1. MARCO TEÓRICO. 1.1 Generalidades y aspectos importantes de los hongos asociados a alimentos. Los hongos son microorganismos eucarióticos (tienen el núcleo rodeado por una membrana) unicelulares o pluricelulares que no forman tejidos y sus células se agrupan formando un cuerpo filamentoso muy ramificado. El conjunto de filamentos de un hongo se llama micelio. Los hongos tienen alimentación heterótrofa, puesto que no pueden realizar la fotosíntesis porque no tienen clorofila. Su forma de reproducción puede ser asexual, por esporas, y sexual. Pueden tener forma redonda, ovalada o en forma de fibras. Las fibras pueden formar un entramado o red, visible a simple vista, como por ejemplo los mohos en los alimentos. Por su modo de vida, los hongos pueden ser: a) Hongos saprofitos. Como el champiñón o la trufa, que se alimentan de sustancias en descomposición. b) Hongos parásitos. Que se alimentan de los líquidos internos de otros seres vivos. c) Hongos simbióticos. Que se asocian con otros organismos para beneficiarse mutuamente. Los hongos viven en lugares húmedos, con abundante materia orgánica en descomposición y en ausencia de luz solar. Son capaces de crecer en condiciones extremas y llegar a formar micotoxinas. 1.1.1 Morfología. A partir de las esporas o células reproductoras, se desarrolla una agrupación celular en forma de filamentos llamados hifas, que se agrupan formando el micelio o cuerpo vegetativo. El micelio se desarrolla de forma radial, colonizando el sustrato de forma superficial o por el interior, tomando distintos aspectos: algodonoso, seco, húmedo, etc. y distintas coloraciones. Son hongos formados por una serie de ramas tubulares llamadas hifas (Fig. 1), el conjunto de las cuales forman el micelio. Se reproducen por la formación de esporas, las cuales pueden ser pigmentadas y le dan el color al hongo. Al centro de la colonia se ubican las hifas fértiles que dan origen a las esporas, razón por la cual los hongos son más coloreados en esa zona. 1.1.2 Características. Los mohos invaden con rapidez cualquier sustrato, gracias a su eficacia en la diseminación, a un crecimiento rápido y a que poseen una rica carga enzimática. La mayoría de los mohos se desarrollan entre 15 y 30 °C con un óptimo de crecimiento alrededor de 20-25 °C, sin embargo, algunas especies presentan un crecimiento lento, aunque significativo incluso a -6 °C, se pueden encontrar por tanto en los almacenes frigoríficos. Los mohos resisten temperaturas muy bajas, sus esporas sobreviven y permanecen aptas para germinar cuando se recuperan las condiciones normales. Así mismo, las esporas pueden también sobrevivir a temperaturas muy elevadas. En los túneles de secado puede existir una microflora fúngica muy abundante, en la que predominan las especies termófilas o resistentes al calor. Ciertos mohos termófilos se comportan como agentes térmicos: Aspergillus candidus, bastante común en granos, puede hacer subir espontáneamente la temperatura de un silo hasta 55 °C, entre estas especies se encuentran las que son potencialmente patógenas para el hombre o los animales. La humedad tiene una gran influencia sobre el desarrollo de los mohos, pero el parámetro más importante es la actividad de agua (aw). La mayoría de ellos se desarrollan a una aw de 0,80 a 0,95. La cantidad de oxígeno disponible es también un factor importante en el desarrollo de los mohos, la mayoría son aerobios, aunque algunos soportan una anaerobiosis muy estricta. No son demasiado exigentes en cuanto a pH. Los mohos se encuentran principalmente en los cereales y sus derivados, en los productos lácteos, en las carnes y los productos cárnicos, en las oleaginosas, las frutas y hortalizas, en los frutos secos, las confituras y en las bebidas. 1.1.3 Reproducción. Todos los hongos se reproducen mediante esporas (Fig. 2). Estas pueden originarse mediante procesos sexuales o asexuales, se dispersan gracias a la incidencia del viento, el agua, los animales, etc. y germinan con condiciones ambientales favorables; primero formando hifas y luego desarrollando micelios. Por otro lado, el talo de los hongos puede ser holocárpico o eucárpico. a) Talos holocárpicos: tienen la capacidad de convertirse completamente en una estructura reproductiva, impidiendo que las fases somáticas y reproductivas coexistan en un mismo momento e individuo. b) Talos eucárpicos: tienen estructuras reproductivas diferenciadas que permiten que las fases somática y reproductiva coexistan. Aunque se reproducen por tres medios: A partir de un trozo de micelio. No es corriente en la naturaleza, se da en cultivos industriales. a) Por esporas asexuales. Es la forma de reproducción más frecuente en los mohos de interés en microbiología de los alimentos. b) Por esporas sexuales. Se producen por la fusión de dos hifas compatibles. c) Ascosporas: encerradas en el asca, normalmente en número de ocho. d) Zigosporas: protegidas por una fuerte pared. 1.1.4 Micotoxinas. Las micotoxinas son sustancias venenosas producidas por algunos hongos que se encuentran mayormente en las siembras de granos y en nueces, pero también pueden ser encontradas en el apio, jugo de uvas, manzanas y en otras frutas y vegetales. Existen muchos de ellos y científicos continuamente descubren hongos nuevos. La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) estima que un 25% de las cosechas a nivel mundial son afectadas por las micotoxinas, de las cuales las aflatoxinas son las más notorias (2018). Son metabolitos tóxicos elaborados por mohos en los alimentos. La ingestión de estos alimentos, si la sustancia tóxica está en cantidad suficiente, provoca una intoxicación en el hombre y en los animales. No todos los mohos elaboran micotoxinas ni todos son toxinogénicos. De las casi doscientas especies consideradas toxinogénicas, existen cepas que producen micotoxinas y cepas que no las producen o las producen en muy poca cantidad. 1.1.5 Aflatoxinas. Aflatoxina es un veneno que causa cáncer de hígado producido por ciertos hongos dentro o encima de los alimentos y de los alimentos para animales, especialmente en las siembras de maíz (Fig. 3) y maní, semilla de algodón y frutos secos (Cascara dura de nueces). Las aflatoxinas son producidas principalmente por Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus, los cuales son abundantes en las zonas cálidas y húmedas del planeta. Los hongos que producen aflatoxinas pueden contaminar los cultivos en los campos, durante la cosecha o durante el almacenamiento (2018). Muchos países regulan y vigilan la presencia de aflatoxinas en los suministros usados para alimentos dirigido a humanos y animales y así tratar de limitar la exposición a ellas. 1.2 Géneros o especies importantes involucradas. 1.2.1 Género Aspergillus. Estos causan el deterioro de muchos productos alimenticios, entre ellos se puede mencionar el maíz, sorgo, trigo, arroz, semillas oleaginosas (soja, cacahuate, girasol y algodón, las especias (cúrcuma, jengibre, pimienta negra), Nueces de árbol como el pistacho, almendras, y nuez de Brasil, en sus coloraciones suelen tornarse de un color verdoso, con matiz amarillento y rojizo en sus esporas. Ejemplo de ello, están las especies: 1.2.1.1 Especie Aspergillus niger. Este es un hongo que crece en colonias desarrolladas rápidamente y fáciles de detectar. Cuentan con un aspecto polvoriento, se puede observar un micelio blanco cuando están jóvenes y a medida se desarrolla se torna como un negro oscuro, hasta marrón oscuro, Observándose en el microscopio, este tiene un conidióforo liso con textura granular ligera, tiene bastantes conidios de aspecto variable, globosas, elípticas, verrugosas (Fig. 4-B). produce en moho negro en vegetales como la lechuga y acelga, este comienza a actuar principalmente durante el almacenamiento y transporte de cultivos. Cuando este hongo afectas a las plantaciones, el Aspergillus niger comienza a demostrarse en forma de moho negro. Como en el caso de la cebolla, por ejemplo, cada capa de la cebolla puede almacenar diferentes grupos de esporas y las capas que terminan siendo mas afectas presentan un aspecto acuoso, y con el pasar de los días ya se observa la proliferación de esporas de color negro (Fig. 4-A) (2018). 1.2.1.2 Especie Aspergillus flavus. El género Aspergillus (Fig. 5-B) por lo general se caracteriza por ser microorganismos anamorfos deuteromicetes, ya solo se reproducen de forma asexual . Este un hongo patógeno, productor de micotoxinas, contaminante de cultivos y productos alimenticios. Este se desarrolla sobre granos de cereales como maíz (Fig. 5-A), arroz y maní, produciendo sustancias toxicas como las hepatotóxicas y aflatoxinas carcinógenas. Las colonias pueden variar de aspecto, ya que se pueden observar granulares, lanosas o pulverulentas. El color puede varias, ya que al principio suelen ser amarillentas, después tonos amarillos-verdosos y con el paso del tiempo un tono más oscuro como marrón. Al reverso pueden ser incoloros o con un tono café amarillento. 1.2.2 Género Penicillium. Este es un hongo filamentoso, causante de perdidas en cosechas y, por otro lado, en los alimentos se les introducen esporas de este, utilizando los mohos de una manera segura para el consumo humano, que forma parte del proceso de producción de ellos. Algunas especies de este genero son: 1.2.2.1 Especie Penicillium roqueforti. Se caracteriza por la presencia de mohos en tonos azulados (Figu. 6), este moho trabaja en conjunto con los cultivos lácticos para la maduración del queso, transformando su sabor y apariencia, usado para la fabricación de los llamados quesos azules como el roquefort, cabrales o el valdeón y danish blue. 1.2.2.2 Especie Penicillium camemberti. Caracterizado por ser un moho blanco particularmente utilizado en la superficie de los quesos para pastas, como, por ejemplo: Camembert y brie. Este presenta diferentes formas, aterciopelado, larga y otra más densa). Es influenciado por el Ph, se desarrolla entre un 4,08,0, generalmente es un halotolerante. 1.2.3 Género Geotrichum. Es un hongo encontrado en suelos, aguas, aire, plantas y cereales, se encuentra enmarcado dentro de los agentes externos que pueden dar lugar a la degradación, podredumbre, malos olores y pérdida de sabor en los productos, con el daño económico que ello implica para los cultivadores. De este género existe una especie que afecta a los alimentos, esta es: 1.2.3.1 Especie Geotrichum candidum. Es un hongo que puede afectar a frutas y verduras durante la postcosecha, ya que está asociada con pudriciones liquidas y ácidas, que especialmente afectan a los tomates (Fig. 8), cítricos y zanahorias cultivados en el campo y que son destinados para la industria, produciendo lesiones que evolucionan rápidamente sobre los frutos maduros, cuya epidermis suele romperse y provoca así que el jugo fluya. el olor acido característico se da porque refleja un pH relativamente bajo de la pulpa de la fruta, siendo un 4 en la escala. 1.2.4 Género Alternaria. Este es un hongo filamentoso, donde se incluyen numerosas especies saprofitas, endofíticas y patógenas (Fig. 9) ampliamente distribuidas en el suelo y la materia orgánica en descomposición, que contamina principalmente trigo, sorgo y cebada, asi como las semillas oleaginosas como pepas de girasol, frutas y vegetales, ya que, por las micotoxinas producidas por las especies de hongos de alternaria, producen enfermedades en diversos cultivos. Las toxinas constituyen un peligro de seguridad alimentaria, ya que además de causar daños en cultivos algunas de las micotoxinas producidas por este género de hongos son genotóxicas. Las micotoxinas de Alternaría. Se han aislado de frutas (manzana, pera, melón, albaricoque, uvas, uvas pasas, fresa, aceituna, cítricos e higos desecados), hortalizas (tomate, pimiento y zanahoria) (Fig. 9) y tubérculos (patata), así como de numerosos alimentos procesados elaborados con materias primas contaminadas (zumos, conservas, salsas, etc.). La presencia de micotoxinas de Alternaria en cereales es muy común, debido al almacenamiento de los granos en condiciones favorables para el crecimiento del moho. 1.2.5 Género Rhizopus. Este hongo actúa principalmente en frutas de hueso, como la fresa, melón, melocotón y cítricos. Posee esporangióforos no ramificados de aproximadamente 2 mm de largo por 0 μm de espesor (Fig. 10). Esta especie presenta un rizoide muy amplio y abundantes zigosporas. Estas últimas son estructuras de forma esférica, pared celular gruesa y lisa, de 200 μm de diámetro aproximadamente. Entre sus características morfológicas más llamativas destaca su rápido crecimiento. Su cultivo en laboratorio cubre totalmente la placa en solo tres días a 25º C. La estructura que presenta la colonia es de aspecto firme, de micelio aéreo denso y algodonoso, siendo de un tono blanquecino inicialmente, pasando a tonos grisáceos, rojizos o marrones. Su rápido y alto desarrollo se ve favorecido en parte por la presencia de estolones, los cuales aportan una estructura área que soporta el crecimiento del micelio. Así, el hongo ocupa rápidamente grandes superficies, ya sea en posición horizontal o vertical (2019). Una de las especies que afecta a cultivos y pan es: 1.2.5.1 Especie Rhizopus stolonifer. Este hongo se compone de esporangios columnares hemiséricos aéreos, anclados por rizoides. Conocido como ‘’Moho negro del pan’’ ya que suele aparecer en el pan duro. Además de provocar pudriciones liquidas en varias plantas especialmente en el momento de la cosecha y durante el almacenamiento, teniendo similitudes con algunas pudriciones causadas por bacterias. Se reporta que alrededor del mundo es responsable de la pudrición en la fruta, como lo son el melón principalmente, además, del pepino, calabacín y calabaza (Fig. 10). 1.2.6 Género Thamnidium. El Thamnidium, es un hongo filamentoso que se caracteriza por propagarse asexualmente mediante esporangios situados en los extremos de esporangióforos (Fig. 11). 1.2.6.1 Especie Thamnidium elegans. Es considerada la especie más importante en este género, este genera ramificaciones laterales del esporangióforo que da lugar a esporangiolos de menor tamaño. Este se encuentra en lo que son las carnes conservadas, siendo productor de cantidades elevadas de ácido linolénico. Responsable del envejecimiento de las carnes conservadas, este se puede hacer de forma húmeda o seca. Durante el envejecimiento en seco existe una restricción del crecimiento bacteriano, promoviendo el crecimiento de Thamnidium, manifestándose como manchas pálidas grisáceas filamentosas que se desarrollan sobre las partes grasas de la carne envejecida. El desarrollo de este libera proteasas y enzimas colagenolíticas que digieren el músculo y tejidos conectivos dando como resultado el ablandamiento y el cambio de su sabor. El crecimiento de este hongo puede empezarse a desarrollar en las primeras tres semanas después del envejecimiento. La carne ya envejecida debe procesarse justo antes de su distribución (2016). 1.2.7 Género Zygosaccharomyces. La presencia de levaduras del género Zygosaccharomyces en el vino puede convertirse en un serio problema para la bodega. Debido a su osmotolerancia y a su elevada resistencia a conservantes convencionales, pueden alcanzar niveles de contaminación elevados a partir de poblaciones iniciales muy bajas y causar alteraciones en el vino una vez embotellado (exceso de CO2, turbidez, sedimentos, etc.). La detección e identificación es un punto clave para la prevención y control en bodega de esta levadura. La limpieza y desinfección de las instalaciones, junto con una adecuada filtración, permitirán asegurar la calidad del producto, evitando así las posibles pérdidas económicas que puedan derivarse de vinos defectuosos. (2009). 1.2.7.1 Especie Zygosaccharomyces rouxii. Este es un microorganismo alterante de mayor impacto en los productos alimentarios, que se incluye en el grupo de las levaduras osmotolerantes u osmófilas, ya que es capaz de crecer en ambientes con alto contenido en solutos, ya sean azúcares, como la fructosa, glucosa o sacarosa, pero también implicando a productos ricos en distintas sales. Es aislada de las materias primas que dan lugar a los productos que posteriormente consumimos. Es decir, en muchos casos ya vienen con ellas, habiéndose detectado por ejemplo en distintos vegetales, frutas y mieles (2020). 1.2.8 Género Kluyveromyces. Esta es una levadura en ciernes, y este es el modo más común de reproducción vegetativa. Las levaduras en ciernes se reproducen desarrollando células hijas en comparación con las levaduras de fisión, para las que existe una división relativamente igual de una célula para formar dos células. Los brotes surgen en cualquier sitio de la célula madre, un proceso que está regulado por una serie de genes que son responsables de la producción de enzimas que dan lugar a nuevo material de pared celular. Las células pueden parecer cadenas ramificadas cuando los brotes no se separan (2018). Tiene capacidad de utilizar lactosa, esta es una de las razones por la que se utiliza como huésped de procesos biotecnológicos. 1.2.8.1 Especie Kluyveromyces marxianus. Esta levadura es de importancia industrial y biotecnológica, ya que, tiene capacidad de producir enzimas b-galactosidasa e inulinasa, que permiten el uso de la lactosa e inulina como fuente de carbón, Silva (2013). Esta levadura posee la capacidad de crecer y reproducirse a temperaturas de hasta 44°C aproximadamente, siendo esta una propiedad de importancia industrial, ya que permite realizar fermentaciones a altas temperaturas, lo que reduce costos por enfriamiento, además, de que previene el crecimiento de microorganismos contaminantes. Siendo un competidor con las levaduras tradicionales, también se utiliza comercialmente para producir la enzima lactasa y como agente aglutinante para piensos y alimentos para mascotas. 1.3 Daños o perjuicios ocasionados por dichos microorganismos y mecanismos para prevenir o controlar esos perjuicios. La presencia de hongos en alimentos que no deben de contenerlos, indica que el alimento ha empezado a fermentarse, un proceso que va acompañado de un cambio de: a) Apariencia (empieza a aparecer un recubrimiento velloso o filamentoso, formando una capa de color negro, azul, verde o blanco). b) Textura (comienza la descomposición del alimento y la textura tiende a ablandarse). c) Aroma del alimento (la descomposición genera aromas que percibimos como desagradables). En algunos casos, los hongos pueden producir micotoxinas y aflatoxinas, que se tratan de productos que generan los hongos con efectos tóxicos y nocivos para la salud. Las aflatoxinas se producen de forma natural en frutos secos, cereales y arroz en condiciones de humedad y temperaturas elevadas, sobre todo durante el proceso de almacenamiento. Esta micotoxina es dañina y tiene capacidad para causar enfermedad hepática. Como es estable al calor, su eliminación es muy complicada (2019). 3.3.1 Micotoxinas frecuentes en los alimentos. Los efectos de algunas micotoxinas presentes en los alimentos se manifiestan rápidamente tras el consumo de los productos contaminados. Otras se han relacionado con efectos a largo plazo, tales como el cáncer y la inmunodeficiencia. De los varios cientos de micotoxinas identificadas hasta ahora, unas doce han llamado más la atención debido a sus efectos graves en el ser humano y su frecuencia en los alimentos, FAO (2018). a) Las aflatoxinas, producidas por los mohos Aspergillus flavus y A. parasiticus que crecen en el suelo, la vegetación en descomposición, el heno y los cereales, se encuentran entre las micotoxinas más tóxicas. Los cultivos que resultan más afectados por Aspergillus, son los cereales, las semillas oleaginosas, las especias. Asimismo, pueden encontrarse en forma de aflatoxina M1 en la leche de animales alimentados con comida contaminada. Grandes dosis de aflatoxinas pueden producir toxicidad aguda (aflatoxicosis), que puede ser mortal, generalmente por lesiones hepáticas. También se ha demostrado que las aflatoxinas dañan el ADN (genotoxicidad) y causan cáncer en diferentes especies animales. También hay evidencia de que causan cáncer de hígado en humanos, FAO (2018). b) La ocratoxina A, producida por varias especies de Aspergillus y Penicillium, es una micotoxina común que contamina en todo el mundo alimentos como los cereales y sus productos, los granos de café, las pasas, el vino y el jugo de uva, las especias y el regaliz. La ocratoxina A se forma durante el almacenamiento de los cultivos y se sabe que causa una serie de efectos tóxicos en diferentes especies animales, FAO (2018). c) La patulina, es una micotoxina producida por distintos mohos, especialmente Aspergillus, Penicillium y Byssochlamys. A menudo se encuentra en manzanas podridas y productos de manzana, pero también puede aparecer en varias frutas enmohecidas, granos y otros alimentos. Las principales fuentes dietéticas humanas de patulina son las manzanas y el jugo de manzanas afectadas. Los síntomas agudos en animales incluyen daño al hígado, bazo y riñón, y toxicidad para el sistema inmunitario. En el ser humano se han descrito náuseas, trastornos gastrointestinales y vómitos. Se considera que la patulina es genotóxica, pero aún no se ha demostrado su potencial cancerígeno, FAO (2018). 3.3.2 Métodos de prevención de contaminación de hongos. a) Al servir los alimentos, mantenerlos cubiertos para prevenir el exponerlos a las esporas de hongos en el aire. Usar una envoltura de plástico para cubrir los alimentos que se mantengan húmedos, como las frutas y vegetales frescos o picados y ensaladas de vegetales verdes y mixtos. b) Vaciar las latas abiertas de alimentos perecederos en envases limpios y refrigerados inmediatamente. c) No dejar ningún alimento perecedero fuera del refrigerador por más de 2 horas. d) Utilizar los sobrantes de comida dentro de 3 a 4 días para que el hongo no tenga oportunidad de crecer. e) Realizar una inspección de los cereales enteros (maíz, sorgo, trigo y arroz), higos secos y nueces (cacahuete, pistacho, almendra, nuez, coco, nueces de Brasil y avellanas), que están frecuentemente contaminados con aflatoxinas, para detectar la presencia de mohos, y descartar los que tengan un aspecto mohoso, descolorado o marchito 3.4 Técnicas microbiológicas para la identificación, estudio y reconocimiento de los microorganismos involucrados en laboratorio. Se realizan ciertos procesos para determinar la contaminación fúngica de los alimentos y de las superficies alimentarias, estos puedes dividirse en métodos tradicionales que se basan en técnicas microscópicas en recuentos de placas de agar u membranas y técnicas basadas en el número más probable. Las técnicas basadas en recuentos de agar en placas poseen una desventaja, que es la demora al momento de obtener resultados, ya que tiene un tiempo recomendado que va entre 7 a 3 días, debido a esto, se han desarrollado técnicas rápidas que resultaron ser eficaces para la detección de hongos (mohos y levaduras). Destacandose el analisis microscopico usando tinciones selectivas que indican estado vital, la citometría de flujo, la detección de metabolitos o constituyentes celulares producidos por los hongos que no estan presentes en el alimento, tecnicas de impedancia, tecnicas enzimaticas, tecnicas de detección inmonulógica de hongos que se basan en anticuerpos especificos de un hongo o un tipo de ellos y la detección de fracciones de ADN y ARN que son especificas para cada genero y especie. Beuchat et Cousin (2002). El desarrollo de estos metodos ha sido a consecuencia de la adaptacion a los previamente utilizados para bacterias, considerando, que en dicha adaptacion deben de tomarse en cuenta condiciones especificas de cada hongo, con el proposito de detectarlos e identificarlos.
