Manual de Prácticas del Laboratorio de Fisiología de la Reproducción Dr. Pablo Luna Nevárez 1 INTRODUCCIÓN La elaboración de este manual, pretende proporcionar al estudiante de Medicina Veterinaria y Zootecnia un conocimiento más amplio de la Fisiología de la Reproducción, con la finalidad de complementar en forma eficiente sus conocimientos teórico-prácticos de esta importante área de la producción animal. La base de la Fisiología de la Reproducción incluye principalmente la Endocrinología, la cual estudia la interacción entre los sistemas nervioso y endócrino, incluyendo este último a las hormonas, quienes juegan un papel preponderante ya que actúan sobre todos los órganos del aparato reproductor de los animales, induciendo diferentes respuestas fisiológicas que mantienen activa la función reproductiva. De aquí la importancia de la realización de prácticas de laboratorio, ya que en ellas se estudia la estructura del tracto reproductor y el efecto de las hormonas sobre el mismo, así como la fisiología de los diferentes eventos reproductivos de los animales domésticos. Sin embargo, es de suma importancia la adecuada comprensión del fundamento teórico y la metodología de cada una de las prácticas contenidas en este manual, para poder realizarlas en forma eficiente. Solamente así, será posible el cumplimiento de los objetivos específicos de cada una de las prácticas, lo que al final contribuirá a satisfacer el objetivo básico para el cual fue elaborado este manual. La información completa que se incluye en este manual, es producto del esfuerzo realizado por los autores en base al conocimiento y experiencia adquiridos en la práctica de la Fisiología de la Reproducción, tratando mediante ello de mantener al alumno a la vanguardia de los adelantos tecnológicos que surgen día con día, para lo cual es también de gran importancia que el alumno complemente su información, con la contenida en revistas científicas actualizadas, lo cual además de ampliar su información, le permitirá establecer un criterio personal para la aplicación de las nuevas tecnologías reproductivas en beneficio de la producción animal. 2 INDICE 3 PRÁCTICA No. 1 “ESTRUCTURA MACROSCÓPICA DEL APARATO REPRODUCTOR DE LA HEMBRA” OBJETIVO Inspeccionar el aparato reproductor de la hembra en las distintas especies de animales domésticos, identificando la estructura macroscópica externa e interna de cada uno de los órganos que lo integran y reconociendo las diferencias existentes entre especies. FUNDAMENTO TEÓRICO En términos generales, el sistema reproductor de la hembra consiste en dos ovarios (órganos primarios), dos oviductos, útero, vagina y genitales externos. Los órganos anteriores se encuentran suspendidos en la cavidad abdominal por el ligamento ancho, el cual se subdivide en: mesovario, que sostiene a los ovarios; mesosalpinx, que sostiene a los oviductos y mesometrio que sostiene al útero. Fig. 1. Esquema de la posición anatómica de los órganos reproductivos de las hembras domésticas (Fuente: UNAM, 2009). Ovarios: 1. Funciones. Básicamente las funciones son de dos tipos: exócrina (producción de óvulos) y endócrina (producción de hormonas como estrógenos, progesterona, relaxina, inhbina, entre otras). 4 2. Forma y Tamaño. El ovario de la vaca es ovoidal y ligeramente aplanado. Mide alrededor de 30 a 40 mm x 20 a 30 mm x 10 a 20 mm, y su tamaño depende en gran parte del estadío del ciclo reproductivo. 3. Sostén. El ligamento ancho sostiene al aparato reproductor. El mesovario es la porción craneal y consta de un pliegue del peritoneo que se origina sobre las paredes laterales de la cavidad pélvica y se fija al hilio ovárico. El ovario permanece en su sitio gracias al ligamento propio, el cual es parte del ligamento ancho. Las arterias, venas, linfáticos y nervios del ovario, se localizan en estos ligamentos. 4. Estructura. El oviducto está formado por tres porciones que son las siguientes: a) Infundíbulo. Es la porción terminal del oviducto y está destinada a recibir al óvulo después de la ovulación. La delgada membrana terminal se denomina borde fimbriado del oviducto. Por lo general, esta porción se encuentra muy cercana al ovario y casi parece englobarlo dentro de la delgada membrana, aunque éste se encuentre fijo en el interior de la bolsa ovárica. b) Ámpula. El infundíbulo forma una estructura semejante a un embudo a medida que penetra hacia la porción tubular del oviducto, esta región recibe el nombre de “ámpula”. Es conducto para el óvulo y en este sitio se lleva a cabo la fecundación. c) Istmo. Este segmento se enrolla en dirección craneal, medial y finalmente lateral antes de unirse al útero. El diámetro es bastante uniforme en toda su longitud y el tubo está embebido en el mesosalpinx. Útero: 1. Funciones. El útero funciona como un conducto que transporta en forma activa el semen hacia el oviducto después de la cópula; asimismo, se transforma en incubadora para el feto en desarrollo. En el primer proceso, secreta líquidos que bañan al semen y se contrae para favorecer el transporte; en el segundo proceso, aporta nutrientes al embrión antes de que éste se fije en sus paredes. Al momento del parto, el útero se contrae para la expulsión del feto. 2. Sostén. Los ligamentos anchos se fijan dorsolateralmente en la cavidad pélvica, y dorsalmente en la cavidad peritoneal. La porción fija al borde lateral de los cuernos y el cuerpo, recibe el nombre de “mesometrio”. La presencia de fibras musculares en los ligamentos suspensorios, indica un papel activo de éstos en el acomodamiento y desplazamiento del útero. El ligamento redondo se encuentra en los pliegues laterales del mesometrio y ayuda a mantener al útero en su lugar. 3. Estructura. El útero de la vaca está situado en la porción craneal respecto a la abertura pélvica, con el cuello sobre la cavidad pélvica. El útero se encuentra al nivel del piso de la pelvis y se dobla hacia abajo en su porción craneal. El útero de la vaca es bipartido (dos partes); el cuerpo mide 3 cm y cada cuerno mide 40 cm de longitud. El diámetro de cada cuerno, en la porción intermedia es de 3 cm, pero la estructura se estrecha a medida que se aproxima el oviducto. El revestimiento peritoneal del cuerpo del útero, hace que éste parezca mucho más largo de lo que es. Los ligamentos intercornuales unen ambos cuernos en la región del cuerpo. Los cuerpos están orientados en dirección craneal y hacen una inflexión en tanto pasan ventral, caudal y dorsalmente, sostenidos por el ligamento ancho. 5 La pared interna del útero está revestida por pliegues longitudinales; encima y por dentro de los mismos, se observan muchas prominencias redondeadas que se denominan “carúnculas”, estas estructuras sirven como punto de fijación de la placenta durante la preñez, para llevar a cabo el intercambio de nutrientes y desechos orgánicos del producto. Existen aproximadamente unas 150 estructuras, distribuidas en forma irregular en los cuernos y el cuerpo del útero; miden de 10 a 15 mm de diámetro en la vaca no preñada. Cérvix: 1. Funciones. El cérvix actúa como pasaje para los espermatozoides después de la cópula, asimismo secreta cierta cantidad de moco para lubricar. Durante la fase lútea del ciclo estral y durante la preñez, el cérvix produce un tipo de moco gelatinoso para proteger al útero llamado “tapón cervical”. Otra función importante del cérvix es que sirve como pasaje del feto al momento del parto. 2. Estructura. El cérvix o cuello uterino es una porción firme del aparato reproductor si se le compara con el útero por un lado y con la vagina por el otro. Es de muy fácil localización mediante la técnica de palpación rectal, y se le utiliza como punto de referencia para la localización del aparato reproductor. El cervix de la vaca a la palpación es muy semejante al pescuezo de un pollo o de un pavo desplumado. Mide alrededor de 8 cm de largo y 2 cm de diámetro. Los cuernos uterinos de las vaquillas jóvenes son mucho más pequeños que los de las vacas adultas. Las vacas que poseen algo de sangre cebú, suelen tener un cuello de mayor tamaño que las de tipo Europeo, no es raro palpar cuellos de 15 cm de longitud y 6 de diámetro. El cuello uterino presenta pliegues longitudinales internos, que forman de 3 a 4 bordes prominentes que se sitúan uno detrás de otro, o contribuyen a un espiral irregular. Por lo general, se dice que las protuberancias tienen una configuración anular. Los bordes se inclinan en dirección caudal, como si su función fuera impedir la entrada de cualquier tipo de material extraño hacia el útero. El piso de las criptas está revestido por células secretoras. El segmento craneal del cérvix se fusiona en forma gradual para integrarse al cuerpo del útero; el cuello uterino, en su segmento caudal, penetra hacia la vagina y forma una depresión circular, el fornix, alrededor de la entrada cervical. La os del cuello uterino tiene el aspecto de una roseta. Vagina: 1. Función. Recibe al pene durante la cópula; además secreta pequeñas cantidades de moco que sirven como lubricante al momento de la penetración. La vagina es una continuación de la uretra y sirve como pasaje del feto durante el nacimiento. 2. Estructura. La vagina de las vacas se extiende desde el cérvix hasta un punto situado en posición craneal, respecto al orificio de la uretra; mide aproximadamente 30 cm de longitud. Sus paredes son musculares y por lo general están colapsadas. El órgano está recubierto por el peritoneo, el cual forma en posición dorsal el “saco recto-vaginal”, que permite la penetración a través de la pared cráneo-dorsal de la vagina, hacia la cavidad 6 del peritoneo. Esto es importante porque se pueden realizar diferentes técnicas como son la ovariectomía, inseminación y transplante de embriones. La porción craneal de la vagina forma un fornix profundo (1 cm) alrededor del segmento intravaginal del cuello uterino. Esta área en ciertas ocasiones representa un problema para algunos inseminadores, ya que el catéter no penetra por la os del cuello uterino quedando detenido en el fondo del fornix, obligando al inseminador a sacar un poco el catéter para realinearlo con la os cervical. El extremo caudal de la vagina es el sitio donde se encuentra el himen (membrana); éste consta de un anillo de tejido de cicatrización, que se forma en las paredes en el punto de unión de la vagina y el vestíbulo, y es el vestigio de una pared tisular que en el embrión en desarrollo separaba las estructuras internas y externas. Por lo general, el himen está degenerado. El vestíbulo es el punto donde se encuentra el himen y se extiende hacia los labios vulvares. Es llamada zona urogenital, ya que forma parte de ambos sistemas. En el piso de la porción craneal del vestíbulo, se encuentra el divertículo suburetral. Este saco ciego mide 2 cm de longitud y 2 de profundidad. La abertura de la uretra se localiza también en el piso del vestíbulo inmediatamente por delante del divertículo suburetral. La función se esta estructura es desconocida, lo único cierto es que le causa problemas a algunos inseminadores. Las paredes del vestíbulo contienen glándulas vestibulares, las cuales se abren al exterior en una porción caudo-lateral respecto al orificio de la uretra. El vestíbulo actúa como entrada y pasaje hacia la vagina, y las glándulas lo lubrican durante la cópula y el parto. Vulva: 1. Función. Representa el órgano más externo del aparato reproductor de la hembra que permite la entrada del pene durante la cópula. 2. Estructura. La vulva integra los genitales externos de la hembra. La vaca presenta un labio en cada lado, equivalentes a los labios menores de la mujer. Ambos labios se reúnen por la parte ventral y forman una comisura, que está cubierta por vellosidades finas de los labios y pelo grueso en la base. Al separarse la comisura ventral, se puede observar el glande y el clítoris. El clítoris es homólogo al pene del macho (proviene de la misma estructura embrionaria). E/cuello clitorial se encuentra en el piso de la vulva y sólo se observa el glande, cubierto por un pequeño saco prepucial. El clítoris no se considera un órgano estimulador en la vaca; no obstante, investigaciones recientes afirman que el masaje clitorial esta relacionado con la tasa de concepción mediante inseminación artificial. MATERIAL Y EQUIPO 1. De Laboratorio: Un estuche de disecciones por equipo Una navaja para bisturí por equipo Un par de guantes para palpación por alumno Un paquete de papel sanita por equipo 7 2. Biológico: Un tracto reproductor completo de vaca Un tracto reproductor completo de cerda Un tracto reproductor completo de yegua Un tracto reproductor completo de perra Un tracto reproductor completo de ovino o caprino METODOLOGÍA Una vez expuestos los tractos reproductores de las diferentes especies domésticas sobre las mesas, se procederá a extenderlos para colocarlos en posición similar a la que se presenta in vivo. Posteriormente, se realizará una inspección detallada de cada uno de los órganos que integran el aparato reproductor para identificar las estructuras macroscópicas externas e internas, observando al mismo tiempo las diferencias entre las distintas especies evaluadas, para lo cual se utilizarán guantes de palpación. Se seguirá el orden que se describe a continuación: 1. Ovarios: a) Folículos (terciarios y maduros). b) Cuerpo hemorrágico. c) Cuerpo lúteo. d) Cuerpo albicans. e) Mesovario. 2. Oviductos: a) Fimbria o infundíbulo. b) Ámpula. c) Istmo. d) Mesosalpinx. 3. Útero: a) Cuernos. b) Cuerpo. c) Mesometrio. 4. Cervix: a) Consistencia externa. b) Anillos cervicales internos. c) Vagina: d) Vagina anterior. e) Vestíbulo vaginal. f) Vulva: g) Labios vulvares. h) Clítoris. 8 OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES Realice sus observaciones, anote sus resultados y haga sus conclusiones. Coloca los nombres de las partes del aparato reproductor de la cerda Fig. 2 Tracto Reproductor de la Cerda 9 CUESTIONARIO 1. ¿Por qué a los ovarios se les denomina “órganos primarios” del aparato reproductor? 2. Esquematice el ligamento que sostiene las diferentes partes del tracto reproductor de la hembra. 3. Explique detalladamente las funciones que tiene el oviducto. 4. ¿En qué parte del oviducto se lleva a cabo la fecundación y cómo se lleva a cabo? 5. Describa detalladamente las funciones del útero (cuerpo y cuernos). 6. ¿Por qué se le llama al útero el órgano de la gestación? 7. Explique claramente ¿cuáles son las funciones del cervix? 8. ¿Qué función tiene el cuerpo lúteo y cuándo cesa su función? 9. Explique detalladamente ¿cuáles son las funciones de la vagina y la vulva? 10. ¿En qué consiste el proceso de capacitación espermática y dónde se lleva a cabo dentro del tracto reproductor de la hembra? 10 BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM. 11 PRÁCTICA No. 2 “ESTRUCTURA MACROSCÓPICA DEL APARATO REPRODUCTOR DEL MACHO” OBJETIVO Inspeccionar el aparato reproductor del macho en las distintas especies de animales domésticos, identificando la estructura macroscópica externa e interna de cada uno de los órganos que lo integran y reconociendo las diferencias existentes entre especies. FUNDAMENTO TEÓRICO Los órganos genitales masculinos incluyen en su formación a los testículos como glándulas sexuales primarias; epidídimo y conductos deferentes, como conductos espermáticos; próstata, glándulas vesiculares y bulbouretrales como glándulas sexuales accesorias; el pene como órgano copulador con la uretra como conducto urogenital; y el prepucio y el escroto, como órganos de recubrimiento externo. Fig. 3. Esquema de la posición anatómica de los órganos reproductivos de los machos domésticos (Fuente: UNAM, 2009). Testículos: 1. Funciones. Las funciones principales de estos órganos son: 1) producir hormonas, principalmente andrógenos (función endócrina), y 2) producir espermatozoides (función exócrina). 2. Estructuras. Cada testículo está recubierto por una capa de tejido conectivo lustroso y resistente denominada túnica vaginal visceral, que deriva del peritoneo a medida que 12 descienden los testículos y cuya función es sostenerlos. Inmediatamente por debajo de esta capa se encuentra la túnica albugínea, que también sostienen a los testículos; se trata de una cápsula de tejido conectivo que envuelve a los tortuosos vasos sanguíneos de la superficie testicular. Los séptulos testiculares son cordones de tejido conectivo que se originan en la capa anterior y la fijan al mediastino, que es un núcleo de tejido conectivo de los testículos. Este retículo sostiene en su lugar los tubos seminíferos y las células intersticiales, a la vez que confiere a los testículos su forma y consistencia características. La mayor parte de los testículos está compuesta por tubos seminíferos y células interesticiales (o de Leydig). Los primeros producen los espermatozoides y las segundas se encuentran dispersas entre los tubos seminíferos y su función es secretar la testosterona. Los espermatozoides pasan de los tubos seminíferos hacia una trama de tubos colectores denominada rete testis, estas estructuras se localizan en el mediastino y recogen los espermatozoides a medida que estos salen de los tubos seminíferos. Seguidamente, las células espermáticas pasan hacia los conductos eferentes que son un grupo de aproximadamente 15 túbulos, que llevan a los espermatozoides desde el testículo hasta otro tubo colector que es el epidídimo. Epidídimo: 1. Funciones. El epidídimo tiene cuatro funciones principales: 1) sirve como lugar de maduración espermática; 2) actúa como pasaje espermático que comunica a los conductos eferentes con el conducto deferente; 3) concentra a los espermatozoides ya que al paso de estos se absorbe una parte del líquido; y 4) sirve como área de almacenamiento. 2. Estructuras. El epidídimo consta de tres partes no muy bien delimitadas, que se entrelazan en los puntos de contacto. La cabeza del epidídimo envuelve el tercio dorsal del testículo y recibe los espermatozoides provenientes de los tubos eferentes que desembocan en uno solo de forma espiralada. El epidídimo forma la abultada cabeza de este último, y luego continúa en el cuerpo, que se localiza sobre el testículo pero, hacia la porción ventral. Conforme el conducto alcanza la región ventral del testículo, se vuelve espiralado otra vez formando la prominente cola del epidídimo. Conducto Deferente: 1. Estructura y Funciones: Esta estructura, larga y tubular, se conecta con la cola del epidídimo y pasa dorsalmente a lo largo del lado mediano del testículo, en posición craneal respecto al epidídimo, para continuar dentro del cordón espermático a través de los anillos inguinales. Posteriormente, penetra en la cavidad del cuerpo, pasa sobre la vejiga urinaria y desemboca en la uretra. El conducto deferente actúa como pasaje del esperma durante la eyaculación. Sus paredes musculares efectúan contracciones peristálticas que se inician en la cola del epidídimo y se desplazan con rapidez hasta la uretra, impulsando un chorro esperma hacia ésta y luego al exterior. La porción terminal de los conductos deferentes poseen paredes engrosadas y cuenta con varias glándulas, estas regiones son las ámpulas de los conductos deferentes las que en ocasiones se les denomina ductos eyaculatorios. 13 Cordón Espermático: Esta estructura, similar a un cordón, se encuentra por encima del testículo y contiene muchos otros elementos: fibras musculo liso, el plexo pampiniforme, nervios, vasos linfáticos y el conducto deferente. El cordón pasa a través de los anillos inguinales superficiales por los músculos abdominales oblicuos externos y penetra en la cavidad abdominal a través del anillo inguinal profundo, integrado por varios músculos. - Músculo Cremáster. Es continuación de la musculatura abdominal y se fija en la túnica vaginal visceral. Su función es elevar los testículos y junto con la túnica dartos, ayuda a mantener la temperatura testicular constante. El cremáster envuelve al cordón espermático y cuando es incapaz de sostener al testículo, permite que éste se asiente en el pico del escroto. - Plexo Pampiniforme. Es una red de vasos sanguíneos que se localiza en el cordón espermático, entre el testículo y el anillo inguinal superficial. La vena testicular está muy espiralada en esta región y forma una estructura reticular alrededor de la arteria testicular. La sangre fría de la red venosa disminuye la temperatura de la sangre arterial que ingresa y de este modo contribuye a mantener el mecanismo termorregulador de los músculos dartos y cremáster. Escroto: Envolviendo a los testículos se encuentra el escroto que es una cubierta de piel gruesa y pilosa. Un tabique intermedio divide al escroto en dos compartimientos, uno para cada testículo. Asimismo, el escroto forma parte del mecanismo termorregulador que permite mantener los testículos a una temperatura óptima para la espermatogénesis que debe ser de alrededor de 5 ºC por debajo de la temperatura corporal. - Túnica Dartos. Sobre la pared interna del tercio ventral, a la mitad de cada saco escrotal, se encuentra una estructura laminar denominada túnica dartos, que está integrada por músculo liso y tejido conectivo elástico. Esta se contrae cuando hace frío para arrugar el escroto y acercar los testículos al cuerpo, con lo cual los entibia, y por el contrario se relaja cuando hace calor y así permite que los testículos pendan lejos de la temperatura del cuerpo. Asimismo, los músculos dartoides se contraen para proteger a los testículos cuando el animal está en tensión, cuando va a correr y cuando se pelea. El desarrollo de estos músculos está determinado por los andrógenos, ya que no se desarrollan en animales castrados. Glándulas Sexuales Accesorias: 1. Glándulas Vesiculares. Son glándulas secretoras pares, situadas en posición dorsal respecto a la vejiga urinaria y se encuentran junto a las ámpulas de los conductos deferentes. En el toro son lobuladas, miden 12 x 3 cm y su aspecto es similar a un racimo de uvas cubiertas por una membrana. La superficie ondulante de la glándula se debe a pliegues de los segmentos glandulares tubulares que la constituyen. Su actividad secretora es muy intensa, ya que producen alrededor del 90 % del volumen del eyaculado total del toro y desembocan en la porción craneal de la uretra como dos orificios en la superficie del colículo seminal. 14 2. Próstata. Se encuentra en posición caudal con respecto a las glándulas vesiculares y envolviendo a la uretra. Esta secreta el líquido resbaloso que limpia y lubrica la uretra a la vez que aumenta ligeramente el volumen seminal. Existen muchas aberturas de la próstata hacia la uretra por debajo de la glándula y a lo largo del conducto, en dirección caudal, hacia la región de las glándulas bulbouretrales a medida que éstas penetran a partir de la porción diseminada de la glándula. 3. Glándulas Bulbouretrales. Por debajo de la porción terminal o caudal del recto se encuentra un músculo prominente, el bulboesponjoso (bulbocavernoso). Este recubre la uretra a medida que ésta cambia su posición del plano horizontal para correr ventralmente por debajo del ano. En el lugar inferior del borde craneal de dicho músculo, se encuentra dos glándulas accesorias de forma esferoidal, las bulbouretrales que miden alrededor de 3 cm de diámetro. Pene: La raíz del pene se localiza en la región del músculo bulboesponjoso. El tejido conectivo forma 3 áreas esponjosas: una que envuelve a la uretra (el bulbo del pene) y las otras dos laterales (la crura penis). Las cruras se juntan por debajo del músculo bulboesponjoso para formar el cuerpo cavernoso del pene, que está recubierto por una capa muy resistente de tejido conectivo blanco, la túnica albugínea. El toro tiene un pene tipo fibroelástico, lo que significa que es muy fibroso y cuenta con cierta elasticidad. Dada su estructura, el tamaño del pene durante la erección varía muy poco tanto en diámetro como en longitud. A medida que se sigue el pene en dirección ventral, éste forma una curva en forma de “S” o flexura sigmoidea. La función de este segmento de unos 25 cm de largo es doblarse cuando el pene está relajado, lo que permite retraerlo y mantenerlo protegido. Durante la erección, la flexura se endereza y el pene se extiende para llevar a cabo la cópula. El músculo retractor del pene, es un músculo par que se contrae durante el reposo y se relaja durante el período de excitación sexual. Estos músculos se fijan en la región de la última vértebra sacra, en la extremidad superior y sobre la cara ventral interna del pene, en posición craneal respecto a la flexura sigmoidea. El cuerpo del pene continúa entre las piernas pasando por los cordones espermáticos y forma la porción libre peneana, cuya porción terminal, de consistencia más blanda, se denomina glande. En la base del segmento libre del pene se encuentra fijo el prepucio, que lo envuelve relajado y lo cubre parcialmente después de la protrusión. La textura más suave del glande es resultado de una menor cantidad de tejido conectivo y de un menor ensanchamiento que en el cuerpo. El glande y la porción libre del toro miden 10 cm de longitud. Uretra: 1. Uretra Pélvica. Esta porción de uretra está revestida por un músculo esquelético capaz de continuar la ola de contracción eyaculativa. Alberga al colículo seminal de la uretra craneodorsal y recibe las secreciones de las glándulas vesiculares y el esperma proveniente de las ámpulas. Además, las aberturas de los conductos prostáticos vacían su contenido en esta sección de la uretra antes y durante la eyaculación. 15 2. Uretra Peneana. Tiene la misma estructura que la pélvica y penetra entre las ramas peneanas en el curso ventral del pene, siguiéndola hasta el glande, donde termina en el orificio externo de la uretra. Esta porción uretral se encuentra rodeada por el cuerpo esponjoso y cuerpo cavernoso de la uretra, que a pesar de tener una fina estructura posee la misma constitución que el cuerpo cavernoso del pene. Prepucio: El prepucio está formado por una capa externa de piel recubierta de pelos y una capa interna que envuelve la parte libre del pene. Esta última es un tejido blando, doblado, que debe permanecer por dentro hasta la extensión del pene. Las glándulas prepuciales secretan hacia la superficie y mantienen esa área lubricada. La presencia de los músculos prepuciales, craneal y caudal, permite al prepucio un cierto movimiento. Por lo general, éste y la porción libre del pene están adheridos en el neonato, pero con el continuo crecimiento y la proliferación celular en esa área, se separan gradualmente. El prepucio se convierte en una cubierta para una parte del cuerpo del pene después de la erección y extensión, lo que protege al pene durante el coito. MATERIAL Y EQUIPO 1. De Laboratorio: - Un equipo de disección por equipo - Una navaja para bisturí por equipo - Un par de guantes para palpación por alumno - Un paquete de papel sanita por equipo - Una bolsa para basura por equipo 2. Biológico. - Un tracto reproductor completo de toro - Un tracto reproductor completo de cerdo - Un tracto reproductor completo de caballo - Un tracto reproductor completo de perro - Un tracto reproductor completo de ovino o caprino 16 METODOLOGIA Una vez expuestos los tractos reproductores de las diferentes especies domésticas sobre las mesas, se procederá a extenderlos para colocarlos en posición similar a la que se presenta in vivo. Posteriormente, se realizará una inspección detallada de cada uno de los órganos que integran el aparato reproductor para identificar las estructuras macroscópicas externas e internas, observando al mismo tiempo las diferencias entre las distintas especies evaluadas, para lo cual se utilizarán guantes de palpación. Se seguirá el orden que se describe a continuación: 1. Testículos: a) Túnica vaginal visceral. b) Túnica albugínea. c) Séptulos testiculares. d) Mediastino testicular. 2. Escroto: a) Estructura externa. b) Túnica dartos. c) Túnica vaginal parietal. 3. Epidídimo: a) Cabeza. b) Cuerpo. c) Cola. 4.Cordón Espermático: a) Músculo cremáster. b) Plexo pampiniforme. c) Conducto deferente. 5. Conducto Deferente: a) Cuerpo. b) Ámpula. 6. Glándulas Sexuales Accesorias: a) Vesículas seminales. b) Próstata. c) Glándulas bulbouretrales. 7. Uretra: a) Porción pélvica. b) Porción peneana. 8. Pene: a) Raíz. b) Cuerpo. c) Porción libre. d) Glande. 17 OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES Realice sus observaciones, anote sus resultados y haga sus conclusiones. Coloca dentro del circulo el número que le corresponda 1. Ámpula 2. Próstata 3. Músculo cremaster 4. Conducto deferente 5. Glande del pene 6. Cuerpo del pene 7. Músculo retractor del pene 8. Cordón espermático 9. Flexura sigmoidea 10. Testículo 11. Cola del epidídimo 12. Vejiga urinaria 13. Glándula vesicular 14. Conducto eferente Fig. 4 Tracto Reproductor del Toro Fig. 5 Estructura del testículo 18 CUESTIONARIO 1. ¿Por qué se les denomina a los testículos como los “órganos primarios” del tracto reproductor del macho? 2. ¿Qué estructuras producen los espermatozoides? 3. ¿Qué función tiene la rete testis o red testicular? 4. Explique detalladamente las funciones del epidídimo. 5. ¿Qué papel juega la túnica dartos y el músculo cremáster en el mantenimiento de la función testicular? 6. Explique las funciones que tiene el conducto deferente. 7. ¿Qué es el plexo pampiniforme y que papel desempeña en la función testicular? 8. ¿Qué es el colículo seminal y que papel juega durante la eyaculación? 9. Describa detalladamente la función que tiene cada una de las glándulas sexuales accesorias. 10. Explique la función del músculo retractor del pene. 11. ¿Cuál es la función del Pene? 12. Explique a qué se le llama Esmegma. 19 BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM. 20 PRÁCTICA No. 3 “ESTRUCTURA MICROSCÓPICA DEL APARATO REPRODUCTOR DE LOS ANIMALES DOMÉSTICOS” OBJETIVO Reconocer la estructura microscópica de los diferentes órganos que integran el tracto reproductor masculino y femenino de los animales domésticos, identificando las diferencias entre especies. FUNDAMENTO TEÓRICO Ovarios: El ovario consta de dos regiones específicas: la médula y la corteza, envueltas por la túnica albugínea y el epitelio superficial. 1. Médula. La porción media del ovario consta de tejido conectivo, el cual sostiene al sistema vascular espiral y los nervios; estos últimos penetran al ovario desde el mesovario, a través del punto de unión denominado hilio. 2. Corteza. Alrededor de la médula, se encuentra un denso estroma de tejido conectivo, en el cual se sitúan los diversos componentes de la célula germinal a lo largo de su vida, así como las estructuras subsecuentes. Ahí se encuentran los folículos, cuerpos hemorrágicos, cuerpos lúteos, cuerpos blancos o albicans, así como los folículos atrésicos; así mismo, en este lugar se producen la hormonas sexuales femeninas. 3. Epitelio Superficial. En los animales muy jóvenes el epitelio superficial del ovario es cuboidal o redondeado; con la edad, las células se aplanan. No existe una generación continua de ovocitos a partir de los que se denomina epitelio germinal. Los ovocitos están embebidos en el ovario desde que el animal nace y su número permanece constante a partir de ese momento. La túnica albugínea se encuentra por debajo del epitelio superficial. 4. Túnica Albugínea. Es una delgada capa de tejido conectivo, es el soporte externo de la estructura ovárica. Se forma muy al principio del desarrollo del animal, y en el caso de la cerda a los tres meses de edad ya se le puede llamar estructura. La zona de ovocitos y desarrollo folicular, se encuentra por debajo de la túnica albugínea. Oviductos: 1. Capa Serosa. La cubierta externa del oviducto es la serosa, que es una continuación del peritoneo, el cual cubre los órganos internos. Es una membrana de tejido conectivo lustroso y resistente, destinado al sostén, cubierto por una capa de epitelio cuboidal simple. 2. Capa Muscular. Por debajo de la serosa se encuentra la capa muscular, ésta es una capa muy delgada en el extremo infundibular, que se engruesa a medida en que se aproxima al útero. Se forman dos capas, una externa orientada en sentido longitudinal, y otra interna dispuesta en forma circular. 21 3. Mucosa. El revestimiento interno del oviducto es la mucosa, la cual está muy plegada en sentido longitudinal y cubierta por células columnares ciliadas, columnares no ciliadas y células secretoras. Las células columnares tienen además microvellosidades sobre la superficie. Estos dobleces son muy leves y se ramifican, forman pliegues secundarios y terciarios a la altura del infundíbulo, rodeados por una capa muscular delgada. Útero: 1. Perimetrio. La capa serosa que cubre al útero, es una continuación de la cubierta del peritoneo del oviducto. Ésta se fija al ligamento ancho a través de ciertos elementos del tejido conectivo que la sostiene. 2. Miometrio. El tejido muscular es de tipo liso, y se encuentra arreglado en tres capas: dos longitudinales, una externa y delgada y otra que es la más interna y que no se encuentra bien definida. La capa intermedia es circular y más gruesa que las anteriores. 3. Endometrio. Consta de estroma, que contiene el sistema vascular, las glándulas, y un epitelio. Constituye hasta las 2/3 de espesor de la pared uterina. Las glándulas, de forma espiralada, están bien desarrolladas en el adulto. En el animal prepúber son muy escasas, pero se desarrollan con rapidez cuando da inicio la pubertad y la actividad hormonal. En la vaca y la oveja, sólo se abren al exterior entre las carúnculas, pero en la cerda, yegua y en la mujer, se abren en cualquier punto. Las células secretoras tienen forma piramidal, ya que son muy anchas en el punto de contacto con la membrana basal y se agudizan hacia la luz del conducto. El epitelio es en su mayor parte, de tipo columnar. Cerca de la región tubouterina, se observan unas cuantas células columnares ciliadas, pero éstas desaparecen a medida que se penetra el cuerpo uterino. Cuello Uterino: Las estructuras del cervix consisten en una membrana mucosa en la que hay dos tipos celulares: “columnares no ciliadas" y "columnares secretoras”. El tejido muscular está formado en su mayor parte (85% aprox.) de tejido conectivo colagénico. También se encuentran fibras musculares lisas y fibras elásticas. La membrana serosa es similar a la del resto del útero. Vagina: La mucosa vaginal es un epitelio estratificado escamoso, muy resistente. En el tejido muscular se encuentran fibras circulares lisas no bien definidas y fibras longitudinales que hacen a la vagina más o menos elástica. Finalmente, la capa más externa que cubre a la vagina es la serosa, que es similar a la del útero. Vulva: Estructura que posee una pequeña cantidad de músculo, glándulas sebáceas y sudoríparas, grasa y tejido conectivo en sus paredes. Las superficies interna y externa, están cubiertas por un grueso epitelio escamoso estratificado de protección. Sobre la superficie exterior, presenta vellos y folículos pilosos. 22 Clítoris: Contiene tejido cavernoso, similar al del pene del macho. El epitelio que lo recubre es de tipo escamoso estratificado. Fig. 6 y 7 Histología del Oviducto y Cérvix Escroto: La capa más externa es protectora, por lo tanto, se compone de epitelio escamoso estratificado. Este crece continuamente y a medida que las células sanas van alejándose de la membrana basal que las nutre, comienzan a morir. Las células muertas endurecidas funcionan entonces protegiendo los tejidos blandos subyacentes. También el escroto presenta una cubierta de pelo o lana. Por dentro de la cubierta de piel resistente, está una fascia de tejido conectivo y luego la túnica dartos, compuesta por fibras musculares no estriadas. 1. Túnica Vaginal Parietal. Es una capa de fascia que reviste al escroto, está compuesta por tejido conectivo denso cubierto por una membrana serosa de epitelio escamoso simple, que es una continuación del peritoneo. Testículos: El testículo consta de dos tejidos de cubierta: a) la túnica vaginal visceral y b) la túnica albugínea. Internamente, está constituido por los tubos seminíferos, células intersticiales, nervios, vasos sanguíneos, rete testis y conductos eferentes. 1. Túnica Vaginal Visceral. Es la cubierta externa del testículo en sí, está formada por una capa de tejido conectivo denso cubierta por un epitelio escamoso simple. Es la prolongación del peritoneo. 2. Túnica Albugínea. Consta de una gruesa capa de tejido conectivo denso de color blanco que se encuentra bajo la túnica vaginal visceral. 3.Tubos Seminíferos. Son las unidades productoras de los espermatozoides. Están revestidos por una membrana basal sobre la cual se asientan las primeras células espermatogénicas. La membrana basal descansa sobre fibras de colágeno. Las células de sostén son ramificadas, con forma columnar, y se extienden desde la membrana basal hasta la luz del tubo, a través de todas las células espermatogénicas en desarrollo. 4.Tubos Rectos. En su conjunto forman una rama de tubos que se denomina rete testis y están revestidos por un epitelio cuboidal o escamoso simple. 23 5. Células Intersticiales. Tienen forma poliédrica irregular, determinada en gran parte por la presión ejercida por los túbulos circundantes. Conductos Eferentes: Estos conductos están revestidos por epitelio cuboidal o columnar pseudo-estratificado ciliado. Además de células ciliadas, existen células secretoras que presentan gránulos de tamaño considerable. Epidídimo: Está cubierto por una membrana lustrosa de tejido conectivo llamada serosa, la cual le confiere su forma y lo sostiene. Por debajo de la misma hay fibras musculares. El tubo en sí se sustenta por tejido conectivo estructural o estroma, y está integrado por una membrana basal y un epitelio columnar pseudoestratificado estereociliado; esta capa ciliada presenta pilosidades largas y rectas en la región de la cabeza. Conducto Deferente: Se trata de una estructura tubular firme, cubierta por una capa serosa, por debajo de la cual yacen tres delgadas capas de músculo. La más externa de éstas, que entra en contacto con la serosa, tiene orientadas sus fibras en sentido longitudinal; la intermedia se dispone en forma circular alrededor del conducto y la interna también es longitudinal. La mucosa que reviste por dentro las capas musculares presenta una lámina propia consistente en una matriz de tejido conectivo laxo, y que presenta células epiteliales columnares pseudoestratificadas estereociliadas; aquí cambia rápidamente a un epitelio columnar pseudo-estratificado y posteriormente a columnar simple. a) Ámpula: El epitelio que la recubre es columnar bajo, presenta muchas glándulas revestidas por células epiteliales columnares secretoras. Pene: Las cruras del pene son áreas esponjosas de tejido laxo, el cuerpo cavernoso. Éste está recubierto por un endotelio y rodeado por muchas células musculares lisas y tejido conectivo. El epitelio de recubrimiento cambia gradualmente a columnar o cuboidal estratificado. Glande: La túnica blanca albugínea se prolonga sobre el glande, que está cubierto por un epitelio escamoso estratificado. Prepucio: Este tejido es en realidad una continuación de la piel externa, consta de un epitelio escamoso estratificado, contiene glándulas secretoras que se abren hacía la superficie interna. 24 Uretra Pélvica: El tejido conectivo que constituye la capa externa de ésta, es de tipo seroso, debajo de la cual se encuentran los músculos uretrales pélvicos. La mucosa presenta pliegues longitudinales. El epitelio que reviste a la uretra es de transición. Fig. 8 Histología del Testículo MATERIAL Y EQUIPO - Microscopio Papel limpia lente de microscopio Aceite de inmersión Laminillas del Aparato Reproductor de la Hembra Laminillas del Aparato Reproductor del Macho Un equipo de cómputo. Un cañón para proyección en power point. Un diaporama que contiene 120 fotografías digitales sobre la estructura microscópica del aparato reproductor. METODOLOGÍA Se procederá inicialmente con una presentación en power point de fotografías digitales referentes a la histología del aparato reproductor, para lo cual se seguirá el siguiente orden, así como la secuencia de estructuras que se describe a continuación: 1). Ovario. Observar las siguientes estructuras: a) Peritoneo b) Epitelio germinal c) Túnica albugínea d) Estroma e) Folículos primarios f) Folículos secundarios g) Folículos maduros (DeGraaf), los cuales constan de las siguientes partes: - Teca Externa - Teca Interna - Membrana basal - Células de la granulosa 25 Antro folicular Cúmulus oophorus Corona radiada Zona pelúcida Espacio perivitelino Membrana vitelina Vitelo Núcleo Cuerpo polar h) Cuerpos hemorrágicos i) Cuerpos lúteos j) Cuerpos albicans k) Folículos atrésicos 2. Oviductos. Reconocer las diferentes capas histológicas que lo componen: a) Serosa b) Muscular c) Mucosa, en la cual se pueden observar células ciliadas, secretoras y no secretoras 3. Útero. Identificar las diferentes capas histológicas: a) Serosa (perimetrio) b) Muscular (miometrio, que consta de 3 capas) c) Mucosa (endometrio, que consta de estroma, glándulas uterinas y epitelio) 4. Cérvix. Identificar los tres tipos de capas que lo conforman: a) Serosa b) Muscular c) Mucosa 5. Vagina. Identificar también las capas que la componen: a) Serosa b) Muscular c) Mucosa 6. Vulva. Identificar las siguientes estructuras: a) Estroma b) Mucosa 7. Testículo. Identificar las siguientes estructuras: a) Túnica vaginal b) Túnica albugínea c) Túbulos seminíferos, los cuales constan de: - Membrana basal - Células de sertolli - Células espermatogénicas (espermatocito primario y secundario, espermatogonia, espermátide y espermatozoide) - Células de Leydig - Rete testis o red testicular - Conductos eferentes - 26 8. Epidídimo. Reconocer las capas histológicas que lo componen: a) Serosa b) Muscular c) Mucosa 9. Conducto Deferente. Identificar las capas que lo integran: a) Serosa b) Muscular c) Mucosa 10. Glándulas Sexuales Accesorias. Observar e identificar las capas que lo componen: a) Serosa b) Muscular c) Mucosa 11. Uretra. Diferenciar las capas histológicas de la uretra en sus diferentes porciones (uretra pélvica y peneana). OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES HEMBRA 27 MACHO CUESTIONARIO 1. Describa la secuencia de eventos microscópicos que ocurren desde el crecimiento folicular hasta la formación del cuerpo albicans. 2. Explique ¿cuál es la función de las diferentes células epiteliales del oviducto? 3. ¿Qué papel juegan las glándulas uterinas en los procesos reproductivos?. 4. ¿Cuál es la importancia de las células secretoras de la mucosa cervical?. 5. ¿Qué cambios histológicos sufre la mucosa vaginal durante el estro y porqué?. 6. ¿Qué células secretan la progesterona dentro del cuerpo lúteo?. 28 7. ¿Qué función tienen las células de Leydig en el proceso espermatogénico?. 8. ¿Qué papel juegan las células de Sertolli?. 9. ¿Cuál es la función de los conductos eferentes y cómo se lleva a cabo dicha función?. 10. ¿Cómo se lleva a cabo el transporte espermático a lo largo del epidídimo?. 11.- Explique el transporte ascendente de los espermatozoides a lo largo del conducto deferente. 12.- ¿Por qué el transporte espermático a través de la uretra es mucho más rápido que en el epidídimo o en el conducto deferente?. BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM 29 PRÁCTICA No. 4 “MECANISMOS DE CONTROL DE LA ACTIVIDAD REPRODUCTIVA” OBJETIVO Analizar y discutir los mecanismos de retroalimentación desarrollados por las hormonas esteroides y que se encargan de regular el comportamiento reproductivo en los animales domésticos. FUNDAMENTO TEÓRICO Como resultado de diversos estudios endócrinos, en los últimos veinticinco años se ha profundizado enormemente en el conocimiento de los cambios hormonales que ocurren en la vaca, para que retorne a una actividad cíclica normal, después del parto. Esto ha facilitado un conocimiento claro de los factores que afectan al intervalo desde el parto a la primera ovulación y el estro entre, y dentro, de los diferentes rebaños y según que las vacas sean ordeñadas o que amamanten a sus crías. Este conocimiento ha sido de incalculable valor para desarrollar protocolos y rutinas de manejo de las hormonas, aplicables a las hembras que muestran retrasos en la reanudación de la actividad ovárica. Fig. 9 Eje hipotálamo hipófisis ovario El retraso en la reanudación de los ciclos ováricos puede ser considerado como una estrategia para la supervivencia de la vaca, al evitar que se inicie otra gestación en periodos de estrés ambiental o fisiológico. Teniendo esto presente, existe cierta controversia entre los objetivos comerciales del ganadero de animales productores de leche o carne y los mecanismos que afectan a la restauración del modelo cíclico de reproducción en la vaca. Han sido varios los autores que han revisado la bibliografía de la década de 1970, sobre el modelo de crecimiento folicular, estro, ovulación y fertilidad después del parto, así como los cambios endócrinos relacionados con esos acontecimientos. En aquel tiempo, se pensó que en la mayoría de las vacas que lactan hay una supresión del crecimiento folicular, inmediatamente después del parto, y que estos cambios suceden, de una manera rápida, en las semanas siguientes a la parición. La secuencia de eventos endócrinos, que ocurren en la vaca normal después del parto, incluye los siguientes hechos: algo de GnRH se segrega inmediatamente después del parto, pero no en cantidad suficiente para producir la liberación de las gonadotropinas; las concentraciones plasmáticas de FSH se elevan rápidamente, después del parto, estimulando el desarrollo folicular; existe un aumento gradual de la frecuencia de los pulsos de LH y de las concentraciones de LH en plasma; la secreción de gonadotropinas estimula el crecimiento folicular y la producción de estradiol y, quizá la de inhibina; y 30 coincidiendo con estos cambios endocrinos hay una recuperación gradual del mecanismo de retrofuncionalidad negativa, de tal forma que los ciclos ováricos comienzan unas dos semanas después del parto. El hipotálamo secreta el factor liberador de las gonadotropinas (GnRH), el cual es transportado por el sistema portal hipofisiario a la glándula pituitaria. El GnRH hace que la hipófisis secrete las hormonas gonadotrópicas, las cuales son la hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH), y éstas son transportadas por la sangre al ovario, donde ambas modulan su actividad. En primera instancia, la FSH estimula el crecimiento folicular al mismo tiempo que los niveles estrogénicos se empiezan a elevar, alcanzando un nivel suficiente que a nivel hipotalámico continúa con la secreción de GnRH, al mismo tiempo que dentro de la hipófisis promueve la liberación selectiva de LH y supresión de FSH. La LH llega al ovario y se encarga de la formación inicial del cuerpo lúteo, a partir de las células de la teca interna y de la granulosa que integraban el cuerpo hemorrágico. El cuerpo lúteo se vuelve entonces funcional e inicia con la secreción de progesterona, la cual promueve un efecto inhibitorio a nivel hipotalámico e hipofisiario, suprimiendo con ello la liberación tanto de GnRH como de FSH y LH. Dicho efecto es eliminado una vez que se presenta el rompimiento del cuerpo lúteo después de que el organismo confirma la inexistencia de la gestación. Con respecto a la testosterona en el macho, su efecto es similar al de la progesterona, ya que al ser liberada ejerce un efecto de retroalimentación negativa sobre la liberación hipotalámica de GnRH, afectando a la vez la liberación hipofisiaria de FSH y de LH. Los mecanismos de retroalimentación son entonces llevados a cabo por hormonas esteroides las cuales son liberadas por hormonas protéicas, y su efecto de retroalimentación lo ejercen básicamente sobre las hormonas que inducen su producción. Dichos mecanismos son indispensables para mantener en el caso de la hembra, la ciclicidad de su comportamiento reproductivo, así como en el macho se requieren para asegurar la continuidad de su actividad sexual. MATERIALY EQUIPO 1. Didáctico- Audiovisual: - Presentación power point - Película ilustrativa 1. 2. 3. 4. METODOLOGÍA Elaborar un cuadro en el que se ilustre la integración entre SNC – Hipotálamo – Hipófisis – Ovarios. Ubicar dentro del cuadro los sitios de liberación y de acción del estradiol. Discutir los mecanismos mediante los cuales el estradiol ejerce su efecto de retroalimentación sobre el eje Hipotálamo – Hipófisis – Gonadal. Ubicar dentro del cuadro los sitios de liberación y de acción de la progesterona. 31 5. Discutir los mecanismos mediante los cuales la progesterona ejerce su efecto de retroalimentación sobre el eje Hipotálamo – Hipófisis – Gonadal. 6. Elaborar un cuadro en el que se ilustre la integración entre SNC – Hipotálamo – Hipófisis – Testículos. 7. Ubicar dentro del cuadro los sitios de liberación y de acción del estradiol. 8. Discutir los mecanismos mediante los cuales el estradiol ejerce su efecto de retroalimentación sobre el eje Hipotálamo – Hipófisis – Gonadal. 9. Ubicar dentro del cuadro los sitios de liberación y de acción de la testosterona. 10. Discutir los mecanismos mediante los cuales la testosterona ejerce su efecto de retroalimentación sobre el eje Hipotálamo – Hipófisis – Gonadal. OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES 32 CUESTIONARIO 1. ¿Qué se entiende por mecanismo de retroalimentación?. 2. ¿Qué hormona protéica está implicada en el mecanismo de retroalimentación en el macho?. 3. Explique brevemente ¿en qué consiste la “primer vuelta” del mecanismo de retroalimentación dentro del eje Hipotálamo – Hipófisis – Ovarios?. 4. Explique brevemente ¿en qué consiste la “segunda vuelta” del mecanismo de retroalimentación dentro del eje Hipotálamo – Hipófisis – Testículos?. 5. Indique ¿quién estimula y quién suprime la liberación de progesterona dentro del ciclo de retroalimentación?. 6. Indique ¿quién estimula y quién suprime la liberación de estradiol dentro del ciclo de retroalimentación?. 7. Indique ¿quién estimula y quién suprime la liberación de testosterona dentro del ciclo de retroalimentación?. 8. ¿Qué pasa en el sistema de retroalimentación cuando se presenta un quiste folicular?. 33 BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM 34 PRÁCTICA No. 5 “APLICACIÓN DE HORMONAS PROTÉICAS EN LA REPRODUCCIÓN ANIMAL (GnRH)” OBJETIVO El alumno identificará las principales hormonas protéicas que son actualmente utilizadas en la reproducción animal y discutirá las implicaciones que dichas hormonas tienen sobre la fisiología reproductiva de los animales domésticos. FUNDAMENTO TEORICO En las diversas explotaciones de animales domésticos, ya sea un rancho ganadero, un establo lechero, una granja porcina, etc., la eficiencia reproductiva representa un aspecto de suma importancia para la rentabilidad de las mismas, ya que es indispensable mantener adecuados parámetros reproductivos, los cuales aseguran un óptimo nivel de producción. Por lo anterior, y con la finalidad de mejorar la productividad de las explotaciones pecuarias, actualmente el uso de productos hormonales para mejorar la fertilidad se ha convertido en una valiosa herramienta para mejorar el comportamiento reproductivo de las especies domésticas; sin embargo, es necesario un adecuado entendimiento de la fisiología del ciclo estral para asegurar el éxito en la aplicación de programas hormonales. Las hormonas de la reproducción se dividen en tres categorías según su estructura química: a) Proteicas, b) Esteroides y c) Ácidos grasos. Las hormonas proteicas u hormonas polipeptídicas fluctúan en tamaño, tienen un peso molecular de 300 a 70 000 daltons, y son degradadas fácilmente por las enzimas, por esta razón no deben ser administradas por vía oral, sino por vía parenteral. Dentro de este grupo encontramos al GnRH, (Hormona liberadora de gonadotropinas), a la FSH (hormona folículo estimulante) y a la LH (hormona leutinizante), llamadas estas dos últimas también gonadotropinas por ser hormonas que actúan directamente sobre las gónadas. Otra hormona que ha tenido efectos positivos sobre la reproducción animal y ha sido muy muy utilizada es la somatotropina bovina (STb). GnRH: Este factor liberador de gonadotropinas, es una hormona protéica producida por el hipotálamo y transferida a la adenohipófisis a través del eje hipotalámico hipofisiario. Es un péptido que estimula la liberación de FSH y LH. Esta hormona es utilizada en medicina veterinaria principalmente en el ganado vacuno para controlar problemas de quistes ováricos, retraso en la ovulación o anovulación anafrodista y, actualmente, ha sido implementado como una importante estrategia de manejo para la sincronización de la ovulación. Una inyección de hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) a vacas tomadas al azar en diferentes etapas de su ciclo estral ocasiona la liberación inicial de hormona luteinizante provocando ovulación o luteinización en los folículos más grandes. Como consecuencia, una nueva onda folicular es iniciada en todas las vacas a los 2 ó 3 dias de 35 la administración de GnRH. Las células luteales que se forman después de la administración de GnRH son susceptibles a la PG ocasionando luteólisis 6 ó 7 días después. Este protocolo de sincronización involucra la aplicación de GnRH en el día 0 (día que se hace la primera aplicación), seguida de una aplicación de prostaglandina al día 7. Después de la aplicación de la prostaglandina, se espera que las vacas entren en calor en un rango de 48 a 72 horas después. A la vaca se le retira el becerro después del calor o el parto. Este sistema nos muestra la inducción a un estro fértil en vacas que no están ciclando. Al evaluar los resultados se observó un 12.7% más de vacas que entraron en calor usando este método comparado con el de prostaglandinas (2 aplicaciones), con un 10.5% mayor de porcentaje de preñez. Sin embargo, es necesario que tengan el tiempo suficiente después del parto para que vuelvan a ciclar. El método de GnRH – PG – GnRH para IA a tiempo fijo se debe al desarrollo de folículos preovulatorios que ovulan en respuesta a la segunda aplicación de GnRH que induce la liberación de LH después de 48 horas posteriores a la aplicación de PG. La aplicación de GnRH 48 horas después de la PG es lo que nos marca la sincronización de la ovulación (OvSynch). El GnRH, es utilizado en el método pre-synch, el cual consiste en controlar las estructuras ováricas, tanto del folículo como cuerpo lúteo, en combinación con PGF2 alfa. Este programa desarrolla la sincronización de las ondas foliculares, tiempo de ovulación y el desarrollo luteal. El método implica la aplicación de PGF2 alfa al día –12, GnRH al día 0, PGF2 alfa al día 7, y GnRH al día 9 con inseminación artificial a tiempo fijo al día 10 con un rango de 16 a 20 hrs después de la última aplicación de GnRH, el cual induce la liberación de LH 48 hrs posteriores a la segunda aplicación de PGF2 alfa, lo cual nos controla la ovulación, mientras que la segunda aplicación de PGF2 alfa, nos garantizará que 14 días después habrá un cuerpo lúteo de tamaño suficiente, el cual al ser eliminado podra desencadenar o activar la liberación de las gonadotropinas. En las pasadas dos décadas, análogos sintéticos de GnRH han sido los mas comúnmente usados en los tratamientos para quistes, el éxito promedio del tratamiento con GnRH ha sido alrededor del 80%. Seguido al tratamiento con uno de los análogos de GnRH, una ola de LH fue detectada que fue similar a la ola de preovulación. Posteriormente, las concentraciones de estradiol-17 B en el plasma tendieron a decrecer dentro de 24 horas. La estructura del quiste después generalmente decrece en talla y se hace más sólido (firme), sobre el subsecuente periodo de 5 a 15 días. Concentraciones circulantes de P4 se incrementan sobre los siguientes 3 a 9 días y permanecen elevadas hasta el día 15 a 18 después del tratamiento con GnRH antes de declinar. El estro y la ovulación entonces ocurren, y ciclos estrales normales son usualmente iniciados. Los quistes responden a la HCG o GnRH mediante la luteinización de la estructura quística. En algunos casos, el tratamiento con HCG o GnRH inició la ovulación del folículo dominante del ovario con quistes al tiempo del tratamiento. La ovulación del quiste seguido al tratamiento no ha sido observado. 36 Somatotropina Bovina (STb): La secreción de STb es regulada por dos células hipotalámicas bien caracterizadas, estas son estimuladas o inhibidas (somatostatina) en la glándula pituitaria. La somatotropina contiene 191 aminoácidos. La somatotropina estimula el crecimiento de los tejidos corporales e influye en el metabolismo de los carbohidratos, lípidos y proteinas. Tiene una función biológica durante toda la vida como agente anabólico, así como una función sinérgica aumentando la acción de la ACTH, TSH, LH, y la FSH en órganos blancos. Estimula directa o indirectamente los procesos biológicos tales como división celular, crecimiento esquelético y síntesis proteica (actividades promotoras de crecimiento y galactopoyéticas). La somatotropina bovina afecta la potencia de las gonadotropinas para estimular la síntesis de esteroides en los cultivos celulares, estimula la síntesis de progesterona en las células luteas, estimula el desarrollo embrionario y finalmente, estimula la concepción y la sobrevivencia embrionaria. Muchos estudios han demostrado los efectos directos de STb y el factor de crecimiento I tipo insulina (IGF-I) sobre los ovarios y el tejido uterino. El análisis inmunohistoquímico de los tejidos reproductivos mostró la presencia de receptores de IGF -I y de bST en el CL y en los folículos del ovario bovino Por lo tanto, el tratamiento con STb puede estimular la gestación a través de sus efectos indirectos y directos (IGF -I) sobre los tejidos reproductivos. En vacas en lactación, el efecto de estimulación de STb sobre la fertilidad parece ser más pronunciado durante el primer posparto IA. No solamente la STb tiene el potencial para alterar el desarrollo embrionario a través de la acción de la progesterona, puede también actuar de forma directa sobre las células embrionarias y acelerar el desarrollo embrionario. El uso de la somatotropina bovina (STb) en combinación con el protocolo Ovsynch, ha resultado en un incremento en las tasas de preñez, indicando posibles efectos en el desarrollo del ovocito y del embrión; asimismo, el tratamiento de vacas donadoras de embriones redujo la proporción de ovocitos no fertilizados e incrementó el número de embriones transferibles, además de que aumentó las tasas de preñez en vacas receptoras. Además, la inyección de STb al momento de la inseminación artificial (IA) siguiente al programa Presynch-Ovsynch en vacas lecheras lactantes, incrementó las tasas de preñez a los 74 días posteriores a la IA. El impacto de la STb sobre las funciones reproductivas de las vacas lecheras en lactación es amplio y muy complejo. Se ha demostrado que afecta la potencia de las gonadotropinas para estimular la síntesis de esteroides en cultivos celulares, estimula la síntesis de progesterona en las células luteales, acelera el desarrollo embrionario y, finalmente, estimula la concepción y la sobrevivencia embrionaria. Además, el tratamiento con STb puede estimular la gestación a través de sus efectos indirectos y directos (IGF-I) sobre los tejidos reproductivos. 37 MATERIALY EQUIPO 1. De Laboratorio: - Tres jeringas de 3 ml por equipo - Tres jeringas hipodérmicas No. 18 por equipo 2. Biológicos: - 3 vacas en edad reproductiva - 600 ug de GnRH por grupo - 75 mg de PGF2alfa por grupo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. METODOLOGÍA En cada una de las vacas a trabajar, se evaluará la actividad ovárica por medio de ultrasonografía, para detectar la presencia de actividad folicular y/o luteal. El día 0 se aplicará por vía intramuscular (IM) 100 ug de GnRH. El día 7 se aplicará por vía IM 25 mg de PGF2alfa. El día 9 se aplicará de nuevo por vía IM 100 ug de GnRH. Se realizará inspección ultrasonográfica los días 0, 7 y 9 para evaluar la presencia y tamaño del folículo dominante, así como la presencia y tamaño del cuerpo lúteo. Se discutirá con el grupo la importancia de la utilización del GnRH, así como el efecto fisiológico que este tiene sobre la fisiología reproductiva de la vaca. Se discutirá el efecto de la aplicación del GnRH como una estrategia para la eliminación de los quistes foliculares en el ganado bovino. Se discutirá el efecto de la aplicación de somototropina bovina en el ganado, así como su efecto sobre el comportamiento reproductivo del ganado. OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES Realice sus observaciones, anote sus resultados y haga sus conclusiones. 38 CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el efecto que tiene el GnRH sobre la dinámica folicular de los animales domésticos?. 2. ¿Qué efecto tiene el GnRH sobre la actividad luteal?. 3. ¿Cuáles son las fuentes comerciales de GnRH?. 4. Explique brevemente en qué consiste el método Ovsynch: 5. ¿Cómo funciona el GnRH para el tratamiento de quistes foliculares?. 6. Mencione otras 3 hormonas protéicas que son utilizadas para mejorar la reproducción animal: 7. ¿Qué efecto tiene la hormona de crecimiento o somatotropina bovina sobre el comportamiento reproductivo del ganado bovino?. 8. Mencione que desventajas tiene la utilización de hormonas protéicas en los animales domésticos: 39 BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM 40 PRÁCTICA No. 6 “APLICACIÓN DE HORMONAS ESTEROIDES EN LA REPRODUCCIÓN (PROGESTERONA-ESTRÓGENOS)” OBJETIVO El alumno identificará las principales hormonas esteroidales que son actualmente utilizadas en la reproducción animal y discutirá las implicaciones que dichas hormonas tienen sobre la fisiología reproductiva de los animales domésticos. FUNDAMENTO TEÓRICO El manejo reproductivo en las especies de animales domésticos ha sido mejorado significativamente a través de la aplicación de hormonas esteroides, las cuales han sido utilizadas principalmente dentro de programas para la sincronización del estro y/o la ovulación. Los esteriodes tiene un núcleo básico o común llamado ciclopentanoperhidro-fenantreno, que consta de 3 anillos de 6 carbonos totalmente hidrogenados. Las hormonas esteroides, no solamente se secretan por el ovario y por el testículo, sino que también por la placenta y la corteza suprarrenal. Los tejidos productores de esteroides poseen las enzimas necesarias para la síntesis de todas las hormonas esteroides. La capacidad de las diferentes células para secretar la hormona esteroide específica depende de la cantidad de enzimas particulares contenidas en la célula. El ovario produce dos hormonas esteroides principales: a) estradiol y b) progesterona que provocan cambios en el aparato reproductor y algunos efectos generales. Se utiliza como nombre de grupo no específico el término estrógeno, pero el secretado en forma natural es el 17 estradiol; sus metabolitos estriol y estrona son estrógenos circulantes de gran importancia fisiológica. Estrógenos: En el bovino, el uso de cipionato de estradiol (ECP) es una estrategia de control alternativa para el tiempo de la ovulación debido a la habilidad exógena del estradiol para inducir el pico de LH cuando se da un ambiente bajo en progesterona. El protocolo consiste en una inyección de GnRH aplicado en etapas aleatorias del ciclo estral para reclutar una nueva oleada folicular. En el dia 7 después de la inyección de GnRH , las vacas reciben una inyección de PGF2 para regresar el CL original y/o al CL recientemente formado inducido por el tratamiento de GnRH. Veinticuatro horas después de la PGF2 , una inyección de ECP se aplica para inducir el pico de LH y sincronizar la ovulación. La inseminación deberá de llevarse a cabo en cualquier momento después de la PGF2 sí la vaca muestra signos de estros o a tiempo fijo 48h después de la aplicación de ECP. Se han aislados estrógenos del ovario, glándula suprarrenal, placenta e incluso de testículos de caballo. En la hembra de tipo cíclico los estrógenos son producidos por las 41 células de la granulosa del ovario y las de sertolli en el macho, y las de la teca del folículo en crecimiento por influencia principal de la FSH , así como de la LH. Los estrógenos son esteroides y por lo tanto, juegan un papel muy importante en los procesos reproductivos, son lo principales responsables del celo en la hembra, estimulan cambios en el aparato genital para controlar el transporte de gametos. Junto con los progestágenos provocan el desarrollo de la glándula mamaria. Potencían la acción de la oxitocina y prostaglandinas sobre el miometrio en el proceso del parto, asimismo, estimulan la liberación preovulatoria de gonadotropinas. Los estrógenos sintéticos no esteroides se han utilizado en la industria pecuaria, principalmente como promotores del crecimiento en bovinos; un ejemplo clásico es el dietilestilbestrol. Los estrógenos sirven de abortivos en vacas y ovejas debido a su acción luteolítica (regresión del cuerpo lúteo), está bien demostrado que éstos presentan acción luteolítica cuando son administrados al ganado durante las primeras etapas de gestación. Sin embargo, en la cerda cumplen una acción luteotrópica (ayudan a mantener el cuerpo lúteo) y por lo tanto, son usados en sistemas de sincronización de estro con objeto de mantener a las cerdas en una fase lútea hasta que se les retira el tratamiento con estrógenos y se continúa con una aplicación de prostaglandinas. En el ganado vacuno la aplicación de esta hormona se ha enfocado al tratamiento de endometritis. En equinos, para la maduración del cuello uterino antes de la inducción del parto con oxitocina. En perros, se aplican cuando existe una cubrición no deseada, incontinencia urinaria en perras castradas, hiperplasia prostática y para el control de la hipersexualidad en perros. Progestágenos: La progesterona (P4) y los compuestos progestacionales son utilizados ampliamente en muchas especies domésticas como método de control del ciclo estral, particularmente para sincronizar el celo en grupos de hembras. En general, se reconoce que los progestágenos actúan como un cuerpo lúteo artificial, que provoca un efecto de retroalimentación negativa sobre la hipófisis anterior, bloqueando la liberación de gonadotropinas. Cuando la administración de ellos se suspende, su efecto bloquedor cesa y se reanuda la ciclicidad sexual. El Norgestomet aplicado por vía subcutánea durante 9 días, aparentemente actúa suprimiendo la liberación de gonadotropinas por parte de la glándula pituitaria y alterando la secreción de esteroides ováricos para inhibir el estro y la ovulación hasta que se retira el agente progestágeno. Uno de los progestágenos más usados actualmente (por su bajo costo) es el acetato de melengestrol (MGA), el cual suprime el estro y la ovulación cuando es administrado oralmente en dosis de 0.5 mg/vaca/día. Los intentos iniciales para regular el ciclo estral comprendieron la aplicación de progesterona exógena o progestágenos sintéticos, con la finalidad de prolongar la fase lútea del ciclo o para establecer una fase artificial. Los progestágenos suprimen el estro y la ovulación inhibiendo la secreción de LH y la maduración folicular. Los métodos más 42 utilizados para tal fin son la administración de progesterona por las siguientes vías: formulación oral, intravaginal, y/o implantes subcutáneos. La progesterona es el progestágeno que se presenta en mayor cantidad en forma natural, y es secretada por las células del cuerpo lúteo. También es secretada por la placenta y por las glándulas suprarrenales. La progesterona es transportada en sangre por una globulina. La regulación de su secreción sólo está entendida parcialmente, pero se considera que es estimulada por la LH en los animales domésticos. Los efectos normales de la progesterona se observan solamente después que el tejido blanco se ha expuesto durante cierto tiempo a estimulación por estrógenos. El papel más espectacular de la progesterona ocurre durante la preñez ya que es la hormona que favorece la gestación. Primeramente prepara al útero para la implantación y mantenimiento de la preñez, mediante el aumento de las glándulas secretoras del endometrio y la inhibición de la motilidad de éste, sin importar si hay o no cigoto presente. La progesterona contribuye a la económica del metabolismo corporal y durante la preñez se advierte en la hembra un período de mejor utilización de los nutrientes; asimismo, durante la preñez mejora el apetito gracias a esta hormona. Los efectos psíquicos de este progestágeno suscitan la aparición de conducta materna en la hembra. De igual forma, actúa probablemente con los estrógenos en la mayoría de las especies para producir el estro psíquico o receptivilidad sexual. La oveja por ejemplo, necesita progesterona antes de que pueda observarse en la misma respuesta plena a los estrógenos, lo que puede explicar el celo silencioso en los ovinos durante cada primer ciclo estral en cada estación reproductiva, en esta especie de tipo estacional. La aplicación de progesterona sintética ha sido de gran utilidad en medicina veterinaria, ya que este producto es muy efectivo y tiene una vida media más larga. Son utilizados en todas las especies domésticas, principalmente para el control de la actividad sexual cíclica. Esto es posible ya que ejercen un gran efecto “feedback” negativo sobre el hipotálamo e hipófisis, inhibiendo la liberación de gonadotropinas. La consecuencia de este efecto es la supresión de la actividad sexual, por lo que después de suspender el tratamiento en las especies poliéstricas hay un reinicio de la actividad sexual a los pocos días. MATERIALY EQUIPO 1. De Laboratorio: - Tres jeringas de 3 ml por equipo - Tres jeringas hipodérmicas No. 18 por equipo - Un paquete de papel sanita por equipo 2. Biológicos: - 3 vacas en edad reproductiva - 3 mg de cipionato de estradiol - 3 dispositivos intravaginales CIDR 43 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. METODOLOGÍA En cada una de las vacas a trabajar, se evaluará la actividad ovárica por medio de ultrasonografía, para detectar la presencia de actividad folicular y/o luteal. El día 0 se administrará por vía intramuscular (IM) 1 mg de ECP, al mismo tiempo se aplicará por vía intravaginal (IV) un dispositivo liberador de progesterona (CIDR). El día 7 se aplicará por vía IM 25 mg de PGF2alfa. El día 8 se aplicará de nuevo por vía IM 1 mg de ECP. Se realizará inspección ultrasonográfica los días 0, 7 y 9 para evaluar la presencia y tamaño del folículo dominante, así como la presencia y tamaño del cuerpo lúteo. Se discutirá con el grupo la importancia de la utilización del cipionato de estradiol, así como el efecto fisiológico que este tiene sobre la fisiología reproductiva de la vaca. Se discutirá el efecto de la aplicación del cipionato de estradiol como inductor de quistes foliculares en el ganado bovino. Se discutirá el efecto de la aplicación de hormonas esteroides en otras especies de animales domésticos. OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES Anote sus resultados y forme sus conclusiones. 44 CUESTIONARIO 1. ¿Cuáles son las estructuras ováricas que producen los estrógenos?. 2. Explique brevemente el mecanismo enzimático a través del cual se producen los estrógenos dentro del ovario: 3. Explique brevemente el mecanismo enzimático a través del cual se produce la progesterona dentro del ovario: 4. ¿Cuáles son los principales usos de las hormonas esteroides en la reproducción animal?. 5. ¿Cuáles son las principales desventajas en el uso contínuo de hormonas esteroides en los animales domésticos?. 6. Explique brevemente las vías por las cuales se puede administrar un progestágeno y sus implicaciones fisiológicas: 7. Explique brevemente el mecanismo de acción de los agentes progestágenos para controlar o regulare el ciclo estral: 8. Mencione algunos productos comerciales de hormonas esteroides y su principio activo: 45 BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: 46 PRÁCTICA NO. 7 “EVALUACIÓN DE LOS CAMBIOS MORFOLÓGICOS EXISTENTES DURANTE EL CICLO ESTRAL” OBJETIVO Identificar y analizar los cambios estructurales que se presentan en el epitelio vaginal de las especies de animales domésticos, asociándolos con los niveles hormonales que prevalecen en las distintas etapas del ciclo estral. FUNDAMENTO TEÓRICO La reproducción de la hembra es un proceso complejo en el que participa todo el organismo. Las hembras de los animales domésticos entran en celo en intervalos regulares bastante precisos, pero con diferencias entre las especies. En todos los mamíferos, el aparato genital de la hembra presenta, durante todo el período de actividad genital, modificaciones estructurales que se reproducen siempre siguiendo el mismo orden y que se repiten en intervalos periódicos según un ritmo característico y definido para cada especie. Estos cambios conocidos como ciclo sexual o ciclo estral, empiezan en el momento de la pubertad, y ocurren a lo largo de toda la vida sexual de la hembra, únicamente son interrumpidos por la gestación o cualquier otro factor anormal; estas modificaciones dependen de la actividad funcional del ovario, el cual a su vez se encuentra bajo el efecto de la acción hipotálamo-hipofisiaria. El ciclo estrual está regulado por dos mecanismos, uno endócrino y otro neuroendócrino, el primero está representado por las hormonas hipotalámicas, gonadotróficas y esteroides que circulan en la sangre de la hembra, mientras que el segundo se encarga de la respuesta de los órganos blanco ante dichas hormonas. El ciclo estral de los animales domésticos se puede dividir en dos etapas desde el punto de vista endocrinológico: a) Fase estrogénica, proliferativa o folicular. b) Fase luteínica o progestacional. Fig. 10 Fases del ciclo estral 47 O bien, desde el punto de vista anatomo-fisiológico, que son las fases por las que atraviesa el aparato reproductor: a) Proestro y Estro (que corresponden a la fase estrogénica) b) Metaestro y Diestro (que corresponde a la fase progestacional). El anestro es otra etapa que sólo se presenta en algunas especies como parte del ciclo estral normal, como sucede en la yegua, oveja, cabra y en la perra; también se puede presentar en otras especies como la vaca y la cerda, pero aquí se considera anormal, ya que esta etapa de anestro puede ser atribuida a otros factores de tipo patológico, nutricional o fisiológico. Citología Exfoliativa: La citología exfoliativa estudia las características de las células que normalmente se descaman de los diversos órganos del cuerpo. Ésta es una técnica utilizada para determinar en que etapa del ciclo estral se encuentra una hembra. Se considera una técnica de gran utilidad ya que nos permite llevar a cabo la inseminación artificial en ciertas especies como en la perra por ejemplo. Esta técnica proporciona importantes datos sobre el equilibrio hormonal y permite la detección temprana de algunos tipos de cáncer del aparato reproductor femenino. Las células que deben ser examinadas son recolectadas de la vagina junto con la secreción que se encuentra ahí contenida, extendidas en láminas y coloreadas con tinciones especiales. El principio de la citología vaginal exfoliativa se basa en determinar el tiempo y cantidad de células de las diferentes etapas del ciclo estral, ya que los cambios hormonales que sufre la vagina durante el ciclo, se reflejan en la morfología de sus células epiteliales. Fig. 11 Técnica de citología vaginal Al inicio del ciclo, las células epiteliales están en contacto con la irrigación sanguínea que es quien proporciona la nutrición celular. Conforme los niveles de estrógenos se incrementan, el epitelio vaginal se va engrosando, ocasionando que las células epiteliales se vayan separando del aporte sanguíneo, dando como resultado una transformación celular que va de células parabasales a células anucleadas o escamosas. Las células del epitelio vaginal se clasifican en cuatro categorías que son: 1. Células Parabasales. Es una célula grande en forma de óvalo o redonda con núcleo aparente y pequeña cantidad de citoplasma. Esta célula se desprende de la capa de células germinales cercanas a los vasos sanguíneos y predominan durante la etapa de anestro y principios del proestro. 2. Células Intermedias. Es una célula grande de bordes irregulares con núcleo mas pequeño o mas grande que el de las células parabasales, pero esta célula tiene una 48 mayor cantidad de citoplasma. La presencia de estas células indica la etapa anterior a su transformación a célula superficial y predomina a mitad del proestro. 3. Células Superficiales. Es una célula pequeña de bordes angostos, con un núcleo de menor tamaño que las células anteriores. Este tipo de célula es característica del final del proestro y está presente durante todo el estro, que es cuando la vagina se encuentra bajo la influencia del pico estrogénico. 4. Células Anucleadas. A este tipo de célula también se le conoce como escamosa, es pequeña, sin núcleo, de bordes angostos e irregulares, predominan en el estro y marca el final del proceso de descamación de la célula parabasal. Bajo la acción de los estrógenos, el epitelio vaginal se vuelve mas grueso, con mayor número de capas celulares. Ocurre también una queratización parcial de las células superficiales. Es tan característica la acción de los estrógenos que el porcentaje de las células acidófilas es un índice de la acción estrogénica. En la fase secretora del ciclo estral y durante la gestación que son los dos períodos en los que ocurre relativa deficiencia de estrógenos, hay menor número de células queratinizadas y predominan en el frótis vaginal las células de capa intermedia, caracterizadas por presentar núcleos condensados y el citoplasma sin queratina. Las células basales internas aparecen en el frotis debido a la descamación masiva del epitelio vaginal, probablemente debida a la declinación brusca del nivel de hormonas. Éstas son células pequeñas redondeadas basófilas con núcleo voluminoso y cromatina dispersa. Fig. 12 Células vaginales Aunque los principales cambios fisiológicos del ciclo estrual ocurren en los ovarios, estos cambios se ven reflejados en la vagina debido a la influencia hormonal ovárica de los estrógenos y la progesterona. La histología del epitelio vaginal no se mantiene constante durante el ciclo estral; los cambios que ocurren son los siguientes: a). Proestro. El útero se encuentra altamente vascularizado por el efecto estrogénico, ocasionando que el epitelio uterino y vaginal se empiece a multiplicar rápidamente encontrándose células epiteliales basales y parabasales de forma y núcleo bien definidos. b). Estro. En esta etapa el útero se vasculariza aún más ya que el folículo alcanza su máximo desarrollo. La mucosa uterina y cervical secreta grandes cantidades de moco viscoso y cristalino, las células epiteliales de descamación son células cornificadas, escamosas y de forma irregular. 49 c). Metaestro. Durante esta etapa podemos encontrar en el frotis vaginal leucocitos, encargados de fagocitar las células de descamación, o bien microorganismos que entran durante la fase del estro, y además se pueden encontrar pocas células cornificadas. d). Diestro. Predominan en el frotis vaginal leucocitos y pocas células epiteliales. MATERIAL Y EQUIPO 1. De Laboratorio: - Un microscopio por equipo - 5 portaobjetos por equipo - 5 cubreobjetos por equipo - Un paquete de hisopos estériles por grupo - Un paquete de papel sanita por equipo - Un paquete de gasas por equipo - Una bolsa de algodón por grupo - Un encendedor por grupo - Un frasco de 20 ml de colorante de Wright - Un frasco de aceite de inmersión por equipo 2. Biológico: - Una perra sexualmente madura por grupo METODOLOGÍA La única especie doméstica en la que los cambios que sufre el epitelio vaginal permiten identificar la etapa del ciclo estral en que se encuentra, es la perra, razón por la cual la técnica de citología vaginal se realizará en dicha especie. Con respecto a las demás especies domésticas, se discutirá con apoyo de material didáctico los cambios estructurales que ocurren en las diferentes etapas del ciclo estral, asociandolos a los niveles hormonales que prevalecen en dichas etapas y que son los que originan tales cambios. 1. Para la realización de la citología vaginal, primeramente un integrante del equipo sujetará a la perra de tal forma que la parte posterior de la misma quede expuesta, mientras que otro integrante del equipo sujetará los miembros posteriores. 2. Otro integrante del equipo tomará un hisopo estéril para introducirlo por la abertura vulvar en dirección superior para evitar que entre por el orificio uretral. 3. Mientras el hisopo avanza éste se endereza hasta tomar una posición horizontal (ya dentro de la vagina), procediendo entonces a realizar movimientos rotatorios del hisopo tratando de que toda la superficie del mismo tenga contacto con el epitelio vaginal. 4. Se retira el hisopo de la vagina de la perra, para después colocarlo sobre un portaobjetos, realizando movimientos rotatorios del mismo tratando de que el material recolectado se impregne a lo largo de la superficie del portaobjetos. 5. La muestra obtenida se tiñe con tinción de Wright y se deja secar al aire. 6. Ya preparado el frotis, se observa al microscopio con objetivo 10X y 40X para identificar el tipo de células existentes. 50 7. Para observar más detalladamente las células observe con objetivo 100X, colocando previamente una gota de aceite de inmersión al portaobjetos. OBSERVACIONES, RESULTADOS Y DISCUSIONES Realice sus observaciones, anote sus resultados y realice sus conclusiones. ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ CUESTIONARIO 1. Mencione ¿cuáles son las hormonas que están relacionadas con el ciclo estral?. 2. Mencione ¿cómo está dividido el ciclo estral?. 3. ¿Cuáles son las etapas en las que se divide el ciclo estral?. 4. Indique ¿cómo se manifiesta la presencia de los estrógenos y de la progesterona en el epitelio vaginal?. 5. ¿Qué utilidad le ve usted a la técnica de citología vaginal exfoliativa?. 6. ¿En qué especies de animales domésticos utilizaría usted esta técnica y porqué?. 51 BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM 52 PRÁCTICA No. 8 “MORFOLOGÍA Y FISIOLOGÍA DEL GAMETO SEXUAL FEMENINO (ÓVULO)” OBJETIVO Observar la estructura completa del gameto sexual femenino (óvulo) y analizar la función que éste desempeña dentro de la vida reproductiva de los animales domésticos, así como su proceso de desarrollo. FUNDAMENTO TEÓRICO El proceso de recolección de oocitos bovinos, consiste en la aspiración de éstos de un folículo De Graaf, dentro del cual el oocito se desarrolla, se capacita y finalmente madura. La fase de crecimiento del oocito incluye una serie de modulaciones de organelos e inclusiones, así como un período de transcripción del oocito, el cual es necesario para que éste alcance la meiosis y su estado de competencia. La transcripción del oocito incluye una función nucleolar (síntesis de RNAr) que es activada en el folículo secundario y es mantenida cuando el oocito alcanza un diámetro de alrededor de 110 m en un folículo terciario de 3 mm. A un diámetro de 100 a 110 m, el oocito gradualmente alcanza la competencia para sufrir la maduración meiótica y sostener el desarrollo embrionario. En el folículo dominante, el oocito sufre posteriores modificaciones ultraestructurales y alcanza su desarrollo total de competencia, a través de un proceso denominado "capacitación". La maduración final del ovocito hasta alcanzar la metafase II después de la estimulación de la LH sobre el folículo ovulatorio, es la culminación del proceso previo y equipa al oocito con un complemento cromosómico haploide y el aparato celular biológico especializado para la fertilización y el desarrollo embrionario inicial. Las características del oocito y su desarrollo dentro del folículo se detallan a continuación: a) Folículo primordial (34.5 3.7m). El oocito (27.9 3.3m) es rodeado por una capa simple de células de la granulosa aplanadas. El núcleo central del oocito es rodeado por mitocondrias redondas, retículo endoplásmico liso y rugoso y un pequeño complejo de Golgi. b) Folículo primario (46.1 6.1m). El oocito (31.6 4.3m) es rodeado por una capa simple de células de la granulosa cuboidales, y presenta algunas microvellosidades y mitocondrias alargadas. El núcleo excéntrico del oocito, pierde sus límites autoradiográficos. c) Folículo secundario (101.7 41.8m). El oocito (45.6 14.0m) es rodeado por más de una capa de células de la granulosa cuboidales. Aparecen pequeñas manchas en la zona pelúcida y se desarrollan huecos entre el oocito y las células de la granulosa y las microvellosidades se vuelven erectas. d) Folículo terciario temprano (1 mm). El antro folicular se ha desarrollado y el oocito (cerca de 80 m) es localizado en el cúmulus oophorus, rodeado por las células del cúmulus y capas más internas, como las células de la corona radiada, la cual posee proyecciones que penetran a la zona pelúcida. Las microvellosidades erectas han quedado embebidas en la zona pelúcida. 53 e) Folículo terciario (3 mm). El oocito tiene de 80 a 110 m de diámetro. En el oocito de menos de 100 m, el núcleo incluye un nucleolo que muestra bordes autorradiográficos distintos, mientras que en el oocito de 100 a 110 m, el núcleo muestra bordes autorradiográficos moderados. f) Folículo terciario tardío (5 mm). El oocito mide más de 110 m de diámetro. Dentro del oocito, los organelos han sido dislocados hacia la periferia, las microvellosidades han sido liberadas de la zona pelúcida y el núcleo periférico pierde sus bordes autorradiográficos. La maduración final del oocito dentro del folículo ovulatorio ocurre por la estimulación de la LH. El objetivo de dicha maduración, es producir un oocito secundario con un número haploide, el cual es equipado con toda la maquinaria celular biológica necesaria para una fertilización y desarrollo embrionario exitosos. El citoplasma se caracteriza por un contínuo desarrollo en el almacenamiento de lípidos, reducción del aparato de Golgi y alineamiento de los gránulos corticales formando una barrera estructural en contra de la polispermia. Además, la aparición de numerosos ribosomas junto a los cromosomas es debida a una redistribución de los mismos, puesto que en esta fase su síntesis ha cesado. Con estas modificaciones, el oocito es considerado maduro y ha desarrollado y modulado la maquinaria biológica celular para sostener la fertilización y el desarrollo embrionario inicial. El incremento gradual en los lípidos del oocito a través de su capacitación y maduración final, es probablemente de gran importancia para la fase inicial del desarrollo embrionario, ya que los lípidos representan la energía utilizada para el desarrollo del blastocisto. El ciclo estral bovino es caracterizado por una serie de 2 ó 3 ondas foliculares. Cada una de ellas es precedida por un incremento sérico de hormona folículo estimulante (FSH), la cual inicia el crecimiento de un grupo de folículos de 3 mm o más. Basado en las observaciones con ultrasonido, la primer onda folicular se considera que inicia el día 1 del ciclo, donde el día 0 es definido como el día del estro. Al tercer día, el primer folículo que emergió alcanza el tamaño de 8 mm mientras que los demás se detienen en 4 mm, considerándose estos últimos como subordinados mientras que el primero es el dominante. Una onda de crecimiento folicular involucra el desarrollo sincrónico de un grupo de folículos. Una onda folicular está caracterizada por el desarrollo de un gran folículo dominante, y varios folículos subordinados que invariablemente se atresian. Algunos investigadores han observado una preponderancia de ciclos estruales de 2-ondas mientras que otros indican una predominancia de ciclos de 3-ondas. Una onda folicular tiene normalmente una duración de 8 a 10 días y el número de ondas foliculares que ocurren durante un ciclo estral depende del período de vida del cuerpo lúteo. Generalmente se presenta de 2 a 4 ondas foliculares durante el ciclo estral, y aproximadamente el 75% de vacas presentan 3 ondas foliculares. Para el patrón de 2-ondas, la emergencia de la primera onda se detectó por ultrasonografía, en promedio, en el día 0 (día de la ovulación) y la de la segunda onda en el día 10. Cada onda estuvo compuesta de varios folículos individualmente identificables a partir de un diámetro de 4 mm. El folículo dominante de la primera onda tuvo una fase de 54 crecimiento (días 0 a 6), una fase aparentemente estática (días 6 a 12) y una fase de regresión (día 12 en adelante); la tasa de crecimiento fue más rápida que la fase de regresión. El folículo dominante de la onda 2 fue ovulatorio y el máximo diámetro alcanzado no difirió de la del primero (promedio 16 mm). Los folículos subordinados en cada onda incrementaron su diámetro durante unos pocos días, el más grande de los cuales alcanzó un diámetro promedio de 8 mm, tres días después de la emergencia de la onda, luego se mantuvieron o sufrieron regresión. Para el patrón de 3-ondas, las emergencias de las ondas se detectaron a los días 0, 9 y 16; las dos primeras fueron anovulatorias. Las características del folículo dominante de la primera onda no fueron diferentes entre el patrón de 2-ondas y el patrón de 3-ondas, pero la onda 2 emergió 1 a 2 días más temprano en este último. El patrón de crecimiento contínuo en ondas se mantiene al menos durante los primeros 100 días de preñez, y durante el período postparto en vacas lecheras y en vacas de carne. No se han realizado estudios ultrasónicos críticos de la dinámica folicular durante los dos últimos trimestres de gestación. En estudios recientes de vaquillonas prepuberales, la composición de las ondas foliculares no ovulatorias fue muy similar a la de animales maduros y se concluyó que los mecanismos que controlan el “bien ordenado” fenómeno de emergencia de ondas, selección y regresión folicular se establecen muy tempranamente en el período prepuberal, tan temprano como 2 semanas de edad. MATERIAL Y EQUIPO 1. De Laboratorio: - Un microscopio estereoscópico por equipo - Dos cajas de Petri por equipo - Una jeringa de 10 ml con aguja No. 18 por equipo - Un vaso de precipitado de 100 ml por equipo - Un par de guantes para palpación por alumno 2. Biológico: - Cuatro ovarios de vaca y cuatro de cerda por equipo METODOLOGÍA 1. Los ovarios son recolectados de hembras bovinas y porcinas sacrificadas en rastro en cualquier estado reproductivo (gestante o vacía) y se depositan en un termo que contenga solución salina fisiológica a temperatura de 28 a 30ºC. De esta manera son transportados al laboratorio. 2. Una vez en el laboratorio, los ovarios se lavan con agua destilada y se colocan en un recipiente con solución salina. 3. Se coloca un guante para palpación en la mano izquierda, con la cual se toma un ovario y se seca con una sanita. 4. Con la mano derecha se toma la jeringa (con la aguja conectada) y se aspira 1 ml de solución madre. 55 5. Posteriormente se procede a recolectar los oocitos con la ayuda de la jeringa, succionando éstos de los folículos, inmediatamente después de atravesar la pared folicular. 6. En una caja de petri se colocan 3 ml de solución madre y sobre ésta se colocan los oocitos recolectados. 7. Con la misma jeringa se eliminan las burbujas (succionando). 8. Se observa la caja de petri al estereoscopio para identificar los componentes estructurales que conforman al ovocito. 9. La evaluación estructural del ovocito, que es representativa de su funcionalidad, se realiza analizando las siguientes estructuras: - Células de la granulosa - Cúmulus oophorus - Corona radiada - Zona pelúcida - Membrana vitelina - Ooplasma (citoplasma del ovocito). 10. Se analizará la correlación existente entre la integridad de la morfología del ovocito y su función. OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES Realice sus observaciones, anote sus resultados y haga sus conclusiones. 56 CUESTIONARIO 1. ¿En qué consiste la capacitación del oocito?. 2. ¿Cuántos oocitos es posible recolectar al mismo tiempo de un ovario de bovino?. 3. ¿En qué consiste la maduración final del oocito?. 4. ¿Qué estructuras del ovocito participan para evitar la polispermia? 5. ¿Qué pasaría si más de un espermatozoide fecunda a un ovocito? 6. ¿En qué consiste una onda folicular? 7. Explique la diferencia entre un folículo dominante y uno subordinado: 8. Describa las etapas en las que se desarrolla una onda folicular completa: 57 BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM 58 PRÁCTICA No. 8 “MORFOLOGÍA Y FISIOLOGÍA DEL GAMETO SEXUAL FEMENINO (ÓVULO)” OBJETIVO Observar la estructura completa del gameto sexual femenino (óvulo) y analizar la función que éste desempeña dentro de la vida reproductiva de los animales domésticos, así como su proceso de desarrollo. FUNDAMENTO TEÓRICO El proceso de recolección de oocitos bovinos, consiste en la aspiración de éstos de un folículo De Graaf, dentro del cual el oocito se desarrolla, se capacita y finalmente madura. La fase de crecimiento del oocito incluye una serie de modulaciones de organelos e inclusiones, así como un período de transcripción del oocito, el cual es necesario para que éste alcance la meiosis y su estado de competencia. La transcripción del oocito incluye una función nucleolar (síntesis de RNAr) que es activada en el folículo secundario y es mantenida cuando el oocito alcanza un diámetro de alrededor de 110 m en un folículo terciario de 3 mm. A un diámetro de 100 a 110 m, el oocito gradualmente alcanza la competencia para sufrir la maduración meiótica y sostener el desarrollo embrionario. En el folículo dominante, el oocito sufre posteriores modificaciones ultraestructurales y alcanza su desarrollo total de competencia, a través de un proceso denominado "capacitación". La maduración final del ovocito hasta alcanzar la metafase II después de la estimulación de la LH sobre el folículo ovulatorio, es la culminación del proceso previo y equipa al oocito con un complemento cromosómico haploide y el aparato celular biológico especializado para la fertilización y el desarrollo embrionario inicial. Las características del oocito y su desarrollo dentro del folículo se detallan a continuación: g) Folículo primordial (34.5 3.7m). El oocito (27.9 3.3m) es rodeado por una capa simple de células de la granulosa aplanadas. El núcleo central del oocito es rodeado por mitocondrias redondas, retículo endoplásmico liso y rugoso y un pequeño complejo de Golgi. h) Folículo primario (46.1 6.1m). El oocito (31.6 4.3m) es rodeado por una capa simple de células de la granulosa cuboidales, y presenta algunas microvellosidades y mitocondrias alargadas. El núcleo excéntrico del oocito, pierde sus límites autoradiográficos. i) Folículo secundario (101.7 41.8m). El oocito (45.6 14.0m) es rodeado por más de una capa de células de la granulosa cuboidales. Aparecen pequeñas manchas en la zona pelúcida y se desarrollan huecos entre el oocito y las células de la granulosa y las microvellosidades se vuelven erectas. j) Folículo terciario temprano (1 mm). El antro folicular se ha desarrollado y el oocito (cerca de 80 m) es localizado en el cúmulus oophorus, rodeado por las células del cúmulus y capas más internas, como las células de la corona radiada, la cual posee proyecciones que penetran a la zona pelúcida. Las microvellosidades erectas han quedado embebidas en la zona pelúcida. 59 k) Folículo terciario (3 mm). El oocito tiene de 80 a 110 m de diámetro. En el oocito de menos de 100 m, el núcleo incluye un nucleolo que muestra bordes autorradiográficos distintos, mientras que en el oocito de 100 a 110 m, el núcleo muestra bordes autorradiográficos moderados. l) Folículo terciario tardío (5 mm). El oocito mide más de 110 m de diámetro. Dentro del oocito, los organelos han sido dislocados hacia la periferia, las microvellosidades han sido liberadas de la zona pelúcida y el núcleo periférico pierde sus bordes autorradiográficos. La maduración final del oocito dentro del folículo ovulatorio ocurre por la estimulación de la LH. El objetivo de dicha maduración, es producir un oocito secundario con un número haploide, el cual es equipado con toda la maquinaria celular biológica necesaria para una fertilización y desarrollo embrionario exitosos. El citoplasma se caracteriza por un contínuo desarrollo en el almacenamiento de lípidos, reducción del aparato de Golgi y alineamiento de los gránulos corticales formando una barrera estructural en contra de la polispermia. Además, la aparición de numerosos ribosomas junto a los cromosomas es debida a una redistribución de los mismos, puesto que en esta fase su síntesis ha cesado. Con estas modificaciones, el oocito es considerado maduro y ha desarrollado y modulado la maquinaria biológica celular para sostener la fertilización y el desarrollo embrionario inicial. El incremento gradual en los lípidos del oocito a través de su capacitación y maduración final, es probablemente de gran importancia para la fase inicial del desarrollo embrionario, ya que los lípidos representan la energía utilizada para el desarrollo del blastocisto. El ciclo estral bovino es caracterizado por una serie de 2 ó 3 ondas foliculares. Cada una de ellas es precedida por un incremento sérico de hormona folículo estimulante (FSH), la cual inicia el crecimiento de un grupo de folículos de 3 mm o más. Basado en las observaciones con ultrasonido, la primer onda folicular se considera que inicia el día 1 del ciclo, donde el día 0 es definido como el día del estro. Al tercer día, el primer folículo que emergió alcanza el tamaño de 8 mm mientras que los demás se detienen en 4 mm, considerándose estos últimos como subordinados mientras que el primero es el dominante. Una onda de crecimiento folicular involucra el desarrollo sincrónico de un grupo de folículos. Una onda folicular está caracterizada por el desarrollo de un gran folículo dominante, y varios folículos subordinados que invariablemente se atresian. Algunos investigadores han observado una preponderancia de ciclos estruales de 2-ondas mientras que otros indican una predominancia de ciclos de 3-ondas. Una onda folicular tiene normalmente una duración de 8 a 10 días y el número de ondas foliculares que ocurren durante un ciclo estral depende del período de vida del cuerpo lúteo. Generalmente se presenta de 2 a 4 ondas foliculares durante el ciclo estral, y aproximadamente el 75% de vacas presentan 3 ondas foliculares. Para el patrón de 2-ondas, la emergencia de la primera onda se detectó por ultrasonografía, en promedio, en el día 0 (día de la ovulación) y la de la segunda onda en el día 10. Cada onda estuvo compuesta de varios folículos individualmente identificables a partir de un diámetro de 4 mm. El folículo dominante de la primera onda tuvo una fase de 60 crecimiento (días 0 a 6), una fase aparentemente estática (días 6 a 12) y una fase de regresión (día 12 en adelante); la tasa de crecimiento fue más rápida que la fase de regresión. El folículo dominante de la onda 2 fue ovulatorio y el máximo diámetro alcanzado no difirió de la del primero (promedio 16 mm). Los folículos subordinados en cada onda incrementaron su diámetro durante unos pocos días, el más grande de los cuales alcanzó un diámetro promedio de 8 mm, tres días después de la emergencia de la onda, luego se mantuvieron o sufrieron regresión. Para el patrón de 3-ondas, las emergencias de las ondas se detectaron a los días 0, 9 y 16; las dos primeras fueron anovulatorias. Las características del folículo dominante de la primera onda no fueron diferentes entre el patrón de 2-ondas y el patrón de 3-ondas, pero la onda 2 emergió 1 a 2 días más temprano en este último. El patrón de crecimiento contínuo en ondas se mantiene al menos durante los primeros 100 días de preñez, y durante el período postparto en vacas lecheras y en vacas de carne. No se han realizado estudios ultrasónicos críticos de la dinámica folicular durante los dos últimos trimestres de gestación. En estudios recientes de vaquillonas prepuberales, la composición de las ondas foliculares no ovulatorias fue muy similar a la de animales maduros y se concluyó que los mecanismos que controlan el “bien ordenado” fenómeno de emergencia de ondas, selección y regresión folicular se establecen muy tempranamente en el período prepuberal, tan temprano como 2 semanas de edad. MATERIAL Y EQUIPO 1. De Laboratorio: - Un microscopio estereoscópico por equipo - Dos cajas de Petri por equipo - Una jeringa de 10 ml con aguja No. 18 por equipo - Un vaso de precipitado de 100 ml por equipo - Un par de guantes para palpación por alumno 2. Biológico: - Cuatro ovarios de vaca y cuatro de cerda por equipo METODOLOGÍA 1. Los ovarios son recolectados de hembras bovinas y porcinas sacrificadas en rastro en cualquier estado reproductivo (gestante o vacía) y se depositan en un termo que contenga solución salina fisiológica a temperatura de 28 a 30ºC. De esta manera son transportados al laboratorio. 2. Una vez en el laboratorio, los ovarios se lavan con agua destilada y se colocan en un recipiente con solución salina. 3. Se coloca un guante para palpación en la mano izquierda, con la cual se toma un ovario y se seca con una sanita. 4. Con la mano derecha se toma la jeringa (con la aguja conectada) y se aspira 1 ml de solución madre. 61 5. Posteriormente se procede a recolectar los oocitos con la ayuda de la jeringa, succionando éstos de los folículos, inmediatamente después de atravesar la pared folicular. 6. En una caja de petri se colocan 3 ml de solución madre y sobre ésta se colocan los oocitos recolectados. 7. Con la misma jeringa se eliminan las burbujas (succionando). 8. Se observa la caja de petri al estereoscopio para identificar los componentes estructurales que conforman al ovocito. 9. La evaluación estructural del ovocito, que es representativa de su funcionalidad, se realiza analizando las siguientes estructuras: - Células de la granulosa - Cúmulus oophorus - Corona radiada - Zona pelúcida - Membrana vitelina - Ooplasma (citoplasma del ovocito). 10. Se analizará la correlación existente entre la integridad de la morfología del ovocito y su función. OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES Realice sus observaciones, anote sus resultados y haga sus conclusiones. 62 CUESTIONARIO 1. ¿En qué consiste la capacitación del oocito?. 2. ¿Cuántos oocitos es posible recolectar al mismo tiempo de un ovario de bovino?. 3. ¿En qué consiste la maduración final del oocito?. 4. ¿Qué estructuras del ovocito participan para evitar la polispermia? 5. ¿Qué pasaría si más de un espermatozoide fecunda a un ovocito? 6. ¿En qué consiste una onda folicular? 7. Explique la diferencia entre un folículo dominante y uno subordinado: 8. Describa las etapas en las que se desarrolla una onda folicular completa: BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM 63 PRÁCTICA No. 9 “MOTILIDAD, MORFOLOGÍA Y FISIOLOGÍA DEL GAMETO SEXUAL MASCULINO (ESPERMATOZOIDE)” OBJETIVO Evaluar la motilidad, así como la estructura completa del gameto sexual masculino (espermatozoide) y analizar la función que éste desempeña dentro de la vida reproductiva de los animales domésticos, así como su proceso de desarrollo. FUNDAMENTO TEÓRICO Los espermatozoides o células espermáticas se empiezan a desarrollar a partir del epitelio seminífero que revisten los tubos seminíferos, los cuales están compuestos por dos tipos de células básicas: a) las células de sertolli y b) las células germinales en desarrollo. El desarrollo del espermatozoide, es un proceso de división celular que comienza con la división de una célula inmóvil de forma redondeada, para terminar en una célula alargada y altamente móvil. Por medio de este proceso de divisiones celulares el número de cromosomas se reduce a la mitad; todo este fenómeno se divide en dos parte distintas que son: la espermatocitogénesis y la espermiogénesis. a) Espermatocitogénesis: Las células originales durante el proceso de espermatogénesis son las espermatogonias tipo A, las cuales son elementales; contienen dos o más nucleolos y se encuentran en estado de latencia sobre la membrana basal hasta que son activadas para que se empiecen a dividir por medio del proceso de mitosis. La espermatogonia tipo A se divide para formar dos células espermatogonias tipo A, una latente y otra activa. La espermatogonia tipo A activa sufre una serie de divisiones que la llevan a formar 16 espermatocitos primarios; los cuales contienen todavía el número de cromosomas de 2N. La primera división meiótica inicia cuando cada espermatocito primario se divide para formar dos espermatocitos secundarios, los cuales se van moviendo hacia la luz del túbulo a medida que se van presentando las divisiones. Después de la división de los espermatocitos secundarios (segunda meiosis), se forman las espermátides, a partir de cada uno. Durante las dos divisiones celulares que cambian el espermatocito primario a espermátide, se encuentran bajo la influencia de la hormona masculina llamada Testosterona, el número de cromosomas se reduce a la mitad de modo que la espermátide tiene un número de cromosomas 1N. b) Espermiogénesis: Los espermatides se transforman en espermatozoides después de sufrir una serie de cambios morfológicos progresivos. Estos cambios incluyen la condensación de la cromatina nuclear, la formación de la cola espermática o aparato flagelar y el desarrollo del caparazón acrosómico. Todo este proceso se lleva a cabo mediante 4 fases que son: 1ª. De Golgi, 2ª. Del capuchón, 3ª. Acrosómica y 4ª. De maduración. 64 1. Fase de Golgi: Esta fase se caracteriza por la formación de gránulos proacrosómicos positivos a la prueba de PAS (Periodic Acid Shiff), dentro del aparato de golgi. Dicho proceso se lleva a cabo por la coalescencia de los gránulos en uno solo; la adherencia de los gránulos para formar una vesícula acrosómica, la cual se empieza a aplanar sobre la superficie del núcleo y las etapas tempranas de la formación de la cola en el extremo opuesto al de la formación del gránulo acrosómico. Esta formación de la cola se realiza cuando las mitocondrias emigran para formar la estructura helicoidal, mientras que el citoplasma sigue alargándose. 2. Fase del Capuchón: Se caracteriza por la diseminación del gránulo acrosómico, el cuál se adhiere sobre la superficie del núcleo de la espermátide. Este proceso se continúa, hasta que cerca de dos terceras partes de la porción antral del núcleo quedan cubiertas por una delgada membrana de doble pared que se une íntimamente a la membrana nuclear. Durante esta fase de la formación del acrosoma, los componentes que desarrollan la cola, formados por elementos del centriolo, se alargan. Durante las primeras etapas del crecimiento de la cola se asemeja a la estructura de un cilio formado por dos túbulos centrales rodeados por nueve pares de túbulos. 3. Fase Acrosómica: Durante esta fase ocurren cambios importantes en el núcleo, acrosoma y cola de las espermátides en crecimiento. Dichos cambios se facilitan por medio de la rotación de cada espermátide, de tal manera que el acrosoma se dirige hacia la base o pared externa del tubo seminífero y la cola hacia la luz. Los cambios nucleares comprenden la condensación de la cromatina en gránulos densos y la reformación del núcleo esferoide en uno alargado y aplanado. El acrosoma íntimamente adherido al núcleo también se condensa y se alarga. Estas modificaciones en la forma del núcleo y del acrosoma parecen ser moldeadas por las células de Sertolli que los rodean. Los cambios en la morfología nuclear se acompañan de desplazamientos del citoplasma hasta la parte caudal del núcleo, mismo que rodea la porción proximal de la cola en desarrollo. Dentro de este citoplasma los microtúbulos se asocian y forman una vaina cilíndrica temporal llamada “manguito”, mismo que se proyecta hacia la parte posterior desde el borde caudal del acrosoma, donde rodea laxamente al acrosoma. Dentro del manguito cilíndrico se encuentra una estructura citoplasmática especializada llamada “cuerpo cromatoide”, el cual se condensa alrededor del axonema y da una estructura anular llamada “anillo”, el cual primero se forma cerca del centriolo proximal, y después se desarrolla a lo largo de la cola. Las mitocondrias previamente distribuidas en todo el citoplasma de la espermátide, empiezan a concentrarse cerca del axonema y forman una vaina que caracteriza la pieza media de la cola. 4. Fase de Maduración: Esta fase incluye la transformación final de la espermátide. En esta fase se forma una vaina fibrosa y las nueve fibras gruesas que cubren al axonema, éstas parecen asociarse en forma individual con los nueve pares de microtúbulos del axonema y se continúan con las columnas en el cuello de la pieza de conexión de la espermátide. El anillo se encuentra desde la unión más cerca del núcleo y por todo lo largo de la cola hasta llegar 65 al punto donde se separa la pieza media de la pieza principal de la cola. Las mitocondrias se unen con fuerza para formar la vaina continua que se extiende desde el cuello hasta el anillo. Durante la última etapa de la espermiogénesis el manguito desaparece y las células de Sertolli forman el citoplasma restante después de alargarse la espermátide en un lóbulo esferoidal llamado “cuerpo residual”. La formación de este cuerpo completa la maduración final y las espermátides alargadas están listas para liberarse como espermatozoides. El espermatozoide entero está cubierto por una membrana celular, la cual está íntimamente ligada a la base de la cabeza y al extremo terminal de la parte intermedia de la cola. La cabeza del espermatozoide es un núcleo homogéneo cubierto anteriormente por el acrosoma que consta de tres capas: 1) la más anterior, que es la de mayor importancia ya que contiene sustancias de tipo enzimático, que le ayudan a la penetración del óvulo. 2) La intermedia y 3) La interna. La base de la cabeza se hace angosta en el punto de fijación de la porción intermedia y de la cola. La cola normal, consta de las estructuras presentes en la mayoría de los flagelos, los cuales poseen 9 fibras externas y 9 internas menos largas ya que rodean a 2 fibras centrales, éstas se recubren por medio de la hélice mitocondrial de la porción intermedia del espermatozoide. La gota citoplasmática se observa cerca del cuello o en cualquier otra parte a lo largo del segmento intermedio de la cola. La cola o flagelo se divide en una pieza principal y otra terminal, la primera es continuación de la estructura del segmento intermedio sin la espiral de mitocondrias, pero está rodeada por una vaina fibrosa. La espermatogénesis ocurre en forma continúa dentro de los tubos seminíferos, de modo que las regiones adyacentes pueden tener diferentes etapas de ciclo espermatogénico. El tiempo para complementar un ciclo del tubo seminífero y para que se lleve a cabo la espermatogénesis es de 13.5 y 54 días en el toro, de 10.4 a 49 días en el carnero y en el verraco de 8.6 a 34.4 días. Morfología: La condición morfológica de las células espermáticas, es el reflejo de la espermatogénesis, la cual si se ha disturbado, se manifestará en la producción de células anormales que se asocian a una baja fertilidad, si la incidencia es seria o el defecto morfológico excede el 20%. Un defecto en la célula espermática es simplemente una desviación (de una o más partes celulares) de las normales. La morfología espermática tiene el potencial de indicar que tipo de problema existe en el animal. Algunas de las muchas razones por las cuales se producen células espermáticas anormales, incluyen la obesidad, infecciones, enfermedades, hipoplasia testicular, anormalidades cromosomales y herencia de un gen anormal. Cualquier desviación que presente la célula espermática se considera anormal. Un estudio morfológico permite distinguir los dos tipos de espermatozoides. Por lo general las anormalidades se dividen en dos clases: a) Primarias y b) Secundarias. 66 a) Anormalidades Primarias: Este tipo de anormalidad es de origen testicular, y se presenta cuando llega a ocurrir una falla durante el proceso espermatogénico y ésta no se corrigió mientras el espermatozoide pasaba por el sistema de conductos. Este tipo de anormalidades se presenta en la cabeza, en el segmento intermedio y en la cola. Anormalidades de cabeza: Dentro de las anormalidades de cabeza, los espermatozoides pueden presentar cualquiera de las siguientes irregularidades. 1. Piriforme o en forma de pera. 2. Redondeada. 3. Alargados y Estrechos. 4. Microcefálicos o de cabeza pequeña. 5. Macrocefálicos o de cabeza grande. 6. Dobles o Mellizos. 7. De acrosoma anormal. Las primeras anormalidades de cabeza tienen nombres descriptivos, ya que son nombrados de acuerdo a la forma y tamaño que presenta la cabeza. La anormalidad de tipo acrosomal tiene mucha importancia, ya que está íntimamente relacionada con la fertilidad. Este acrosoma presenta una forma peculiar, ya que se encuentra formando un pliegue sobre el borde apical del espermatozoide, la integridad está correlacionada con la fertilidad. El acrosoma se estropea en forma gradual y comienza con un ensanchamiento de la porción anterior que luego se deteriora y se desprende; se han descrito acrosomas incompletos, arrugados o con gránulos y según las investigaciones realizadas, la condición acrosómica es hereditaria. Fig. 13 Anormalidades de la cabeza del espermatozoide Segmento intermedio: Estos son los defectos más comunes, sin embargo, existe mucha variación respecto a los tipos; los más comunes son colas dobles y algunos investigadores suponen que la inserción abaxial de la cola es normal. Dentro de los tipos de anormalidades que se presenta en esta parte son: 1. Doblado o retorcido en ángulo recto. 2. Doble o mellizo. 3. Agrandado o hinchado. 4. Punto de inserción descentrado o abaxial. 67 De cola: El enrollamiento es la anormalidad más común de la cola y de hecho del espermatozoide entero. La cola puede comenzar en la base de la cabeza y envolverla o bien presentar una espiral en su extremo libre. En la mayoría de los casos, la espiral es muy cerrada y no se le debe de confundir con la espermátide enfriada bruscamente, ya que éste último presenta la cola enrollada de forma uniforme y gradual, formando una media luna y casi nunca se curva más de 180º. b) Anormalidades Secundarias: Estas anormalidades aparecen durante el paso de los espermatozoides por los sistemas de conductos, después de salir de los tubos seminíferos y del testículo en sí. Es conveniente hacer una evaluación de este tipo de anormalidades, ya que son de mucha importancia en el proceso de fertilidad. Dentro de este grupo encontramos las siguientes anormalidades: 1. Cabeza desprendida. 2. Gota citoplasmática en cuello o cola. 3. Cola en forma de gancho. 4. Cápsula desprendida de la cabeza. Fig. 14 Anormalidades de la cola del espermatozoide Por lo general, el desprendimiento de la cabeza ocurre durante la manipulación de la muestra y por ello se debe de manejar con mucha precaución, evitando todo aquel movimiento brusco o violento, también se puede desprender al realizar un frotis para colorear los espermatozoides. La gota citoplasmática nos puede indicar que el espermatozoide fue eyaculado antes de completar su maduración y probablemente que el macho esté sobreutilizado y por lo tanto necesita descansar. Otras anormalidades frecuentes en el eyaculado son: Formaciones semejante a medusas. Células epiteliales. Leucocitos. Eritrocitos. Células espermiogénicas primordiales o en vía de desarrollo. La presencia de estas inclusiones en el eyaculado, indican algunas alteraciones en el aparato reproductor y en estos casos, conviene hacer un análisis detallado para poder detectar enfermedades de tipo reproductivo. 68 Existe mucha relación entre el porcentaje de células anormales y la fertilidad. Una serie de investigaciones han demostrado que la tasa de concepción es de 66% para 10 toros con un 10 a 20% de anormalidades; 62% para dos toros con un 20 a 30% de anormalidades y 61% para cinco toros con un 30 a 45% de anormalidades; con estas investigaciones se ha llegado a la conclusión de que un porcentaje del 23% o mas de células anormales, disminuye considerablemente la tasa de concepción; por otra parte las células anormales no guardan ninguna relación con la edad ni el peso de animal, así como con la estación del año o la nutrición. MATERIAL Y EQUIPO 1. De Laboratorio: Un microscopio por equipo Un baño maría por grupo Un termómetro por grupo 10 portaobjetos y cubreobjetos por equipo 10 ml de colorante eosina-nigrosina por grupo Un frasco de aceite de inmersión por grupo Un paquete de papel sanita por equipo 2. Biológico: Dos dosis de semen bovino por equipo Una dosis de semen porcino por equipo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. METODOLOGÍA Se utilizará semen fresco de sementales bovinos y porcinos, que serán transportados en su momento al Laboratorio de Reproducción Animal en baño maría a 35 a 37ºC. Se colocará una muestra del semen bovino en un portaobjetos, mientras que en otro se depositará una gota de semen porcino, realizando este proceso en un lugar a temperatura ambiente y sin corrientes de aire. Observe la muestra al microscopio con objetivo 4X y 10 X. Observe la motilidad masal y el tipo de motilidad que presentan los espermatozoides. Posteriormente enfoque con el objetivo 40X para determinar la motilidad individual de los espermatozoides y observar aquellas células que presenten algún movimiento anormal. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre su cubreobjetos y ahora observe con el objetivo 100X, para determinar el tipo de anormalidades espermáticas que se presenten. Coloque otra gota de semen en uno de los extremos del portaobjetos y sobre ella coloque una gota de colorante de Eosina-Nigrosina, con la ayuda de otro portaobjetos mezcle y deslice la muestra para la formación de un frotis, el cual deberá dejarlo secar a temperatura ambiente por unos 3-5 minutos. Coloque el frotis en el microscopio y observe con objetivos 10 y 40X. 69 8. Coloque una gota de aceite de inmersión y observe con objetivo 100X y proceda a realizar su conteo de células anormales en 10 campos diferentes. 9. Colocar otra gota de colorante en un portaobjetos y agregarle una gota de semen porcino coloque sobre ésta un cubreobjetos y observe al microscopio las anormalidades de tipo acrosomal con objetivo 40X y 100X. OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES Realice sus observaciones, anote sus resultados y haga sus conclusiones. CUESTIONARIO 1. Esquematice en forma gráfica las estructuras que componen al espermatozoide. 2. Explique brevemente la función de las estructuras que conforman el espermatozoide. 3. ¿Cuál es la importancia que tiene el hacer una evaluación de las anormalidades morfológicas?. 4. ¿Qué importancia tiene el conocer el porcentaje de células anormales en una muestra de semen?. 70 5. ¿Con qué porcentaje de células espermáticas anormales usted califica a una muestra de semen como buena, como regular y como mala?. 6. Describa las partes que componen al espermatozoide. 7. ¿Qué tamaño presentan los espermatozoides en las diferentes especies domésticas?. 8. Explique ¿cómo se clasifican las anormalidades en los diferentes animales domésticos e indique a qué se deben?. 9. Explique ¿qué tipo de anormalidades considera usted más importantes y por qué?. 10. Explique ¿qué sucede cuando un toro está sobretrabajado?. 11. Explique ¿qué puede suceder cuando un toro es sobreestimulado por medio del electroeyaculador?. BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM. 71 PRÁCTICA No. 10 “CAPACITACIÓN ESPERMÁTICA EN LOS ANIMALES DOMÉSTICOS” OBJETIVO Observar y comprender el proceso de capacitación espermática a través de la evaluación microscópica de la presencia de reacción acrosomal en el semen bovino, utilizando para ello medios de cultivo específicos. FUNDAMENTO TEÓRICO La Capacitación Espermática (CE) es definida como una serie de eventos que capacitan al esperma para unirse al ovocito, sufriendo una Reacción Acrosómica (RA) en respuesta a la zona pelúcida, con las fuentes de glucoproteínas que rodean al ovocito. Durante la RA, ocurre una afluencia excesiva de Ca+2, provocando exocitosis en el acrosoma y la liberación de estas enzimas. La RA es necesaria para la fertilización porque las enzimas favorecen la penetración del espermatozoide. Fig. 15 Capacitación espermática Otros eventos que coinciden con la CE son la hiperpolarización de la membrana, absorción de Ca+2, elevación del cAMP, activación de la kinasa, fosforilación proteica y la producción de especies reactivas de oxígeno conocidas con las siglas ROS. Los espermatozoides no adquieren su capacidad total de fecundación sino hasta después de que son transportados en el sistema reproductor femenino, y deben experimentar cambios fisiológicos adicionales (CE) antes de poder penetrar a la zona pelúcida y fusionarse con el vitelio de los óvulos; la CE permite que el espermatozoide pase por la RA normal antes de la fecundación. Bioquímicamente los espermas se caracterizan por el aumento en la permeabilidad de la membrana plasmática, disminución en el contenido de fosfolípidos y cambios en su carga neta. El modelo más aceptado de los procesos que acompañan a la capacitación implica la eliminación de la superficie de los factores decapacitantes, con lo que se logra la desestabilización de la membrana plasmática y un cambio que va a favorecer la 72 interacción con la membrana acrosomal externa. El tiempo e incluso el proceso varía según la especie, se sabe que las mayores tasas de concepción se obtienen cuando la vaca es inseminada 12 a 20 h antes de la ovulación. Al parecer, los ovinos necesitan un período de capacitación de 1.5 h, en porcinos si ocurre debe ser muy rápida, se ignora lo que sucede en los primates y el hombre. Se descubrió un factor de descapacitación en los equinos, pero no hay evidencia de capacitación. En investigaciones realizadas en ratas y conejos, se descubrió que los espermatozoides deben permanecer varias horas en el aparato reproductor de la hembra. Para la CE in vitro, el espermatozoide se debe de separar del plasma seminal, diluyente, crioprotectores y células no viables antes de la FIV. Existen diferentes métodos para purificar el semen: la centrifugación en gradientes de Percoll, swing-up, BSA (albúmina sérica), lavado por centrifugación y la filtración por el método de fibra de vidrio son comúnmente los más utilizados para la separación espermática. Siendo el primer método el más utilizado en los laboratorios de FIV. El Percoll consiste en partículas de sílica coloidal con un diámetro de 15 a 30 mm las cuales están cubiertas con polivinilpirrolidona (PVP), que es un medio de gradiente de densidad que se puede utilizar para la purificación de células, virus y organelos, considerado completamente no tóxico para las células. La separación espermática con el método de Percoll es simple y resulta en un alto porcentaje de células mótiles y una fracción de espermatozoides limpia, la recolección de espermatozoides es de alrededor del 50 %, lo cual representa de 5 a 10 veces más que el método Swim-Up. En los mamíferos, el semen fresco eyaculado es incapaz de fertilizar al óvulo, la maduración se lleva a través de su recorrido dentro del aparato genital femenino. A este proceso se le llama CE, la cual permite al espermatozoide llegar a la zona pelúcida, donde ésta induce la RA y el espermatozoide fertiliza al óvulo. Numerosos estudios han demostrado que el espermatozoide sufre muchos cambios estructurales y bioquímicos durante el proceso de la capacitación, como cambios en la membrana y permeabilidad, incremento de Ca+2 intracelular, alcalinización citoplasmática, activación de canales de ión, cambio interno del pH y generación de oxígeno reactivo. La capacitación también está asociada con la fosforilación de la proteína tirosina, la cual está regulada vía el cAMP y el decremento de la relación colesterol: fosfolípidos en la membrana. La hiperactivación es un cambio radical en la motilidad del espermatozoide, viéndose un espermatozoide vigoroso con un movimiento asimétrico de la cola y frecuentes cambios de dirección. El incremento en la hiperactivación está asociada con la capacitación, ya que se cree que es resultado de la redistribución de los componentes de la membrana durante la capacitación. En el tracto genital femenino se encuentran las lipoproteínas de alta densidad (HDL), y están presentes en los folículos y el fluido del oviducto, los cuales inducen la CE., las HDL facilitan la salida de colesterol del espermatozoide, lo cual ocurre durante las primeras etapas de la capacitación. Se ha encontrado variación en la concentración de las HDL en los folículos y fluido del oviducto durante el ciclo estrual, siendo los niveles más altos durante el periodo de ovulación y los más bajos durante el resto del ciclo. 73 La capacitación en bovinos comienza tan pronto como el espermatozoide es eyaculado y se mezcla con las secreciones de la vesícula seminal. Las vesículas seminales producen las proteínas del plasma seminal bovino (BSP), las cuales inducen inicialmente la salida de colesterol del espermatozoide, lo cual tiene lugar después de la interacción con los glucosaminoglicanos como la heparina (GAG) o con las HDL en el oviducto. La heparina induce la capacitación cuando las proteínas del BSP se ligan al espermatozoide y actúan como receptores de la heparina. La heparina puede interactuar con la membrana del espermatozoide por medio de las proteínas del BSP para inducir una serie de eventos intracelulares tales como el incremento del pH, Ca+2 y cAMP. Existen diferentes tipos de métodos para evaluar la CE, pero el método ideal para determinar el porcentaje de espermatozoides con RA debe ser preciso, consistente, rápido, aplicable a un número pequeño de células, inofensivo a las funciones del espermatozoide, susceptible de ser usado en fluidos biológicos y ambientes en los cuales se encuentra el espermatozoide y que sea capaz de distinguir una RA normal de una falsa. El método de Clortetraciclina (CTC) es el más utilizado para determinar la CE durante la incubación de los espermatozoides. Se ha monitoreado exitosamente en varias especies como el ratón, humano, mono, caballo, toro, verraco y borrego. MATERIAL Y EQUIPO 1. De Laboratorio: Un microscopio por equipo Tjeras Un termómetro por grupo 10 portaobjetos y cubreobjetos por equipo Un frasco de aceite de inmersión por grupo Un paquete de papel sanita por equipo Centrífuga Tubo eppendorf 2. Biológico: Dos dosis de semen bovino por equipo Solución de Percoll Solución de glutaraldehido Barniz para uñas METODOLOGÍA 1. Se utilizará una pajilla de semen congelado, la cual será descongelada colocándola durante 60 segundos en agua a 37°C. 2. El semen será purificado a través del procedimiento de Gradientes de Percoll. 3. Una vez descongelada, se seca la pajilla con una servilleta de papel, se corta la punta de la pajilla con tijeras y el contenido de la pajilla se coloca sobre la 74 superficie del gradiente de Percoll, vaciando el contenido de la pajilla con un émbolo especialmente diseñado para esta tarea. 4. De la pequeña cantidad de semen que queda en la pajilla, se coloca una pequeña gota en un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos. 5. Se observa al microscopio con un objetivo de 40x, para analizar la viabilidad de los espermatozoides de cada pajilla. 6. El semen y el gradiente de Percoll son colocados dentro de una canastilla de centrífuga previamente calentada a 38.5° C y se centrífuga a 2000 X G por 30 min. 7. Posteriormente se coloca el sedimento de semen en un medio de fertilización hasta tener una concentración espermática de alrededor de 10,000 espermatozoides/ ml. 8. Se incuba en un tubo Eppendorf 2 ml de la suspensión de semen con una concentración de 1 x 107 espermatozoides/ml a la cual se le añade 0 y 8 µg de heparina en ambos diluyentes. 9. En un microtubo se colocan 40 μl de la suspensión espermática y se le agregan 40 μl de la solución CTC. Inmediatamente después, los espermatozoides se fijan adicionando 4 μl de solución glutaraldehido al 8% y mezclándolos suavemente. 10. En un micro tubo se agregan 40 µl de la mezcla anterior y se añaden 40µl de semen ya capacitado, luego se agregan 4µl de fijador glutalaldeido® al 8%. 11. En un portaobjetos se coloca una gota de 10 μl de la solución espermática fijada y una gota de 5 μl de 1,4-diaza-2, 2, 2-biciclo disuelta en glicerol (9:1) para atenuar el desvanecimiento de la fluorescencia. 12. Se coloca un cubreobjetos cuidando que no queden burbujas de aire entre el portaobjetos y el cubreobjetos, sellándolos con barniz de uñas común y cubriéndolos con papel aluminio. 13. Las muestras se almacenan a 4ºC hasta la evaluación de la capacitación espermática, realizándola antes de 10 días (no más de 12 d). 14. Para el conteo de los espermatozoides se utiliza un microscopio Olympus BX41 equipado con fase de contraste y ópticos 40x Epifluorescentes. 15. En cada portaobjetos se cuentan 100 espermatozoides bajo una iluminación azulvioleta (400 a 450 nm de excitación y 470 nm de emisión), y se clasifican de acuerdo a los siguientes patrones: patrón “B”, presenta el acrosoma intacto, con una banda fluorescente principalmente concentrada en la región postacrosomal, presentándose ésta sólo en los espermatozoides capacitados con el acrosoma intacto, y patrón “RA”, con una cabeza ligeramente fluorescente y una delgada banda brillante de fluorescencia en el segmente ecuatorial, representando los espermatozoides capacitados y con reacción acrosomal. 75 OBSERVACIONES, RESULTADOS Y DISCUSIONES Realice sus observaciones, anote sus resultados y haga sus conclusiones. ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ CUESTIONARIO 1. ¿Por qué es indispensable la capacitación espermática para el proceso de la fecundación?. 2. Mencione la duración de la capacitación espermática en las diferentes especies de animales domésticos. 3. Describa brevemente ¿en qué consiste la reacción acrosomal del espermatozoide?. 4. ¿Cuáles son las estructuras del ovocito que son penetradas por el efecto de las enzimas que libera el espermatozoide?. 76 5. Describa los mecanismos que despliega el ovocito al momento de la fecundación para evitar la penetración multiespermática. 6. ¿Qué pasaría si durante la fecundación penetra más de un espermatozoide a través de la membrana vitelina del ovocito?. 7. ¿En qué fase de la división celular se encuentra el ovocito al momento en que se lleva a cabo la fecundación?. 8. Explique brevemente cómo se lleva a cabo el desarrollo y nutrición del cigoto recién formado. 9. ¿En qué momento es expulsado del ovocito el segundo cuerpo polar? BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM 77 PRÁCTICA No. 11 “DESARROLLO DE LA GESTACIÓN EN LOS ANIMALES DOMÉSTICOS” OBJETIVO Reconocer la importancia de la placenta dentro del proceso de la gestación, así como la estructura y funcionalidad de la misma, e identificar las distintas etapas del desarrollo gestacional en matrices de hembras preñadas de diferentes especies domésticas. FUNDAMENTO TEÓRICO Se entiende por período de gestación o de preñez, al tiempo destinado al desarrollo del nuevo ser y sus membranas, desde la concepción hasta el nacimiento. La gestación comienza con la fecundación del óvulo y el envío de una señal al cuerpo lúteo para que mantenga su estructura y siga produciendo progesterona. El útero responde manteniendo su vascularización y sus estructuras glandulares, las cuáles sintetizan una secreción denominada leche uterina, que nutre al embrión hasta que éste se fija en las paredes del útero. El período de desarrollo del nuevo producto en el tracto reproductor de la vaca se puede dividir en tres períodos: 1. Período del Huevo: Este es el tiempo que transcurre, desde la fertilización hasta que el óvulo fecundado (huevo) se ha dividido varías veces hasta alcanzar una forma particular. Esto ocurre el día 12 de gestación cuando la zona pelúcida se rompe y es en este momento cuando el nuevo producto recibe el nombre de “embrión en desarrollo”. 2. Período del Embrión: Este período de desarrollo embrionario dura hasta que las membranas fetales se amarran a la pared interna del útero, lo cuál ocurre del día 38 al 45 de la gestación en el bovino. Durante esta fase ocurre la formación de los diferentes órganos y sistemas, incluyendo el sistema respiratorio, nervioso, digestivo, circulatorio y reproductivo. El embrión se encuentra flotando libre en la cavidad uterina y depende de la leche uterina para su alimentación y nutrición. En este período no existe ninguna otra conexión entre el embrión y las paredes del útero. 3. Período del Feto: Con la aparición y fijación de las membranas fetales a la pared uterina se inicia el período del feto (día 38-45), el cual dura hasta el día del parto, aproximadamente el día 283 de gestación en la vaca. Durante este período el feto bovino se conecta con la madre a través de diversos placentomas, los cuales permiten el paso de los nutrientes de la madre al feto en desarrollo. 78 Desarrollo de la Placenta: La formación de las membranas fetales se inicia después de formarse la vesícula germinativa y de la formación de las tres hojas embrionarias principales. a). Amnios. Es la membrana más interna que envuelve al embrión, ésta se comunica con el feto a través del ombligo amniótico, que se localiza en la región umbilical del abdomen. El saco amniótico protege al feto contra los agentes traumáticos externos, tales como los provocados por la presión de los órganos abdominales, y en las fases posteriores, el amnios recoge las excreciones de los aparatos urinario y digestivo. b). Alantoides. Esta hoja embrionaria se forma como una evaginación del intestino posterior, cerca del saco vitelino, a lo largo del cordón umbilical. Esta membrana se adosa al corion, al cual se liga íntimamente formando el alantocorion, después se adosa al amnios para formar el alantoamnios. Una vez efectuada la diferenciación de las vías comunes de la excreción intestinal y urinaria, el saco alantoides queda en comunicación con la vejiga urinaria por mediación de un conducto llamado uraco. c). Corion. Representa una membrana delgada y cubierta con el trofoblasto, es la encargada de la alimentación embrionaria y también después del desarrollo del alantoides con la nutrición hemática fetal. Clasificación de la Placenta: La placenta es la estructura mediante la cual se lleva a cabo la nutrición fetal por vía sanguínea. La formación de la placenta difiere con la especie y tiene las siguientes clasificaciones: 1. Clasificación dependiendo de su posición en la pared uterina. a). Placenta Central. Es aquella en la que el producto se encuentra en la luz del útero; ésta se encuentra en la vaca, cabra y yegua. b). Placenta Excéntrica. Es aquella en la que el producto (feto y membranas fetales) se encuentran invadiendo la pared uterina, pero tiene contacto con la luz uterina, mediante el alantoides; este tipo de placenta, se encuentra en los roedores. c). Placenta Intersticial. Es aquella en la cual el producto se encuentra completamente en el interior de la pared uterina sin ningún contacto con la luz del útero, ésta última se cierra y oblitera por el crecimiento del feto en el endometrio, éste es el tipo de placenta que presenta el humano. 2. Clasificación de acuerdo a la morfología. a). Placenta Difusa. Es aquella en la que el corion establece contacto con el útero, por medio de las vellosidades coriónicas que se encuentran en toda la extensión del corión. Este tipo de placenta la encontramos en la cerda y en la yegua. b). Placenta Cotiledonaria. En ésta existen zonas bien definidas del corion que tienen vellosidades (cotiledones), las cuales se unen con porciones especializadas del endometrio (carúnculas), y a esta unión se le llama “placentoma”; esta placenta la presentan los rumiantes. 79 c). Placenta Zonal. En este caso, la placenta tiene una región circular con micro vellosidades y únicamente en esta región hay unión con la pared uterina, ésta se encuentra en los carnívoros. d). Placenta Discoidal. Este tipo de placenta tiene una región central en forma de disco y es donde existen vellosidades coriónicas que se adhieren al útero, este tipo se presenta en los roedores y en el humano. 3. Clasificación de acuerdo a su histología. a). Placenta Epiteliocorial. Está formada por seis capas y se encuentra en el cerdo y el equino. b). Placenta Sindesmocorial. Está formada por cinco capas y se encuentra en el bovino, ovino y caprino. c). Placenta Endoteliocorial. Está formada por cuatro capas y se encuentra en el perro y en el gato. d). Placenta Hemocorial. Formada por tres capas y está presente en los primates. e). Placenta Hemoendotelial. Está formada por una sola capa y se encuentra en los roedores y conejos. Fig. 16 y 17 Tipos de placentas de acuerdo a su corte histológico Desarrollo embrionario y fetal: El embrión en su crecimiento a partir del óvulo fecundado hasta convertirse en feto a término, no sólo aumenta de dimensiones y peso, sino que sufre muchos cambios en la forma. El período o velocidad de crecimiento; es decir, el porcentaje de aumento de peso y dimensiones por unidad de tiempo (crecimiento relativo), es rápido en las etapas tempranas de la gestación y va disminuyendo su crecimiento conforme ésta avanza, en tanto que el aumento absoluto por unidad de tiempo (crecimiento absoluto) aumenta en forma exponencial y alcanza su máximo desarrollo en las últimas etapas de la gestación. La velocidad de crecimiento del feto y sus órganos y tejidos componentes, varían durante las diferentes etapas de vida intrauterina, como por ejemplo en el desarrollo fetal temprano, la región cefálica crece con rapidez y en etapas más avanzadas de la gestación el crecimiento cefálico disminuye y al momento del nacimiento la cabeza y las extremidades tienen un desarrollo bastante mayor que el de los músculos. 80 En tanto que ciertos órganos fetales crecen rápido en etapas de la vida prenatal, otros empiezan a hacerlo más tarde. Estas velocidades máximas de crecimiento ocurren en forma seriada: primero el sistema nervioso central; después los huesos y finalmente el músculo y tejido adiposo. Si el feto carece de aporte nutricional, algunos de sus órganos se afectan más que otros, según la etapa de embarazo en que ocurre esta carencia; por otra parte algunos órganos parecen tener preferencias nutricionales independientemente de la etapa en que ocurra la carencia, por ejemplo el feto que presenta una deficiencia nutricional, sus órganos, el corazón y cerebro no se ven tan afectados como el hígado y el peso corporal. Cálculo de la edad: Los principales criterios para determinar la edad de embriones y fetos se basa en las dimensiones y características generales del desarrollo. Suelen usarse mediciones como: 1. Longitud coronilla-rabadilla (CR). Es la distancia entre el vértice del cráneo y la raíz de la cola. 2. La longitud del radio y tibia. Todas estas medidas varían de un feto a otro debido a factores como raza, estirpe, edad materna, tamaño de la camada y estación en que ocurre el nacimiento. Un método ideal para calcular la edad sería la diferenciación y el desarrollo de estructuras embrionarias y fetales o sea los llamados “horizontes del desarrollo”. Factores que afectan el crecimiento fetal: La velocidad del crecimiento fetal, depende sobre todo del aporte de nutrientes y de la capacidad del feto para utilizarlos. Las diferencias de especie, estirpe y raza se deben a diferencias en la velocidad de la división celular, la que está determinada por genética. Así que hay una íntima integración entre el aporte de nutrientes del feto (factores ambientales), la velocidad de división células (factores genéticos) y la velocidad de crecimiento. - Factores ambientales. Los principales factores que modifican el crecimiento prenatal son: tamaño, paridad y nutrición de la madre, tamaño de la camada, dimensiones placentarias y estrés climático. De ello es importante el tamaño materno pues se ha observado que las dimensiones de los recién nacidos en cruzas recíprocas entre caballos grandes y pequeños ponis, depende sobre todo del tamaño de la madre, el tamaño del progenitor empieza a tener efecto sobre el crecimiento después del nacimiento. El tamaño fetal también es afectado por la edad de la madre, ya que aquellas hembras jóvenes que no alcanzan las tallas adultas continúan creciendo durante su primer embarazo y compiten así con el feto por los nutrientes disponibles. - Factores genéticos. La contribución materna a la variabilidad en el tamaño fetal es mayor que la contribución paterna. - Factores hormonales. Es posible que las hormonas fetales modifiquen el crecimiento, ya que la hormona del crecimiento puede estimular el desarrollo fetal. La insulina tiene mucha importancia en el crecimiento fetal y ejerce sus efectos al aumentar el sustrato energético disponible, estimulando el crecimiento placentario. 81 MATERIAL Y EQUIPO 1. De Laboratorio: - Una charola metálica por equipo - Un equipo de disección por equipo - Un par de guantes para palpación por alumno - Un paquete de papel sanita por equipo 2. Biológico: - Una matriz de bovino, equino, porcino y caprino en diferentes etapas de gestación por equipo METODOLOGÍA En primera instancia las matrices de cada especie doméstica serán colocadas sobre diferentes mesas y se procederá tal y como se describe a continuación: 1. Se colocan los guantes para palpar en ambas manos. 2. Se toma una matriz y se palpan los cuernos uterinos para determinar el tamaño de los mismos. Se palpa suavemente y en repetidas ocasiones utilizando ambas manos. 3. Una vez que se palpó los cuernos, se procede a hacer una ligera presión sobre el cuerno hasta sentir la consistencia del mismo y la fluctuación. 4. Se balotea dicho cuerno repetidamente hasta sentir la presencia del embrión o del feto. 5. Con un bisturí se hace una incisión sobre la superficie externa del cuerno gestante, para identificar las diferentes capas maternas y fetales, así como los sacos acuosos existentes. 6. Se evalúa el tamaño del embrión/feto para estimar la edad de gestación, de acuerdo con la longitud de la misma en cada especie. 7. Se procede a identificar la placenta para su evaluación y clasificación de acuerdo a los siguientes esquemas: - De acuerdo al tipo de fijación entre el feto y el tejido uterino: a) Difusa. b) Cotiledonaria. c) Zonaria. d) Discoidal. - De acuerdo a las capas que separan sangre materna de sangre fetal: a) Epiteliocorial. b) Sindesmocorial. c) Endoteliocorial. d) Hemocorial. e) Hemoendotelial. 82 OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES Realice sus observaciones, anote sus resultados y elabore sus conclusiones. CUESTIONARIO 1. Explique ¿por qué no es posible diferenciar macroscópicamente el estado de cigoto?. 2. ¿Al cuánto tiempo después de la fecundación se lleva a cabo el transporte del cigoto bovino a través de la unión tubo uterina?. 3. ¿En qué consiste la nutrición del cigoto?. 4. Explique ¿cómo se lleva a cabo la nutrición fetal?. 5. ¿En qué consiste la nutrición del embrión?. 6. ¿En qué fase de desarrollo gestacional el crecimiento es más pronunciado, y por qué?. 7. ¿Qué clasificaciones de placentas existen y en qué consisten?. 8. ¿Al cuánto tiempo se forman los placentomas bovinos?. 83 9. ¿Cómo se clasifica la placenta de bovino desde el punto de vista morofológico e histólogico?. 10. ¿Qué tipo de placentación presentan los humanos?. BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM 84 PRÁCTICA No. 12 “PROCESO Y EVOLUCIÓN DEL PARTO EN LAS ESPECIES DOMÉSTICAS” OBJETIVO Observar las etapas del parto en las especies domésticas y comprender la importancia que juegan los mecanismos hormonales en el desarrollo de este proceso, así como los factores que lo pueden alterar. FUNDAMENTO TEÓRICO El parto en las especies domésticas representa un proceso complejo en el cual interactúan varias hormonas en forma coordinada, las cuales secuencialmente dan origen a las tres etapas de las que consta el parto. Es importante tomar en cuenta que el manejo de la hembra poco antes del parto es muy importante para asegurar que este proceso se lleve a cabo de manera adecuada. En caso de existir en la explotación problemas nutricionales, sanitarios o de manejo que puedan ser causa de estrés antes del parto, es necesario corregirlos a la brevedad posible, ya que el mecanismo del parto es un proceso endócrino regulado por el feto y que se desencadena cuando éste envía ciertas señales al endometrio materno, es decir, el inicio del parto no depende de factores ambientales externos, por lo que el parto se inicia aún cuando existan problemas de manejo. El problema se va a presentar cuando dichos alteraciones en el manejo interrumpan la secuencia endócrina coordinada que permite que el parto transcurra de forma normal. Se reconoce que la principal señal fetal que desencadena el parto, es la liberación de cortisol fetal una vez que éste ha adquirido la maduración pulmonar necesaria para subsistir fuera del útero materno. Dicha señal es captada por la madre, quién en respuesta a ello promueve la secreción endometrial de cantidades elevadas de PGF2alfa, lo cual desencadena el proceso de parto dentro de la madre. El parto tiene tres etapas. La primera etapa es la fase preparatoria para el parto y termina con la dilatación completa del cuello del útero. La segunda etapa es la de expulsión, que culmina con el nacimiento de la(s) cría(s). La tercera, contempla la expulsión de la placenta. La primer etapa es generalmente la más larga de todo el parto y da inicio cuando el cuello del útero empieza a dilatar para finalizar cuando el mismo está totalmente abierto. Al inicio de la misma podrá observar una pequeña cantidad de mucosidad. Al término de esta etapa las contracciones se vuelven más fuertes y duraderas. La segunda etapa representa el evento principal -el nacimiento. Durante la misma, la hembra tendrá una sensación intensa de presión y estiramiento, lo cual posiblemente le provoque una urgente sensación de pujar. Sus contracciones se harán más lentas -cada 3 a 5 minutos- mientras que la(s) cría(s) se orienta(n) en posición hacia la vagina (coronación). Una vez que la cabeza sale, los hombros y el resto del cuerpo le siguen más fácilmente. En un primer parto, esta etapa puede ser mas tardada con respecto a hembras multíparas. 85 La tercera es la etapa final, la cual empieza después de que la(s) cría(s) ha(n) nacido y termina cuando la placenta se separa de la pared del útero y es expulsada a través de la vagina. Es la más corta y se pueden presentar algunas contracciones que son mucho menos dolorosas. Cualquier alteración en el desarrollo de una de las dos primeras etapas del parto, en la mayoría de los casos dificulta el proceso general del parto, conduciendo a la presentación de la distocia, lo cual por consecuencia afecta el desarrollo de la tercer etapa, presentándose así la retención placentaria. El problema más serio se presentará una vez que la expulsión fetal se retrasa, debido a que en estos momentos está en riesgo la vida de la cría, debido a que posiblemente ya se encuentre respirando dentro de un útero que contiene un alto volumen de líquido amniótico y alantoideo. Es importante evaluar en estos momentos la estática fetal para determinar con precisión la posición, presentación y actitud fetal, ya que mediante ello será posible establecer rápidamente la mejor estrategia de manejo para corregir el problema que se presenta. Esto sólo será posible en aquellas especies en las que se facilita la manipulación del tracto reproductor a través del recto, tal es el caso de la vaca y la yegua, ya que en el resto de las especies domésticas, la imposibilidad de la manipulación rectal impide cualquier maniobra para el reacomodo fetal. La ventaja es que la especie en la que con mayor frecuencia existen problemas de distocia es la vaca, por lo que en la mayoría de los casos de distocia que son tratados a tiempo, el problema se corregirá sin mayores consecuencias. La distocia puede ser de origen materno o debido a problemas en el feto. Lo importante es determinar rápidamente la posible causa para que en base a ello se puede establecer el procedimiento a utilizar para corregir el problema al parto. Hay que tomar en cuenta también, que después de un parto distócico, el excesivo movimiento fetal dentro del útero va a ocasionar retención placentaria, razón por la cual hay que tomar las precauciones requeridas. MATERIALY EQUIPO 1. Didáctico- Audiovisual: - Proyectos de Acetatos. - Proyector de video VHS. - Material didáctico (acetatos y videos). METODOLOGÍA Una vez colocado el video, se procederá a la observación detallada del mismo, haciendo pausas para su discusión en base a la siguiente metodología: 1. Observar la fase de preparación del parto que se presenta en la vaca y en la cerda. 2. Analizar los mecanismos hormonales que deben desencadenarse durante esta fase del parto. 86 3. Discutir aquellos factores que pueden alterar o interrumpir el desarrollo de esta etapa del parto. 4. Observar la fase de expulsión fetal que se presenta en la vaca y en la cerda. 5. Analizar los mecanismos hormonales que deben desencadenarse durante esta fase del parto. 6. Discutir aquellos factores que pueden alterar o interrumpir el desarrollo de esta etapa del parto. 7. Observar la fase de expulsión placentaria que se presenta en la vaca y en la cerda. 8. Analizar los mecanismos hormonales que deben desencadenarse durante esta fase del parto. 9. Discutir aquellos factores que pueden alterar o interrumpir el desarrollo de esta etapa del parto. OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES Anote sus resultados y forme sus conclusiones. CUESTIONARIO 1. Explique brevemente la secuencia hormonal que se desencadena al momento del parto (expulsión fetal). 2. Mencione la duración normal del proceso de parto en las diferentes especies domésticas. 3. Investigue sobre la importancia del carácter “facilidad al parto” en los programas de mejoramiento genético del ganado. 87 4. Indique en qué especie(s) es más común que se presente dificultad al parto (distocia) y ¿por qué?. 5. Describa y explica tres causas inherentes al feto que pueden originar una distocia. 6. Describa y explica tres causas inherentes a la madre que pueden originar una distocia. 7. Explique qué efectos secundarios en la madre puede originar una distocia. 8. Describa brevemente una metodología para corregir un parto distócico en la vaca. BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM 88 PRÁCTICA No. 13 “REESTABLECIMIENTO DE LA ACTIVIDAD REPRODUCTIVA POSTPARTO EN LOS ANIMALES DOMÉSTICOS” OBJETIVO Evaluar los cambios anatómicos y fisiológicos que sufre el aparato reproductor de la hembra después del parto, en preparación para una nueva gestación, y analizar los factores que pueden alterar dicho proceso. FUNDAMENTO TEÓRICO El objetivo de los sistemas normales de manejo en cualquier explotación pecuaria es maximizar los niveles de producción, para lo cual es indispensable mantener una fertilidad elevada para que las hembras estén pariendo con una frecuencia deseable. Por ello, el manejo reproductivo postparto es de gran importancia para la productividad de la explotación, ya que es necesario que después del parto las hembras reinicien rápidamente sus ciclos reproductivos en preparación para una nueva preñez. Inmediatamente después del parto, los ovarios están relativamente inactivos y no se presentan ovulaciones. Además, para comenzar otra gestación es preciso la regresión y reconstitución del útero, etapa que dura entre 35 y 40 días aproximadamente. Por lo tanto, antes de que se pueda restablecer una nueva gestación es necesario que la vaca recupere la actividad regular y periódica del ciclo estral. Se ha establecido que la primera ovulación ocurre normalmente entre los días 13 y 40 después del parto y se ha asumido que en adelante las vacas continúan ovulando normalmente. Como resultado de los muchos estudios endócrinos, en los últimos veinticinco años se ha profundizado enormemente en el conocimiento de los cambios hormonales que ocurren en la vaca, para que retorne a una actividad cíclica normal, después del parto. Esto ha facilitado un conocimiento claro de los factores que afectan al intervalo desde el parto a la primera ovulación y el estro entre, y dentro, de los diferentes rebaños y según que las vacas sean ordeñadas o que amamanten a sus crías. Este conocimiento ha sido de incalculable valor para desarrollar protocolos y rutinas de manejo de las hormonas, aplicables a las hembras que muestran retrasos en la reanudación de la actividad ovárica. El retraso en la reanudación de los ciclos ováricos puede ser considerado como una estrategia para la supervivencia de la vaca, al evitar que se inicie otra gestación en periodos de estrés ambiental o fisiológico. Teniendo esto presente, existe cierta controversia entre los objetivos comerciales del ganadero de animales productores de leche o carne y los mecanismos que afectan a la restauración del modelo cíclico de reproducción en la vaca. Han sido varios los autores que han revisado la bibliografía de la década de 1970 sobre el modelo de crecimiento folicular, estro, ovulación y fertilidad después del parto, así como los cambios endócrinos relacionados con esos acontecimientos. En aquel tiempo, se pensó que en la mayoría de las vacas que lactan hay una supresión del crecimiento 89 folicular, inmediatamente después del parto, y que estos cambios suceden, de una manera rápida, en las semanas siguientes a la parición. La involución uterina es necesaria antes de que la vaca pueda concebir de nuevo. Normalmente, los úteros de las primíparas involucionan más rápidamente que los de las multíparas y parece ser que el amamantar a los terneros acelera la involución, que suele durar en estos casos 30 días. No ha recibido mucha atención el estudio de las relaciones entre la involución uterina y la actividad ovárica, aunque se ha demostrado una correlación entre la duración de una elevada concentración plasmática del metabolito de la PGF2, la 13-14-dihidro-15 ceto PGF2 (PGFM) y la duración de la involución uterina. Por otra parte, se ha demostrado que los niveles de PGFM invariablemente retornan a la línea basal antes de que ocurra cualquier elevación del nivel de progesterona, lo que sugiere que la involución uterina está casi completada antes de que aparezca la primera ovulación posparto. La secuencia de eventos endócrinos, que ocurren en la vaca normal después del parto, incluye los siguientes hechos: algo de GnRH se segrega inmediatamente después del parto, pero no en cantidad suficiente para producir la liberación de las gonadotropinas; las concentraciones plasmáticas de FSH se elevan rápidamente, después del parto, estimulando el desarrollo folicular; existe un aumento gradual de la frecuencia de los pulsos de LH y de las concentraciones de LH en plasma; la secreción de gonadotropina estimula el crecimiento folicular y la producción de estradiol y, quizá la de inhibina; y coincidiendo con esos cambios endócrinos hay una recuperación gradual del mecanismo de retrofuncionalidad negativa, de tal forma que los ciclos ováricos comienzan unas dos semanas después del parto. Otros factores que están muy relacionados con la actividad reproductiva postparto en las diversas especies domésticas, son la nutrición y el estrés ambiental. Ambos son factores de manejo que si están controlados no afectan a la reproducción, sin embargo, la existencia de problemas nutricionales y factores causante de cualquier tipo de estrés, sí pueden ocasionar un efecto desfavorable sobre el desempeño reproductivo de los animales después del parto. El estado nutricional puede tener un impacto positivo o negativo sobre el sistema reproductivo. Cuando la nutrición es deficiente, el sistema reproductivo es inhibido y la tasa de reproducción se disminuye. Cuando es adecuada, la nutrición no es un factor limitante con respecto al funcionamiento de estos sistemas, y es en estas circunstancias, cuando otros factores son los reguladores más importantes de la endocrinología reproductiva. Aunque la eficiencia reproductora puede ser influida por deficiencias específicas, desequilibrios nutritivos o ingestión de sustancias tóxicas, la relación de energía, tanto al largo como al corto plazo, son de gran importancia. Cuando el consumo de energía se reduce y el balance energético se hace negativo puede haber fallas en la reproducción debido a la influencia sobre el estro, las tasas de ovulación, fertilidad, supervivencia embrionaria, pérdidas prenatales y el peso al nacer. En cuanto a los efectos que el estrés por manejo pueda tener sobre la reproducción, es algo que no se conoce del todo, en parte porque el organismo de una vaca puede responder a las situaciones de estrés de muy distintas formas. A pesar de la amplia 90 variabilidad de respuestas posibles, la más característica es el aumento en la secreción de glucocorticoides a partir de las glándulas adrenales. Aunque el mecanismo exacto por el que el estrés afecta a la reproducción no está totalmente clarificado, se puede comprobar que muchos animales, sometidos a condiciones de estrés, presentan disfunciones tales como no mostrar los signos primarios de celo o presentar mayores dificultades para quedar preñadas tras la inseminación. Hay dos tipos de situaciones "estresantes": el excesivo calor ambiental y el manejo inadecuado. MATERIAL Y EQUIPO 1. De Laboratorio: Un estuche de disecciones por equipo Una navaja para bisturí por equipo Un par de guantes para palpación por alumno Un paquete de papel sanita por equipo 2. Biológico: Un tracto reproductor completo de vaca recién parida. Un tracto reproductor completo de vaca de más de 90 días de parida. METODOLOGÍA 1. Colocar sobre la mesa el aparato reproductor completo de una hembra doméstica recién parida, así como el de otra hembra no-gestante con más de 90 días de parida. 2. Inspeccionar inicialmente el tamaño y consistencia del útero en ambas matrices. 3. Hacer un corte longitudinal con el bisturí a lo largo del cuerpo del útero, extendiendo dicha incisión a lo largo de uno de los cuernos uterinos. 4. Inspeccionar la estructura interna del cuerpo y cuerno uterinos para evaluar el tamaño y grosor de las carúnculas existentes en ambas matrices. 5. Discutir acerca de los procesos hormonales que se llevan a cabo durante la involución uterina. 6. Inspeccionar los ovarios de ambas matrices para detectar la presencia de estructuras foliculares y luteales. 7. Evaluar el tamaño y consistencia de los ovarios de ambas matrices. 8. Discutir sobre los procesos hormonales que se llevan a cabo durante el reestablecimiento de la actividad ovárica. 9. Analizar otros factores de importancia que repercuten directamente sobre el comportamiento reproductivo postparto. 91 OBSERVACIONES, RESULTADOS Y CONCLUSIONES Anote sus resultados y forme sus conclusiones. CUESTIONARIO 1. Explique brevemente ¿cómo influye la nutrición sobre el comportamiento reproductivo postparto?. 2. Explique brevemente ¿cómo influye el amamantamiento sobre el comportamiento reproductivo postparto?. 3. Explique brevemente ¿cómo influye el estrés sobre el comportamiento reproductivo postparto?. 4. ¿En qué consiste la involución uterina?. 5. ¿Cómo afecta una distocia el proceso de involución uterina?. 6. ¿Qué ocurre primero, la reactivación ovárica o la involución uterina? ¿por qué?. 7. Explique brevemente ¿por qué una hembra no puede quedar gestante hasta haber completado su involución uterina postparto?. 92 8. Mencione la duración de la involución uterina en las diferentes especies domésticas. 9. Describa de qué manera se puede evaluar el grado de involución uterina, así como la actividad ovárica, en una vaca. BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA Feeldman, E.C. (2000). Endocrinología y Reproducción en Perros y Gatos. México: MCGRAWHILL INTERAMERICANA EDIT. Feeldam, E.C., Nelson, R.W. (2007). Endocrinología y Reproducción Canina y Felina. Argentina: INTER-MÉDICA. Gordon, I. (2004). Tecnología de la Reproducción de los Animales de Granja. Zaragoza, España: ACRIBIA. Hafez, E.S.E. I., Hafez, E.S.E. II., Hafez, B. (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. MCGRAW-HILL INTERAMERICANA. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 1). Estados Unidos Americanos: ElSEVIER. Knobil, E. & Neill, J.D. (2006). Knobil and Neill's physiology of reproduction (Vol. 2). Estados Unidos Americanos: ELSEVIER. Lopate, C. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats and exotic pets. Iowa: WILEY-BLACKWELL. Morel, D., & Morel, M. C. D. (2005). Fisiología de la Reproducción de los Équidos, cría y manejo de la yeguada. Zaragoza, España: ACRIBIA. Root, K., Maragaret, V. (2005). Manual de Reproducción del Perro y del Gato. España: MULTIMEDICA ED. VET. Velázquez, J. (2001). Biología de la Reproducción. México: UNAM 93
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