IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y DIFERENCIACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS CULTIVADAS EN 5 TIPOS DE AGAR. *Gutiérrez, juan; García,Lorena; Guacanes, Leidy 1; Motta, Diana 1. Estudiantes de cuarto semestre de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la universidad de la Amazonia. Florencia- Caquetá Email: [email protected]* RESUMEN Universidad Uno de los sistemas más importantes para la identificación microorganismos es de observar Florencia, de la Amazonia quienes microorganismos analizaron presentes sede los dos su diferentes tipos de leche, utilizadas para crecimiento de bacterias en la leche, para que estas crezcan adecuadamente el consumo humano, este estudio se en un medio de cultivo artificial este realizado en 5 medios de cultivo sólidos debe reunir una serie de condiciones (agares). como son: humedad temperatura, y presión grado de de oxígeno PALABRAS CLAVE: Leche, Agar, Consumo humano, adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y Microorganismo, Patógeno ABSTRACT factores de crecimiento necesarios y One of the most important systems for debe the identification of microorganisms is to estar microorganismo exento de contaminante, todo este informe se plasman los resultados de una práctica realizada por estudiantes de la observe their growth of bacteria in milk, so that they grow properly in an artificial culture medium, this must meet a series of conditions such as: temperature, M.R, humidity and pressure of adequate pueden ser observados individualmente a oxygen, as well as a correct degree of través de un microscopio (Díaz G.A, 2009) acidity or alkalinity. A culture medium o a simple vista cuando en conjunto must contain the necessary nutrients and forman colonias (Pírez M, 2014). Las growth factors and must be free of all colonias son la manera macroscópica de contaminating observar la morfología que constituye una microorganisms, this 1999). Estos report reflects the results of a practice agrupación carried out by students of the University establecen en agrupaciones formadas por of the Amazon headquarters Florence, la reproducción de las bacterias en un who medio (Axelsson L, 1998). analyzed the two different de microorganismos bacterias, que se microorganisms present types of milk, Existen miles de medios de cultivos con used for human consumption, this study diferentes características pero en este was conducted in 5 solid culture media caso, el medio de cultivo fueron cinco (agars). tipos KEYWORDS MacConkey, agar EMD, agar bismuto Milk, Agar, Human consumption, de agar: agar sangre, agar sulfito y agar Sabouraud. Estas colonias, Microorganism, Pathogen Vistas al microscopio, por lo general, INTRODUCCIÓN presentan Las bacterias son tres formas básicas: las microorganismos bacterias esféricas se denominarán cocos, unicelulares que se reproducen por fisión las alargadas se denominan bacilos, las binaria, es decir, asexualmente (Adams bacterias curvadas y las que tienen forma de espiral se denominan espirilos, su forma en los diferentes grupos espiroquetas, comas o vibriones; cada bacterianos. una distintas MATERIALES de su En primer lugar, es necesario para reproducción en el medio; Las múltiples ingresar al laboratorio tener en cuenta el formas estar equipo de bioseguridad, estando en determinadas por distintos factores, primer lugar la bata, guantes, tapabocas y siendo la rigidez de la pared celular, la gorro. de ellas características presentan dependiendo bacterianas pueden más importante de ellas (Jay J.M, 2000). En las últimas décadas la investigación de este tipo de microorganismos ha permitido comprender su relación con el hombre además de encontrar los mecanismos de inmunidad para algunas bacterias mediante la creación de vacunas (Torres M, 2002). El estudio de las bacterias se constituye de esta manera un Imagen 1, Bata de bioseguridad, autor: https://www.hoyfarma.com/images/stories/virtuemar tema bastante importante dentro de la microbiología, por lo tanto, el objetivo de este laboratorio es identificar la morfología de las colonias y bacterias estudiadas para clasificarlas de acuerdo a t/product/bata%20blanca%20manga%20larga%20pun o%20resorte.png Luego, para llevar a cabo todo el procedimiento en el laboratorio con éxito se necesitó un mechero, un asa de platino, laminas porta objetos y un porta laminas para conservar adecuadamente Imagen 2, Guantes de bioseguridad, autor: las muestras. http://distribuidoradicola.com/wpcontent/uploads/2015/01/guantes-de-vitrilo-sin-polvotalla-extra-grande.jpg Imagen 3, Tapabocas de bioseguridad, autor: https://www.hoyfarma.com/images/stories/virtuemar Imagen 4, mechero, autor: juan David Gutiérrez. Tomada en: laboratorio de biología UDLA. t/product/tapabocas%20tres%20pliegues.png Imagen 5, asa de platino, autor: juan David Gutiérrez. Tomada en: laboratorio de biología UDLA. Imagen 4, gorro desechable, autor: https://img.directindustry.es/images_di/photog/166427-13250970.jpg Imagen 6, laminas porta objetos, autor: https://cdn.shopify.com/s/files/1/1111/2076/products /Captura_de_pantalla_2016-02Imagen 8, microscopio, autor: https://images21_a_las_11.46.48_1024x1024.png?v=1456052952 na.ssl-images-amazon.com/images/I/71ATAp4YXL._SX466_.jpg También se necesitó el medio de cultivo, en este caso fue el agar. Imagen 7, porta laminas, autor: https://encryptedtbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSFDKstKKGgmL2oXJ8EOiAlnCTvsEgs5fe5STUXvMF7OB75V Imagen 9, agar sangre, agar Sabouraud, agar bP&s Se necesitó un microscopio para poder MacConkey, agar EMD y agar bismutosulfito. autor: juan David Gutiérrez. Tomada en: laboratorio de realizar la correspondiente observación morfológica de las placas tomadas en el laboratorio. biología UDLA. por último, se utilizó leche comercial y El día 12 se septiembre del año 2019 a el material biológico que fue la leche de las 6:00 am se realizó el muestreo en la Finca san Vicente, ubicada en la vía principal que conecta a Florencia con El paujil, aproximadamente en el km 15. El muestreo se realizó de una forma general, es decir, no se tomó la muestra de leche vaca. solo en una vaca, sino que la muestra se Imagen 10, leche comercial <Colanta>, autor: juan David Gutiérrez. Tomada en: laboratorio de biología UDLA. tomó de todas las vacas que se ordeñaron, 4 vacas en total para ser más específicos. La muestra fue tomada en un tarro de orina y se selló hasta el día de la siembra en el laboratorio. Para evitar que . las bacterias se murieran por cuestiones . de temperatura, la muestra se mantuvo Imagen 11, leche de vaca, autor: juan David en la nevera, a una temperatura entre 0 y Gutiérrez. tomada en: finca san Vicente 5 grados centígrados aproximadamente. La siembra de cultivos de bacterias se METODOLOGÍA realizó el mismo día, 12 de septiembre del La recolección del material biológico se 2019 a las 6:00 pm en el laboratorio de realizó por parte de los integrantes del presente informe. biología de la UDLA. Para la siembra, primero se tuvo en cuenta el asa de platino (imagen 5), el cual se calentó en el mechero (imagen 4) para poder dividir el cultivo en 2 mitades (imagen 12). se dividió en dos mitades para poder diferenciar los resultados tanto de la muestra de leche comercial, como la muestra biológica. Imagen 12, división de cultivo en dos mitades, autor: juan David Gutiérrez. Tomada en: laboratorio de biología UDLA RESULTADOS Y DISCUSIÓN AGAR MACCONKEY El agar MacConkey es un medio diferencial y selectivo para el aislamiento de bacilos Gram negativos, fermentadores o no de lactosa, de la familia de las Enterobacterias provenientes de muestras Imagen 13, muestra de agar MacConkey, leche comercial clínicas y no clínicas (Levine, M., and y finca. autor: leidy guacanez. tomada en: laboratorio microbiología H.W.). también puede ser utilizado en análisis de alimentos (Downes, F.P., and K. Ito.). Este medio está basado en el hecho de que las sales biliares son precipitadas por los ácidos; la presencia de sales biliares y cristal violeta inhibe el crecimiento de la mayoría de bacterias Gram positivas como Imagen 14, muestra de agar MacConkey, leche comercial y finca. autor: diana marcela Motta. tomada en: laboratorio microbiología 1-macconkey se observó Enterococcus y (MacConkey, A.T.). microorganismos fermentadores Staphylococcus dentro entéricos de de se lactosa fermentadores (MacConkey, A.). los tienen y en 100x bacilos pleomorficos. no Microscópicamente se logró determinar, que la morfología que se encontraba presente era la de Bacilos Gram positivos, encontrados sin una organización o agrupación definida, como lo podría ser que son bacilos pleomorficos, una forma circular y en algunos puntos del comercial fue contaminada desde su campo se observaron cómo bacilos rectos origen. y no fue posible identificar la presencia de AGAR SULFITO BISMUTO flagelos; teniendo en cuenta lo anterior y Como la mayoría de los medios de cultivo, lo descrito por Alberto Ernesto Parma en el agar sulfito de bismuto contiene Microbiología 197 sustancias nutritivas para promover el (Stanchi N. O. 2007), sobre Escherichia desarrollo bacteriano, tales como las Coli. peptonas y el extracto de carne. Así Es posible determinar como positiva la mismo, la glucosa funciona como una presencia de este microorganismo en estas fuente de energía y carbono. veterinaria, pág. colonias, sumado a que coincide de igual forma la morfología colonial Ahora bien, no todas las bacterias y la crecerán en este medio, ya que el agar posibilidad de que se desarrolle en este sulfito de bismuto es un medio selectivo. medio de cultivo específico y además a Este contiene compuestos que inhiben el esto, la posibilidad de encontrar el mismo crecimiento de los microorganismos Gram microorganismo en la leche comercial se positivos y de ciertas bacterias Gram puede determinar finalmente que una de negativas. Estos compuestos son: el las muestras en este caso la leche se indicador sulfito de bismuto y el verde encuentran contaminadas con Escherichia brillante. Por su parte, el fosfato disódico Coli, o durante el protocolo de toma y mantiene la osmolaridad y el pH del siembra de las muestras se realizó una medio. contaminación cruzada entre estas, de Adicionalmente, el agar sulfito de manera esto quiere decir que la leche bismuto es un medio diferencial gracias a la presencia del sulfato ferroso, que evidencia la formación de H2S. El H2S compuestos contienen muchos nutrientes y formado por las bacterias reacciona con el esta propiedad permite que en él puedan sulfato ferroso y forma un precipitado crecer negro insoluble claramente visible. cultivables. Finalmente, el agar-agar proporciona la consistencia sólida al medio según (Wilson y Blair) (1927). la mayoría de las bacterias Ese crecimiento ocurre sin restricción; por este motivo es no selectivo. Sin embargo, si a este medio se le adicionan compuestos que impidan el crecimiento de algunos microorganismos y favorezca el de otros, se vuelve selectivo. Es el caso si se adicionan ciertos tipos de antibióticos o anti fúngicos. Así mismo, el agar sangre es un medio diferencial, ya que permite distinguir 3 tipos de bacterias: los beta-hemolíticos, alfa – hemolíticos y gamma-hemolíticos Según Imagen 15, muestra de agar bismuto, leche comercial y los laboratorios Britania (Britania, s. f.). finca. autor: leidy guacanez. tomada en: laboratorio microbiología Microscópicamente no se logró determinar nada en este agar porque no estaba contaminado entero bacterias. AGAR SANGRE El agar sangre es un medio enriquecido Imagen 16,, muestra de agar sangre, leche comercial porque lleva como aditivo principal 5 -10% y finca. autor: leidy guacanez. tomada en: laboratorio de sangre sobre una base de agar. Ambos microbiología Imagen 17:1-01 sangre bacilos en empalizada gram + leche de finca esta muestra se observó en 100x autor: diana marcela Motta tomada en laboratorio. Este campo estuvo destinado para la Imagen 18:(1-01) formas coco basilares (estafilococos con bacilos) Gram + leche de finca agar sangre esta muestra se observó en 100x autor: diana marcela Motta tomada en laboratorio. siembra de la leche tomada directamente de una vaca de finca, las características microscópicas y de su colonia, han llevado a realizar un diagnóstico presuntivo que apunta a el hallazgo de E. coli, se determinó una la colonia de forma alargada, con centro grande y color más oscuro que su exterior, también se determinó una alfa hemolisis debido a que hubo una oxidación parcial de los glóbulos rojos, por otro lado microscópicamente presento bacilos Gram positivos, en empalizada. Este campo estuvo destinado para la siembra de la leche tomada directamente de una vaca de finca, donde según las características microbiológicas y de su colonia, las cuales resultan tener una similitud bastante cercana con las del microorganismo staphylococcus aureus. Con bacilos y cocos bacilares Se observó una colonia grande, de forma alargada, elevación plana o elevada, con color amarilloso a dorado, un crecimiento fuerte y rápido y tambien se observó una beta hemolisis. Imagen 19:1-02 formas coco basilares organizados bacilos alargadas Gram –leche comercial sangre se observó en 100x autor: diana marcela Motta tomada Este campo estuvo destinado para la siembra de la leche tomada directamente de una bolsa de leche comercial, donde según las características microscópicas y de su colonia, se determinó la morfología de la colonia fue grande, teniendo en cuenta que este microorganismo no es exigente y el agar sangre le proporciona nutrientes necesarios para su desarrollo; donde se vio como formas bacilares organizados y bacilos alargados Gram negativos. observó en 100x autor: diana marcela Motta tomada en laboratorio. en laboratorio. los Imagen 20-2-01 sangre cocos gran + leche comercial se Este campo estuvo destinado para la siembra de la leche tomada directamente de una bolsa de leche comercial, donde según las características microscópicas y de su colonia, se determinó la morfología de la colonia fue pequeña, teniendo en cuenta que este microorganismo no es exigente y el agar sangre le proporciona los nutrientes necesarios para su desarrollo; donde se vio como formas bacilares organizados y bacilos alargados Gram positivos. AGAR SABOURAUD negativas. Se agrega gentamicina para El agar dextrosa de Sabouraud (SDA) inhibir aún más el crecimiento de bacterias se usa para el aislamiento, cultivo y gram Negativas. mantenimiento de especies de hongos y levaduras no patógenas y patógenas. SDA fue formulado por Sabouraud en 1892 para el cultivo de dermatofitos. El pH se ajusta a aproximadamente 5,6 para mejorar el Imagen 21, muestra de agar sangre, leche comercial crecimiento de hongos, especialmente dermatofitos, e inhibir ligeramente el y finca. autor: leidy guacanez. tomada en: laboratorio microbiología crecimiento bacteriano en muestras clínicas (Sagar Aryal) Este medio está basado en La peptona (resumen enzimático de caseína y resumen enzimático de tejido animal) proporciona la fuente de nitrógeno y vitaminas necesaria para el crecimiento de Imagen 22: 1-01saboraud bacilos letras china gram- organismos en SDA. La dextrosa se agrega esta muestra se observó en 100x autor: diana marcela como fuente de energía y carbono. El agar Motta tomada en laboratorio. es el agente solidificante, Se puede agregar Este campo estuvo destinado para la cloranfenicol y / o tetraciclina como siembra de la leche tomada directamente antimicrobianos de amplio espectro para de inhibir el crecimiento de una amplia gama características microscópicas y de su de bacterias grrftam positivas y Gram colonia, se determinó la morfología de la una finca, donde según las colonia fue grande donde se vio como que es una colonia blanca con borde entero formas bacilos en letras chinas alargados y elevación plata. Gram negativos también se puede determinar que es una colonia amarillenta con bordes irregulares y elevación baja convexa. Imagen 24: 2 –saboraud -01 bacilos empalizada esta muestra se observó en 100x. autor: diana marcela Motta tomada en laboratorio. Este campo estuvo destinado para la siembra de la leche tomada directamente de una bolsa de leche comercial donde Imagen 23:1- Sabouraud - 02-cocos gram- según las características microscópicas y muestra se observó en 100x. autor: diana marcela de su colonia, se determinó la morfología Motta tomada en laboratorio. Este campo estuvo destinado para la de la colonia fue grande donde se vio como siembra de la leche tomada directamente formas de bacilos en empalizada alargados de una finca, donde según las Gram positivos también se puede características microscópicas y de su determinar que es una colonia amplia con colonia, se determinó la morfología de la borde cremado y elevación baja convexa. colonia fue pequeña donde se vio como formas de cocos circulares Gram negativos también se puede determinar y Teague) Agar EMB, contiene colorantes de azul de metileno y eosina, que inhiben las bacterias gram positivas en cierto grado. Los colorantes también actúan Imagen 25: 2 -saboraud -02 bacilos en empalizada esta muestra se observó en 100x autor: diana marcela como indicadores diferenciales en respuesta a la fermentación de la lactosa o Motta tomada en laboratorio. Este campo estuvo destinado para la la sacarosa por siembra de la leche tomada directamente microorganismos. parte de los de una bolsa de leche comercial donde Los coliformes producen colonias de según las características microscópicas y color negro azulado, mientras que las de su colonia, se determinó la morfología colonias de Salmonella y Shigella son de la colonia fue pequeña donde se vio incoloras o de color ámbar transparente. como formas de bacilos en empalizada Las colonias de Escherichia coli pueden alargados Gram negativos también se exhibir un brillo puede determinar donde hay dos colonias característico blancas pequeñas, con borde entero y fermentación de la lactosa. (MacFaddin, elevación plana, J.F.) debido verde a metálico la rápida AGAR EMB El agar EMB es un medio ligeramente selectivo para el aislamiento y la diferenciación de bacilos gram negativos Imagen 26, muestra de agar sangre, leche comercial entéricos (Enterobacteriaceae y diversos y finca. autor: leidy guacanez. tomada en: laboratorio microbiología. otros bacilos gram negativos) (Holt-Harris medios utilizados para el crecimiento de entero bacterias (Elida Gentiline). El flagelo polar monotrico no es visible. Imagen 27-1-emb-01-lf bacilos ramificados gram + autor: leidy guacanez. tomada en: laboratorio microbiología. Esta muestra de obtuvo directamente de una bolsa de leche comercial marca colanta donde se pudo observar una colonia donde se identificó esta era color Imagen 28: -02-emb-01-01 bacilos organizados crecimiento ramificado relacionados con micobacteriun autor: leidy guacanez. tomada en: laboratorio blanco, con un tamaño de 5mm de microbiología. diámetro, y contaba con un centro en Esta muestra de obtuvo directamente de relieve, microscópicamente de observaron una bolsa de leche comercial marca bacilos negativa; colanta donde se pudo observar una características colonia donde se identificó esta era color Debido ramificados a morfológicas Gram estas de la colonia y violeta; con un tamaño grande, microscópicas la colonia tuve un bajo microscópicamente de observaron bacilos crecimiento también se dice que tiene organizados con crecimiento ramificados respiración anaerobia, pueden crecer en relacionados con micobacterium Gram medios de cultivos simples o todos los negativo; Debido a estas características morfológicas de microscópicas la la colonia colonia y tuvo un crecimiento alto donde se observa grande. Imagen 30 -2-mb-03 lc hongos bacilos letras chinas esta muestra se observó en 100x autor: diana marcela Motta tomada en laboratorio. Esta muestra de obtuvo directamente de leche de finca donde microscópicamente Imagen 29: -Emb 2-02 bacilos en agrupaciones gram – se pudo observar una colonia de esta muestra se observó en 100x autor: diana marcela crecimiento lento también se observan Motta tomada en laboratorio. bacilos Esta muestra de obtuvo directamente de una bolsa de leche comercial marca ramificados que son Gram negativos color blanca pequeña con bordes irregulares. colanta donde microscópicamente se pudo observar una colonia de crecimiento rápido también se observan hongos, y CONCLUSION bacilos en letras chinas que son Gram Si bien hay muchos factores que pueden positivos color violeta. influir en los resultados durante una práctica de laboratorio, y más por estudiantes universitarios inexpertos en la materia, durante la cual se puede realizar un mal manejo o mal procedimiento, que afecten en los resultados y no permitan tener conclusiones precisas; teniendo en Los lácteos descompone la caseína a consideración la posible contaminación péptidos y aminoácidos y la grasa de la cruzada leche a ácidos grasos libres, los cuales entre contaminación muestras, por la posible exposición al ambiente, la falla en protocolos como descomponen la leche y acortan su vida útil. pueden ser los de tinción, toma de muestras, siembra, conservación de las REFERENCIAS Referencias muestras, entre otros realizados durante el Adams M.R. (1999). food microbiology. desarrollo de la práctica, podemos concluir cambridge : the royal society of chemistry . que directamente relacionado a los Axelsson L. (1998). latic acid bacteria: resultados obtenidos en los agares, las classification and physiologic. microbiology muestras bacilares tanto como de finca and functional aspects , 1-72. como comercial presentaron un tipo de contaminación por heces fecales o han tenido contacto con alguna herida . La práctica universitaria en conclusión puede declararse como exitosa, debido a que se cumplio con el objetivo de identificar los microorganismos presentes en las Diaz G.A. (2009). morfologia y estructura bacteriana . centro de formacion profesional. instituto villaverde, 28(2). Jay J.M. (2000). modern food microbiology . Pírez M. (2014). morfologia y estructura bacteriana. revista de actualizacion clinica , 45(2). muestras, sin embargo, no es posible Torres M. (2002). flora, probioticos y salud. determinar el origen real de cada uno de Guadalajara : segunda edicion, formas finas. los mismos, ni describir su procedencia en .Laboratorio ValteK. (2009). Agar Sabouraud la muestra. dextrosa con cycloheximida. Disponible en: Signature=be1abb82133c62188d064a661ab andinamedica.com. 6ce332e3b09908c9346f9596b35733e0770ae Bayona M. Condiciones microbiológicas para https://www.lifeder.com/agar-sulfito-de- el cultivo de Helicobacter pylori. Rev Col bismuto/ Gastroenterol 2013; 28 (2): 94-99 https://www.lifeder.com/agar-sangre/ Laboratorio CEDIVET Centro de Diagnóstico https://www.lifeder.com/agar-sabouraud/ Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). http://aramara.uan.mx:8080/bitstream/123 Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott. 456789/436/1/Bacterias%20l%c3%a1cticas% 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina 2c%20Importancia%20en%20alimentos%20y http://metabase.uaem.mx/bitstream/handle %20sus%20efectos%20en%20la%20salud.pdf /123456789/1466/280_2.pdf?sequence=1htt ps://s3.amazonaws.com/academia.edu.docu ments/43169930/MorfologiayEstructuraBact eriana.pdf?response-contentdisposition=inline%3B%20filename%3DTEM AS_DE_BACTERIOLOGIA_Y_VIROLOGIA_MED IC.pdf&X-Amz-Algorithm=AWS4-HMACSHA256&X-AmzCredential=AKIAIWOWYYGZ2Y53UL3A%2F20 191112%2Fus-east1%2Fs3%2Faws4_request&X-AmzDate=20191112T154451Z&X-AmzExpires=3600&X-AmzSignedHeaders=host&X-Amz-
