Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA Norovirus: la carga de la Desconocido Walter Randazzo*,† , Doris H. D'Souza‡, Gloria Sanchez*,1 *IATA­CSIC, Valencia, Spain † Universidad de Valencia, Valencia, España ‡ 1 Universidad de Tennessee, Knoxville, TN, Estados Unidos Autor para correspondencia: dirección de correo electrónico: [email protected] Contenido 2 1. Introducción 1.1 Clasificación y Estructura 2 1.2 Características de la infección por norovirus 2 1.3 Vía de transmisión 3 1.4 Epidemiología 1.5 3 Norovirus en los alimentos 4 4 2. Avances en el Cultivo de Norovirus Humano 3. Detección de norovirus en alimentos 5 3.1 Extracción de virus de los alimentos 6 7 3.2 Métodos de detección molecular 4. Prevalencia del Norovirus Humano en los Alimentos 10 5. Enfoques para controlar los norovirus humanos en productos alimenticios 5.1 11 Inactivación de norovirus mediante procesamiento térmico 5.2 Inactivación de 12 norovirus mediante procesamiento no térmico 5.3 Depuración de mariscos 5.4 13 Eficacia de los procedimientos de lavado para eliminar o inactivar los HNoV en los 19 alimentos productos 19 22 5.5 Polímeros antivirales para envasado de alimentos 27 6. Conclusiones y perspectivas futuras Referencias 28 Abstracto Los norovirus humanos (HNoV) se transmiten principalmente por vía fecal­oral, ya sea por contacto de persona a persona o por ingestión de alimentos o agua contaminados, así como por aerosolización. Además, los HNoV contribuyen significativamente a que las enfermedades transmitidas por los alimentos sean el agente causante de una quinta parte de las gastroenteritis agudas en todo el mundo. Como consecuencia de la globalización, los brotes transnacionales de infecciones transmitidas por los alimentos se notifican con mayor frecuencia. Por lo tanto, en esta revisión, la información más actualizada sobre Avances en la Investigación de Alimentos y Nutrición ISSN 1043­4526 https://doi.org/10.1016/bs.afnr.2018.02.005 # 2018 Elsevier Inc. Reservados todos los derechos. 1 Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA 2 Walter Randazzo et al. Se han resumido los procedimientos moleculares para la detección del norovirus humano en los alimentos, así como las tecnologías comunes de procesamiento de alimentos. Además, el propósito de este capítulo es consolidar la información básica sobre varios aspectos de los HNoV y resumir las tecnologías de procesamiento de alimentos que pueden aplicarse potencialmente en la industria alimentaria. 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Clasificación y Estructura Los norovirus humanos (HNoVs) de la familia Caliciviridae y clasificados dentro del género Norovirus, son responsables de casos esporádicos y brotes de gastroenteritis aguda (GEA) (Greening & Cannon, 2016). Los HNoV son virus pequeños de estructura redonda, de 28 a 35 nm, con un genoma de ARN monocatenario lineal de sentido positivo de aproximadamente 7,4 a 7,7 kb de longitud. El genoma de HNoV está organizado en tres marcos de lectura abiertos (ORF). ORF1 codifica una poliproteína que se escinde después de la traducción en siete proteínas maduras no estructurales (NS1–NS7), que funciona en la replicación viral; ORF2 codifica la proteína de la cápside mayor (VP1) que mantiene la estructura del virus junto con ORF3 que codifica la proteína de la cápside menor (VP2) (Vinje, 2015). La cápside viral VP1 tiene 90 dímeros que consisten en un dominio de cubierta (S) y un dominio sobresaliente (P). El dominio P incluye las subregiones P1 y P2, donde se informa que el subdominio P2, que es muy variable, contiene los sitios de neutralización putativos e interactúa con los receptores celulares de norovirus humanos putativos llamados antígenos del grupo histosanguíneo (HBGA) (Prasad et al., 1999 ) . Sin embargo, se ha encontrado que algunas cepas de HNoV no se unen a ningún ligando HBGA, lo que sugiere posibles cofactores adicionales (Almand, Moore y Jaykus, 2017). Los HNoV se clasifican actualmente en siete genogrupos (G), tres de los cuales (GI, GII y GIV) son responsables de brotes en humanos. Además, GI y GII son responsables de la gran mayoría de los casos clínicos (Vinje, 2015). 1.2 Características de la infección por norovirus Los síntomas comunes asociados con la infección por HNoV son diarrea, vómitos, náuseas y calambres estomacales, junto con febrícula, dolor de cabeza, escalofríos, dolores musculares y fatiga (Lopman et al., 2015) . Las personas con enfermedad por norovirus generalmente desarrollan síntomas de gastroenteritis dentro de las 12 a 48 horas posteriores a la exposición, y la mayoría de las personas sanas se sienten mejor después de 1 o 3 días, los síntomas se resuelven por sí solos y no se sabe que experimenten problemas de salud a largo plazo. (Teunis et al., 2008). Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA Norovirus: la carga de lo desconocido 3 1.3 Vía de transmisión Las principales rutas de transmisión de partículas infecciosas ocurren debido a episodios de diarrea y/o vómitos que liberan partículas virales en altas dosis/niveles infecciosos, que son las principales preocupaciones en entornos cerrados como residencias de ancianos, centros de cuidados a largo plazo y centros de salud. conciertos, eventos y cruceros (Marsh et al., 2017; Sa´nchez, Randazzo, & D'Souza, 2018). Para este último, la mayoría (97 %) de los brotes de AGE que se informaron y diagnosticaron en cruceros en los Estados Unidos durante 2008–14 fueron causados por HNoV (Mouchtouri et al., 2017). Se ha identificado que los manipuladores de alimentos, los trabajadores del servicio de alimentos y los trabajadores de tratamiento de aguas residuales infectados contribuyen a los brotes de HNoV. Los alimentos listos para comer que no se procesan más, las verduras de hoja verde frescas, las verduras y frutas frescas y congeladas, los embutidos en rodajas, el hielo (Cheng et al., 2017) y los artículos de panadería se han visto implicados en los brotes de HNoV (D 'Souza, Moe, & Jaykus, 2007; Sánchez et al., 2018). 1.4 Epidemiología A pesar de la tasa creciente de brotes informados causados por HNoV, su incidencia ha sido difícil de estimar debido a las limitaciones técnicas asociadas con su diagnóstico y también por la naturaleza leve y autolimitada de la enfermedad. De hecho, los casos de HNoV muy a menudo no se notifican a las autoridades públicas, ya que rara vez requieren atención médica u hospitalización, aunque a veces se necesitan y ocurren en personas mayores o inmunocomprometidas ( Atmar et al., 2014; Teunis et al., 2008). ). Dado este hecho de que no se notifican los brotes de HNoV, se sigue informando que los HNoV siguen siendo los principales agentes causantes de infecciones transmitidas por los alimentos y GEA en todo el mundo, con incidencias epidémicas y esporádicas (OMS, 2015). A nivel mundial, se estima que hay 120 millones de enfermedades, con más de 35 000 muertes atribuidas a enfermedades transmitidas por los alimentos con HNoV cada año (OMS, 2015) y un costo anual estimado de $64 500 millones (Bartsch, Lopman, Ozawa, Hall y Lee, 2016). Según los últimos datos epidemiológicos disponibles, los HNoV son la causa del 9%­20% de los brotes de origen alimentario notificados en Europa (EFSA, 2015a, 2016a), con 12.591 casos, 349 hospitalizaciones y 1 muerte en 2015. En Estados Unidos Unidos, la incidencia de brotes transmitidos por alimentos causados por HNoV durante 1998–2015 fue de 5362 brotes, 140,101 enfermedades, 1431 hospitalizaciones y 13 muertes (evaluado en línea el 10/10/2017 en https:// wwwn.cdc.gov/foodborneoutbreaks ). La incidencia de brotes de HNoV no parece variar mucho entre los entornos de ingresos bajos, medios y altos, lo que los convierte en la causa principal Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA 4 Walter Randazzo et al. de enfermedades diarreicas incluso en países de altos ingresos con alrededor de 18 casos por cada 100 personas (Lopman et al., 2015). Además, se ha pronosticado que una persona experimentará un promedio de tres a ocho episodios de gas troenteritis por HNoV en su vida, de los cuales al menos uno ocurrirá antes de los 5 años (Patel, 2008) . Se ha observado una variación estacional de los brotes notificados en los países de ingresos altos con tasas más altas en invierno, aunque parece depender más de las infecciones sanitarias que de las transmitidas por los alimentos (McLeod, Polo, Le Saux y Le Guyader, 2017). 1.5 Norovirus en los alimentos La contaminación de un alimento con HNoV puede ocurrir en cualquier punto desde la granja hasta la mesa. Anteriormente se informaron ejemplos de alimentos implicados en brotes. En el pasado, la mayoría de los brotes se relacionaron con mariscos, aunque la mayoría de los alimentos (hojas verdes, bayas frescas y congeladas, mezcladas en batidos o jugos, verduras frescas y congeladas, hierbas como ingredientes en preparaciones de alimentos), fiambres en rodajas Se sabe que las carnes y los artículos de panadería están implicados según las condiciones de manipulación, procesamiento y almacenamiento. Como se informó anteriormente, los entornos cerrados y los restaurantes, hoteles y servicios de catering son los lugares más comunes de brotes de HNoV (Chen, Hall y Kirk, 2017; EFSA, 2016a; Hall, Wikswo, Pringle, Gould y Parashar, 2014) . Aproximadamente el 14 % de todos los brotes de HNoV en todo el mundo se pueden atribuir a alimentos contaminados (Verhoef et al., 2015), en el mismo orden de magnitud que el 36 % notificado en los Estados Unidos y el 9,8 % en la Unión Europea según las estimaciones de la vigilancia de brotes datos (CDC, 2017; EFSA, 2017; Hall et al., 2014). A nivel mundial, los peligros transmitidos por los alimentos causan aproximadamente 600 millones de enfermedades al año, principalmente debido a agentes infecciosos que causan enfermedades diarreicas, siendo los HNoV responsables de 120 millones de casos atribuidos al agua y los alimentos (OMS, 2015). 2. AVANCES EN EL CULTIVO DE NOROVIRUS HUMANO Uno de los avances más importantes en la investigación de HNoV ha sido el cultivo exitoso de múltiples cepas de HNoV (incluidas cuatro variantes GII.4 y GII.3, GII.17 y GI.1) en monocapas de enteroide de yeyuno humano (Ettayebi et al. , 2016). Aunque existen diferencias entre las cepas de HNoV dependiendo de los contenidos variables del intestino (la bilis, por ejemplo) que promueven la replicación de HNoV. Si bien es necesario avanzar más para aumentar los niveles de propagación e infección de este sistema (actualmente en Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA Norovirus: la carga de lo desconocido 5 1200 y 2,0104 equivalentes de genoma/pozo según la cepa), este avance debería permitir la investigación que antes se había visto obstaculizada (Ettayebi et al., 2016). Estos numerosos desafíos en la propagación exitosa de HNoV de manera reproducible y el alto título que ha seguido prevaleciendo ha dificultado el estudio de la comprensión de las interacciones HNoV­huésped, los mecanismos de transmisión y control (Knight, Li, Uyttendaele y Jaykus, 2013). En el pasado (desde la década de 1970), se realizaron numerosos estudios para comprender mejor la infección y la patología de los HNoV infectando a voluntarios sanos (Atmar & Estes, 2001; Dolin et al., 1972; Frenck et al., 2012; Hutson, Atmar , Graham, & Estes, 2002; Lindesmith et al., 2003; Lindesmith et al., 2005; Richards, 2012). Por lo tanto, las cuestiones éticas eran una preocupación natural, junto con la reproducibilidad del estudio. Luego, estudios más recientes se centraron en el uso de estudios de laboratorio con modelos animales, incluidos chimpancés (Bok et al., 2011), ratones (Taube et al., 2013), terneros (Souza, Azevedo, Jung, Cheetham y Saif, 2008), y cerdos Los problemas de los derechos de los animales, la ética, el manejo y el costo de estos modelos continúan siendo una preocupación. Como se informó anteriormente (Sa´nchez et al., 2018), entonces serían más adecuadas las líneas celulares, los cultivos primarios, así como los cultivos tridimensionales que simulan tejidos intestinales para la replicación in vitro de HNoV que no tuvieron mucho éxito en obtener reproducibles. o títulos infecciosos a niveles elevados (Duizer et al., 2004; Lay et al., 2010; Papafragkou, Hewitt, Park, Greening y Vinje, 2013). El cultivo de HNoV en células B se informó recientemente, pero la limitación fue la replicación de una sola cepa de HNoV a niveles limitados (Jones et al., 2015, 2014). Por lo tanto, las monocapas de enteroides de yeyuno humano, aunque actualmente son costosas y requieren mucha experiencia, sientan las bases para futuros estudios in vitro con HNoV. 3. DETECCIÓN DE NOROVIRUS EN ALIMENTOS A pesar de representar aproximadamente una quinta parte de todos los casos de AGE en todo el mundo, el HNoV ha recibido comparativamente menos atención que otros patógenos transmitidos por los alimentos (Bartsch et al., 2016). Hasta el momento, no se dispone de métodos de rutina para el cultivo de HNoV aislado de matrices alimentarias. Porque Debido al creciente número de brotes de HNoV transmitidos por los alimentos, se ha vuelto aún más importante contar con técnicas confiables y ampliamente aplicables para la detección y cuantificación de HNoV en los alimentos. Además, dado que la dosis infecciosa de HNoV es muy baja (18–2800 equivalentes genómicos) (Teunis et al., 2008), por lo tanto, se necesitan métodos sensibles al cribar Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA 6 Walter Randazzo et al. productos alimenticios para HNoV. La detección del HNoV se ha abordado básicamente mediante la detección de genomas virales mediante técnicas de amplificación molecular como la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT­PCR) o la PCR cuantitativa en tiempo real (RT­qPCR). Sin embargo, la secuenciación tradicional y la secuenciación del genoma completo parecen ser la tendencia para detectar y clasificar las cepas de HNoV en el seguimiento de brotes (Yang et al., 2017). 3.1 Extracción de virus de los alimentos La extracción de HNoV de los alimentos se puede definir como la separación y concentración de partículas de HNoV de la matriz alimentaria. Dichas metodologías generalmente consisten en un paso de elución del virus, seguido de una concentración y purificación del virus diseñadas para reducir el volumen de la muestra y eliminar al menos algunos de los compuestos de la matriz mientras se recuperan simultáneamente la mayoría de los virus contaminantes. El tipo de alimento, su composición y la ruta de contaminación determinan cómo liberar los virus de los alimentos antes de la extracción del ácido nucleico (Bosch et al., 2011), por lo que se han desarrollado muchos métodos diferentes (Stals, Baert, Van Coillie, y Uyttendaele, 2012). Por lo general, se usa un tampón de elución para liberar el HNoV de los alimentos. Muchos procedimientos de concentración de virus utilizan la manipulación del pH y/o las condiciones iónicas para facilitar la adsorción del virus o la elución de la matriz alimentaria. El extracto de carne y la glicina se agregan comúnmente a los tampones de elución para reducir la adsorción de virus inespecíficos a la matriz alimentaria (Stals et al., 2012). Además, la alta concentración de proteína del extracto de carne de vacuno facilita la floculación de virus durante la precipitación con polietilenglicol (PEG). Sin embargo, el extracto de carne de res también podría interferir con los métodos de detección molecular, lo que podría generar resultados falsos negativos. Luego, la precipitación con PEG es seguida por una centrifugación a velocidad relativamente baja, después de lo cual el precipitado de virus se recupera para una purificación adicional. Las verificaciones de control de calidad, incluidos los controles internos de amplificación y los controles de proceso, son esenciales para monitorear cualquier problema que pueda generar resultados falsos negativos (D'Agostino, Cook, Rodriguez­Lazaro y Rutjes, 2011). Con respecto a este tema, la ISO 15216­1:2017 incluye el uso de una suspensión titulada de mengovirus como control del proceso, que se agrega durante el paso inicial de la extracción y se analiza y cuantifica mediante RT­qPCR al final del proceso. procedimiento (Costafreda, Bosch, & Pinto´, 2006). Esto proporciona una estimación precisa del rendimiento de todo el procedimiento. Como no parece haber un protocolo de extracción universal para recuperar de manera eficiente los virus entéricos humanos de todo tipo de alimentos, la ISO 15216­1:2017 propone Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA Norovirus: la carga de lo desconocido 7 diferentes métodos de elución y concentración de virus dependiendo de la muestra, es decir, tratamiento de las glándulas digestivas con proteinasa K para mariscos, precipitación con PEG para frutas blandas y verduras de hoja, y adsorción en membranas cargadas positivamente seguida de ultrafiltración para agua embotellada (como se describe en Sánchez et al., 2018). Aunque se sabe que los métodos de concentración aplicados a un alimento contaminado tienen un gran impacto en el rendimiento de los procedimientos, se ha prestado poca atención comparativamente a esta área (Butot, Zuber y Baert, 2014). Una vez que se extrae el virus, se pueden usar ensayos de infectividad cuando estén disponibles y/o métodos moleculares para la detección. Para la detección molecular, primero se debe liberar o extraer el ARN mediante la interrupción de la cápside viral. El protocolo estándar de Boom que usa reactivos caotrópicos seguidos de adsorción de ARN a partículas de sílice (Boom et al., 1990) o kits comerciales se pueden usar para obtener ARN purificado y de alto rendimiento. Alternativamente, los aptámeros de ácidos nucleicos, secuencias cortas de ssDNA que tienen afinidad de unión por HNoV, se han utilizado como ligandos de unión para capturar y concentrar HNoV de lechuga (Escudero­Abarca, Suh, Moore, Dwivedi y Jaykus, 2014). Actualmente, diferentes instituciones internacionales como los CDC de EE. UU . (https://www.cdc.gov/norovirus/lab­testing/diagnostic.htmland ) y Health Canada (http:// www.hc­sc.gc.ca/fn­an/res­rech/analy­meth/microbio/volume5­eng.php#share ) han publicado procedimientos para la detección de HNoV en muestras de alimentos. Además, recientemente se emitió un procedimiento estandarizado basado en RT­ qPCR para HNoV GI y GII en varias matrices alimentarias, incluidos mariscos, bayas, verduras y agua embotellada (ISO 15216­1:2017), incluido un estudio de validación internacional que involucra 18 laboratorios de 11 países (Lowther et al., 2017). 3.2 Métodos de detección molecular Los medios tradicionales para la detección microbiana no se pueden aplicar para la detección de HNoV en los alimentos; sin embargo, las metodologías moleculares pueden proporcionar información oportuna y precisa sobre la presencia de HNoV en los alimentos. Hasta ahora, se han aplicado varios procedimientos moleculares más nuevos para detectar y cuantificar los HNoV en los alimentos, como la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, NASBA ( Houde et al., 2006; Kou, Wu, Zhang y Fan, 2006; Moore et al. ., 2004) y técnicas de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcriptasa inversa, RT­LAMP (Fukuda, Takao, Kuwayama, Shimazu y Miyazaki, 2006). Sin embargo, RT­qPCR sigue siendo el estándar de oro actual para HN Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA Walter Randazzo et al. 8 detección, debido a su sensibilidad, especificidad, velocidad y capacidad para entregar datos cuantitativos (como también se describe en Sanchez et al., 2018). Durante el desarrollo de ensayos moleculares, el conjunto de cebadores y sondas altamente conservados debe tener como objetivo aumentar la capacidad de detectar las diferentes cepas de HNoV entre los genogrupos que afectan a los humanos. Según se informa, la unión ORF1/ORF2 es la mejor región del genoma objetivo para la detección de € HNoV (Hohne & Schreier, 2004 ; Kageyama et 2005; al., 2003; Katayama et al., .2002; Loisy et al., Nishida et al., 2003) Sin embargo, en la actualidad, un solo ensayo para detectar simultáneamente todos los genotipos de HNoV sigue siendo difícil de alcanzar. Aunque el estándar de oro actual, las metodologías de RT­qPCR tienen inconvenientes para detectar el ARN viral de HNoV tanto infeccioso como inactivado, lo que podría sobrestimar la cantidad de virus infecciosos. De hecho, la persistencia del ARN viral en alimentos y en el medio ambiente puede ser mucho mayor que la de los correspondientes virus infecciosos (Baert, Uyttendaele, Van Coillie, & Debevere, 2008; Butot, Putallaz, Amoroso, & Sa´nchez, 2009). ; Butot, Putallaz, & Sánchez, 2008; Hewitt & Greening, 2004). Para permitir la diferenciación entre partículas virales infecciosas e inactivadas, se han informado diferentes enfoques basados en la integridad de la cápside (DiCaprio, 2017; Sanchez et al., 2018), que incluyen: (i) pretratamiento con nucleasas y/o enzimas proteolíticas antes del ácido nucleico extracción para eliminar cualquier señal de genomas dañados o expuestos (Lamhoujeb, Fliss, Ngazoa y Jean, 2008; Nowak et al., 2011); (ii) uso de unión de HNoV (con sitio de unión intacto) a mucina gástrica porcina (PGM) (Tan & Jiang, 2005; Tang et al., 2010) que permite la recuperación selectiva de HNoV potencialmente infecciosos en alimentos (Dancho, Chen , & Kingsley, 2012; DiCaprio et al., 2016), y (iii) pretratamiento de ácido nucleico con colorantes intercalantes convencionales y recientemente desarrollados (es decir, monoazida de propidio, PMA y monoazida de etidio, EMA; PMAxx y PEMAX, respectivamente) ( Elizaquı ´vel, Aznar, & Sa´nchez, 2014; Randazzo, Lo´pez­Ga´lvez, Allende, Aznar, & Sa´nchez, 2016). Este enfoque se basa en la capacidad de intercalar colorantes para penetrar solo en las cápsidas dañadas o alteradas y se intercala covalentemente en el genoma viral después de la exposición a una luz visible intensa, lo que evita e interfiere con la amplificación por PCR. Hasta ahora, los colorantes intercalados combinados con RT­qPCR se han aplicado con éxito a las suspensiones de virus para discriminar entre HNoV infecciosos e inactivados (Tabla 1), y además estos pretratamientos ya se han aplicado para detectar HNoV potencialmente infecciosos en muestras de agua, aguas residuales. , vegetales y mariscos y discriminan entre viriones infecciosos y no infecciosos (Randazzo et al., 2018; Randazzo, Lo´pez­Ga´lvez, et al., 2016). Curiosamente, este enfoque Machine Translated by Google Tabla 1 Aplicación de Colorantes Intercalantes para la Detección de Norovirus Humanos Potencialmente Infecciosos Inactivación Proceso Colorante/surfactante Matriz Discriminación exitosa Referencias Sí por RT­PCR pero no por RT­qPCR Parshionikar, Laseke y Fout (2010) Sí (SYBR verde Squire­Embrace, Rawsthorne, Goulter, Suh y Calor (72°C, 5min) AMP Calor (90°C, 5min) AMP Calor AMP No (por RT­PCR) Karim, Fout, Johnson, White y Parshionikar (2015) PMA/ Sí Lee, Lee, Yoon, Kim y Ha (2018) Sí Jeong, Park y Ha (2017) Sí Randazzo, López­Gálvez, et al. (2016) Sí Randazzo et al. (2018) EN ARTÍCULO PRENSA Suspensión de heces RT­qPCR) Jaykus (2014) Cloro Cloro lauroilsarcosinato de sodio Calor (65–85 °C, 2 min) AMP Calor (99°C, 5min) PMAxx/Tritón Heces y espinacas Heces, lechuga y espinacas Mejillones, ostras y berberechos Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA 10 Walter Randazzo et al. demostró reducir las señales falsas positivas de RT­qPCR para HNoV en muestras de agua contaminadas naturalmente (Blanco et al., 2017; Randazzo et al., 2018; Randazzo, Lo´pez­Ga´lvez, et al., 2016). Por otro lado, se han observado algunas desventajas con este enfoque, particularmente para lograr la supresión completa de la señal de RT­ qPCR de los virus inactivados presentes en algunas matrices alimentarias particulares, por ejemplo, mariscos (Randazzo et al., 2018) . Como se mencionó anteriormente, se está buscando la secuenciación del genoma completo de virus de brotes y muestras de alimentos para la detección y confirmación simultáneas de cepas de HNoV en el seguimiento de brotes, aunque es necesario lograr un progreso significativo para enrutar las pruebas de muestras de alimentos para vincularlas a entornos clínicos. 4. PREVALENCIA DEL NOROVIRUS HUMANO EN LOS ALIMENTOS Además, como se mencionó anteriormente (Sanchez et al., 2018), los mariscos y todos los alimentos listos para el consumo se han visto implicados en brotes de HNoV, lo que indica la prevalencia de HNoV en ellos. La contaminación de mariscos por HNoV ha sido y sigue siendo un importante problema económico y de salud (Bellou, Kokkinos y Vantarakis, 2013). El año pasado, la Comisión Europea lanzó un programa de seguimiento para estimar la prevalencia europea de contaminación por HNoV en ostras recolectadas en puntos de seguimiento representativos en áreas de producción y centros de expedición utilizando la norma ISO 15216­1:2017 (EFSA, 2016b; ISO 15216­1 : 2017 ). Además, los riesgos para la salud asociados con el consumo de ostras crudas no se reducen lo suficiente con los actuales procedimientos comerciales de depuración aplicados para reducir la contaminación microbiológica (McLeod et al., 2017). Hasta la fecha, se han informado altos niveles de HNoV en las ostras, con niveles que varían notablemente entre los sitios en Europa, con algunos sitios con una puntuación constante de más de 1000 copias/g durante el invierno, mientras que otros rara vez o nunca superan las 100 copias/g (Panel de la EFSA sobre peligros biológicos) . , 2012; Polo et al., 2016; Schaeffer, Le Saux, Lora, Atmar y Le Guyader, 2013). Bélgica, Canadá y Francia fueron los primeros países en proporcionar datos sobre la prevalencia de HNoV en más de 1000 muestras de verduras de hoja verde. Los genomas de HNoV se detectaron con frecuencia (28,2 %, 33,3 % y 50 % en muestras canadienses, belgas y francesas, respectivamente); sin embargo, la confirmación de la secuencia no tuvo éxito en la mayoría de las muestras analizadas (Baert et al., 2011). En ensaladas de vegetales de países europeos, las muestras fueron positivas en 2% y 2.95% para HNoV GI y HNoV GII, respectivamente (Kokkinos et al., 2012). En muestras de México, HNoV estuvo presente en el 32,6% de las muestras (Felix­Valenzuela, Resendiz­Sandoval, Burgara­Estrella, Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA Norovirus: la carga de lo desconocido 11 Herna´ndez, & Mata­Haro, 2012), mientras que en Turquía, de 525 muestras analizadas, se detectó HNoV GII en 1 muestra de cebolla verde y 1 muestra de tomate mediante los ensayos SYBR Green y TaqMan RT­qPCR (Yilmaz et al . , 2011). Un estudio reciente realizado en ensaladas verdes del delta del Nilo mostró la validez del procedimiento ISO 15216­1:2017 en productos naturalmente contaminados con HNoV que detectan HNoV GI en 20.8%–34.0% de muestras naturalmente contaminadas, incluidas cebollas verdes, berros, rábanos. , puerro y lechuga con un número de copias del genoma de alrededor de 102 (El­Senousy, Costafreda, Pinto´, & Bosch, 2013). En 2016, tras una alerta de per gram brote en Europa (Rapid Alert System for Food and Feed, RASFF, expediente 2017/0469), Blanco et al. (2017) determinaron beber agua embotellada como la posible fuente de transmisión de HNoV. El estudio estimó la concentración de HNoV GI y GII en dos de las cuatro muestras en alrededor de 103 a 104 copias del genoma por litro de agua. 5. ENFOQUES PARA EL CONTROL DE NOROVIRUS HUMANOS EN PRODUCTOS ALIMENTICIOS Como virus sin envoltura, los HNoV tienden a ser más resistentes a la inactivación que las bacterias transmitidas por los alimentos en los procesos tradicionales de fabricación de alimentos. La mayoría de los estudios para determinar la eficacia de diferentes tecnologías de procesamiento, así como la actividad antiviral de diferentes compuestos, se han realizado agregando artificialmente una cantidad conocida de virus a un material dado, determinando la reducción en el título infeccioso después de someter el material enriquecido a las condiciones designadas. , y aplicando procedimientos estadísticos para determinar la importancia de la descomposición del virus (Sa´nchez Evidentemente, esto implica el uso de cepas de virus que pueden propagarse en cultivo celular y enumerarse a través de la infectividad, lo que restringe mucho el rango de cepas que pueden incluirse en estos estudios debido a las dificultades para desarrollar sistemas de cultivo in vitro para replicar HNoV. . Por lo tanto, la infectividad de los HNoV se ha inferido principalmente a través de sustitutos cultivables, como el calicivirus felino (FCV), el norovirus murino (MNV) y el virus Tulane (TV) ( Hirneisen & Kniel, 2013a). Aunque estos modelos de virus se han utilizado en gran medida para estudiar la tasa de supervivencia de los HNoV expuestos a diferentes procesos de inactivación, no está claro si los HNoV podrían inactivarse mediante las condiciones de inactivación establecidas para sus sustitutos (Bae & Schwab, 2008; Knight et al . , 2016; NACMCF, 2016). Como se informó anteriormente, la persistencia ambiental de HNoV depende de muchos factores físicos, biológicos y químicos, como la temperatura, la fuerza iónica, Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA 12 Walter Randazzo et al. componentes químicos, el antagonismo microbiano, el estado del virus (como virus unido a materia orgánica o agregación de virus) y el tipo de virus (Cook, Knight, & Richards, 2016; Knight et al., 2016; Sa´nchez et al. al., 2018). Se ha informado que diferentes genotipos de HNoV muestran diferentes comportamientos y tasas de inactivación. 5.1 Inactivación de norovirus por procesamiento térmico El procesamiento térmico sigue siendo uno de los métodos más importantes y comunes de conservación de alimentos en la industria alimentaria (Micali, Fiorino y Parisi, 2016). Se ha demostrado que el procesamiento térmico es una tecnología muy eficaz para la inactivación de bacterias y levaduras. Sin embargo, hasta hace poco tiempo, la inactivación por calor de los virus entéricos, en particular los HNoV en los alimentos, se había explorado poco. Es bien sabido que la inactivación de HNoVs o de cualquier microorganismo por calor está influenciada por factores como la presencia de materia orgánica, como materia fecal, la matriz alimentaria (por ejemplo, alto contenido de grasas o proteínas), el nivel inicial de contaminación, y el tiempo­temperatura del proceso (Li, Predmore, Divers, & Lou, 2012). Comprender la resistencia térmica y las propiedades de un patógeno objetivo sigue siendo crucial para diseñar procesos de tratamiento térmico efectivos para su inactivación y control, que se determina utilizando el valor D, definido como el tiempo a una temperatura dada para causar una reducción de 1 log del target (Bozkurt, D'Souza, & Davidson, 2015). Esta sección se centra en los estudios que utilizan HNoV, mientras que no se incluye la información de los estudios que involucran solo sustitutos. El IG de HNoV en albahaca después de calentar a 75 y 95 °C tuvo valores D de 5,2 y 4,9 min, en cebollino de <0,83 min y <0,83 min, en menta de 2,57 min y <0,83 min, y en perejil de 1,56 y 1,58 min, respectivamente, cuando se analizó por RT­ qPCR (Butot et al., 2009). Mientras que HNoV GII después del análisis por RT­ qPCR después de calentar a 75 y 95 °C mostró valores D de 1,71 y 1,55 min en albahaca, 1,85 y 1,08 min en cebollino, 1,58 y <0,83 min en menta, 1,64 y 0,89 min en perejil , respectivamente (Butot et al., 2009). El efecto de los procedimientos de cocción comunes en HNoV GII.3 inoculado en varios productos alimenticios se investigó mediante RT­qPCR, donde la salsa de tomate especiada se trató a 74 °C durante 1 minuto, la carne picada se asó a 200 °C durante 30 minutos y la pizza congelada se horneó a 200 °C durante 12 min mostró una reducción de 0,4, 1,6 y >4 log copias del genoma HNoV (Mormann, Dabisch y Becker, 2010). Además, las espinacas, la lechuga y el canónigo se han utilizado como matrices alimentarias para evaluar la infectividad de los HNoV después de tratamientos térmicos mediante la aplicación de pretratamiento de diferentes tintes intercalantes junto con RT­qPCR (Jeong et al., 2017; Randazzo, Lo´pez ­ Ga ´lvez, et al., 2016). Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA Norovirus: la carga de lo desconocido 13 La aparición de brotes de HNoV asociados con el consumo de mariscos fritos, a la parrilla, guisados y al vapor indica que los procedimientos estándar de cocción no garantizan la inactivación completa de HNoV (McDonnell et al., 1997). Los estudios iniciales se realizaron con sustitutos de HNoV, mientras que los estudios más recientes se centraron en HNoV usando RT­qPCR sola o combinada con PGM o pretratamientos con colorantes intercalados, donde los HNoV en mejillones calentados a 100 °C mostraron valores D de 1,3 min por RT­qPCR ( Hewitt & Greening, 2006) y los HNoV en mejillones calentados a 60 °C mostraron valores D de 25 min mediante RT­qPCR (Croci, Suffredini, Di Pasquale y Cozzi, 2012). Del mismo modo, Randazzo et al. (2018) evaluaron el destino de los HNoV GI y GII en ostras bioacumuladas y contaminadas naturalmente después de un tratamiento térmico. Al aplicar un pretratamiento PMAxx antes de la RT­qPCR para predecir la infectividad de HNoV, los autores informaron reducciones de 1,61 y 2,18, y 2,99 y 1,93 log RT­PCRU/100 μL para HNoV GI y GII en ostras bioacumuladas y contaminadas naturalmente, respectivamente. Además, en las ostras bioacumuladas, las diferencias en los valores de reducción entre el pretratamiento sin colorante y los pretratamientos con colorante aumentaron gradualmente junto con el aumento escalonado de la temperatura, incluso estos resultados pueden subestimar la tasa real de inactivación de HNoV como se informó anteriormente. En general, los procedimientos de cocción en los que la temperatura interna del marisco alcanza al menos los 90 °C durante 1,5 min se han considerado tratamientos adecuados para eliminar la infectividad viral (Codex Alimentarius, 2012; NACMCF, 2008), aunque publicaciones recientes de la EFSA indican tiempos más altos. necesario (EFSA, 2015b). 5.2 Inactivación de norovirus por procesamiento no térmico En los últimos años, el interés por productos alimenticios de alta calidad está aumentando constantemente debido a la demanda de los consumidores. Por lo tanto, tanto la industria como la academia han avanzado en el desarrollo de tecnologías no térmicas en un intento de enfrentar el desafío de producir alimentos procesados seguros de alta calidad, aunque algunas preocupaciones en cuanto a la aceptabilidad actual del consumidor y la regulación han limitado sus aplicaciones. 5.2.1 Procesamiento a alta presión (HPP) HPP es una técnica de procesamiento en frío, no térmica, en la que el alimento en su empaque flexible final se somete a altos niveles de presión hidrostática, inactivando microorganismos, extendiendo la vida útil y garantizando la seguridad alimentaria del producto (Rodrigo, van Loey, & Hendrickx , 2007). Los efectos de HNoV por HPP se han investigado principalmente utilizando sustitutos de HNoV, mientras que hay poca información disponible sobre HNoV (Tabla 2; Machine Translated by Google Tabla 2 Efecto de los tratamientos HPP sobre los norovirus humanos aplicados a muestras de alimentos hnov Presión Condiciones de procesamiento Genotipo (MPa) (Tiempo, Temperatura) soldado americano 650 600 Inactivación Tipo de comida (Reducción logarítmica) Referencias 2min, 0°C Frambuesas 2.5 Huang et al. (2016) 5min, 6°C ostras 4.0 León et al. (2011) EN ARTÍCULO PRENSA Cebollas verdes >3.0 2min, 0°C cuartos de fresa 1.9 Huang et al. (2016) 2min, 0°C puré de fresa >3.0 Huang et al. (2016) Puré de arándanos 2.9 puré de frambuesa 2.9 2min, 1°C Sido, Huang, Liu y Chen (2017) 550 500 2min, 1°C Salsa (principalmente tomates) >3.0 2min, 0°C Arándano >3.2 Huang et al. (2016) ostras >4.3 Ye et al. (2015) homogeneizado de almejas 4.0 Ye, Li, Kingsley, Jiang y 5min, 1°C 450 4.1 400 2.8 Sido et al. (2017) Chen (2014) Machine Translated by Google GII 650 2min, 0°C cuartos de fresa 3.1 Huang et al. (2016) 550 2min, 0°C Puré de arándanos >4.4 Huang et al. (2016) Frambuesa >4.1 2min, 1°C Cebollas verdes >3.0 Sido et al. (2017) 5min, 1°C homogeneizado de ostras 4.0 Ye et al. (2014) 500 EN ARTÍCULO PRENSA 450 4.3 400 2.9 350 300 2min, 0°C puré de fresa >4.2 Huang et al. (2016) 5min, 25°C ostra 1,87–1,99 Imamura et al. (2017) 2min, 0°C puré de frambuesa >4.2 Huang et al. (2016) ostras >4.2 Ye et al. (2015) 2min, 1°C Salsa (principalmente tomates) >3.0 Sido et al. (2017) 2min, 0°C arándanos Huang et al. (2016) >4.1 Adaptado de Sa´nchez, G., Randazzo, W., & D'Souza, DH (2018). Capítulo 10: Norovirus humanos. En D. Liu (Ed.), Manual de enfermedades transmitidas por los alimentos. Taylor y Francisco. Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA dieciséis Walter Randazzo et al. de Sa´nchez et al., 2018), que muestra que los diferentes factores de procesamiento (presión, temperatura de mantenimiento y tiempo) y las propiedades de los alimentos (pH, grasa, sal, azúcar o contenido de proteína) son factores clave que deben tenerse en cuenta. durante el diseño de tratamientos HPP efectivos (revisado por Kingsley, 2013; Lou, Neetoo, Chen, & Li, 2015; Sanchez et al., 2018). Por ejemplo, se informa una mayor inactivación de HNoV y sus sustitutos a pH neutro que a pH ácido cuando se aplica HPP (Chen, Hoover y Kingsley, 2005; Kingsley y Chen, 2008; Li, Chen y Kingsley, 2013; Lou et al. , 2016; Lou, Neetoo, Chen y Li, 2011), que se confirmó para HNoV GI y GII mediante un método de captura PGM (Li, Chen y Kingsley, 2013). Las bajas temperaturas también mejoraron el efecto HPP en los sustitutos HNoV (Kingsley, Holliman, Calci, Chen, & Flick, 2007; Lou et al., 2011; Sa´nchez, Aznar, Martı ´nez, & Rodrigo, 2011) y HNoVs GII ( Lou et al., 2016). Se observó un efecto baroprotector con CaCl2, NaCl y sacarosa utilizando sustitutos de HNoV (Kingsley & Chen, 2008; Sa´nchez et al., 2011), que también fueron informados por Lou et al. (2016) para HNoV GII en PBS y DMEM en comparación con agua. El HPP de alimentos contaminados artificialmente, incluidos vegetales, purés, almejas y ostras, se resumen en la Tabla 2 (adaptado de Sa´nchez et al., 2018). Se informó que HNoV GI se inactivó a 600 MPa durante 5 minutos a 6 °C en un estudio con voluntarios humanos, mientras que 400 MPa a 6 °C durante 5 minutos no protegió a todos los voluntarios (Leon et al., 2011) . Se informa que el genotipo GII.4 de HNoV es más sensible a los tratamientos de presión que el GI.1 (Huang et al., 2016; Li, Chen y Kingsley, 2013; Lou et al., 2016; Ye et al., 2014). 5.2.2 Homogeneización a alta presión (HPH) HPH es un proceso puramente mecánico y continuo con una presión relativamente más baja (<400MPa) y un tiempo de exposición más corto (s), ideal para alimentos líquidos. No hay muchos estudios informados en la literatura hasta la fecha que utilicen este enfoque. HPH a 300 MPa durante <2 s mostró una reducción de 3 log para FCV F9 en tampón, leche y jugos, mientras que MNV­1 fue más resistente y mostró una reducción de título mucho menor ( D'Souza, Su, Roach y Harte, 2009; Horm & D'Souza, 2011; Horm, Davidson, Harte y D'Souza, 2012; Horm, Harte y D'Souza, 2012). 5.2.3 Plasma a presión atmosférica (APP) APP es un enfoque innovador que utiliza un gas ionizado neutro que contiene especies altamente reactivas de iones, moléculas y fotones (Wan, Coventry, Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA Norovirus: la carga de lo desconocido 17 Swiergon, Sanguansri y Versteeg, 2009). Como resumen Sánchez et al. (2018), el tratamiento con APP fría (CAPP) en HNoV GII.4 ha demostrado que el aumento de los tiempos de tratamiento con plasma condujo a una disminución de las copias del genoma de HNoV en las superficies inoculadas (Ahlfeld et al., 2015). De manera similar, la potencia de generación de plasma CAP, la mezcla de gases de alimentación, el tiempo y la distancia de exposición y el medio de suspensión del virus afectaron la inactivación de FCV­F9 (Aboubakr et al., 2015). Alshraiedeh, Alkawareek, Gorman, Graham y Gilmore (2013) utilizaron un chorro de plasma no térmico que mostró una rápida reducción de 3 log después de 3 min y más de 7 log después de 9 min para el bacteriófago MS2. Se informó que los tratamientos con plasma no térmico de las superficies de acero inoxidable mostraron reducciones para los sustitutos de HNoV, con una clasificación de reducción de FCV­F9>MS2> MNV­1 (D'Souza, 2013). Con respecto al tratamiento de los alimentos, el tratamiento con chorro de APP después de 5 minutos en carnes frescas provocó una reducción de >2 log en la infectividad del MNV sin cambiar la calidad de la carne (Bae, Park, Choe y Ha, 2015), mientras que la descarga de la barrera dieléctrica APP, según se informa, redujo la TV. por solo 0,7 log en lechuga envasada (Min et al., 2016). 5.2.4 Ultrasonido de alta potencia (HPU) HPU ha demostrado que inactiva eficazmente las bacterias en alimentos líquidos y productos frescos a bajas frecuencias que van desde 20 a 100 kHz (Bilek & Turantaş, 2013). Se informó que HPU a 0,56 kW/L, 20 kHz durante 60 min no es eficaz para la reducción de MNV­1 en el agua de lavado de lechuga (Sa´nchez, Elizaquı´vel, Aznar y Selma, 2015), aunque la reducción de 1,5 log de MNV­1 después de 30 minutos en jugo de naranja se informó anteriormente (Su, Zivanovic y D'Souza, 2010). Además, el ultrasonido de vapor también mostró que esta tecnología actualmente establecida no parece ser adecuada para la descontaminación viral transmitida por los alimentos hasta que se pueda lograr una mayor optimización de los parámetros (Schultz, Uhrbrand, NØrrung y Dalsgaard, 2012). 5.2.5 Radiación Las radiaciones ionizantes con fines de inocuidad de los alimentos indican dosis de 10 kGy por la OMS, 4 kGy para lechuga iceberg y espinacas frescas, y 5,5 kGy en productos marinos frescos por la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos, 2012; Goodburn & Wallace , 2013; y como se describe en Sanchez et al., 2018). Se informa que los sustitutos de HNoV son más resistentes a la irradiación (ionizante) que los patógenos bacterianos, y esta tecnología no parece ser suficientemente efectiva contra las cepas de HNoV (Sa´nchez et al., 2018). Después de un tratamiento con rayos X de 5,0 kGy, el MNV­1 internalizado en ostras de concha entera mostró 2,0 log Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA 18 Walter Randazzo et al. Reducción de UFP/g (Wu et al., 2017), reducción de 2,6 log UFP/g en ensalada de atún y >3,5 log UFP/g en ostras de media concha y sushi de salmón (Wu et al., 2016). Mientras que a 5,6 kGy, se informó una reducción de 1,7–2,4 log MNV­1 en productos frescos (Feng, Divers, Ma y Li, 2011). La irradiación con haz de electrones a 4 kGy redujo TV en 1,4 y 1,3 log en fresas y lechuga, respectivamente (Predmore et al., 2015), y MNV­1 en 0,4 y 0,7 log en fresas y repollo, respectivamente (Sanglay, Li, Uribe y Lee, 2011). La irradiación gamma mostró un mejor rendimiento que el haz de electrones contra HNoV GII.4 (DiCaprio et al., 2016), aunque el ensayo de unión de PGM MB mostró que se necesitaban dosis de 22,4 kGy mayores que los niveles actualmente aprobados en fresas enteras para abolir la unión del receptor actividad. En un estudio muy reciente, el haz de electrones a 1, 3, 5, 7 y 10 kGy disminuyó la infectividad de MNV en 0,31, 0,6, 0,9, 1,1 y 1,4 log en carne de mariscos, respectivamente, mientras que los parámetros sensoriales evaluados no fueron significativos. significativamente modificado (Kim, Park, Rui y Ha, 2017). El rango de longitud de onda de la luz ultravioleta (UV) para el procesamiento de alimentos varía de 100 a 400 nm y se clasifica como UV­A (320–400 nm), UV­B (280–320 nm) y UV­C (200–400 nm). 280nm). UV­C ha recibido la aprobación de la FDA para controlar los microorganismos en las superficies de los productos alimenticios (Administración de Alimentos y Medicamentos, 2007; Li et al., 2011; Park, Kim, Lee y Ha, 2015). Se demostró que el tratamiento con UV­ C después de 5 minutos reduce los títulos de MNV­1 en menos de 1 log en lechuga recién cortada, aunque se observó una reducción de 3 log en discos de acero inoxidable, lo que indica que la topografía de la superficie, la dosis, la distancia, el tiempo y la matriz son factores que juegan un papel en la eficacia del tratamiento y que acoplados con peróxido de hidrógeno vaporizado pueden incrementar sus efectos (Li et al., 2011). MNV­1 se inactivó por completo (>4 log) cuando los arándanos se sumergieron en agua agitada durante 12 J/cm2 de tratamiento UV asistido por agua, con una reducción menor de 2,5 log con el tratamiento UV seco (Liu, Li y Chen, 2015). La luz ultravioleta pulsada es aplicable para la descontaminación de superficies en contacto con alimentos y alimentos mediante el uso de una lámpara de xenón que emite longitudes de onda entre 200 y 1000 nm, y duraciones de pulso que no superan los 2 ms, y una intensidad acumulada que no supera los 12 J/cm2 (Administración de Alimentos y Medicamentos, 2013) . ). Se informó que el MNV­1 se inactivó por completo con luz ultravioleta pulsada operada a 59 mWs/cm2 que provocó alteraciones en la estructura del virus, con mayor reducción en fómites que en líquido, con menor eficacia esperada en presencia de materia orgánica (Jean, Morales­Rayas , Anoman y Lamhoujeb, 2011; Vimont, Fliss y Jean, 2015). Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA 19 Norovirus: la carga de lo desconocido 5.3 Depuración de mariscos La depuración de mariscos es una tecnología de procesamiento comercial utilizada en todo el mundo, donde los mariscos se colocan en tanques que contienen agua de mar limpia y se les permite purgar los contaminantes durante varios días. La depuración de mariscos elimina rápidamente los patógenos bacterianos y los microorganismos indicadores; sin embargo, la comunidad científica está de acuerdo en que los procesos comerciales de depuración de mariscos son inadecuados para los HNoV, ya que ha habido muchos brotes de HNoV en ostras depuradas que contienen alrededor de 103de copias tejido ostradel ( Legenoma/ Mennec et al., 2017; McLeod et al., 2017). Además, la mitad de las publicaciones no mostraron disminución en los títulos de HNoV durante la depuración, y en los estudios restantes, tomó entre 9 y 45,5 días para una reducción de 1 logaritmo, significativamente más que los plazos de depuración comercial (revisado por McLeod et al. , 2017). Además, un estudio con voluntarios humanos sobre la depuración de mariscos concluyó que la depuración no tuvo éxito (Grohmann, Murphy, Christopher, Auty y Greenberg, 1981). 5.4 Eficacia de los procedimientos de lavado para eliminar o inactivar HNoV en productos alimenticios Los productos y, en particular, las verduras de hoja verde y las bayas que se consumen crudas, han ganado mucho reconocimiento como vehículos importantes para la transmisión de patógenos virales transmitidos por los alimentos. Los HNoV pueden contaminar los productos a través del contacto con aguas residuales tratadas incorrectamente o aguas residuales contaminadas en los campos, así como a través de la contaminación del agua de riego y los sistemas de riego, y durante el procesamiento, almacenamiento, distribución o preparación final. Esto puede ocurrir porque las personas infectadas con HNoV, el agua contaminada o los fómites entran en contacto con los alimentos (Xiao, Ta De hecho, estudios experimentales han demostrado que aproximadamente el 1 % del € HNoV se puede transferir al pepino a partir de guantes de látex contaminados (Ronnqvist et al., 2014). Por lo tanto, se continúan investigando estrategias mejoradas de saneamiento y descontaminación. 5.4.1 Cloro y dióxido de cloro El uso de desinfectantes a base de cloro está muy extendido en toda la industria de productos frescos, con la intención de mantener la seguridad microbiana de los productos, evitar la contaminación cruzada y reciclar el agua. Se supone que el mecanismo de acción del cloro y los compuestos liberadores de cloro contra los virus es a través de la destrucción de la cápside por oxidación que da como resultado la exposición del ARN a la degradación por el medio ambiente. Machine Translated by Google 20 ARTÍCULO EN PRENSA Walter Randazzo et al. (Fraisse et al., 2011; Lim, Kim y Ko, 2010; Tian, Yang, Quigley, Chou y Jiang, 2013). Muchos estudios han informado sobre la capacidad del cloro y los desinfectantes a base de cloro para inactivar el HNoV y sus sustitutos (Doultree, Druce, Birch, Bowden y Marshall, 1999; D'Souza y Su, 2010; Fraisse et al., 2011; Hirneisen & Kniel, 2013a; Lim et al., 2010; Tian et al., 2013) , mientras que hay menos información disponible sobre su aplicación en los productos agrícolas. Por ejemplo, se demostró que la infectividad de FCV­F9 se redujo en 2,9 log después de lavar las verduras de hoja con 200 ppm de cloro durante 2 minutos (Allwood, Malik, Hedberg y Goyal, 2004). Butot et al. (2008) exploraron la eficacia del lavado de diferentes tipos de bayas y verduras de hojas verdes con 200 ppm de cloro libre y demostraron que la infectividad de FCV­F9 se redujo a niveles indetectables. Además, la inactivación de HNoV varió según el tipo de alimento y el genotipo de HNoV, con una reducción máxima de más de 3 log para el IG de HNoV en arándanos, fresas y albahaca (Butot et al., 2008). Se informó que el lavado con hipoclorito de sodio a 200 mg/L durante 15 s redujo la infectividad de FCV­F9 en lechuga y chiles jalapeños en menos de 1,4 log UFP/mL y a niveles indetectables, respectivamente (Su & D'Souza, 2011) . La combinación de surfactantes (dodecilsulfato de sodio) y polisorbatos (Tween 20 a 50 ppm) junto con los lavados tradicionales con cloro (200 ppm), redujo la infectividad del MNV­1 en 3log PFU/mL después de 1 h en productos frescos (Predmore & Li , 2011). Las copias del genoma de HNoV GI se redujeron en 2,0 log en hojas enteras y lechuga romana picada después de lavados con cloro a 1,5 y 0,9 mgmin/L, respectivamente, mientras que se necesitaron concentraciones más altas para la inactivación de HNoV GII (Dunkin, Weng, Jacangelo y Schwab, 2017). Se demostró que el cloro libre a 33 y 189 ppm durante 1 min utilizando un ensayo PGM MB reduce la unión de HNoV en 1,4 y 4,1 log, respectivamente (Kingsley, Vincent, Meade, Watson y Fan, 2014). El dióxido de cloro se ha convertido en una alternativa al cloro, ya que su eficacia se ve poco afectada por la materia orgánica y el pH, y a 10 ppm durante 10 minutos podría inactivar FCV­F9 en menos de 1,5 log en frambuesas y perejil, y reducir las copias del genoma HNoV GI y GII por menos de 1 log (Butot et al., 2008). 5.4.2 Aerosoles electrostáticos/agua electrolizada El mecanismo exacto de acción antiviral del agua electrolizada (EOW) aún no está claro (Tian, Yang y Mandrell, 2011). Se demostró que el lavado ácido EOW aumenta la unión de HNoV a las frambuesas y la lechuga, provocando una eliminación de solo el 7,5 % y el 4 %, respectivamente (Kingsley & Chen, 2008). Un estudio reciente mostró que EOW neutral a 250 ppm de cloro disponible libre causó Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA Norovirus: la carga de lo desconocido 21 una reducción logarítmica de 4,8 y 0,4 en el número de copias del genoma de HNoV después de 1 minuto en suspensión y en acero inoxidable, respectivamente (Moorman, Montazeri y Jaykus, 2017). 5.4.3 Ozono El ozono se ha utilizado como un fuerte desinfectante contra microorganismos en el medio ambiente y en superficies que pueden destruir la proteína de la cápside y el genoma viral (Kim, Yousef y Dave, 1999). Hasta el momento, tres estudios han informado el efecto del ozono gaseoso en sustitutos de HNoV en matrices alimentarias (es decir, lechuga, frambuesas, fresas y cebollas verdes) ( Hirneisen, Markland y Kniel, 2011; Predmore, Sanglay, Li y Lee, 2015). Rociar las plantas de cebolla verde con ozono a 6,25 ppm durante 10 min redujo los títulos de MNV­1 en 2,0 log UFP/planta (Hirneisen et al., 2011). Además, 6,25 ppm de ozono durante 4 min redujeron la infectividad de FCV­F9 en más de 6 log TCID50/mL en agua y en 2 log TCID50/mL en lechuga y cebollas verdes (Hirneisen & Kniel, 2013b). También se obtuvo una inactivación comparable para MNV y TV en lechuga y fresas (Predmore, Sanglay, Li y Lee, 2015). Muy recientemente, se demostró que 3 ppm de ozono gaseoso durante 1 minuto reduce la infectividad de MNV­1 en más de 3,3 log en frambuesa fresca (Brie et al., 2018). 5.4.4 Ácidos/álcalis Los desinfectantes ácidos (como el ácido gálico y el ácido peroxiacético, PAA), así como los alcalinos, se han evaluado contra los HNoV o sus sustitutos cultivables (Cliver, 2009). Sin embargo, PAA a 195 ppm redujo la unión de HNoV en menos de 1 log (Kingsley et al., 2014) y a 250 mg/L redujo la infectividad de MNV­1 en 1 log en lechuga triturada, incluso en presencia de materia orgánica (Baert et al. ., 2009). Mientras que el lavado de la lechuga con un biocida basado en PAA (100 ppm) durante 2 min se informó que causaba una reducción logarítmica de 3,2 y 2,3 de FCV­F9 y MNV­1, respectivamente (Fraisse et al., 2011) . Se informó que el fosfato trisódico alcalino (TSP, pH 12) al 2 % después de 30 s reduce el FCV­F9 a niveles no detectables (Su et al., 2010), y cuando se aplica al 2 % y al 5 % durante 30 s en lechuga y pimientos redujo los títulos de MNV­1 en 3 log UFP/mL y hasta niveles indetectables, respectivamente (Su & D'Souza, 2011). Sin embargo, se deben considerar las desventajas potenciales de TSP para el medio ambiente. 5.4.5 Compuestos naturales La industria alimentaria se ve impulsada a buscar estrategias alternativas naturales para controlar los patógenos debido a la creciente demanda de los consumidores de productos etiquetados como "naturales" y "limpios". En esta medida, numerosos de origen vegetal y animal Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA 22 Walter Randazzo et al. los compuestos naturales se han probado contra sustitutos de HNoV (revisado por D'Souza, 2014; Li, Baert y Uyttendaele, 2013; Ryu et al., 2015; Seo y Choi, 2017), con solo unos pocos informes que han utilizado cepas de HNoV, es decir, extracto de semilla de uva (GSE), extracto de té verde (GTE) (Falco´ et al., 2018; Randazzo, Falco´, Aznar, & Sa´nchez, 2017), y ()­galato de epigalocatequina (Falco´ et al. ., 2017; Li et al., 2012) como se informó anteriormente (Sánchez et al., 2018) y se resume en la Tabla 3. Li, Baert y Uyttendaele (2013) y Li, Baert, et al. (2012) combinaron una RT­qPCR de unión a células con un ELISA de unión a saliva y demostraron el efecto antiviral de GSE en HNoV GII.4. Además, estudios recientes indicaron que las algas marinas son nuevas fuentes de compuestos bioactivos que mostraron actividad antiviral in vitro contra los sustitutos de HNoV (Choi et al., 2014; Eom et al., 2015). Al igual que con cualquier método de inactivación, las matrices alimentarias que incluyen proteínas y grasas disminuyeron la eficacia de los bioactivos y antimicrobianos al proteger o recubrir las partículas virales (Li, Baert, et al., 2012). El carvacrol y el jugo de frambuesa (Gilling, Kitajima, Torrey y Bright, 2014; Oh et al., 2012) mostraron actividad antiviral contra los sustitutos de HNoV. Los compuestos naturales que actúan como fotosensibilizadores incluyen la curcumina, un compuesto polifenólico extraído de los rizomas de la cúrcuma (Curcuma longa L.) que ha demostrado reducir la infectividad de FCV­F9 y MNV­1 en soluciones que usan inactivación fotodinámica (Randazzo, Aznar, & Sa´ nchez, 2016) y en ostras (Wu et al., 2015; y como se informó en Sanchez et al., 2018). Los pocos informes sobre su uso en aplicaciones alimentarias, como se mencionó anteriormente, se resumen en la Tabla 3. Por ejemplo, se informó que GSE es efectivo para disminuir los títulos de FCV­F9, MNV­1 y HAV en lechuga, chiles jalapeños, jugo de manzana y la leche (Joshi et al., 2015; Su & D'Souza, 2013) , así como el carvacrol, podrían reducir los niveles de MNV­1 y FCV­9 en la lechuga y el agua de lavado de (Sánchez, Aznar, & Sánchez, 2015). GTE también se ha aplicado con éxito para reducir los títulos de MNV­1 en hojas de lechuga y espinaca inoculadas (Randazzo et al., 2017) y en superficies en contacto con alimentos (Falco´ et al., 2018). Además, la mayor actividad antiviral de GTE se relacionó con el cambio en la cantidad de derivados de catequina, en función del pH y el tiempo de almacenamiento (Falco´ et al., 2018). Las mejoras en las eficiencias de encapsulación y/o liberación de bioactivos en los alimentos es una investigación necesaria (Go´mez­Mascaraque, Soler, & Lopez Rubio, 2016). 5.5 Polímeros antivirales para el envasado de alimentos Existe un interés creciente en la aplicación de recubrimientos y películas antimicrobianos en la industria alimentaria, motivado por el creciente consumo Machine Translated by Google Tabla 3 Efecto de los compuestos naturales contra sustitutos de norovirus y HNoV en aplicaciones alimentarias Natural Concentración y Inactivación Virus (Inicial Compuesto Concentración) Aplicación de Alimentos Extracto de aloe vera MNV (5 Lavado de repollo log PFU) Carvacrol FCV Agua de lavado de lechuga Condiciónes de la prueba (Reducción logarítmica) Referencia 1mg/mL a 25°C por 60min 0.8 Ng et al. (2017) 0,5 % a 37 °C durante 3.1 Sanchez, Aznar, and Sanchez (2015) EN ARTÍCULO PRENSA 2h (6 registro TCID50) 4.5 MNV (6 log TCID50) FCV Lavar la lechuga (4 registro TCID50) 1% a temperatura ambiente no detectable durante 30 min niveles 1.8 MNV (4 registro TCID50) Cinnamaldehído MNV (5 log Películas antimicrobianas 2,60 mg/cm2 a 37 TCID50) % de HR FCV Fabra et al. (2016) no detectable niveles (6 registro TCID50) Curcumina MNV (4 log PFU) 2.7 °C, ENCENDIDO, 100 ostras 20μM Fotoactivación 1.15 Wu et al. (2015) 0.4 Ng et al. (2017) 3,6 J/cm2, 0,06 W/cm2 durante 60 s Extracto de hoja de Eriobotrya MNV (5 log UFP) Lavado de repollo 1mg/mL a 25°C por 60min Continuado Machine Translated by Google Tabla 3 Efecto de los compuestos naturales contra sustitutos de norovirus y HNoV en aplicaciones alimentarias (continuación) Natural Concentración y Inactivación Virus (Inicial Compuesto Concentración) Aplicación de Alimentos Condiciónes de la prueba (Reducción logarítmica) Referencia Semilla de uva extracto HNoV GII.4 2mg/mL a 37°C por 60min 1.2 0,1% leche (7 log copias Le, Baert, et al. (2012) genómicas) 1.0 MNV (5 EN ARTÍCULO PRENSA log UFP) HNoV GII.4 (7 1.2 extracto de lechuga log copias genómicas) MNV no detectable (5 log UFP) niveles FCV Lavar la lechuga (7 log UFP) 0,25 y 1 mg/ml a TA durante 1 min 2,71; niveles no detectables MNV (5 log UFP) FCV (7 log UFP) lavado de pimientos 1 mg/ml a TA durante 5 min 1.09 0,25 y 1 mg/ml a TA durante 1 min 3,0; no detectable niveles MNV (5 log UFP) 1 mg/ml a TA durante 5 min 1.2 Su y D'Souza (2013) Machine Translated by Google FCV jugo de manzana (4 log UFP) 1mg/mL a 37°C 5min Niveles no detectables Joshi, Su y D'Souza (2015) 15min Niveles no detectables MNV (5 log UFP) FCV 2% de leche 4mg/mL a 37°C por 24 h 1.1 Películas de quitosano 5; 10; 15% a 23 °C durante 24 h 1,9; 3.2; 4.0 Amankwaah (2013) Películas comestibles de alginato 0,50 g extracto/g 1.0 EN ARTÍCULO PRENSA (5 log UFP) MNV (6 log UFP) MNV alginato a 37°C, ON (6 registro TCID50) 0,75 g extracto/g Fabra, Falco´, Randazzo, Sánchez, y López (2018) 1.7 alginato a 37°C, ON Extracto de té verde MNV (6 log UFP) lavar fresas 10 mg/mLa a TA durante 10 min 1.08 Lavar la lechuga 1.34 Lavar cebollas verdes 0.58 MNV Desinfección de inoxidable (6 registro TCID50) superficies de acero y vidrio 10 mg/ml a TA durante 30 min 1,79–3,46 VHA Niveles no (6 registro TCID50) detectables Martí, Ferrary­Américo, y Barard (2017) Randazzo et al. (2017) Continuado Machine Translated by Google Tabla 3 Efecto de los compuestos naturales contra sustitutos de norovirus y HNoV en aplicaciones alimentarias (continuación) Natural Concentración y Inactivación Virus (Inicial Compuesto Concentración) Aplicación de Alimentos Condiciónes de la prueba (Reducción logarítmica) Referencia 1,75–1,27 MNV Desinfección de superficies 5 mg/ml (24 h de (6 registro TCID50) de acero inoxidable y vidrio almacenamiento y pH 7,2) a TA durante 15 min VHA Falco´ et al. (2018) 1,92–1,54 (5 registro TCID50) EN ARTÍCULO PRENSA MNV Películas de quitosano (6 log UFP) MNV Películas comestibles de alginato (6 registro TCID50) 5; 10; 15% a 23 °C durante 24 h 1,6; 4,5; 4.2 Amankwaah (2013) 0,50 g extracto/g 2.0 Fabra et al. (2018) alginato para 37°C, ON 0,75 g extracto/g 1.9 alginato para 37°C, ON aPolyphenon 60, compuestos de GTE, con un mínimo del 60% de catequinas. TA: temperatura ambiente; ENCENDIDO: durante la noche; HR: humedad relativa; UFP: unidades formadoras de placa; TCID50: dosis infecciosa en cultivo tisular. Modificado de Sa´nchez, G., Randazzo, W., & D'Souza, DH (2018). Capítulo 10: Norovirus humanos. En D. Liu (Ed.), Manual de enfermedades transmitidas por los alimentos. Taylor y Francisco. Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA Norovirus: la carga de lo desconocido 27 demanda de alimentos seguros y estables. Se ha llevado a cabo una amplia investigación para incluir en la película o recubrimiento antimicrobianos como aceites esenciales y compuestos fenólicos. Sin embargo, aunque sus propiedades bactericidas y fungicidas han sido ampliamente investigadas, existe poca información disponible en la literatura sobre cómo los biopolímeros podrían actuar como portadores de compuestos antivirales. Como metales, se ha informado que las nanopartículas de plata (así como el cobre) muestran propiedades antivirales en películas a base de polihidroxialcanoatos (Castro Mayorga, Fabra Rovira, Cabedo Mas, Sa´nchez Moragas, & Lagaro´n Cabello, 2018; Castro­Mayorga et al. ., 2017; Warnes, Summersgill, & Keevil, 2015) y coloides híbridos magnéticos (Park et al., 2014). El único informe actual sobre aplicaciones alimentarias es que el uso de iones de plata al 1,0 % incorporados en películas de polilactida redujo el FCV­F9 a niveles no detectables en lechuga a 4 °C, sin ningún efecto antiviral significativo en paprika (Martı´nez­Abad, Ocio, Lagaro ´n, & Sánchez, 2013). Una de las estrategias más prometedoras es la inclusión de compuestos antivirales naturales dentro de los materiales de empaque o películas de recubrimiento. Como se resume en la Tabla 3, el cinamaldehído, el GTE y el GSE mostraron interesantes propiedades antivirales cuando se incluyeron en películas desarrolladas para el envasado de alimentos. 6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO La contaminación de alimentos por HNoV es un problema económico y de salud grave y creciente. Actualmente, sin tener un método de enrutamiento sólido de cultivo celular para evaluar la infectividad de HNoV en los alimentos, los procedimientos de RT­qPCR siguen siendo el estándar de oro para la detección y cuantificación de HNoV, incluso si estos procedimientos no pueden discriminar entre virus inactivados e infecciosos. Para superar esta limitación, se han evaluado diferentes estrategias para predecir la infectividad utilizando ensayos PGM basados en RT­PCR y el uso de tintes intercalantes en RT­PCR, que parecen ser herramientas prometedoras, especialmente para la discriminación de HNoV potencialmente infecciosos y no infecciosos en alimentos (Sánchez et al., 2018). Además, la adopción de estos procedimientos en el seguimiento rutinario permitirá una cuantificación más precisa del HNoV potencialmente infeccioso en los alimentos, lo que constituirá una herramienta útil para futuros estudios de evaluación de riesgos. Como se sugirió recientemente, la aplicación de secuenciación de próxima generación también es una tecnología prometedora tanto para la detección como para la identificación de secuencias de HNoV (Yang et al., 2017). Además, después de la identificación de la contaminación o como medida preventiva, es necesario aplicar medidas de descontaminación, saneamiento y control que sean eficaces contra los HNoV. Machine Translated by Google ARTÍCULO EN PRENSA 28 Walter Randazzo et al. Los estudios futuros deben buscar nuevos bioactivos y, especialmente, la eficacia de los compuestos naturales en los alimentos como aditivos antivirales y también en la aplicación relacionada con los alimentos como agentes desinfectantes que simulan escenarios prácticos en términos de diseño experimental. Con este mayor conocimiento de los HNoV, se puede mejorar la salud pública y la seguridad alimentaria. REFERENCIAS Aboubakr, HA, Williams, P., Gangal, U., Youssef, MM, El­Sohaimy, SAA, Bruggeman, PJ, et al. (2015). Efecto virucida del plasma gaseoso atmosférico frío sobre el calicivirus felino, un sustituto del norovirus humano. Microbiología aplicada y ambiental, 81(11), 3612–3622. https://doi.org/10.1128/AEM.00054­15. 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