Inhibidores potenciales de TTBK1 en la enfermedad de Alzheimer Un análisis integrado de Docking y Dinámica molecular1 RincónMontes Pimiento

Inhibidores potenciales de TTBK1 en la enfermedad de Alzheimer: Un análisis
integrado de Docking y Dinámica molecular
Natalia Rincón Montes1, María Juliana Pimiento Pacheco2
1. Microbiología, Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes, 2. Biología, Ciencias Biológicas, Universidad
de los Andes.
Introducción
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por un
declive a nivel cognitivo, comportamental y funcional con manifestaciones clínicas frecuentes como la
pérdida de memoria de eventos recientes (Scheltens et al, 2016). La EA es reconocida como la principal
causa de demencia por la OMS contribuyendo en un 60-70% de los casos (OMS, 2023). La prevalecía de
demencia por Alzheimer incrementa de forma drástica con la edad, por lo que constituye un desafío
considerable en el panorama de la salud, particularmente entre la población de adultos mayores.
Las características patológicas distintivas en el tejido cerebral de individuos con EA incluyen
niveles aumentados de β-amiloide (Aβ) y tau hiperfosforilada (p-tau) (Zhang, 2021). Aquí nos
centraremos en la hiperfosforilación de tau y los NFTs, los cuales son marcadores claves para el
diagnóstico neuropatológico de EA (Metaxas & Kempf, 2016). Tau es una proteína que principalmente
se encarga de facilitar la formación y estabilización de los microtúbulos (Yoshida et al., 2012). Los
microtúbulos se extienden por los axones neuronales y son esenciales para el transporte celular (Kumar et
al., 2023). En la EA se produce una alteración en la proteína tau mediante un proceso de hiperfosforilación,
el cual resulta en la formación de agregados de tau que desencadenan en la formación de NFTs, estos son
estructuras anómalas de fibrillas de agregados de tau retorcidos (Kumar et al, 2023). Los NFTs interfieren
con las funciones normales de las células nerviosas, contribuyendo al daño celular y al avance de la
enfermedad.
Por otra parte, TTBK1 es una serina/treonina/tirosina quinasa conservada expresada en el cerebro,
específicamente en las neuronas corticales y del hipocampo (Sato et al., 2006). En estudios se ha
encontrado que TTBK1 fosforila las proteínas tau en sitios relacionados con la EA, incluidos Ser198,
Ser199, Ser202 y Ser422, e induce la agregación de tau (Sato et al., 2006). Dada la relación de TTBK1
con la fosforilación de Tau, TTBK1 surge como un blanco clave para abordar la EA, y sus inhibidores
selectivos se perfilan como prometedores fármacos eficaces para el tratamiento de esta afección. Por tanto,
el objetivo de este trabajo es evaluar dos fármacos PDB:VP7 y PDB:IQY como potenciales inhibidores
de TTBK1.
Para el cumplimiento de este objetivo, se realizó el uso de herramientas bioinformáticas como el
docking y la dinámica molecular. Primero, el docking molecular o acoplamiento ligando-proteína tiene
como objetivo prever cómo se unirá un ligando a una proteína de estructura tridimensional conocida
(Morris & Lim-Wilby, 2008). En este caso el acoplamiento de los ligandos VP7 e IQY a TTBK1. Los
métodos exitosos de docking exploran eficazmente espacios de alta dimensión y utilizan funciones de
puntuación precisa, lo cual es valioso para cribar bibliotecas de compuestos, clasificar resultados y
proponer hipótesis sobre la inhibición del blanco (Morris & Lim-Wilby, 2008). A su vez, la dinámica
molecular se centra en la interacción entre los ligandos VP7 e IQY y la proteína TTBK1, permitiendo una
simulación detallada de eventos a nivel atómico durante su unión. Esta aproximación captura cambios
conformacionales, fuerzas de interacción y energías asociadas, facilitando la comprensión de cómo los
ligandos impactan en la estructura y dinámica de la proteína. Este análisis revela información crucial sobre
la afinidad y estabilidad de la interacción ligando-proteína, siendo fundamental para desentrañar los
mecanismos subyacentes. Los resultados de la dinámica molecular contribuyen a comprender la relación
molecular entre los ligandos y la proteína TTBK1, con posibles aplicaciones en el diseño de fármacos
(Sargsyan et al., 2017).
Metodología
Docking
Preparación de las estructuras pre-Docking.
Para ello se descargaron las estructuras correspondientes a TTBK1 y los ligandos VP7 e IQY desde el
Protein Data Bank (PDB), identificadas con los códigos 7ZHN y 7ZHP, respectivamente. Posteriormente,
se empleó el software Pymol para la eliminación de moléculas de agua, iones fosfato y moléculas de
etanediol
Procedimiento de Docking
Primero, se realizó la preparación del receptor TTBK1 por medio de la adición de hidrógenos polarizados
y la generación de un nuevo archivo pdb . Para los ligandos VP7 e IQY, se realizaron pasos específicos,
los cuales incluyeron la configuración de torsiones y la conversión de los ligandos a formato PDBQT.
Posteriormente, se realizó la configuración de la cuadrícula para el docking se basó en la asociación de la
macromolécula TTBK1 y la definición de dimensiones de la caja X,Y y Z a 44 guardando está en archivo
CPF.
Los parámetros del docking se ajustaron utilizando el algoritmo genético, especificando archivos de
entrada y salida. Seguidamente, se realizó la ejecución de autogrid, lo que generó archivos .map y .glg,
seguido por la ejecución de autodock para llevar a cabo el docking molecular.
Análisis e interpretación de Resultados del Docking.
Se realizó la evaluación de los resultados del docking mediante el programa Autodock. En este, exploraron
diversas conformaciones, priorizando aquellas con menor energía. Finamente, se seleccionó la
conformación más estable y se guardó el complejo en formato PDB.
Dinámica
Parte 1: Preparación con LEaP
En la fase inicial de la metodología, se empleó LEaP para la preparación de los ligandos VP7 e IQY antes
de la simulación. Estos ajustes detallados se realizaron mediante la modificación de los ligandos en los
archivos VP7.mol2 e IQY.mol2. Utilizando herramientas como Parmchk, se generaron archivos de
parámetros (.frcmod) para describir las propiedades de los ligandos. Posteriormente, Leap se utilizó para
crear archivos adicionales (.lib) esenciales para la simulación. Estos procesos se ejecutaron en la terminal
de un nodo específico. La segunda parte de esta etapa incluyó la generación de coordenadas y topología
mediante tleap, con la adecuación de los nombres de archivos en el input correspondiente. Estas acciones
aseguraron que los ligandos estuvieran listos para desempeñar su función en la simulación de la
interacción con la proteína TTBK1.
Parte 2: Ejecución con Amber
La siguiente fase consistió en la ejecución del software Amber para simular las interacciones entre los
ligandos VP7 e IQY y la proteína TTBK1. Durante esta etapa, se realizaron ajustes clave en los archivos
de la carpeta "inputs dinámicas". La ejecución comprendió tres fases esenciales: minimización,
equilibración y producción. En la fase de minimización, se ajustó el archivo min.in, modificando el
número máximo de pasos a 2,000,000 y la frecuencia de pasos antes de cambiar al método de gradiente
conjugado a 10,000. La equilibración, por su parte, implicó la adaptación de la cantidad de pasos por
100,000 en heat1.in y heat2.in. En heat2.in, se especificó el barostato como Berendsen y la temperatura a
100 K, según el manual de AMBER. Para la fase de producción, se configuró la escritura de archivos rst
cada 5,000 pasos, coordenadas cada 10,000 pasos, y un total de 500,000 pasos, siguiendo las pautas del
manual de AMBER. La ejecución del trabajo se inició con "nohup sh job.sh &", ajustando los flags según
las necesidades específicas. Estos pasos se llevaron a cabo de manera meticulosa para garantizar la
integridad y precisión de la simulación.
Parte 3: Análisis
En la fase final de la metodología, se llevó a cabo un análisis exhaustivo de las simulaciones realizadas.
Se utilizó la herramienta CPPTRAJ con los archivos cpptraj.in y cpptraj2.in para evaluar detalladamente
las trayectorias de la simulación, abordando aspectos estructurales y dinámicos. Se generaron gráficas
esenciales de RMSD para comprender el comportamiento molecular a lo largo del tiempo, y se
visualizaron al final con Google Colab, el cual permitió que con el archivo generado de .ipynb se corriera
el código para una representación efectiva. Además, se aplicó nuevamente CPPTRAJ con el archivo
cluster.in para realizar un análisis de agrupamiento, permitiendo la comprensión de la distribución y
agrupación de conformaciones. Estos pasos de análisis proporcionaron una evaluación integral de la
dinámica molecular simulada, permitiendo entender la estabilidad, flexibilidad estructural y agrupación
de conformaciones relevantes en la interacción entre los ligandos VP7 e IQY y la proteína TTBK1.
Resultados y discusión
Docking
Se obtuvo 50 conformaciones para cada ejecución, tanto para VP7 como IQY, estás se ordenaron según la
energía de unión (binding energy), siendo la conformación con la energía de unión más negativa la
conformación 1 y la conformación con energía más alta para cada simulación correspondió a la
conformación 50. Se define la energía de unión como la suma de las fuerzas intermoleculares que actúan
sobre el complejo ligando-receptor (Ecuación 1)(Matossian et al, 2014)
Δ𝐺𝑏𝑖𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔 = Δ𝐺𝑣𝑑𝑤 + Δ𝐺𝑒𝑙𝑒𝑐 + Δ𝐺𝐻𝑏𝑜𝑛𝑑 + Δ𝐺𝑑𝑒𝑠𝑜𝑙𝑣 + Δ𝐺𝑡𝑜𝑟𝑠𝑖𝑜𝑛𝑎𝑙 (Ecuación 1).
De lo anterior, se obtuvo los resultados de la tabla 1 a partir de la conformación 1 para cada ligando, VP7
e IQY. Se puede afirmar que el ligando IQY presenta una mayor afinidad a TTBK1 debido a que presenta
un valor de energía de unión más negativo que VP7, siendo este de –5.56 (kcal/mol) para IQY y –5.27
(kcal/mol) para VP7.
Asimismo, se evaluó la refRMS para cada ligando, esta corresponde a la diferencia Root Median Square
(RMS) entre las coordenadas de la conformación actual y estructura de referencia, la RMS es usada para
cuantificar la diferencia estructural entre dos estructuras moleculares, como la conformación predicha por
el programa de docking y una conformación de referencia (Huey et al, 2012) P. Por defecto, el ligando de
entrada se utiliza como la referencia (Huey et al, 2012) Para VP7 se encontró un valor de 5.16Å para su
refRMS, lo cual indica que la conformación predicha de VP7 presenta una diferencia estructural de 5.16Å
con la estructura de referencia. En el caso de IQY, el valor de refRMS de 5.63 indica una mayor diferencia
estructural promedio de aproximadamente 5.63 Å en comparación con la estructura de referencia. Esto
sugiere que la conformación predicha de IQY puede ser más variable o tener una desviación estructural
más marcada en comparación con VP7.
Por otra parte, se realizó el clustering para ambos ligandos (fig. 1.). Para VP7 se observaron 6 clusters, el
cluster principal corresponde a 40 conformaciones que tienen una energía de unión menor a 0. A su vez
IQY, presentó 10 clusters, su clúster principal consta de 33 conformaciones que presentan una energía de
unión menor a 0.
Finalmente, también se analizó las interacciones de los ligandos con residuos de aminoácidos para la
conformación 1. De ello, se observó que VP7 e IQY interactúan de forma similar con los residuos, IQY
presentó interacción con todos los residuos que interactúa VP7. Aunado al residuo LEU179, el cual no
interactúa VP7. Así mismo, tanto VP7 como IQY interactúan con el residuo LYS156 por medio de un
puente de hidrógeno (fig. 2.).
Proteina
Ligando
refRMS
Aminoacid Residues
VP7
Binding
Energy
-5.21
TTKB1
5.16
IQY
-5.56
5.63
MET107, LYS63. ASP176, LEU175,
ASN159, ASP154, LYS156.
MET107, LYS63, LEU175, ASP176,
ASN159, AS154, LYS156, LEU179
TTKB1
Tabla 1. Resumen resultados para ligando IQY y VP7 en la conformación 1.
A) .
B) .
Fig 1. A) Clustering para VP7, eje X corresponde a la energía de unión y eje Y al # de conformaciones del cluster. B)
Clustering para IQY, eje X corresponde a la energía de unión y eje Y al # de conformaciones del cluster
A) .
B) .
Fig 2. A) Interacciones ligando VP7 en la conformación 1. B) Interacciones ligando IQY en la conformación 1.
Dinámica
La RMSD, o Root Mean Square Deviation (Desviación Cuadrática Media), es una medida utilizada en
biología estructural para evaluar la similitud estructural entre dos conjuntos de átomos, como los átomos
de una proteína en su forma original y los átomos de la misma proteína después de algún tipo de
modificación o interacción, como la unión de un ligando. En el contexto de la interacción entre ligandos
y proteínas, el RMSD se utiliza para evaluar qué tan bien se ajusta o se superpone un ligando con la
proteína receptora. Si después de la unión del ligando la estructura de la proteína se desvía
significativamente de su forma original, el RMSD será mayor. Un RMSD bajo indica una buena
superposición y una interacción más favorable entre el ligando y la proteína (Sargsyan et al., 2017).
Interacción proteína-ligando: TTBK1-IQY
Interacción proteína-ligando: TTBK1-VP7
Fig 3. RMSD 50ns TTBK1-IQY
Fig 4. RMSD 50ns TTBK1-VP7
La curva de RMSD refleja las variaciones en la forma de la proteína TTBK1 durante la interacción con
los ligandos IQY y VP7. En el caso del ligando IQY, un RMSD de 0.4 Å indica un acoplamiento efectivo,
sugiriendo que el ligando se ubica de manera estable en el sitio de unión de la proteína. Observamos
pequeñas fluctuaciones en la estructura de la proteína y el ligando durante la simulación, que podrían ser
causadas por movimientos normales debidos al calor y ajustes locales en la estructura debido a la
interacción dinámica entre ambos. Es crucial considerar el impacto de la energía de minimización: cuando
esta se realiza bajo restricciones que limitan la flexibilidad del receptor, puede ocasionar desviaciones
notables en la forma realista del receptor. En el caso de la interacción TTBK1-VP7, observamos
fluctuaciones similares a la interacción con IQY, respaldando la idea de un acoplamiento efectivo en
ambas interacciones (Zacharias M, 2004).
Conclusiones
Los enfoques de acoplamiento ligando-receptor se centran en tres tareas esenciales: la identificación de
ligandos potenciales capaces de unirse a un bolsillo específico del receptor, la predicción de una geometría
de unión realista y la selección de dicha geometría como la solución de acoplamiento con menor energía
o mayor clasificación. El análisis detallado de las interacciones entre la proteína TTBK1 y los ligandos
VP7 e IQY ha revelado hallazgos significativos. Específicamente, se ha observado que el ligando IQY
presenta una mayor afinidad hacia TTBK1 en comparación con VP7, indicado por su energía de unión
más negativa. Además, el análisis de la refRMS ha señalado que la conformación predicha de IQY puede
exhibir una mayor variabilidad estructural en comparación con VP7. En cuanto a la dinámica molecular,
ha proporcionado una visión detallada de las fluctuaciones en la conformación de la proteína durante la
interacción con ambos ligandos. Estas observaciones corroboran la eficacia de los ligandos en su
interacción con TTBK1, proporcionando información valiosa para la selección de posibles inhibidores en
el contexto de la enfermedad de Alzheimer.
Referencias
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