CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL: CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA CURSO : DOCENTE : ESTUDIANTES: Microbiología Industrial Dr. Daladier Mayra Sharon Begazo Flores Gabriel Aly Jiménes Sucari TACNA – PERÚ 2016 [Escriba texto] Página 1 2012- 36100 2012- 36085 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA ÍNDICE CRECIMIENTO DE CELULAS (BIOMASA MICROBIANA) CRECIMIENTO RELACIONADO CON LA TEMPERATURA - Cada tipo microbiano tiene un óptimo de t o. - La to óptima de crecimiento con la de formación de producto no son necesariamente la misma. - La velocidad especifica de crecimiento se describe por el modelo de arrhenius: CRECIMIENTO RELACIONADO CON EL SUSTRATO - Relacionando al nutriente limitante según Monod: BIOMASA RELACIONADO CON DEGRADACIÓN DEL SUSTRATO Y FORMACIÓN DEL PRODUCTO: RENDIMIENTO DE BIOMASA PRODUCTIVIDAD: MEDIDA DE LA EFICIENCIA TOTAL DEL PROCESO [Escriba texto] Página 2 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA INTRODUCCIÓN Los microorganismos crecen en el espectro en variedad de entornos físicos y químicos, su crecimiento y otras actividades fisiológicas en el tacto de una respuesta, he aquí su entorno físico-químico. En la cinética de fermentación se describe el crecimiento y la formación del producto por los microorganismos, no sólo el crecimiento celular activo, sino también las actividades de descanso y la muerte de las células, ya que muchos productos de la fermentación de alto interés comercial son producidos tras el crecimiento que se ha detenido. CINÉTICA DE LA FERMENTACION DISCONTINUA [Escriba texto] Página 3 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA 1. LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA. Llamados también procesos “Bach” o lote, son de gran importancia dentro de la biotecnología y son de gran uso industrial. Las técnicas que se llevan a cabo, dependerá si el proceso es aerobio o anaerobio. “Un proceso discontinuo o “Bach” puede considerarse como un sistema cerrado. A tiempo cero, la solución esterilizada de nutrientes se inocula con microorganismos y se permite que se lleve a cabo la fermentación en condiciones óptimas. A lo largo de la fermentación no se adiciona nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La composición del medio, la concentración de sustrato, la concentración de biomasa y la concentración de metabolitos cambia continuamente como resultado del metabolismo de la célula”. Observándose las cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte. Mientras que en la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente del cultivo, con los microorganismos, se saca simultáneamente del sistema. En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios). 2. CRECIMIENTO DE CELULAS (BIOMASA MICROBIANA). Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al [Escriba texto] Página 4 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA crecimiento de un único microorganismo (ciclo celular) sino al demográfico de una población. Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria considerada de forma aislada. A lo largo del ciclo celular, tiene lugar la replicación del material de la bacteria, la síntesis de sus componentes celulares, el crecimiento para alcanzar un tamaño doble del inicial y su división por bipartición de la bacteria para dar lugar a dos células hijas. La duración del ciclo celular coincide con el tiempo de generación y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos. Este crecimiento suele ser asincrónico puesto que cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en una población se encuentran células que acaban de dividirse, otras que están replicando su ADN y elongándose, otras que están iniciando la división celular, etc. En un crecimiento sincrónico todas las células se encuentran simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrónicos son muy difíciles de mantener por lo que su importancia está principalmente ligada a los estudios básicos de biología microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrónicas. 2.1. Cinética del crecimiento microbiano. Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos porque es necesario poder predecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir consumiéndose el substrato y cómo se va a ir acumulando el producto de una fermentación. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, [Escriba texto] Página 5 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qué va a pasar, cuándo va a completarse el crecimiento, cómo se va a acumular el producto, etc. Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuanto han podido duplicar su masa y su material genético. El tiempo que tarda una célula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generación y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones óptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Cada vez que transcurre un tiempo de generación, el número de células se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial. Si llamamos No al número de células inicial, y g al número de generaciones transcurridas, el número de células final (N) será: N = N02g Llamando T al tiempo de generación y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuación anterior puede transformarse en la siguiente: N=N02t/T Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente, por ello es mejor transformarlas en algo más simple, como puede ser una recta. Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los dos términos y resulta: LnN = LnN0 + 1/T ln2 [Escriba texto] Página 6 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generación T es muy grande, el crecimiento tendrá poca pendiente (será lento) y si T es pequeño el crecimiento será rápido. En un crecimiento equilibrado, todos los parámetros de crecimiento evolucionan en paralelo. Esto es: el incremento en el número de células, en la biomasa de cultivo y en la acumulación de metabolitos primarios, proteínas, ácidos nucleicos etc., es paralelo. Por tanto, en la ecuación anterior N puede representar cualquiera de estos factores. Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que describe la cinética es la siguiente: dN/dt=uN Esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al número de células presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionalidad (µ) se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo así como la probabilidad de que una célula se divida en un tiempo determinado. Integrando la ecuación anterior durante el tiempo de cultivo, se transforma en la siguiente función exponencial: N=N0eut La transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente: LnN = LnN0 + ut [Escriba texto] Página 7 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad µ. Comparando esta ecuación con la similar presentada más arriba, podemos concluir que µ = ln2/T y, por consiguiente, que T = ln2/µ. Es decir, que hay una correlación inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo de generación. Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa celular, etc. después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento µ a partir de medidas experimentales del incremento en el número de células, biomasa, etc. 2.2. Fases del crecimiento de un cultivo El estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito denominado cultivo batch o podríamos traducirlo por cutivo discontinuo por contraposición con el cultivo continuo. El desarrollo de un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la siguiente figura: Figura 01. Fases del crecimiento. [Escriba texto] Página 8 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Fuente: Google imágenes Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: a. La fase lag o de adaptación. En la que el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) y pone en marcha su maquinaria metabólica para poder crecer activamente. La duración de esta fase es variable y en general es mayor cuanto más grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. b. La fase exponencial. En ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio. c. La fase estacionaria. En la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sino que la aparición de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales. d. La fase de muerte. En la que el número de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una constante k que depende de diferentes circunstancias. [Escriba texto] Página 9 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA En la fase de muerte decimos que el número de microorganismos vivos disminuye exponencialmente. Pero ¿qué es un microorganismo vivo en términos microbiológicos? Consideramos vivo al microorganismo que puede multiplicarse (dividirse), y muerto al que ha perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este concepto porque los microorganismos microbiológicamente muertos no tienen por qué estar metabólicamente inactivos. 3. FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN AL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS. Una vez visto cómo podemos seguir la evolución de un cultivo, vamos a recordar que en un proceso de crecimiento equilibrado todos los parámetros del cultivo evolucionan manteniendo unas proporciones constantes. Por tanto, la medida (seguimiento) de cualquiera de los factores nos permite seguir la evolución de los otros. ¿Qué factores ambientales influyen en el crecimiento microbiano? A continuación vamos a revisar los que son estrictamente ambientales y más adelante revisaremos los relacionados con los nutrientes del cultivo. Entre los factores ambientales destacan los siguientes: 3.1. CRECIMIENTO RELACIONADO CON LA TEMPERATURA Cada tipo microbiano tiene un óptimo de To. Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si consideramos la variación de la velocidad de crecimiento (µ) en función de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mínima por debajo de la cual no hay crecimiento (dX/dt = 0); a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que µ es máxima. Por [Escriba texto] Página 10 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA encima de esta temperatura óptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente (µ → 0) y se produce la muerte celular. El incremento de µ con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura. Se denomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura. En términos generales, la velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar. La ausencia de crecimiento (µ=0) a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de crecimiento y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos (algo parecido a la precipitación del aceite a bajas temperaturas) impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas. Es importante tener en cuenta que a temperaturas muy bajas, el metabolismo celular es muy bajo y las células paran de crecer; aunque no tienen por qué comenzar a morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamente y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío. Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimiento mínima, máxima y óptima. Tipo de microorganismo T° mínima T° óptima T° máxima Psicrófilo -5 +5 12 - 15 15 - 20 Psicrótrofo -5 +5 25 - 30 30 - 35 Mesófilo 5 - 15 30 - 45 35 - 47 Termófilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90 [Escriba texto] Página 11 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Además de los indicados existen organismos hipertermófilos que pueden crecer a temperaturas cercanas o incluso superiores a 100ºC en condiciones de alta presión. Son microorganismos muy importantes desde el punto de vista ambiental; pero no tienen aplicaciones actuales en agronomía o en microbiología industrial. Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 - 8ºC) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35ºC). Los microorganismos deben ser cultivados a la temperatura adecuada para que su crecimiento sea el deseado. En cualquier caso, hay que tener en cuenta los problemas derivados de las altas temperaturas y controlar la de los fermentadores para evitar la esterilización de los cultivos. Estas altas temperaturas, por otro lado, tienen interés aplicado en el campo de la termodestrucción de microorganismos y en algunos procesos de fermentación en los que el incremento de temperatura que se produce es capaz de eliminar los microorganismos mesófilos patógenos presentes. La to óptima de crecimiento con la de formación de producto no son necesariamente la misma. Ningún proceso químico o físico-químico es ajeno a la influencia de la temperatura a la que se realiza; tan sólo varía la magnitud de este efecto en cada caso. Como en todas las fermentaciones, se dan distintos procesos bien diferenciados pero estrechamente relacionados. Entre ellos, el mayor [Escriba texto] Página 12 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA interés cuantitativo lo ostentan el desarrollo de los microorganismos y la formación de producto como consecuencia del metabolismo de los mismos. A su vez, ambos procesos son la consecuencia global de procesos parciales cuya dependencia con la temperatura no es necesariamente la misma. La temperatura óptima del proceso depende especialmente de la composición de la materia prima empleada, en particular de la concentración total o grado total de la misma. Por ejemplo, la fermentación de vinos o substratos alcohólicos de elevada concentración requiere el empleo de temperaturas de fermentación más bajas. La velocidad especifica de crecimiento se describe por el modelo de Arrhenius: Cuando el modelo de Arrhenius es empleado para evaluar el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano, entonces k se transforma en la velocidad de crecimiento específico (Ross y McMeekin, 1994; Giannuzzi et al., 1998), y la ecuación de Arrhenius puede escribirse como: u Ae ( Eo ) RT Dónde: A= constante de Arrhenius Eo= energia de activacion (Cal/mol) R= constante de los gases (1,98 Cal/mol ok) T = temperatura absoluta (ok) NOTA: La energía de activación - Para el crecimiento está entre 15-20 Kcal/mol Para la muerte microbiana esta entre 60-70 Kcal/mol [Escriba texto] Página 13 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Sin embargo, el crecimiento bacteriano es complejo y las extrapolaciones de las gráficas pueden no mostrar linealidad, por lo tanto, la ecuación anterior no puede encajar muy bien por debajo de los datos óptimos o por encima de las temperaturas de crecimiento. Entonces, las gráficas obtenidas solo sirven para predecir el crecimiento microbiano en un limitado rango de temperatura (McDonald y Sun, 1999; La buza y Fu, 1993). Así la ecuación que ha sido utilizada mayoritariamente para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano es el modelo de la raíz cuadrara propuesto por Ratkowsky et al., en 1982 (Giannuzzi et al., 1998; Neumeyer et al., 1997; Willocx et al., 1993; Adair et al., 1989) √u = g + (T – T0) Importancia de los microorganismos de ambientes extremos. La mayor parte de los microorganismos de importancia aplicada tanto en microbiología industrial como alimetaria son mesófilos, psicrófilos o psicrótrofos. En los procesos de compostaje, el papel de los termófilos es importante, y también hay que conisderar la presencia de esporas termorresistentes en el estudio de los tratamientos térmicos de termodestrucción de microorganismos en alimentos. Sin embargo, es creciente el número de productos que se producen partiendo de microorganismos termófilos porque producen proteínas termorresistentes que tienen gran utilidad en procesos aplicados. Quizá el mejor ejemplo de esto es la ADN polimerasa Taq obtenida a partir de la eubacteria termófila Thermus aquaticus. Esta enzima permite sintetizar in vitro ADN a alta temperatura lo que ha sido esencial para el desarrollo de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (conocida por sus iniciales en inglés: PCR) lo cual ha supuesto un avance en la biología molecular, el diagnóstico y la detección de microorganismos en los ambientes más variados. [Escriba texto] Página 14 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relativa (HR). El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en una disolución saturada de sal común (NaCl) donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la solvatación de los iones de la sal disuelta. En este último caso, la actividad de agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada. La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes: bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw >0.80. Como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (mucho más secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias. En función de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halófilos y [Escriba texto] Página 15 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA xerófilos según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente. La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. La utilización de almíbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano. El pH: Es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo sólo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica. El pH interno en la mayoría de los microorganismos está en el rango de 6.0 a 7.0. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, también, distintos. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcaló- filos que toleran pH=10.0 Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. Así, por ejemplo, las bacterias lácticas que producen grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y las lácticas se convierten en la población dominante. La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico, acético, láctico) por ciertas bacterias. En este sentido, hay que tener en cuenta que la acción [Escriba texto] Página 16 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA bactericida de estos ácidos orgánicos de cadena corta es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que producen. Esto es, los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por sí mismos. El efecto letal del pH ácido sobre los microorganismos tiene aplicación en la conservación de alimentos acidificándolos. De esta forma, la adición de ácido acético en forma de vinagre permite la conservación de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo) y la producción de ácidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo). Potencial Redox: nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar electrones, esto es: sus características oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque no el único, es la concentración de oxígeno [O2]. Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para que se produzca el crecimiento. En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo. Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entéricas, o como Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lácticas) o cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios). Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxígeno (anaerobios) que, sin embargo, llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de electrones que actúa como oxidante ambiental. Por ejemplo, [Escriba texto] Página 17 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA las bacterias que "respiran" nitratos (NO3 - ), sulfatos (SO4 2-) u otros compuestos orgánicos oxidados (respiración anaerobia). Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de oxígeno, no son capaces de utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermentativo (las bacterias lácticas que son anaerobias aerotolerantes, por ejemplo). Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo. Esto es: en presencia de oxígeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia, fermentativo. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el de los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando. En el curso de ciertas reacciones metabólicas redox se forman compuestos altamente reactivos (radicales libres, formas superóxido) que pueden dañar las proteínas, membranas y ácidos nucleicos produciendo la muerte de las células. Las células se defienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes: Superóxido dismutasa (SOD) y catalasa. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno. La detección de estas enzimas tiene valor taxonómico. 3.2. CRECIMIENTO RELACIONADO CON EL SUSTRATO. El gráfico siguiente representa la variación de la biomasa (o número de células, etc.) de un cultivo (línea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya concentración (línea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. [Escriba texto] Página 18 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Fuente: Google imágenes Esta relación de proporcionalidad puede expresarse de la forma siguiente: dN/dt = - Ys (dS/dt) Donde: dS indica la variación de la concentración del substrato. Al valor Ys lo denominamos rendimiento de utilización del substrato, ya que mide la cantidad de biomasa que puede producirse por unidad de substrato consumido: Ys = dN/dS (8) El rendimiento de utilización de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos, o alimentos, que "engordan" más que otros), varía entre diferentes microorganismos (en un símil antropomórfico: hay personas que engordan más que otras comiendo lo mismo) y varía también en función de otras condiciones ambientales o fisiológicas (no engorda lo mismo uno al comer algo si está sano o enfermo o si está en verano o en invierno). También varía el rendimiento en función de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo (estos conceptos serán revisados más adelante). [Escriba texto] Página 19 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Podemos calcular el rendimiento de la utilización del substrato en función de la cantidad de substrato añadido al cultivo, o en función de la cantidad de carbono presente en ese substrato. Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total en gramos de células, o de carbono presente en las células (aproximadamente el 50% de la masa celular corresponde a carbono). Haciendo las transformaciones que se indican a continuación sobre la fórmula que relaciona la variación de biomasa con la de substrato (8), llegamos a la definición de un nuevo concepto qs denominado tasa específica de consumo de substrato por el organismo. Ys = dN/dS (ecuación 8) dN/dt = Ys (dS/dt) (ecuación 9) (dN/dt)/N = Ys (dS/dt)/N (ecuación 10) Como, de acuerdo con la ecuación (5), µ = (dN/dt)/N, (ecuación 11) Esto es, la tasa específica de consumo de substrato (qs), la podemos considerar la "velocidad" con la que el organismo consume el substrato. Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor será la tasa de crecimiento (µ). qs = Ys/µ (ecuación 12) Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, también mayor será la tasa de crecimiento. [Escriba texto] Página 20 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Sin embargo, hay una cierta compensación entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimiento más bajo (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el rendimiento disminuye). A esta relación inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur. Por último, nos falta relacionar la tasa de crecimiento (µ) con la concentración de substrato (S). En condiciones de substrato abundante, la concentración de este no afecta al valor de µ; pero cuando el substrato se hace limitante, sí existe ese efecto. La expresión matemática que relaciona ambos parámetros se conoce con el nombre de ecuación de Monod y es la siguiente: µ = µmax [S/(Ks+S)] (ecuación 13) En esta ecuación la tasa de crecimiento (µ) depende de la máxima que puede alcanzar el microorganismo (µmax), de la concentración de substrato (S) y de un valor constante, Ks, que representa la concentración de substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la máxima. La ecuación de Monod tendrá mucha importancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuación el rendimiento debe ser independiente de la concentración de substrato. En la práctica, los valores de Ks suelen ser muy bajos, lo que indica que los microorganismos crecen con tasas (µ) muy próximas a las máximas (µmax) a concentraciones de substrato bajas y sólo cuando estas son extremadamente bajas, la velocidad de crecimiento se reduce. Esto es debido a que los sistemas de transporte de nutrientes suelen tener valores de Km considerablemente reducidos (La Km indica la concentración de substrato a la que la velocidad de transporte es la mitad de la máxima) [Escriba texto] Página 21 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA 4. BIOMASA RELACIONADO CON DEGRADACIÓN DEL SUSTRATO Y FORMACIÓN DEL PRODUCTO: En un sistema de operación discontinua la condición fundamental de flujo es: E = 0 = S. “El flujo de entrada y el flujo de salida son cero: F1 = 0 = F2” Durante la fermentación discontinua o en lote, la composición del medio de cultivo, la concentración de microorganismos (concentración de la biomasa), la composición química interna de los microorganismos, y la cantidad de la proteína "target" o del metabolito, todas cambian como una consecuencia del estado de crecimiento celular, el metabolismo celular y la disponibilidad de nutrientes. Bajo estas condiciones, se observan usualmente seis fases de crecimiento: fase lag, fase de aceleración, fase logarítmica o exponencial, fase de desaceleración, fase estacionaria y fase de muerte. Durante la fase logarítmica de crecimiento, la masa celular sufre varias duplicaciones y la velocidad de crecimiento específica del cultivo (µ) permanece constante. Cuando hay exceso de sustrato (suplemento de nutrientes) y no hay inhibición del crecimiento, la velocidad de crecimiento específica es independiente del sustrato. [Escriba texto] Página 22 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA En este caso, la velocidad de incremento de la biomasa celular con el tiempo, dX/dt, es el producto de la velocidad de crecimiento específico, µ, y de la concentración de la biomasa, X: dX/dt = µX La velocidad de crecimiento específico, µ, es una función de la concentración del substrato limitante (por ej., la fuente de carbono o de nitrógeno) S, de la velocidad de crecimiento específica máxima, µmax, y de una constante específica de sustrato Ks. Ambas S y Ks son expresadas en términos de concentración, por ej. en gramos o moles por litro. µ = µmax [S/(Ks+S)] ds dt Sustrato consumido dP dt uX Y ( x / s) qpX Y ( p / s) Crecimiento Producto Acumulado Síntesis de producto q pX Síntesis de Producto S: Concentración de sustrato (g/l) t: Tiempo u: Velocidad especifica de crecimiento(h-1) X: Concentración Celular (g/l) [Escriba texto] Página 23 mX Mantenimiento CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA 5. RENDIMIENTO DE BIOMASA: La concentración de biomasa por unidad de tiempo es: x – XR = γs (SR – s) Dónde: x = concentración celular en un tiempo t XR = inóculo o concentración celular inicial γ = rendimiento para el substrato limitante (g de biomasa por g de substrato consumido) s = concentración de substrato en el tiempo t SR = concentración inicial de medio Ys = dN/dS μ = (dN/dt)/N (dN/dt)/N = Ys (dS/dt)/N μ = Ys qs «tasa específica de consumo de substrato» Figura. Curva de la variación de la biomasa en relación con el sustrato. 6. PRODUCTIVIDAD : MEDIDA DE LA EFICIENCIA TOTAL DEL PROCESO [Escriba texto] Página 24 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA La productividad se define como la producción de biomasa por unidad de volumen, por unidad de tiempo del cultivo, dado en concentración de biomasa (g/L) en función del tiempo (h). Esta depende del diseño del fermentador, ya que afecta la transferencia de oxígeno que se ve reflejada en el rendimiento obtenido al final de la fermentación (Quinteros, 1981). Un microorganismo adecuado para su utilización industrial debe producir la sustancia de interés, pero hay muchos otros aspectos a considerar. Es preciso disponer del organismo en cultivo axénico (puro), debe ser genéticamente estable, y debe crecer en cultivo a gran escala (Stanbury et al., 1995). Por otra parte el volumen de cultivo variará en el tiempo según sean F1 y F2. Suponiendo que la densidad del cultivo y de la alimentación son iguales resulta: Ahora bien, dependiendo de cómo sean F1 y F2 surgen, básicamente, tres sistemas de cultivo, de los cuales veamos al modelo discontinuo: Ambos caudales son nulos por lo que V es constante y en la ecuación anterior se anulan los términos F1Ci1, F2Ci. La duración del cultivo batch es, por supuesto, también limitada en el tiempo y depende esencialmente de las condiciones iniciales del cultivo. Una vez inoculado el medio, la concentración de biomasa aumenta a expensas de los nutrientes y cuando el sustrato que limita el crecimiento se agota, finaliza el batch. El cultivo tipo "batch", si bien es quizás el más difundido, es el que menos posibilidades de control ofrece. Una vez sembrado el medio de cultivo y fijada la temperatura, las células quedan "libradas a su propia suerte" o, dicho de otro modo, a su propia potencialidad, que se manifiesta creciendo a la máxima velocidad que le permite el medio de cultivo empleado, siendo el operador un [Escriba texto] Página 25 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA mero espectador de los acontecimientos. En este aspecto tanto el cultivo continuo como el "batch" alimentado superan ampliamente al "batch". En fermentaciones es llamada productividad volumétrica. Se expresa en gramos de producto por litro y hora. P Xf 1 Xf ln td tr t l um Xo 1 Xf t ln td tr t l um Xo td: Tiempo de descarga del fermentador(h) tr: tiempo de recarga del fermentador(h) tl: tiempo que dura la fase de latencia (h) um: velocidad máxima de crecimiento (h-1) Xo: Concentración inicial de células (g/l) BIBLIOGRAFÍA [Escriba texto] Página 26 Xf t CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Microbiología Industrial. José Merchuk. 2006. Desarrollo de Modelos Cinéticos para Bioprocesos. Alarcón Martín. 1999. https://www.academia.edu/992792/Aplicaci%C3%B3n_de_la_Microbiolog %C3%ADa_Predictiva_en_la_determinaci%C3%B3n_de_la_vida_ %C3%BAtil_de_los_alimentos http://blog.espol.edu.ec/grakavas/files/2012/01/Microbiolog%C3%ADaPredictiva_Parte11.pdf http://www.unavarra.es/genmic/micind-2-2.htm http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.%20Cultivo%20de %20microorganismos.pdf https://microagroalimunvime.wikispaces.com/file/view/Microbiologia_Industri al_Libro.pdf BIOMASA RELACIONADO CON DEGRADACIÓN DEL SUSTRATO Y FORMACIÓN DEL PRODUCTO [Escriba texto] Página 27 CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN DISCONTINUA Positivo. Es un método clásico. Bien conocido. Instalaciones simples Negativo. Mala utilización de los medios materiales y humanos [Escriba texto] Página 28
