guia para validación

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INECC-CCA, (2010). GUÍA PARA LA IMPLANTACIÓN, VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO
CONTINUO DE UN MÉTODO ANALÍTICO. México, p.27.
NORTH AMERICAN COMMISSION FOR
ENVIRONMENTAL COOPERATION
(NACEC)
DESARROLLO DE LOS PROTOCOLOS BASE
PARA EL PROGRAMA NACIONAL DE
MONITOREO Y EVALUACIÓN (PRONAME)
ANEXO 6 DEL REPORTE FINAL
GUÍA PARA LA IMPLANTACIÓN, VALIDACIÓN Y
VERIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO CONTINUO DE UN
MÉTODO ANALÍTICO
LABORATORIOS
ABC
QUÍMICA INVESTIGACIÓN Y ANÁLISIS S.A. DE C.V.
DICIEMBRE 2009
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CONTENIDO
1.0
INTRODUCCIÓN
2.0
OBJETIVOS
3.0
PROCEDIMIENTOS PARA REALIZAR LOS PARÁMETROS DE
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO
3.1 LIMITE DE DETECCIÓN DEL METODO (LDM)
3.2 INTERVALO DE TRABAJO DEL MÉTODO (ITM).
3.3 LÍMITE PRÁCTICO DE CUANTIFICACIÓN (LPC)
3.4 CALIBRACIÓN INICIAL (CI)
3.5 EXACTITUD (RECUPERACIÓN) Y SESGO INICIAL DEL MÉTODO
3.6 PRECISIÓN INICIAL DEL MÉTODO
3.7 REPRODUCIBILIDAD DEL MÉTODO
3.8 INCERTIDUMBRE INICIAL
4.0 BIBLIOGRAFIA
2
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1.0 INTRODUCCIÓN
Todos los laboratorios analíticos y en especial los de la Red de PRONAME se deben
obligar a seguir los 6 Principios básicos de buenas prácticas de mediciones
analíticas (ref. 3)
1.- Las mediciones analíticas deben ser realizadas de acuerdo a
requerimientos acordados (con un propósito definido).
2.- Las mediciones analíticas deben ser realizadas usando métodos y equipos
que han sido probados para asegurar que son adecuados para el propósito de
la medición.
3.- El personal que realiza las mediciones analíticas debe ser calificado y
competente para llevar a cabo sus tareas.
4.- Debe haber regularmente una evaluación independiente del desempeño
técnico del laboratorio.
5.- Las mediciones analíticas efectuadas en un lugar deben ser consistentes
con aquellas efectuadas en cualquier otro lugar.
6.- Las organizaciones que realizan mediciones analíticas deben tener
perfectamente definidos procedimientos de aseguramiento y control de
calidad.
La validación de un método de ensayo se ha definido como:

“La confirmación por examen y la provisión de evidencia objetiva de que se
cumplen los requisitos particulares para un uso propuesto” [NMX EC 17025
IMNC 2006 Ref 1]

“El proceso de establecer las características de desempeño y limitaciones de
un método de medición y la identificación de aquellas influencias que pueden
modificar estas características y a que grado lo afectan” [EURACHEM “The
fitness for Purpose of Analytical Methods” Ref 2]

“La validación examina las características de desempeño de un método para
identificar y establecer cualquier limitación que pueda esperarse del método
cuando se aplique a un tipo específico de muestras” [CENAM Métodos
analíticos adecuados a su propósito. Guía de laboratorio para validación de
métodos y tópicos relacionados” Ref 3]
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Las 3 definiciones tienen en común en que la validación es el proceso para
demostrar que el desempeño en un laboratorio determinado con un método analítico
específico cumple con las especificaciones necesarias para las necesidades de
medición especificadas.
Internacionalmente la comunidad analítica ha establecido las principales
especificaciones y requisitos operativos de un laboratorio de pruebas por medio de
la Norma Internacional ISO/IEC 17025:2005 “Requisitos generales para la
competencia de los laboratorios de ensayo y calibración”, esta Norma especifica
claramente la necesidad de la validación de los métodos analíticos como un requisito
indispensable antes de realizar una medición analítica, ya que el desempeño de un
método analítico es diferente en cada laboratorio que lo realiza y además los
métodos analíticos no se pueden utilizar para medir algún mensurando en cualquier
matriz, sino que son muchas veces específicos para la matriz en la que fueron
desarrollados y por ende validados originalmente:
5.4.1 “El laboratorio debe usar métodos y procedimientos apropiados para todos
los ensayos dentro de su alcance. Estos incluyen muestreo, manejo, transporte,
almacenamiento y preparación de los elementos que serán ensayados.....”
5.4.2 “Deben usarse preferentemente los métodos publicados en normas
internacionales (ISO, AOAC, etc.), regionales o nacionales (NOMs, NMXs para
México; USEPA, NIOSH, OSHA, FDA, etc. para USA; etc.) o por organizaciones
técnicas reconocidas (ASTM, UL, API, ACS, etc.), o en textos o publicaciones
científicas importantes, o como sea especificado por los fabricantes de
equipo.....”
5.4.5.2 “El laboratorio debe validar métodos no normalizados, métodos diseñados
/ desarrollados por el laboratorio, métodos normalizados usados fuera de su
alcance propuesto y ampliaciones y modificaciones de métodos normalizados
para confirmar que los métodos se ajustan al uso propuesto....”
(por extensión
se podría entender que los métodos normalizados usados dentro de su alcance
no deben validarse…)
5.4.2 “....El laboratorio debe confirmar que puede operar adecuadamente
métodos normalizados antes de implantar los ensayos, si el método cambia la
confirmación debe ser repetida”.
NOTA: La 17025 utiliza el concepto de “confirmación” sin definirlo, por lo que internacionalmente se ha adoptado que
este término equivale a una “validación parcial” con la cuál se pueda evidenciar su adecuación al uso propuesto)
La referencia mas completa sobre validación de métodos, sobre la cuál se basa la
17025, se encuentra en la publicación de Eurachem “The Fitness for Purpose of
Analytical Methods, a Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics”
(La Adecuación al Uso Propuesto de los Métodos Analíticos, una Guía para el
Laboratorio para la Validación de Métodos y Tópicos Relacionados Ref. 2)
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Los parámetros de una validación completa de un método analítico (ref. 3) son los
siguientes:











Recuperación
Sensibilidad
Selectividad / Especificidad
Robustez
Límite de detección
Límite de cuantificación
Intervalo lineal y de trabajo
Reproducibilidad
Repetibilidad
Sesgo (En algunos casos evaluado a partir de la Recuperación)
Incertidumbre inicial
Estos parámetros se evalúan mediante una serie de indicadores como:
PARÁMETRO
Selectividad / Especificidad
Robustez
Sensibilidad
Precisión
Exactitud
Intervalo lineal y de Trabajo
INDICADOR
Pruebas estadísticas en diferentes
matrices con diferentes interferencias
Pruebas
Interlaboratorios
con
variaciones en las condiciones de
prueba
Límite de detección
Repetibilidad, Reproducibilidad e
Incertidumbre
Recuperación y sesgo
Límite de Cuantificación, Intervalo
lineal, curva de calibración
Cuando se utiliza un método Normalizado, es decir un método desarrollado por una
Institución técnicamente reconocida (Organismos internacionales de normalización
como la ISO o AOAC. Dependencias extranjeras reconocidas internacionalmente
como la EPA, DIN, NIOSH, OSHA, FDA, etc. Organizaciones técnicas reconocidas
como la ASTM, UL, API, ACS, etc.) y que ha sido validado con los estándares
internacionales antes mencionados, solo es necesario que el laboratorio “confirme”
que lo puede realizar con los mismos criterios de desempeño bajo el cual fue
validado, por lo que debe realizar esta “confirmación” o validación parcial con los
siguientes parámetros:





Recuperación
Sensibilidad
Límite de detección
Límite de cuantificación
Intervalo lineal y de trabajo
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



Reproducibilidad
Repetibilidad
Sesgo (En algunos casos evaluado a partir de la Recuperación)
Incertidumbre inicial
Cuando un laboratorio desarrolla un método analítico, debe validarlo totalmente, este
desarrollo implica los siguientes casos:
o Los métodos que un laboratorio de ensayos desarrolla internamente
para una aplicación específica sin seguir detalladamente las
especificaciones de un método normalizado.
o Los métodos que se basan en un método normalizado pero al que se le
han realizado modificaciones para aplicarlo a otra matriz no
contemplada en el método de referencia
o Métodos Normalizados con modificaciones que alteran su alcance
inicial.
o Métodos mencionados en textos o publicaciones científicas
o Métodos especificados por los fabricantes de equipos.
Es muy difícil validar un método analítico en un laboratorio de ensayos, ya que la
determinación de la selectividad/especificidad y la robustez se basan en diseños
experimentales que implican tiempo y altos costos, normalmente se realizan por
medio de estudios de colaboración realizados por algunas Instituciones
Gubernamentales, principalmente extranjeras (EPA, FDA, NIOSH, OSHA, etc.) u
Organizaciones Técnicas reconocidas, también extranjeras (AOAC, ASTM, etc.),
existen algunos pocos casos realizados por Laboratorios Primarios.
No es válido el realizar un diseño experimental simple en un solo laboratorio ya que
puede existir un sesgo importante, existen referencias internacionales al respecto si
se quiere profundizar en el tema, la más completa está en AOAC International
Method Validation Program (www.aoac.org/vmeth/oma_program.htm).
Los criterios de cuando se debe realizar una Validación Parcial o Completa son los
siguientes:
PROBLEMA
Desarrollo de un método para un problema
en particular
Existe un método evaluado para aplicarlo en
un problema en particular
Un método establecido, realizar una revisión
para incorporar innovaciones
Un método establecido, extenderlo o
adaptarlo a un problema nuevo
Cuando el control de calidad indica que un
método establecido cambia con el tiempo
TIPO DE VALIDACION
Completa
Completo
Parcial o completa
Parcial o completa
Parcial o completa
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Establecer un método en un laboratorio
diferente
Establecer un método con diferente
instrumentación
Establecer un método con diferente operador
Parcial
Parcial
Parcial
La validación inicial documenta que el Laboratorio es inicialmente competente para
realizar el método de ensayo, para algunos este proceso se denomina “Montaje del
método”, solo se realiza una vez.
Al menos cada año debe reevaluarse la incertidumbre, el LDM, Intervalo lineal, el de
trabajo y la reproducibilidad.
La reproducibilidad se debe realizar a través del análisis de muestras de control de
calidad (QC), las cuáles deben:



Estar en la matriz analizada o lo más parecida,
En concentraciones diferentes a través de todo el intervalo de trabajo,
Ser analizadas con cada lote de muestras analizadas.
La Prueba Inicial de Desempeño del Analista (PIDA) documenta la competencia de
los analistas respecto a la validación del método en el laboratorio específico, todos
los analistas que realizan algún método de ensayo deben demostrar que son
competentes para operarlo a través de la obtención de los LDM, Repetibilidad,
Sesgo y Recuperación, los cuáles deben estar dentro de los criterios de aceptación y
rechazo del método de referencia, lo anterior se denomina “Evaluación Inicial de
Desempeño del Analista”, se debe realizar para cada analista, al menos cada año y
cuando se efectúan cambios importantes en el equipo.
Esta PIDA puede ser utilizada por el laboratorio para evidenciar que su método sigue
validado a través del tiempo.
Para determinar si se ha confirmado adecuadamente un método se deben seguir los
siguientes criterios:




Intervalo de Trabajo, debe abarcar al menos de 0.25 a 2 veces el LMP o la
especificación acordada con el cliente (curva de calibración) y debe estar
dentro del Intervalo Lineal.
El LDM debe estar al menos 10 veces por debajo del LMP o especificación
acordada.
El LPC debe estar al menos 2 veces por debajo del LMP o especificación
acordada.
La Repetibilidad inicial debe estar realizada con la concentración del punto
medio de la curva de calibración (LMP o especificación acordada).
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

Para la estimación de la incertidumbre se debe utilizar un estudio de precisión
que cumpla con lo siguiente:
o Número de muestras de QC mayor a 20
o Todas dentro de control estadístico
o Que pertenezca a una distribución normal
o Que se hayan elaborado a través de todo el intervalo de trabajo del
método de ensayo (diferentes concentraciones).
Los valores obtenidos en la Validación Parcial del Método deben cumplir con
los de la Validación del Método de Referencia y son la base para establecer
los Criterios de Aceptación y Rechazo del Laboratorio (pueden ser mejores
que los del Método de Referencia pero no peores).
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2.0 OBJETIVOS
2.2.1 Objetivo General
Establecer los pasos a seguir para realizar la validación parcial de métodos
analíticos cuantitativos estandarizados.
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3.0 PROCEDIMIENTOS PARA REALIZAR LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN
DE UN MÉTODO ANALÍTICO
En este capitulo se presentan los procedimientos específicos para realizar todos los
parámetros de una validación parcial, no se presentan los procedimientos para
determinar la Especificidad, Robustez por estar fuera de los alcances de un
laboratorio de ensayo.
3.1 LIMITE DE DETECCIÓN DEL METODO (LDM)
Aplica a las siguientes técnicas analíticas:







Cromatografía de Gases
Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de
Masas
Cromatografía de Líquidos de Alta Presión
Espectrofotometría UV/VIS
Espectrofotometría de Absorción Atómica
Espectrometría de Emisión Óptica con Plasma Inducido
Acoplado (ICP/OES)
Espectrometría de Masas con Emisión de Plasma Inducido
Acoplado (ICP/MS)
NOTA IMPORTANTE:
ESTE PROCEDIMIENTO NO SE DEBE APLICAR A TÉCNICAS
GRAVIMETRICAS,
VOLUMÉTRICAS,
POTENCIOMETRICAS
Y
CONDUCTIMETRICAS, PARA ESTAS TECNICAS LA CANTIDAD MINIMA
DETECTABLE ES EQUIVALENTE AL LIMITE PRACTICO DE CUANTIFICACION
INSTRUMENTAL.
-Anote todo lo realizado en su bitácora de analista.
-Verifique para cada analito el límite de detección estimado del método
fuente, tome como base este valor para determinar la concentración de
la muestra control, la cual se debe encontrar entre 5 y 10 veces por
arriba del límite de detección estimado del método.
-Prepare una muestra control conteniendo los analitos del método a
evaluar, en un volumen suficiente para dividirla en 7 porciones iguales.
-Divida la muestra control en 7 alícuotas y analícelas de acuerdo al
método analítico en cuestión.
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-Calcule la media y la desviación estándar de los resultados obtenidos.
-Calcule el límite de detección del método (LDM) usando la siguiente
ecuación
LDM = (tn-1, 0,99%)*s
donde:
(tn-1, 0,99%)
s
= 3,14 (para 7 repeticiones)
= desviación estándar
-Si el resultado del LDM obtenido es menor de 10 veces la
concentración de la muestra que se utilizó, entonces prepare otra
muestra que se encuentre entre 5 y 10 veces arriba del LDM obtenido y
repita el procedimiento.
-El Límite de Detección del Método que se obtenga, debe ser igual o
menor al que se presenta en el Método Fuente. Cuando el LDM no
puede ser igual o menor al del método fuente, pero es menos de 10
veces el valor del Límite Máximo Permisible (LMP) o del criterio
ambiental aplicable, éste puede ser aceptado.
3.2 INTERVALO DE TRABAJO DEL MÉTODO (ITM).
Aplica a las siguientes técnicas analíticas:
Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS),
Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos
(UV/VIS, AAE).
-Determine el ITM de acuerdo al Límite Máximo Permisible o criterio de
calidad respectivo, con al menos dos puntos de la curva de calibración
por debajo de dicho valor y dos puntos por encima. Los valores deben
ser calculados tomando como punto de partida el LMP o criterio y los
valores bajos deberán guardar una relación aproximada de 2 y 5 veces
menos de ese valor; mientras que para los valores altos la relación
deberá ser de 2 a 5 veces mas ese mismo valor.
Ejemplo 1:
LMP: 0,20 mg/L
Curva de calibración: 0,04; 0,10: 0,20; 0,40; 1,0
Intervalo de trabajo: 0,04 – 1,0 mg/L
Ejemplo 2 (mismo método para 2 normas de LMP diferentes):
LMP: 0,20 mg/L Pb para agua potable y 1,0 mg/L para agua residual
Curva de calibración: 0,04; 0,10; 0,20; 0,40; 1,0; 2,0; 5,0 mg/L
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Intervalo de trabajo: 0,04 – 5,0 mg/L
Determine el ITM utilizando como indicador el coeficiente de
correlación de la recta de ajuste por mínimos cuadrados, el cual debe
ser mayor a 0,997 (siempre y cuando se verifique la linealidad por
métodos gráficos antes).
3.3 LÍMITE PRÁCTICO DE CUANTIFICACIÓN (LPC)
Aplica a las siguientes técnicas analíticas:
Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS),
Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos
(UV/VIS, AAE)
-Calcule el LPC multiplicando por 5 el LDM o en caso de que el primer
punto del intervalo de trabajo sea mayor a éste valor, entonces utilice el
primer punto de la curva de calibración.
3.4 CALIBRACIÓN INICIAL (CI)
La calibración inicial está íntimamente relacionada con el Intervalo de
Trabajo del Método, el cual puede ser mas amplio, la calibración inicial,
nunca puede tener un intervalo menor al ITM.
Aplica a las siguientes técnicas analíticas:
Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS),
Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos
(UV/VIS, AAE)
-La calibración inicial se define con la curva de calibración al momento
de calcular el intervalo de trabajo. Debe estar conformada por al menos
tres puntos y recomendablemente, cinco puntos.
-La curva de calibración debe ser lineal (r2 > 0,997 con 5 puntos de
curva y 0,98 con 3 puntos de curva).
-Mientras la pendiente de una curva de calibración es mayor, mayor es
su sensibilidad (a pequeños cambios de señal, mayor es el cambio en
concentración).
-La ordenada al origen nunca puede ser negativa (error matemático de
ajuste por mínimos cuadrados). Si es positiva, significa que a una
concentración “0” existe una señal, lo cual puede deberse a
contaminación de reactivos.
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-Se debe buscar la mayor sensibilidad y nunca se debe ajustar la señal
del “0” de calibración con el blanco de reactivos, sino con el blanco de
calibración.
-En la gran mayoría de los métodos ambientales, los patrones de la
curva de calibración no se procesan, se analizan solo
instrumentalmente (solo en el caso de los Compuestos Orgánicos
Volátiles que se analizan por Purga y Trampa).
Se debe verificar la calibración inicial con un Material de referencia
Certificado de otra fuente diferente a la utilizada para elaborar la curva
de calibración inicial para evidenciar que no existió algún error de
dilución que pudiera invalidar la calibración inicial.
3.5 EXACTITUD (RECUPERACIÓN) Y SESGO INICIAL DEL MÉTODO
Aplica a las siguientes técnicas analíticas:
Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS),
Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos
(UV/VIS, AAE)
-Prepare una muestra control conteniendo los analitos del método a
evaluar, en un volumen suficiente para dividirla en 10 porciones iguales
y realice el análisis completo en las mismas condiciones de operación y
por el mismo analista. La concentración de la muestra debe ser
cercana al punto medio de la curva de calibración.
-Analice las 10 muestras y registre los resultados.
-Calcule la Exactitud inicial del Método, la cual estará expresada como
un porcentaje de recuperación o recobro:
%R = (Valor Encontrado / Valor Real) x 100
donde:
%R = Porcentaje de Recuperación o Recobro
Valor Encontrado = Valor medido en la muestra
Valor Real = Valor asignado a la muestra
-Calcule el promedio y la desviación estándar del %R, al promedio del
%R obtenido reste 100 para calcular el Sesgo (respete el signo
obtenido).
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-Compare los valores obtenidos del promedio y la desviación estándar
del %R y del Sesgo con los que se presentan en el método de
referencia, si existen.
-Si los valores no cumplen con lo especificado, determine las causas y
corrija los errores, documente adecuadamente las incidencias y
acciones correctivas e inclúyalas en el expediente del método.
-Repita el procedimiento anterior hasta que se cumpla con las
especificaciones del método fuente.
3.6 PRECISIÓN INICIAL DEL MÉTODO
-REPETIBILIDAD DEL MÉTODO
Aplica a las siguientes técnicas analíticas:
Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS),
Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos
(UV/VIS, AAE).
-Con los resultados de las 10 muestras preparadas en la Sección
anterior elabore una tabla donde se pongan los 10 valores (5 parejas
de 2 valores apareados).
-Calcule la DPR de cada pareja de datos apareados con la siguiente
ecuación:
DPR = ((X1 - X2) / (X1 + X2))*200
donde:
DPR = Diferencia Porcentual Relativa
X1 = Valor medido de la muestra original
X2 = Valor medido de la muestra duplicada (apareada)
-Calcule la media aritmética de las 5 DPR obtenidas
-Compare los valores de la media con los que se presentan en el
método de referencia.
-Si los valores no cumplen con los especificados, determine las causas
y corrija los errores, documente adecuadamente las incidencias y
acciones correctivas e inclúyalas en el expediente del método.
-Repita el procedimiento anterior hasta que se cumpla con las
especificaciones de los criterios de aceptación del método fuente.
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3.7 REPRODUCIBILIDAD DEL MÉTODO
Aplica a las siguientes técnicas analíticas:
Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS),
Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos
(UV/VIS, AAE),
-Después de haber obtenido la Repetibilidad del Método, inicie la
medición de muestras reales y cuando tenga 12 datos de las muestras
de Control de Calidad, calcule la Reproducibilidad Inicial del Método,
elabore una tabla donde se pongan los 12 valores (6 parejas de 2
valores apareados).
-Calcule la DPR de cada pareja de datos apareados con la siguiente
ecuación:
DPR = ((X1 - X2) / (X1 + X2))*200
Donde:
DPR = Diferencia Porcentual Relativa
X1 = Valor medido de la muestra original
X2 = Valor medido de la muestra duplicada (apareada)
-Calcule la media aritmética de las 6 DPR obtenidas
-Compare los valores de la media con los que se presentan en el
método de referencia, si existen.
Estos valores de reproducibilidad deben ser mayores que los de
Repetibilidad, en caso contrario, determine las causas y corrija los
errores, documente adecuadamente las incidencias y acciones
correctivas e inclúyalas en el expediente del método.
Con estos valores inicie las cartas control de Reproducibilidad.
3.8 INCERTIDUMBRE INICIAL
La estimación de la incertidumbre en este tipo de mediciones puede ser muy
compleja y aún no existen lineamientos oficiales de como obtenerla, existen fuertes
discusiones acerca de hasta donde debemos llevar la formalidad académica o
científica y que equilibrio debemos guardar entre esta formalidad y los aspectos
prácticos y de tipo comercial que todos los laboratorios que realizamos la importante
función de las mediciones analíticas del medio ambiente, por lo que en este inciso se
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presenta un acercamiento de como poder obtenerla, existen otros, los cuales
pueden ser igualmente válidos.
Es muy importante tener en cuenta algunos conceptos básicos:
“La calidad de un resultado de una medición se juzga por el grado de
representatividad de la magnitud de la propiedad que intenta cuantificar. Un
resultado de medición tendrá cuanta mas calidad como permita lograr mas
eficacia en las decisiones que se tomen basándose en ello.”
“La medición de la calidad de un resultado de medición estará entonces
relacionada con el contenido informativo que proporcione, que no es
independiente del usuario y/o de la finalidad o intento de la medición.”
“El concepto de incertidumbre se utiliza internacionalmente para cuantificar y
representar esta calidad.”
“Un resultado de una medición no está completo si no viene acompañado de la
estimación de la incertidumbre señalada por quien realizó la medición y quien
conoce la información relacionada con la conducción del proceso de medición.”
(1)
Los conceptos anteriores son citas textuales de la Introducción de la NMX CH 1401996 IMNC “Guía para la Evaluación de la Incertidumbre en los resultados de las
mediciones”
La definición de Incertidumbre (International Vocabulary of Basic and General Terms
in Metrology, ISO, Geneva, 1993):
“Parámetro asociado con el resultado de una medición, que
caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente pueden
ser atribuidos al mesurando”
El estadístico que se debe utilizar en mediciones de química analítica debe ser la
Incertidumbre Expandida(2).
La referencia a la incertidumbre surge debido a que la concordancia entre los
laboratorios es limitada, en parte, por las incertidumbres en que incurre cada
laboratorio en su cadena de trazabilidad. Por lo anterior, la trazabilidad esta
íntimamente ligada a la incertidumbre, la trazabilidad provee los medios para poner
todas las mediciones relacionadas en una escala consistente de medición, mientras
que la incertidumbre caracteriza la “fuerza” de los eslabones de la cadena y la
concordancia que es esperada entre los laboratorios que hacen mediciones
similares(2).
La incertidumbre de las mediciones que realiza un laboratorio ambiental de tercera
parte no pueden incluir la incertidumbre del muestreo, ya que ésta es desconocida y
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trasciende regularmente a los alcances del servicio que estos laboratorios
proporcionan. Además, regularmente tampoco se pueden evaluar las incertidumbres
relativas a las condiciones de almacenamiento, ya que en la mayoría de los casos,
las determinaciones analíticas solo se pueden dentro de un periodo de tiempo corto
(holding times). Lo anterior debe ser claramente definido en los informes de prueba.
Existe una relación directa entre los datos de QC e Incertidumbre:

QC exactitud: Mide el error del proceso, normalmente a través del %R o del
error relativo (valor “real”-valor obtenido) aplica a una sola medición.

QC precisión: Mide la variabilidad del proceso a través normalmente de la
Desviación Estándar

NO es posible con estos conceptos determinar cuales son las causas del error
o de la variabilidad, ya que están basadas en el cálculo de solo un número
final, normalmente por el uso de MRs o MRCs.

NO se puede tener un proceso de mejora continua de una forma lógica y
ordenada sobre el resultado al desconocer las causas precisas del resultado
de QC.

El proceso para la estimación de la incertidumbre expandida determina en
1er. lugar las fuentes de variación, su importancia en el resultado final, y no
solo combina los dos conceptos anteriores y los unifica en un solo número,
sino que permite el proceso de mejora continua de una forma lógica y
ordenada.
El procedimiento para la estimación de la incertidumbre es el siguiente:
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PROCEDIMIENTO PARA LA ESTIMACION DE LA
INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (U)
Definir el Mensurando
Identificar las magnitudes de Entrada
Establecer el Modelo Matemático
Identificar las fuentes de incertidumbre
Cuantificar la variabilidad de cada fuente
y asociarle el tipo de distribución
Reducir: Obtener la incertidumbre e´tándar u(xi)
Estimar correlaciones
Calcular la incertidumbre estándar combinada uc
Determinar el factor de cobertura
Calcular la incertidumbre expandida U
El Mensurando es lo que se va a medir (DDT, Cadmio, Naftaleno, etc.)
El Modelo Matemático se determina a partir de las ecuaciones matemáticas que
relacionan las diferentes variables medidas para obtener el resultados analítico (p.
ej. y=mx+b, Co=1000 x m x p / V, etc.), normalmente se utiliza para determinar las
magnitudes de entrada relevantes (masa, volumen, temperatura, curva de
calibración, etc.)
Las principales fuentes de incertidumbre son las siguientes en mediciones químicas,
bioquímicas y biológicas (2):












Toma de la muestra
Condiciones de almacenamiento de la muestra
Efectos instrumentales
Pureza de reactivos
Estequiometría asumida del analito
Preparación de la muestra
Condiciones de la medición
Efectos de la muestra (interferencias de matriz)
Efectos de las computadoras (modelos de curvas de calibración, cifras
significativas en los cálculos, etc.)
Corrección por blancos de reactivos
Efectos de los analistas
Efectos aleatorios
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Todas las fuentes de incertidumbre tienen variabilidad y sus propias incertidumbres,
las cuales se deben expresar en términos de la desviación estándar, pero
normalmente en unidades diferentes (C, ml, mg, etc.)
Existen 2 tipos de Incertidumbre estándar:


Tipo A: Incertidumbre calculada por métodos estadísticos (normalmente
por estudios de repetibilidad).
Tipo B: Incertidumbre calculada por otros métodos (especificaciones del
fabricante, certificados de calibración, efectos del medio ambiente, etc.)
La determinación de la Incertidumbre Estándar se realiza de la siguiente forma:

Incertidumbre Estándar = u(xi) = s / n
donde:
o u(xi) = desviación estándar experimental de la media
o Esta u(xi) representa un intervalo centrado en el mejor estimado del
mensurando (media aritmética) que contiene el valor verdadero con
una probabilidad p del 68.27% (si los datos siguen una distribución
Normal)
Las desviaciones estándar se tienen que “corregir” dependiendo del tipo de
distribución estadística de los datos para obtener las incertidumbres estándar:




s/1 = Normal
s/2 = Normal (k=2)
s/3 = Rectangular (especificaciones simétricas, sin límites de confianza y
donde se pueden esperar valores limítrofes, +- x% como en el material de
vidrio)
s/6 = Triangular (especificaciones simétricas, sin límites de confianza y
donde no se esperan valores limítrofes, pero con datos de alguna distribución
estadística, como en el material de vidrio anterior pero verificado en el
laboratorio y donde no se aprecian valores en los extremos de la
especificación)
Se debe determinar la relación entre las magnitudes de entrada, de tal forma que se
conozca si existe o no correlación entre ellas, con objeto de utilizar el modelo
matemático pertinente para el cálculo de la incertidumbre combinada.
A continuación se debe estimar la incertidumbre estándar combinada, par realizarlo,
se combinan las incertidumbres estándar, según el procedimiento científico, se debe
hacer por medio de la integración de cada una de las incertidumbres estándar de
cada una de las fuentes de incertidumbre, lo cual es bastante complicado, sin
embargo existen aproximaciones aprobadas por la Eurachem que permiten tener
esta combinación por medios matemáticamente menos complejos basados en el tipo
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de modelo matemático que se emplea para calcular la concentración del
mensurando:
1.- Para modelos donde en la formula de cálculo solo existan sumas y restas:

y = (p+q+r+...) entonces uc(y(p,q..) = u(p)2+u(q)2+...
2.- Para modelos donde en la formula de cálculo existan multiplicaciones y divisiones
(el más común):

y = (p x q x r x...) ó p/(q x r x ...) entonces uc(y(p,q..) = (u(p)/p)2+(u(q)/q)2+...
donde:
uc = incertidumbre combinada de y respecto a p,q,r
u(p) = incertidumbre estándar de p
u(q) = incertidumbre estándar de q
u(r) = incertidumbre estándar de r
p = valor de r
q = valor de r
r = valor de r
p,q,r = fuentes de incertidumbre
La incertidumbre combinada se debe ahora multiplicar por el factor de cobertura, el
cual es normalmente es 2 el cuál equivale en una distribución normal al 95.45% de
confianza.
Puede ser otro número dependiendo del número de datos utilizados, en poblaciones
pequeñas se utiliza la t de Student de una tabla de 2 colas.
Con lo anterior se obtiene la incertidumbre expandida, el cual es el estadístico
acordado internacionalmente para expresar la incertidumbre (U):
Incertidumbre Expandida = U = uc k
donde:
uc es la incertidumbre combinada
k es el factor de cobertura, este factor es generalmente 2, el cual
equivale a 2 desviaciones estándar y por lo mismo a una
probabilidad del 95.45%.
Copn objeto de ejemplificar la estimación de incertidumbre con un caso real, se
presenta el caso de la determinación de Cadmio en loza vidriada (NOM 009 SSA1
1993)
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EJEMPLO DE LA DETERMINACION DE LA INCERTIDUMBRE DE LA NOM 009 SSA1 1993
PASO 1 ESPECIFICACION DEL METODO:
1.-Elaboración del diagrama de procesos unitarios
Preparación
Acondicionamiento
de la superficie
Llenado con Acido
Acético al 4%
Lixiviación por 24
hs.
Homogeneización
del lixiviado
Preparación de
Estándares de
Calibración
Determinación por
AAE
Calibración del
AAE
Resultado
PASO 2 IDENTIFICACION Y ANALISIS DE LAS FUENTES DE INCERTIDUMBRE:
2.1- Determinar el modelo matemático (ecuación para el cálculo de la concentración)
I.- r (Masa de Cadmio lixiviado por unidad de area mg/dm2) = ((Co * Vl) / Av) * d * Facido * Ftiempo * Ftemp
Co
Vl
Av
d
Facido
Ftiempo
Ftemp
Contenido de cadmio en la solución de extracción, mg/L
Volumen del lixiviado, L
Area superficial del objeto de prueba, dm2
Factor de dilución
Influencia de la concentración del ácido
Influencia del tiempo de lixiviación
Influencia de la temperatura
II.- Co = (Ao-Bo)/Bi
Ao
Bo
Bi
Absorbancia del metal en la muestra
Intercepción de la curva de calibración
Pendiente de la curva de calibración
Por lo tanto:
III.- r (mg/dm2) = (Vl * (Ao-Bo) * d * Facido * Ftiempo * Ftemp) / (Av * Bi)
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2.2- Identificación de todas las fuentes de incertidumbre (a través de un diagrama causa-efecto)
IV.- r (mg/dm2) = ((Vl * (Ao-Bo) * d) * Ftemp * Facido * Ftiempo / (Av * Bi))
Co
Curva de Calibración
Facido
Ftiempo
Ftemperatura
Vl
Llenado
Temperatura
Calibración
Lectura
r
Longitud 2
Longitud 1
Area
Av
d
Concentración de Cadmio (Co):
Curva de calibración:
Ver Hoja siguiente
U(Co) =
0,017801097
mg/L
0,062091166
dm2
Area (Av):
Longitud 1 (altura):
La superficie se calculo en 2.37 dm2, se estima que la medición está +- 2 mm al 95% de confianza (LC)
si la altura es de 1 dm entonces la Ustd = 2 mm/2 por ser LC 95% = 1 mm
Longitud 2 (ancho):
idem anterior Ustd = 1 mm = 0.01 dm
Area:
Ya que no es exactamente geométrico se utiliza una Uc=5% al 95% LC,
Ustd= 5/2 = 2.5 dm2
Area = 2.37 dm2
Uc(Av) = (0.01^2 + 0.01^2 + ((0.05x2.37) / 1.96)^2)^0.5
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CALCULO DE LA INCERTIDUMBRE POR LA CURVA DE CALIBRACION
Xi
Yi
Xi-X
(Xi-X)^2
Yi-Y
1
2
3
4
5
Suma
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
2,5
0,029
0,083
0,133
0,181
0,220
0,646
-0,400
-0,200
0,000
0,200
0,400
0,000
0,160
0,040
0,000
0,040
0,160
0,400
-0,101
-0,047
0,004
0,052
0,091
0,000
n
X
Y
5
0,5
0,1292
r
b
a
0,9983
0,2410
0,0087
Sy/x
Sb
Sa
LC95b
LC95a
Sx0
m
p
Co
Sxx
0,0051
0,0080
0,005
0,2203
-0,0032
0,018
2
15
0,26
0,4
(Yi-Y)^2 (Xi-X)(Yi-Y)
0,010
0,002
0,000
0,003
0,008
0,023
0,040
0,009
0,000
0,010
0,036
0,096
x^2
Yi
^y
0,0
0,1
0,3
0,5
0,8
1,7
0,0
0,1
0,1
0,2
0,2
0,03
0,08
0,13
0,18
0,23
[yi-^y] (yi-^y)^2
0,00
0,00
0,00
0,00
0,01
0,000017
0,000003
0,000014
0,000015
0,000028
0,000078
1
2
3
4
5
Suma
Xi
Y1
Y2
Y3
Yp
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
2,5
0,028
0,084
0,135
0,180
0,215
0,642
0,029
0,083
0,131
0,181
0,23
0,029
0,081
0,133
0,183
0,216
0,029
0,083
0,133
0,181
0,220
No de datos
Media de X
Media de Y
Desviación estándar residual
Desviación estándar de la intercepción
Desviación estándar de la pendiente
Incertidumbre (Error) del resultado analítico (u(co))
No. de lecturas
No. de puntos de la curva leidos
Resultado analítico
Suma de los cuadrados de la diferencia de los valores menos la media de x
Efecto de temperatura:
El efecto de la temperatura está publicado y es 5%/grado C (ver ref 1-5 Eurachem) para el rango de +- 2 que permite
el metodo, el Ftemp sería 1+-0.1
Ustd con una distribución rectangular sería 0.1/3^0.5 = 0.06
0,06
mL
Efecto de Tiempo:
Un estudio (ref 1 eurachem) 1.8 mg/l en 86 mg/l = 0.3%/h por el rango de +- 0.5h en 24 h el Ft = 1+-(0.5x0.003) = 1+- 0.0015
Ustd con una distribución rectangular sería 0.0015/3^0.5 = 0.001
0,001
mL
Concentración del ácido acético:
Un estudio dice que ujh cambio de 4 a 5% del ácido aumenta de 92.9 a 101.9 mg/l o sea 9.7% (0.097) por cada 1% de cambio
concentracion de acido
Por otro lado la Ustd de la estandarizacion del acido con NaOH (ver ejemplo en eurachem) es de 0.008% v/v
Ustd del Facido = 0.008 x 0.1 = 0.0008, como esta en Ustd, no se hacen mas calculos
0,008
mg/L
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PASO 4 CALCULO DE LA INCERTIDUMBRE ESTANDAR COMBINADA:
Los valores intermedios son:
r (Masa de Cadmio lixiviado por unidad de area mg/dm2) = ((Co * Vl) / Av) * d * Facido * Ftiempo * Ftemp
Valores Intermedios e incertidumbres
Magnitud de
Valor
Incertidumbre
Entrada o Fuente de Unidades
Estimado (x)
Estándar
Incertidumbre
Símbolo
Concentración de
Cadmio (Co):
Volumen (Vl):
Area (Av):
Efecto de
temperatura:
Concentración de
Cadmio (Co):
Volumen (Vl):
Area (Av):
Efecto de
temperatura:
Incertidumbre
Estándar
Combinada
Incertidumbre
Estándar
Relativa U(x)/x
mg/L
0,26
0,017801
0,06847
L
dm2
0,332
2,37
0,001829
0,062091
0,00551
0,02620
mg/L
1
0,0600
0,06000
Efecto de Tiempo: Efecto de Tiempo:
mL
1
0,0010
0,00100
Concentración del Concentración del
ácido acético: ácido acético:
mg/L
1
0,0080
0,00800
Diluciones (D)
r = ((0.26 * 0.332 * 1 * 1 * 1 * 1) / 2.37) =
0,036422
mg/dm2
Incertidumbre Combinada Ucr = r * ((U(Co)/Co)^2+(U(Vl)/Vl)^2+(U(Av)/Av)^2+(Ufacido/Facido)^2+(Uft/ft)^2+ (Uftemp/Ftemp)^2) ^0.5 =
0,003469
0.0034 mg/dm2
mg/dm2
CALCULO DE LA INCERTIDUMBRE EXPANDIDA:
U = Uc * t95
0,00694
RESUMEN:
Símbolo
Magnitud de
Valor
Entrada o Fuente de Unidades
Estimado (x)
Incertidumbre
Concentración de Concentración de
Cadmio (Co): Cadmio (Co):
mg/L
Diluciones (D) Diluciones (D)
Volumen (Vl): Volumen (Vl):
Llenado
L
L
Temperatura
L
Lectura del
Volumen
Calibración
Area (Av):
Longitud 1 altura
Longitud 2 ancho
Area
Fuente de
Información
0,26
Curvas de
calibración
#¡DIV/0!
No se hizo
dilución
Incertidumbre
Original
Tipo de
Distribución
Calculo de la Us
Incertidumbre
Estándar
0,332
Practica
99.5+-0.5%
Triangular
Metodo
22+-2 C
Rectangular
0.005*332/6^0.5
(2.1e-4*332*2) /
(3)^0.5
0,0007
Incertidumbre
Incertidumbre
Coeficiente de
Estándar
Estándar
Sensibilidad
Combinada
Relativa U(x)/x
0,017801
0,06847
0,001829
0,00551
0,062091
0,02620
0,0001
L
Practica
1% error
Triangular
0.01*332/(6)^0.5
0,0014
L
dm2
dm
dm
dm2
Especificacion
500+-2.5 ml
Triangular
2.5/(6)^0.5
0,0010
0.02/1.96
0.02/1.96
(0.05*2.37)/1.96
0,010
0,010
0,060
0.008*0.1
0,0080
0,00800
2,37
Practica
2 mm al 95%P Normal
2 mm al 95%P Normal
5 % error
Normal
0.1% por %v/v
Estudio + U de la
acido + 0.008% U
titulación del
de la titulación con
ácido
NaOH
Concentración del
ácido acético:
mg/L
1
Efecto de Tiempo:
mL
1
0,0015
Rectangular
0.0015/(3)^0.5
0,001
0,00100
Efecto de
temperatura:
mg/L
1
0,1
Rectangular
0.1/(3)^0.5
0,06
0,06000
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HOJA DE CALCULO PARA LA ESTIMACION DE LA INCERTIDUMBRE
Valor
Concentra
ción de
Cadmio
(Co):
0,26
Incertidumbre Std
0,01780
Concentración de Cadmio0,26
(Co):
0,332
Volumen (Vl):
2,37
Area (Av):
1
Concentración del ácido acético:
1
Efecto de Tiempo:
1
Efecto de temperatura:
r
u(y,xi)
u(y)^2,u(y,xi)^2
0,332
0,00183
0,2778011
0,26
0,332
0,33382877
2,37
2,37
1
1
1
1
1
1
0,036422
0,038916
0,002494
6,22E-06
1,199E-05
Inceridumbre
Combinada Uc(r)
Volumen
(Vl):
0,036623
0,000201
4,03E-08
Concentración
del ácido acético:
Area (Av):
Efecto de
Tiempo:
Efecto de
temperatura:
2,37
1
1
1
0,06209
0,00800
0,00100
0,06000
0,26
0,332
2,432091166
1
1
1
0,26
0,332
2,37
1,008
1
1
0,26
0,332
2,37
1
1,001
1
0,26
0,332
2,37
1
1
1,06
0,035492
0,000930
8,65E-07
0,036713
0,000291
8,49E-08
0,036458
0,000036
1,33E-09
0,038607
0,002185
4,78E-06
0,003462
Incertidumbres Std. Vs Incertidumbre Combinada
Efecto de temperatura:
Efecto de Tiempo:
0,002185
0,000036
Concentración del ácido acético:
0,000291
Area (Av):
Volumen (Vl):
0,000930
0,000201
Concentración de Cadmio (Co):
0,002494
r
0,0000
0,003462
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
0,0025
0,0030
0,0035
0,0040
Incertidumbres (mg/dm2)
Para la estimación de la incertidumbre inicial los datos de partida son los de la
validación del método.
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