5
7
8
11
17
19
21
24 27
21A2
4B1
4A11
4F2
4F3
11A1
11B1
11B2
2A6 2B6 2C8 2D6 2E1 2F1
2C9
2C18
2C19
7
CYPs - Abundancia relativa y especificidad
Diclofenac
Tolbutamide
S-Warfarin
Phenytoin
SUBSTRATOS
Coumarin
Fadrozole
2A6
Mephenytoin
Diazepam
2C8- 9
3A4- 5
1A2
Sulphaphenazole
Ketoconazole
Furafylline
2C19
INHIBIDORES
Nifedipine
Erythromycin Phenacetin
Bufuralol
Cyclosporine Caffeine
Sparteine
Chlorzoxazone
Cortisol
Theophylline Debrisoquine Alcohols
2D6
2E1
Quinidine
¿Tenemos todos el mismo patrón isoenzimático de CYPs?
Variabilidad interindividual : Causas
succinil Co-A + glicina
ALA sintetasa
Gen-CYP
ácido d-aminolevulínico
ALA deshidratasa
mRNA
porfobilinógeno
PBG desaminasa
Porfirias
Co++, Pb++
POLIMORFISMOS
Inductores químicos
Señales inflamatorias
Hormonas
Dieta, etc.
Citocromo P450
apoproteína
protoporfirina IX
Fe
Ferroquelatasa
HEMO
CYP
Inhibidores
8
Variabilidad interindividual: consecuencias
Efecto
tóxico
2D
CYP
6
LENTO
Efecto
terapéutico
2D6
CYP
NORMAL
Fallo
terapéutico
CYP
2D6
RAPIDO
9
Variabilidad interindividual : Consecuencias
Benzo-a
pyrene
Benzo-apyrene
B-a -pepoxide
GSTM1
CYP1A1
M
CYP1A1
+++ activo
GSTM1
null
genotype
Benzo-a
-pyreneSG
Benzo-apyrene-SG
El benzo-a-pireno se
elimina
El benzo-a-pireno se
convierte en un epóxido
reactivo que no se
elimina
POLIMORFISMO
Genetic variations (difference in DNA sequence)
occurring in more than 1% of a population.
The term defines monogenetic traits that exist in the
normal population in at least two phenotypes, for
example the ABO blood groups.
In the context of pharmacology, genetic polymorphism
of drug metabolising enzymes gives rise to distinct
subgroups in the population that differ in their ability to
perform a certain drug biotransformation.
10
POLIMORFISMOÆ Variación genética Æ Cambio en la secuencia del DNA Æ Mutaciones
Las mutaciones, o variaciones en la expresión de los genes, pueden ocurrir con
relativa facilidad en las distintas fases del flujo de información genética
(replicación-transcripción-traducción)
Causas
Factores endógenos: Errores en la maquinaria molecular.
Factores ambientales: Radiaciones ultravioleta, alteraciones químicas
producidas por sustancias tóxicas, etc.
Tipos de mutaciones puntuales :
Sustitución:
Adición (Inserción)
Deleción
- Silenciosas
- De cambio de sentido
- Sin sentido
- Desplazamiento de la pauta de lectura
El código genético
11
Mutaciones del DNA. Puntuales
Silenciosas
De cambio de sentido
Sin sentido
Mutaciones del DNA. Delección, adición y cambio en la pauta de lectura
12
Mutaciones del DNA. Alteración en corte y empalme (splicing)
Introducción de mutaciones
puntuales por acción de
sulfonato de etilmentano
(EMS), un agente mutagénico
de uso común.
Sustitución G Æ A
13
POLIMORFISMOS
FENOTIPACIÓN Y GENOTIPACIÓN
MÉTODOS de FENOTIPACIÓN
• Medida directa de la actividad en tejido (biopsia
hepática).
• Métodos ex vivo. Medida de actividad en cultivo de
linfocitos.
• Métodos in vivo. Medida de un metabolito, relación
metabólica (Sustrato / Producto), o velocidad de
eliminación, de un fármaco modelo:
CYP1A2 Æ Cafeína (?)
CYP2C9 Æ Tolbutamida, warfarina
CYP2C19ÆS-mefenitoina, omeprazol
CYP2D6 Æ Dextrometorfan
CYP2E1 Æ Cloroxazona
14
Fenotipo polimórfico: Hidroxilación de debrisoquina
Debrisoquine
CYP
4-Hydroxydebrisoquine
Genotipación. Detección de mutaciones puntuales. RFLP
15
RFLP (Southern
blot analysis)
Genotipación. Single-strand conformation polymorphism (SSCP)
16
Citocromos P450 polimórficos con relevancia en el metabolismo de xenobióticos
CYPs humanos implicados en el metabolismo de carcinógenos
17
CYPs humanos implicados en el metabolismo de carcinógenos
CYP1A1
Hidrocarburos aromáticos policíclicos
(benzo(a)pireno & dimetilbenzantraceno)
CYP1A2
Nitrosaminas, aminas heterocíclicas
CYP2A6
Nitrosaminas, aflatoxina B1
CYP2D6
NNK (nitrosamina derivado en humo tabaco)
CYP2E1
Benzeno, tetracloruro de carbono, cloruro de vinilo
CYP3A4/5
Aflatoxina B1, benzo(a)pireno, 6-aminocriseno
Polimorfismo del CYP2D6
Polimorfismo de la debrisoquina / esparteina
El 7% de la población presenta un metabolismo deficiente
Herencia autosomal recesiva
Influye en la metabolización de mas de 25 fármacos de uso común:
β-bloqueantes, antiarrítmicos, antidepresivos tricíclicos,
antipsicóticos, analgésicos, antihistamínicos, etc
Number of people
Debrisoquine
CYP2D6
4-Hydroxydebrisoquine
Extensive
metabolizers
Poor
metabolizers
Debrisoquine / 4-hydroxydebrisoquine
18
Polimorfismo del CYP2D6
CYP2D6 allele
Detrimental
mutation
2D6-A
A
A2637 deleted
2D6-B
B
Consequence
Frequency in
Caucasian
5-10
G1934 Æ A
Reading frame
disruption
Defect splicing
2D6-D
D
Gene deletion
No-enzyme
10-15
2D6-E
E
A3023 Æ C
1-5
2D6-T
T
T1795 deleted
His324Æ Pro
nonfunctional prot.
Reading frame
disruption
70-80
5-10
Polimorfismo del CYP2D6
Cys
N
2D6-wt
wt
signal anchor
C (497)
SRS1 SRS2 SRS3 SRS4
N
2D6-T
T
2D6-E
E
SRS5
SRS6
C (152)
SRS1
Pro (324)
Cys
N
C (497)
SRS1 SRS2 SRS3 SRS4
SRS5
SRS6
19
Polimorfismo del CYP2D6 y cáncer de pulmón
NNK (4- (metilnitrosamina)- 1- (3
- piridil)- 1- butanona)
Nitrosamina identificada en el humo del tabaco (Crespi et al. 1991)
Es activada (bioactivada) por CYP2D6
Menos aductos DNA
- nitrosamina en metabolizadores pobres 2D6
Metabolizador pobre Æ fenotipo protector
Nicotina
es sustrato del CYP2D6. Nicotina Æ cotinina
Mas nicotina en el plasma de metabolizadores pobres 2D6
Menos necesidad (mayor duración efecto) Æ menos cigarrillos
Æ Menos riesgo de cancer
Metabolizador pobre Æ fenotipo protector
Ah
R
p9
Hs
0
Hs
p9
0
AhR
Arnt
AhR
P
AhR
TCDD
Arnt
Polimorfismos del CYP1A1 y del receptor AhR
P
Cytochrome Endoplasmic
P450 1A1 Reticulum
Enhancer
Promoter
TFIIX
TBP
TATA
mRNA
Nuclear RNA
20
Polimorfismo del CYP1A1
CYP1A1
Polimorfismo del CYP1A1: Estudios fenotípicos
Actividad: hidroxilación de hidrocarburos aromáticos
(benzo(a)pireno Æ 3-hidroxi-benzo(a)pireno)
Tejido: linfocitos periféricos inducidos con -3
MCo TCDD
En estudios poblacionales la actividad CYP1A1 muestra una distribución
trimodal Æ Fenotipos: Baja, media y alta actividad / inducibilidad
Asociación fenotipos 1A1 con carcinoma bronquial Æ
Alta actividad
% Controles:
10.9
% Pacientes:
30.6
Baja actividad
42.2
5.0
21
Polimorfismo del CYP1A1: Estudios genotípicos
Ile / Val(462)
polymorphic site
Exon 1
2
3 4 5
6
7
MspI
polymorphic site
AA-MspI polymorphic site
Alelos
Genotipo
Fenotipo
Controles
Cáncer pulmón
m2 MspI +
m2/m2
Alta Inducción
10.6
22.9
Val 462
Val/Val
Alta Actividad
4.7
12.5
Enzimas de Fase II implicadas en carcinógenesis
GSTs
NATs
Sulfotransferasas
Otras enzimas implicadas en el metabolismo de carcinógenos
Alcohol deshidrogenasa
Aldehido deshidrogenasa
Microsomal epoxido hidrolasa
Mieloperoxidasa
NAD(P)H:quinona oxidoreductasa
22
Glutation
- S
-transferasas
GST
S (centro electrófilo) + GSH
- - ---------- >S
- SG
• Multifamilia de enzimas citsólicos mayoritariamente hepáticos.
• Presente en la mayoría de seres vivos.
• Protección contra compuestos nocivos.
SUSTRATOS:
• Endógenos: Productos del estrés oxidativo
Peroxidación lipídica Æ cumene hydroperoxide, 4-hidroxinonenal
Oxidación del DNA Æ Propenales básicos de timina y uracilo
• Exógenos: Carcinógenos ambientales
HAP bioactivados por P450 ( epóxidos, trans-4-fenil-3-buten-2-ona, benzo(a)pireno-diolepoxido) acroleina (humo tabaco), agentes metilantes (cloruro de metilo) pesticidas,
disolventes industriales (oxido de etileno).
Conjugación con glutation y su metabolismo
GSH (γ-Glu -- Cys --Gly)
23
Glutation-S-transferasas humanas
Familias
alpha
mu
GSTM1
Isoenzimas
GSTA1
GSTA2
GSTM2
GSTM3
GSTM4
theta
M1*2 (57%)
M1*A
M1*B GSTT1
M3*1
pi
GSTP1
T1*1
T1*2 (20%)
GSTT2
M3*2
GSTM5
Glutation
- S
-transferasas humanas : Polimorfismos y cáncer
Cutaneous basal cell carcinoma (BCC):
UV Æ ROS Æ mutations
GSTM1, GSTM3 y GSTT1 conjugan compuestos resultantes del estrés oxidativo
inducido por UV.
GST se expresa en la epidermis y en la lamina basal de la piel
(que incluye las stem cells)
Número promedio de BBCs
SI
NO
Skin type 1
2.99
2.12
+GSTM1*2 (null) 4.57
2.00
+GSTM3*1 (AA) 3.57
2.08
24
- acetil- transferasas (NATs)
N
Sustrato + Ac-
NAT
CoA--------------------> S
- acetilado
SUSTRATOS:
Endógenos: Aminas aromáticas endógenas como serotonina. Transferencia de
grupos acetilo entre arilaminas endógenas (sin Ac-CoA). Son denominadas:
Arilamina N-acetiltransferasas
Exógenos: Carcinógenos ambientales (Procesos industriales y combustion tabaco o
alimentos). Aminas e hidrazinas aromáticas y heterocíclicas.
- acetil- transferasas humanas: variantes alélicas
N
NAT1
(7 alelos)
Genes
NAT2
(15 alelos)
1*4
1*10
1*14
1*11
1*15
wt
Alternat polyA
Arg187Gln
Val149Ile
Arg187Stop
(Ç level) rapid
(È affinity) slow
(Ç Vmax) rapid
(no NAT1) slow
2*4
2*5A
2*6A
2*7A
2*14A
wt
Ile114Thr
Arg197Gln
Gly286Glu
Arg64Gln
(È NAT2) slow
(È stability) slow
(È stability) slow
(È stability) slow
25
- acetil- transferasas humanas y cáncer
N
Cáncer
Genotipo
Colon: Bell et al. (1995)
Controles
Enfermos
Rápido
Pulmón: Bouchardy et al. (1998)
Controles
Enfermos
Lento
Hígado: Agúndez et al. (1996)
Controles
Enfermos
Lento
NAT1
% (n) OR
NAT2
% (n) OR
29 (112) 1.0
44 (202) 1.9
56 (170) 1.0
66 (148) 1.9
54 (258) 1.0
68 (100) 1.8
ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS. Medidas de asociación.
ODDS de que nazca un niño:
nº niños 51 / nº niñas 49 = 1.04
RISK de que nazca un niño:
nº niños 51 / (tot 100) = 0.51
ODDS RATIO:
ODDS control = 1.04
ODDS india = 1.70 (63/37)
OR= 1.70 / 1.04 =1.63
RELATIVE RISK
RISK control = 0.51
RISK india = 0.63 (63/100)
RR= 0.63 / 0.51 =1.24
26