FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS RECURSOS NATURALES Y DEL AMBIENTE FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS RECURSOS NATURALES Y DEL AMBIENTE GUÍA DE PRACTICAS DE LABORATORIO 1 Período académico (Junio 2020-Septiembre 2020) DATOS INFORMATIVOS: Carrera: Ingeniería Agroindustrial Curso: Tercero Asignatura: Microbiología General Docente: Ing. Favian Bayas-Morejón PhD Fecha: noviembre N° horas: 2 Código de la asignatura MIB213 Prerrequisito BIC125 Correquisito NN TEMA: Reconocimiento de materiales de laboratorio y tinción de Gram OBJETIVOS • Conocer los diferentes equipos y materiales que se usan a nivel de laboratorio • Caracterizar microorganismos mediante la técnica de tinción de Gram FUNDAMENTO TEÓRICO Es de gran importancia reconocer e identificar los diferentes instrumentos o herramientas de laboratorio, ya que de esta manera seremos capaces de utilizarlos adecuadamente y también de llamarlos por su nombre y saber cuál es la utilidad que se le da a cada uno de los materiales. Sabemos que la mejor forma de aprender es haciendo y llevando a la práctica los conocimientos teóricos, de manera que podamos enriquecer y fortalecer nuestra experiencia en el amplio mundo de la microbiología. La tinción de Gram es una técnica de laboratorio que permite caracterizar a los microorganismos dentro de los espectros Gram + y Gram – de acuerdo a su membrana celular MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS E INSUMOS Equipos Materiales Reactivos Microscopio Porta objetos Violeta de genciana convencional Cubre objetos Lugol Piseta Alcohol Cajas Petri Safranina o fucsina b Mechero bunsen Aceite de inmersión Cristalizador Asa de siembra Cajas petri y tubos de ensayo con colonias de bacterias PROCEDIMIENTO • Prepara un frotis bacteriano ✓ En un portaobjetos limpio colocar con el asa una muestra del cultivo ✓ Extender la muestra formando una fina capa sobre el portaobjetos • • • • • • • ✓ Con movimientos del portaobjetos secar la muestra al aire ✓ Fijar el frotis pasando rápidamente (tres veces) por la llama de un mechero Teñir el frotis con Cristal Violeta o violeta de genciana por un tiempo de 60 segundos Cubrir el frotis con Lugol, tiempo 60 segundos, lavar con agua destilada Decolorar con alcohol al 95%, hasta que el escurrimiento sea sin ningún color Lavar con agua destilada Cubrir el frotis con safranina, tiempo 30 segundos y luego lavar con agua destilada Secar el frotis primero con movimientos en el aire y después a la llama del mechero Observar la preparación al microscopio compuesto con el lente de inmersión, utilizando una gota de aceite de inmersión. BIBLIOGRAFÍA Jacome L, Hernandez M, Colin C (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS RECURSOS NATURALES Y DEL AMBIENTE FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS RECURSOS NATURALES Y DEL AMBIENTE GUÍA DE PRACTICAS DE LABORATORIO 2 Período académico (Junio 2020-Septiembre 2020) DATOS INFORMATIVOS: Carrera: Ingeniería Agroindustrial Fecha: noviembre Curso: Tercero N° horas: 2 Asignatura: Microbiología General Código de la asignatura MIB213 Docente: Ing. Favian Bayas-Morejón PhD Prerrequisito BIC125 Correquisito NN TEMA: PREPARACIÓN Y AJUSTE DE pH DE MEDIOS DE CULTIVO OBJETIVOS Preparar correctamente los principales medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio de microbiología, como instrumentos necesarios para siembre de microorganismos Ajustar el pH de los medios de cultivos a niveles adecuados para el correcto desarrollo de los microorganismos a nivel de laboratorio FUNDAMENTO TEÓRICO Un método fundamental para estudiar los microorganismos especialmente hongos y bacterias es cultivándolos en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen factores influyentes que corresponden a distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. A más de los factores influyentes como los nutrientes que se emplean, es necesario tomar en cuenta otras consideraciones relacionadas con las exigencias del microorganismo, entre ellos su pH, necesidades de gases, como el oxígeno y el dióxido de carbono. En la práctica existen medios de cultivo sólidos, semisólidos y líquidos, los medios sólidos y semisólidos llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido acídico que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una concentración del 1,5% y 0,7% respectivamente. Lo importante es que cada medio de cultivo constituya fuente de energía, carbono, nitrógeno, azufre, fosfatos, vitaminas, agua, proteínas y otros nutrientes necesarios para el desarrollo óptimo de los microorganismos. Con respecto al pH, se debe señalar que es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismos a nivel de laboratorio, ya que estos sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH, fuera algunos dejan de crecer o simplemente mueren rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica. • Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, también, distintos. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalófilos que toleran pH=10.0 • El pH interno en la mayoría de los microorganismos está en el rango de 6.0 a 7.0. Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de cultivo suele bajar durante el proceso de cultivo. Por consiguiente, es necesario controlar el pH de los medios de cultivos a nivel de laboratorio para poder estudiar sus principales características. Por estas razones, es necesario controlar el pH de los cultivos para que se mantenga en los niveles adecuados para el crecimiento y metabolismo correcto del microorganismo con el que se trabaja. MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS E INSUMOS Equipos Materiales Autoclave Vaso de precipitado Parrilla (cocineta) Matraz Agitador Balanza pH metro Espátula Algodón papel indicador de pH Reactivos Agua Agar Papa (otros vegetales) Dextrosa (glucosa) Medios de cultivo preparados con anterioridad Hidróxido de sodio al 10, 1 y 0.10 % Ácido clorhídrico 1, 0.1 y 0,01 N PROCEDIMIENTO A. PREPACION DEL MEDIO DE CULTIVO • Pesar el agar, la papa u otro vegetal previamente lavados, pelados y picados y la dextrosa (glucosa), en varias proporciones • Cocinar en un matraz la papa u otros vegetales en la mitad de agua requerida, mantener en ebullición por 20 minutos • Cernir y eliminar los restos de vegetales. • Añadir al caldo el agar y la glucosa en las cantidades requeridas y agitar la mezcla • Completar la cantidad de agua requerida • Distribuir el caldo en Erlenmeyer y taponar con algodón B. AJUSTE DE pH • • Determinar el pH de los medios de cultivos preparados con anterioridad en estado líquido, utilizando el pH metro y papel tornasol Dependiendo del valor del pH, con la ayuda de un gotero añadir el hidróxido de sodio o el ácido clorhídrico en las concentraciones indicadas BIBLIOGRAFÍA Universidad Central de Venezuela. (2014). Preparación de medios de cultivo - Universidad Central de Venezuela. www.ucv.ve/.../10_Preparación_de_medios_de_cultivo.pdf FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS RECURSOS NATURALES Y DEL AMBIENTE FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS RECURSOS NATURALES Y DEL AMBIENTE GUÍA DE PRACTICAS DE LABORATORIO 3 Período académico (Junio 2020-Septiembre 2020) DATOS INFORMATIVOS: Carrera: Ingeniería Agroindustrial Fecha: noviembre Curso: Tercero N° horas: 2 Asignatura: Microbiología General Código de la asignatura MIB213 Docente: Ing. Favian Bayas-Morejón PhD Prerrequisito BIC125 Correquisito NN TEMA: Esterilización de materiales y medios de cultivo OBJETIVOS Eliminar todos los microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de los utensilios y medios de cultivo para garantizar su aplicación en la inoculación de microbios. FUNDAMENTO TEÓRICO La esterilización es un proceso esencial para el funcionamiento de un laboratorio de microbiología, en el cual, todos los utensilios y medios de cultivo deben ser absolutamente esterilizados. La desecación y la congelación eliminan muchas especies de bacterias, pero otras simplemente permanecen en estado vegetativo. El calor seco o húmedo elimina todas las bacterias combinando adecuadamente factores como la temperatura a la que se someten y el tiempo de exposición. Se puede esterilizar por calor seco en estufas a más de 160 °C durante media hora, o por calor húmedo en autoclaves a 121 °C durante 20 minutos y a presión superior a la atmosférica. La ebullición a 100 °C no elimina todos los gérmenes patógenos (entre los que no sólo están incluidas las bacterias sino también virus y levaduras). Otro medio habitual de esterilización, utilizado para objetos no resistentes al calor, son los medios químicos: el ácido fénico, iniciador de la era de la antisepsia (véase Fenol), el ácido cianhídrico, el óxido de etileno, la clorhexidina, los derivados mercuriales, los derivados del yodo (especialmente la povidona yodada) y muchas otras sustancias. El alcohol etílico no produce esterilización completa. Otro medio de esterilización actual son las radiaciones ionizantes (beta, gamma). La esterilización de medios de cultivo es un proceso esencial para eliminar una variedad de células vegetativas diferentes y de esporas que proceden de los constituyentes del medio, del agua y del recipiente. Estos microorganismos deben ser eliminados mediante calor húmedo antes de la inoculación. Para la esterilización de la vidriería y demás utensilios a utilizarse en el manejo de microorganismos en el laboratorio, se puede utilizar el calor seco MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS E INSUMOS Equipos Materiales Reactivos Autoclave Autoclave Estufa Medios de cultivo preparados con anterioridad Vidriería y utensilios de laboratorio Papel PROCEDIMIENTO A. Esterilización del medio de cultivo • Taponar los matraces con algodón • Cubrir hasta el cuello de los matraces con papel aluminio o común y amarrar • Incorporar agua al autoclave en cantidad adecuada • Introducir en el autoclave los matraces con el medio de cultivo • Cerrar herméticamente el autoclave • Esterilizar el medio de cultivo a 121º C (15 lb/pul2) • Luego de 20 minutos, abrir el equipo tomando las precauciones necesarias para evitar accidentes • Sacra los matraces, dejarlos enfriar • Colocarlos en la refrigeradora B. Esterilización de utensilios y vidriería • Envolver con papel aluminio o común las cajas petri u otros utensilios y sujetarlos con ligadura o cinta adhesiva • Colocarlos en la estufa y estilizarlos a 180º C por 60 minutos • Luego retirar y almacenar el material en un lugar adecuado BIBLIOGRAFÍA 1. FAGRO (2010). Medios de cultivo y esterilizacion - Facultad de Agronomía www.fagro.edu.uy/.../Medios%20de%20cultivo%20y%20esterilizacion.pdf 2. UNAM (2013). PRÁCTICA 2.3 Esterilización y Preparación de Medios de Cultivo. depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Protocolo2_3_19088.pdf
