Profesor Félix Hernández Pérez BLOQUE I: ENZIMOLOGÍA 1. Enzimas. Generalidades. Centro activo. Catálisis enzimática. Mecanismos Cinética enzimática. Cinética hiperbólica: ecuación de Michaelis-Menten. Km y Vmax. Inhibidores enzimáticos. LAS ENZIMAS SON LOS CATALIZADORES BIOLÓGICOS • • • • • • • • La inmensa mayoría son proteínas Aumentan la velocidad con que las reacciones alcanzan el equilibro No se transforman Participan prácticamente en todas las reacciones que tienen lugar en los seres vivos Acoplan reacciones espontáneas a aquellas que no lo son Son altamente específicas: Una única reacción y sin reacciones colaterales Algunas son estereoespecíficas (solo utilizan, por ejemplo como sustrato los L-aa) Algunas son regulables ■ La vida depende de la existencia de catalizadores específicos: las enzimas. Casi todos las reacciones bioquímicas están catalizadas por una enzima. Las enzimas aceleran la velocidad con la que las reacciones alcanzan su equilibrio ■ Las enzimas son específicas de sustrato, de reacción, funcionan a pH fisiológico y temperatura suaves. Además, su actividad es regulable ■ Con la excepción de unos pocos ARN catalíticos, todos las enzimas conocidas son proteínas. Muchos requieren coenzimas o cofactores no proteicos por sus función catalítica. ■ Holoenzima=Apoenzima (proteína)+Cofactor y/o Coenzima ■ Grupo prostético=Coenzima y/o cofactor unido covalentemente a la enzima ■ Sustrato y cosustrato, son los compuestos sobre los que actúa la enzima ■ Las enzimas se clasifican según el tipo de reacción que catalizan. Todas las enzimas se pueden describir con su número de la Comisión Internacional de Enzimas, un nombre también sumistrado por dicha comisión y la mayoría tiene un nombre trivial acabado en -asa. A cada enzima se le asigna un número formado a su vez por cuatro números, un nombre sistemático que identifica la reacción cataliza. Como ejemplo, la sistemática formal de la enzima que cataliza la reacción ATP+D-glucosa → ADP+D-glucosa 6-fosfato es ATP: glucosa fosfotransferasa, lo que indica que cataliza la transferencia de un grupo fosforilo del ATP a la glucosa. Su número de Comisión de Enzimas (E.C. número) es E.C.2.7.1.1. El primer número (2) denota el nombre de la clase (transferasa); el segundo número (7), es la subclase (fosfotransferasa); el tercer número (1), una fosfotransferasa con un grupo hidroxilo como aceptor; y el cuarto número (1), D-glucosa como aceptor de grupo. Para muchas enzimas, un nombre trivial es de uso más común acabado en -asa, en este caso hexoquinasa Centro activo. Catálisis enzimática. Mecanismos Cinética enzimática ■ Las enzimas son catalizadores muy eficaces. Incrementan las velocidades de reacción por un factor de 105 a 1010 ■ Las reacciones catalizadas por enzimas se caracterizan por la formación de un complejo entre sustrato y la enzima (un complejo ES). La unión del sustrato ocurre en un bolsillo en el enzima llamada sitio activo. ■ La función de las enzimas y otros catalizadores es reducir la energía de activación G ‡, durante una reacción y, por lo tanto, mejorar la velocidad de reacción. El equilibrio de una reacción no se ve afectado por la enzima. ■ Muchas reacciones enzimáticas con un variación de energía libre positiva, pueden llevarse a cabo en las células porque las enzimas acoplan reacciones con variación de energía libre negativa como es la hidrólisis de ATP. ■ Una parte importante de la energía utilizada para el incremento en la velocidad se derivan de interacciones débiles (enlaces de hidrógeno y interacciones hidrofóbicas e iónicas) entre sustrato y enzima. El sitio activo de la enzima está estructurado de modo que algunos de estos débiles las interacciones ocurren preferentemente en la reacción estado de transición, estabilizando así la transición estado. La necesidad de interacciones múltiples es una razón del gran tamaño de las enzimas. La energía de enlace se puede utilizar para reducir entropía del sustrato o para causar un cambio conformacinal en la enzima (ajuste inducido). ■ Mecanismos catalíticos adicionales empleados por las enzimas incluyen catálisis ácido-base general, catálisis covalente y catálisis de iones metálicos. La catálisis a menudo implica interacciones transitorios covalentes entre el sustrato y la enzimas o grupos de la enzima. • Las reacciones catalizadas por enzimas se caracterizan por la formación de un complejo entre el sustrato y la enzima (un complejo ES). • La unión del sustrato ocurre en un bolsillo en el enzima llamado sitio activo. Existe una barrera energética entre el S y el P que debe ser superada y es la formación del complejo ES o estado de transición El punto importante aquí es que la relación entre la constante de velocidad k y la energía de activación G ‡ es inverso y exponencial. En términos simplificados, esta es la base para la afirmación de que una activación más baja energía significa una velocidad de reacción más rápida. • Estabilización del estado de transición. Complejo ES se ve estabilizado por la enzima • Desolvatación del sustrato haciendo que se una con puentres de hidrógeno o interacciones electrostáticas al centro activo • Desestabilización del sustrato por torsión, desolvatación o efectos electrostáticos. • Alineamiento de grupos catalíticos CENTRO ACTIVO OROTATO FOSFORIBOSILTRANSFERASA EC 2.4.2.10 + + Ejemplo de orientación adecuada de los residuos que tienen que reaccionar 8:08 1opr.pdb NUCLEOSIDO-MONOFOSFATO QUINASA EC 4.1.1.23 UMP Ejemplo de neutralización de cargas negativas presente en el sustrato que favorecen su unión al centro activo. 8:08 ATP ADP UDP Ejemplo de ajuste inducido provocado por la unión del sustrato a la enzima. Catálisis ácido-base general : Catálisis covalente: Catálisis electrostática y por iones metálicos: Dos átomos de zinc participan tanto en la unión del sustrato N-carbamoil-L aspartato como en el mecanismo de catálisis alfa Lys102 8:08 beta Asp-250 CINÉTICA ENZIMÁTICA • La cinética es el estudio de la velocidad a la que reaccionan los compuestos. La velocidad de la reacción enzimática se ve afectada por: - La enzima –El o los sustratos –Efectores: inhibidores y/o activadores -Temperatura, pH y fuerza iónica • La cinética enzimática propone un modelo cinético (como entran y salen los sustratos y productos del centro activo de la enzima). A continuación deduce un ecuación de velocidad (fórmula matemática) cuya representación gráfica debe ajustarse a los datos experimentales Michaelis y Menten, entre otros, fueron de los primeros en llevar a cabo este tipo de estudios CINÉTICA ENZIMÁTICA • Cuando se estudia la actividad enzimática en función de la concentración de sustrato pueden obtenerse tres tipos de gráficos. • La inmensa mayoría se ajustan a una cinética hiperbólica cuadrangular (línea azul). Los otros dos los estudiaremos al final del tema CINÉTICA ENZIMÁTICA Cinética de Michaelis-Menten Modelo cinético 1º Sólo se estudian velocidades iniciales, [P] es muy pequeña, y k4 es despreciable 2º La [ES] permanece constante: ESTADO ESTACIONARIO (Briggs and Haldane) 3º La [S] >>> [E] (in vitro). A concentraciones altas de sustrato toda la enzima se encuentra en la forma de ES Ecuación de velocidad ¿Se ajusta a los datos experimentales? Si la respuesta es SI, probablemtne el modelo cinético sea cierto Estado estacionario. La concentración de ES se mantiene constante durante toda la reación Cinética de Michaelis-Menten Modelo cinético 1º Sólo se estudian velocidades iniciales, [P] es muy pequeña, y k4 es despreciable 2º La [ES] permanece constante: ESTADO ESTACIONARIO (Briggs and Haldane) 3º La [S] >>> [E] (in vitro). A concentraciones altas de sustrato toda la enzima se encuentra en la forma de ES Ecuación de velocidad ¿Se ajusta a los datos experimentales? Si la respuesta es SI, probablemtne el modelo cinético sea cierto Al principio de la reacción, la concentración del producto, [P], es insignificante, y hacemos la suposición simplificadora de que la reacción inversa, E+P → ES no existe y puede ignorarse. La reacción general luego se reduce a A tiempo=0 no existe K-2 El término (k2+ k 1) / k1 se define como el Michaelis constante, Km. Sustituyendo esto en la ecuación 6-18 simplifica la expresión a V0 está determinado por la descomposición de ES para formar un producto, por tanto Paso 4 Ahora podemos expresar V0 en términos de [ES]. Sustituyendo el lado derecho de la Ecuación 6-19 para [ES] en la Ecuación 6–11 da También sabemos que: Paso 1 Las tasas de formación y descomposición de ES están determinadas por los pasos gobernados por las constantes de velocidad k1 (formación) y k 1 y k2 (ruptura), según las expresiones Estado estacionario. La concentración de ES se mantiene constante durante toda la reaccion Paso 2 Ahora hacemos una suposición importante: que la la tasa de formación de ES es igual a la tasa de su descomposición. Esto se llama supuesto de estado estacionario. Las expresiones en ecuaciones anteriores se pueden igualar para el estado estacionario, dando Paso 3: ahora resolvemos la Ecuación 6-14 para [ES]. Sumando el término k1 [ES] [S] a ambos lados de la ecuación y simplificando da Luego resolvemos esta ecuación para [ES]: 3er supuesto, solo cuando la concentracón de S es mucho mayor que la de enzima Esta ecuación se puede simplificar aún más. Porque el la velocidad máxima ocurre cuando la enzima está saturada (es decir, con [ES] [Et]) Vmax se puede definir como k2 [Et]. Sustituyendo esto en la ecuación 6-20 da la ecuación 6–9: Esta es la ecuación de Michaelis-Menten, la ecuación de velocidad para una reacción catalizada por unaenzima monosustrato. (1/mol min-1) y= m x + b PROBLEMA CINÉTICA ENZIMÁTICA a resolver en clase Se ha determinado experimentalmente las velocidades correspondientes a una reacción enzimática catalizada por la enzima Xasa para diferentes concentraciones de sustrato: [S] mM Vo(µmol/min) Calcular Km, Vmax 0 0 3 10,4 5 14,5 10 22,5 30 33,8 90 40,5 Se ha determinado experimentalmente las velocidades (en nmol/min) correspondientes a una reacción enzimática catalizada por la enzima Xasa para diferentes concentraciones de sustrato: [So](mM) 0,2 0,25 0,33 0,5 1 2 2,5 3,33 4 5 CONTROL 16,67 20 24,98 33,33 50 66,67 71,4 76,92 80 83,33 Calcular Km, Vmax Significado parámetros cinéticos: kcat: -constante catalítica o número de recambio, equivale a la constante de velocidad k2 para la descomposición de ES en producto. -A alta [S], supuesto 3º, toda la Enzima está en forma de ES -vo = Vmax= k2·[Et] -kcat= k2= Vmax/ [Et] -kcat nos da una medida de la actividad catalítica potencial máxima del enzima. - Número de moléculas transformadas por centro activo y por unidad de tiempo. Vmax: -es constante a una [Enzima total] fija. Aumenta con la cantidad de enzima: Vmax=Kcat [Enzima] -es la asíntota a [S] elevada -unidades: concentración / tiempo U = cantidad de E que transforma 1 micromol de S por minuto) Actividad específica: U/mg de proteína, (micro)mol/min/mg prot Km: - es la [S] que determina una Vo igual a la mitad de la Vmax - es la Cte de disociación aparente del complejo ES, Km = k2+k3/k1= [E]·[S]/[ES] - Se expresa en unidades de concentración (CUIDADO) - Es constante independientemetne de la concentración de enzima y para un S determinados. - Depende de la temperatura, el pH y la fuerza iónica - Se suele emplear para definir la afinidad del E por un S. Valores altos de Km baja afinidad de la enzima por el sustrato. - Es más correcto emplear el cociente kcat/Km, llamado Cte de especificidad. A un valor alto, mayor eficacia catalítica INHIBICIÓN ENZIMÁTICA • Las enzimas están sujetas a fenómenos de inhibición reversible • Los inhibidores de enzimas son moléculas que interfieren con la catálisis, ralentizando o deteniendo las reacciones enzimáticas. • Las enzimas catalizan prácticamente todos los procesos celulares, por lo que No debe sorprender que los inhibidores de enzimas sean entre los agentes farmacéuticos más importantes conocidos. • Por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) inhibe la enzima que cataliza el primer paso en la síntesis de prostaglandinas, compuestos implicados en muchos procesos, como el dolor y la fiebre. • El estudio de inhibidores enzimáticos también ha proporcionado información valiosa sobre los mecanismos enzimáticos y ha ayudado a definir algunas vías metabólicas. Hay dos clases de inhibidores enzimáticos: reversibles e irreversibles. Las Ki son constantes de disociación, por tanto a menor Ki, mejor inhibidor Inhición reversible El caso especial, que rara vez se encuentra a nivel experimental, es cuando KI y Ki tienen el mismo valor. En este caso hablamos inhibición no- competitiva Inhibición irreversible • Los inhibidores irreversibles son aquellos que se unen covalentemente e inactivan un grupo funcional esencial para la actividad enzimática. También es posible que formen una unión no covalente particularmente estable. • Estos inhibidores son una herramienta útil para estudiar los mecanismos de reacción. Los aminoácidos implicados en el sitio activo a veces se pueden identificar determinando qué residuo están unidos covalentemente a un inhibidor irreversible. Un ejemplo es se muestra en la Figura adjunta. • Una clase especial de inhibidores irreversibles son los inhibidores suicidas. Estos compuestos son relativamente poco reactivos hasta que se unen al sitio activo de una determinada enzima. Un inhibidor suicida sufre los primeros pasos químicos de la reacción enzimática normal convirtiendose en un compuesto muy reactivo que se combina irreversiblemente con la enzima PROBLEMA CINÉTICA ENZIMÁTICA a resolver en clase Valores de Vo (nmol/min). Calcular Km, Vmax, decir el tipo de inhibidores son I y X y calcular sus Ki [So](mM) 0,2 0,25 0,33 0,5 1 2 2,5 3,33 4 5 CONTROL inhibidor I inhibidor X (6 uM) (30 uM) 16,67 6,25 5,56 20 7,69 6,67 24,98 10 8,33 33,33 14,29 11,11 50 25 16,67 66,67 40 22,22 71,4 45,45 23,81 76,92 52,63 25,64 80 57,14 26,67 83,33 62,5 27,77 OTRAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS • La inmensa mayoría se ajustan a una cinética hiperbólica cuadrangular (línea azul). Qué pasa con el resto de cinéticas que no se ajustan a una hipérbola cuadrangular, a una cinética de Michaelis-Menten. • Se observó que todas ellas estaban formadas por más de una subunidad proteíca (recordad la hemoglobina) • Enzimas con cooperatividad positiva permiten que pequeños cambios en la concentración de sustrato se traduzcan en grandes cambios de actividad enzimática. Por ello suelen ser enzimas reguladoras de rutas metabólicas. • Enzimas con cooperatividad negativa permiten amortiguar cambios grandes en la concentración de los sustratos respondiendo con pequeños cambios en la velocidad de la reaccion - Enzimas alostéricos: Modelos cinéticos que explican la cooperatividad ¿Cómo diferenciar Cooperatividad negativa y positiva de una hipérbola cuadrangular?, gracias al cálculo de la pendiente de la representación gráfica de Log (Vo/Vmáx-Vo) vs Log [So]. La pendiente de la curva en el tramo recto se conoce como índice de Hill El número de enzimas que presentan cooperatividad positiva es mucho mayor que el de la cooperatividad negativa. En función del efecto sobre la Vmax y la S0.5 (concentración de sustrato que da lugar a ½ de la Vmax, AQUI NO HABLAMOS DE Km) de inhibidores y activadores, se habla de enzimas tipo K y enzimas tipo V Reacciones bisustrato (Bi-Bi – dos sustratos, dos productos-) Todo lo estudiado hasta ahora es con enzimas monosustrato, pero…. Las reacciones bisustrato del tipo A+B=C+D son la mayoría…. por tanto, ¿todo lo estudiado no sirve mas que para unas pocas enzimas? • Reacciones bisustrato del tipo A+B=C+D son la mayoría de reacciones. • Muy pocas reacciones son monosustrato. • Se estudian de la misma manera, pero calculando las constantes cinéticas de un sustrato a concentraciones saturantes del otro. Así calculamos una KmA, KmB, VmaxA y VmaxB • Existen tres modelos cinéticos para las reacciones Bi-Bi (dos sustratos-Dos productos). Utilizando un esquema de Cleland Ordenado Ping-Pong Al azar • Ejemplo de ecuación de velocidad NUCLEOSIDO-MONOFOSFATO QUINASA Modelo cinético. Bi-Bi ordenado UMP ATP UMP 8:08 ATP ADP Modelo cinético Bi-Bi ordenado UDP NUCLEOSIDO-DIFOSFATO QUINASA Modelo cinético Ping-pong UDP ADP ATP ADP UDP Modelo cinético Ping-Pong 8:08 UTP
