3-LISBOA 1.Hidrolizado de Spirulina

XIII Congreso CYTAL - AATA
Facultad de Ciencias de la Alimentación, UNER,
Buenos Aires, Argentina, 19-21 de octubre 2011
ESTUDO DO GRAU DE HIDRÓLISE DA PROTEÍNA DA MICROALGA
Spirulina UTILIZANDO ENZIMA COMERCIAL MICROBIANA
C.R. Lisboa1*, S.P. Ferreira1, A.M. Pereira1, J.A.V. Costa1
1
Universidade Federal do Rio Grande – Escola de Química e Alimentos
Caixa Postal 474 – 96201-900 Rio Grande, RS, Brasil, [email protected]
Resumo: O objetivo deste trabalho foi estudar a obtenção de um hidrolisado protéico derivado de
biomassa microalgal utilizando uma enzima proteolítica, avaliando a influência da concentração de
enzima, de substrato e tempo de reação sobre o grau de hidrólise das proteínas. A microalga utilizada no
estudo foi Spirulina sp. LEB-18 e a enzima proteolítica comercial Protemax 580L. Foi utilizado um
planejamento fatorial 23 com três repetições no ponto central. Foram realizados 11 experimentos em
“shaker” a 180 rpm e temperatura constante de 60 ºC. A reação de hidrólise foi realizada durante 4h, e
analisado o grau de hidrólise em 0h, 1h, 2,5h e 4h. O maior grau de hidrólise atingido foi 66,7%, no qual
corresponde ao experimento 6 em 4h de reação, sendo o sistema reacional composto por 10 U.mL-1 de
enzima e 5 % de substrato. A variável concentração de substrato apresentou efeito significativo sobre o
grau de hidrólise.
Palavras-chaves: grau de hidrólise, Spirulina sp. LEB-18, planejamento fatorial
INTRODUÇÃO
As microalgas representam os microrganismos
fotossintéticos procarióticos e eucarióticos que
vivem em meio ambiente aquático (Vonshak,
1997). As cianobactérias são microrganismos
procarióticos fotossintetizantes que surgiram há
mais de 3 milhões de anos e formaram a atual
atmosfera com oxigênio, e desde então regulam a
biosfera do planeta retirando CO2 e produzindo O2
(Romano et al., 2000). A Spirulina é uma
cianobactéria que tem despertado interesse de
muitos pesquisadores devido ao seu elevado poder
nutricional, produção de substâncias de alto valor
agregado e propriedades nutracêuticas (Sarada et
al., 1999). Possui biomassa rica em proteínas (60 a
70%), apresentando um grande potencial para a
extração de biocompostos com alto valor agregado.
A hidrólise de proteínas é basicamente o resultado
da clivagem de suas ligações peptídicas, liberando
peptídios de diferentes tamanhos e aminoácidos
livres. Para romper as ligações peptídicas e preparar
os hidrolisados são indicados três métodos
principais: as hidrólises enzimática, alcalina e ácida
(Bernardi, 2000; Clemente, 2000; Furlan e Oetterer,
2002). A hidrólise enzimática apresenta uma série
de vantagens sobre a hidrólise química, como
especificidade, controle do grau de hidrólise,
condições moderadas de ação, disponibilidade
comercial em larga escala, custo moderado, menor
teor de sal no produto final e formação mínima de
subprodutos (Mannheim e Cheryan, 1992; Pearce,
1995; Clemente, 2000). Por ser realizada em
condições brandas e controladas, garante a
manutenção da qualidade nutricional dos
hidrolisados e um perfil peptídico definido e
reprodutível. O grau de hidrólise (GH) é o
parâmetro utilizado para comparar hidrolisados
protéicos entre si (Adler-Nissen, 1986; Mahmoud et
al., 1992; Siemensma et al., 1993; Lahl e Braun,
1994).
Enzimas proteolíticas ou proteases catalisam a
quebra das ligações peptídicas em proteínas. Várias
enzimas têm sido utilizadas na extração enzimática
de proteínas. Entre estas, encontram-se a
pancreatina, as proteases alcalina, fúngica ou
bacteriana (Euber et al., 1991); uma endoprotease
(alcalase de grau alimentício do Bacillus
liccheniformis); um complexo de proteases
(flavourzima do Aspergillus oryzae) seguido de
uma preparação de carboidrase do Aspergillus
aculeatus e do Humicola insolens (Fischer et al.,
2001); endoprotease e amilase (Tang et al., 2002);
α-amilase (BAN 240 L) e protease (Promozyme
400 L) (Agboola et al., 2005).
O objetivo deste trabalho foi estudar a obtenção de
um hidrolisado protéico derivado de biomassa
microalgal utilizando uma enzima proteolítica,
avaliando a influência da concentração de enzima e
de substrato e tempo de reação sobre o grau de
hidrólise das proteínas.
MATERIAL E MÉTODOS
Microalga
Foi utilizada biomassa da microalga Spirulina sp.
LEB-18, da coleção do Laboratório de Engenharia
Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande.
Enzima
Utilizou-se a enzima comercial Protemax 580L de
Bacillus lichenformis, gentilmente cedida pela
Prozyn (São Paulo – SP). A atividade da enzima foi
definida como a quantidade de enzima que libera
1µg de tirosina por minuto, dentro das condições
usadas no estudo.
Atividade Enzimática
A atividade enzimática das proteases comerciais foi
determinada segundo o método descrito por Ma et
al., 2007.
Processo de Hidrólise Enzimática
As reações de hidrólise com a enzima Protemax
580 L foram realizadas em meio aquoso. O sistema
de reação foi composto pela biomassa de Spirulina,
previamente caracterizada quanto à composição
centesimal (AOAC, 2000), em tampão bicarbonato
carbonato de sódio pH 9,5 e enzima Protemax
580L, totalizando 100 mL. Os erlenmeyers foram
dispostos em “shaker” (Certomat BS-1) com
agitação de 180 rpm e temperatura constante de 60
°C, temperatura ótima de atividade da enzima, para
todos os experimentos. As quantidades de enzima e
biomassa foram adicionadas conforme estabelecido
no planejamento fatorial. A hidrólise enzimática foi
acompanhada durante um período de 4 h.
Determinação do grau de hidrólise
A análise de determinação do grau de hidrólise
(GH) foi realizada em 0h, 1h, 2,5h e 4h. Após
transcorrido cada tempo, alíquotas de 1 mL de
hidrolisado foram inativadas pela adição de 9 mL
de solução de ácido tricloroacético (TCA) 6,25 % e
deixadas em repouso por 10 min. Posteriormente
foram centrifugadas por 5 min a 5000 rpm para
remoção do material insolúvel precipitado pelo
TCA. Determinou-se o teor de proteínas solúveis no
filtrado utilizando o método de Folin-Lowry,
expresso em mg de albumina. O grau de hidrólise
foi estimado segundo o método descrito por Hoyle
e Marrit (1994) com modificações, sendo expresso
como a porcentagem de proteínas solúveis no TCA
em relação à quantidade de proteína inicial total, e
calculado segundo a Equação (1):
%GH =
( PS tempot − PS tempo 0 ) × 100
Ptotal
(1)
onde o branco, PS tempo 0, correspondeu à quantidade
de proteína solúvel em TCA 6,25 % antes da adição
da enzima; PS tempo t foi a quantidade de proteína
solúvel em determinado tempo após a adição da
enzima e Ptotal foi a quantidade de proteína total na
amostra determinada por micro Kjeldahl (N x 6,25).
Planejamento Fatorial
Neste estudo o planejamento fatorial foi utilizado
para verificar quais das variáveis apresentaram
efeitos significativos sobre o grau de hidrólise.
Assim, foi estudada a influência da concentração de
enzima, concentração de substrato e o tempo de
reação. O teor inicial do substrato, a concentração
de enzima adicionada e o tempo de reação foram as
variáveis estudadas através de planejamento
fatorial. Foi realizado um planejamento fatorial tipo
23 com três repetições no ponto central,
considerando como variável dependente o grau de
hidrólise das proteínas. As análises foram
realizadas em duplicata e os dados tratados através
do software Statistica 5.0. A Tabela 1 apresenta os
níveis e valores das variáveis independentes
utilizadas no planejamento fatorial.
Tabela 1. Níveis e valores das variáveis
independentes de concentração de substrato, de
concentração de enzima e de tempo utilizados no
planejamento fatorial 23.
Variáveis
Níveis
independentes
-1
0
+1
CE (U.mL-1)
5
7,5
10
CS (%)
5
7,5
10
t (min)
60
150
240
CE = concentração de enzima; CS = concentração
de substrato; t = tempo.
A influência da concentração de enzima, da
concentração de substrato e do tempo de reação
sobre a resposta grau de hidrólise foi avaliada
estatísticamente de modo a fazer análise de efeitos e
verificação de modelos empíricos através dos
coeficientes de regressão e análise de variância
(ANOVA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 2 apresenta a composição centesimal
média e o desvio padrão da microalga Spirulina sp.
LEB-18 utilizada neste estudo.
Tabela 2. Composição centesimal da microalga
Spirulina sp. LEB-18
Spirulina sp. LEB-18
Determinações
(%)
Umidade
Proteínas
Cinzas
Lipídios
(X ± D.P ) *
11,99 ± 0,07
51,66 ± 1,87
7,84 ± 0,02
7,06 ± 0,11
*médias ( X ) e desvios padrões (D.P)
A porcentagem de proteínas da biomassa da
microlga foi utilizada para calcular a quantidade de
biomassa necessária para obter as suspensões de
cada experimento estudado. Os valores encontrados
de composição centesimal foram semelhantes aos
encontrados por MORAIS et al., 2009.
A Tabela 3 apresenta a matriz do planejamento
fatorial com as variáveis reais e codificadas,
correspondentes aos valores máximos alcançados
em cada experimento para o grau de hidrólise.
Tabela 3. Matriz do planejamento fatorial 23 e a
resposta grau de hidrólise.
Valores codificados
GH
Exp.
CE
CS
t
(%)
(U.mL-1)
(%)
(min)
1
-1
-1
-1
55,7
2
+1
-1
-1
60,2
3
-1
+1
-1
35,8
4
+1
+1
-1
37
5
-1
-1
+1
62,9
6
+1
-1
+1
66,7
7
-1
+1
+1
39,9
8
+1
+1
+1
43,7
9
0
0
0
54,7
10
0
0
0
54,3
11
0
0
0
55,2
Exp. = experimento, CE = concentração de enzima,
CS = concentração de substrato, t = tempo de
reação, GH = grau de hidrólise.
O GH apresentou uma variação de 35,8 % a 66,7 %
dentre os experimentos estudados. Sendo que o
maior GH (66,7 %) foi alcançado no experimento 6
em 4 h de reação, correspondendo ao sistema
reacional composto por 10 U.mL-1 de enzima e 5 %
de substrato. Schmidt e Salas-Mellado (2009)
estudando a influência da ação da enzima comercial
Alcalase 2.4L de Bacillus lichenformis no GH das
proteínas do peito de frango, obtiveram uma
variação de 20,93 % a 57,42 %.
Os dados obtidos no planejamento experimental
foram tratados com seus valores codificados. A
resposta grau de hidrólise foi tratada a 95% de
confiança. Calculou-se o coeficiente de regressão
para a resposta, permitido a obtenção um modelo
codificado linear de primeira ordem, conforme a
Equação (1), que descreve a resposta, em função
das variáveis independentes.
Grau de Hidrólise = 51,56 + 1,53CE – 11,25CS +
2,93T
(1)
A Tabela 4 refere-se à analise de variância para
resposta grau de hidrólise
Tabela 4. Análise de variância para a avaliação da
significância estatística do modelo para a resposta
grau de hidrólise
Fonte de
Variação
SQ
GL
MQ
F cal
Regressão
1100,49
3
366,83 57,2
Resíduo
44,91
7
6,42
44,51
5
Falta de ajuste
0,41
2
Erro puro
1145,406
10
Total
R= 0,96079; F(0,95; 3,7) = 4,35
Verifica-se na Tabela 4 que o coeficiente de
correlação obtido para o grau de hidrólise foi de
0,96079 e o F calculado foi 13,71 vezes maior que
o valor tabelado, portanto tornando o modelo
preditivo e significativo possibilitando a construção
da Figura 1.
(A)
(B)
(C)
Figura 1. Superfícies de resposta para o grau de
hidrólise (a), (b) e (c).
Na figura 1(a), observa-se que se atingem valores
em torno de 63% de grau de hidrólise quando o
sistema é composto pela menor concentração de
enzima (5 U.ml-1) e menor concentração de
substrato (5%). Observa-se na figura 1(b) que
quando o sistema é composto pela maior
concentração de enzima (10 U.mL-1) e maior tempo
(240min), podendo-se atingir resultados em torno
de 54%. Já na figura 1(c), o grau de hidrólise pode
atingir valores superiores a 65% quando o sistema
composto pela menor concentração de substrato
(5%1) e maior tempo de reação (240min).
Ao analisarmos os resultados, pode-se observar
que, para a resposta grau de hidrólise, quando o
sistema é composto pela menor concentração de
substrato e maior tempo de reação, obtêm-se
melhores resultados.
A Figura 2 apresenta os efeitos obtidos das
variáveis estudadas no grau de hidrólise das
proteínas da biomassa de Spirulina LEB 18,
utilizando a enzima Protemax 580L.
50
Grau de Hidrólise (%)
40
30
20
10
0
-10
-20
Média
CE*
CS*
t*
CExCS
CExt
CSxt
*p<0,05
Figura 2. Efeitos principais e de interação da
concentração de enzima (CE), concentração de
Substrato (CS) e tempo (min) sobre o Grau de
Hidrólise.
Na figura 2 pode-se observar que todas as variáveis
estudadas apresentam efeitos significativos sobre a
resposta.
Pode-se observar que o aumento da concentração
de enzima de 5U.mL-1 para 10 U.mL-1, bem como o
aumento do tempo de reação de 60 min para 240
min, influenciaram positivamente a resposta,
aumentando-a em cerca de 3,05% e 5,85%,
respectivamente. No entanto, a concentração de
substrato apresentou um efeito contrário,
diminuindo a resposta em 22,50%. Já as interações
entre as variáveis não apresentaram efeito
significativo sobre a resposta grau de hidrólise.
Schmidt e Salas-Mellado (2009) estudando o grau
de hidrólise nas proteínas de carne de frango
verificaram um efeito negativo para a concentração
de substrato, ocorrendo comportamento semelhante
no estudo de Centenaro (2008) que estudaram a GH
das proteínas de pescado.
O presente estudo, mostrou que quando aumentouse a concentração de substrato esta gerou um efeito
inibidor na hidrólise das proteínas. Este tipo de
inibição causada pela elevada concentração de
substrato, conforme Whitaker (1994), citado por
Tardioli (2003), comporta-se como uma competição
acompetitiva, pois uma segunda molécula de
substrato se liga a um local próximo ao sítio ativo
da enzima, reduzindo a velocidade inicial de
reação, impedindo que a primeira molécula se ligue
corretamente ao sítio ativo ou que ela seja
transformada em produto.
CONCLUSÕES
A enzima comercial Protemax 580L apresentou
atividade enzimática sobre a biomassa da microalga
Spirulina, obtendo-se hidrolisados protéicos com
diferentes graus de hidrólise. O grau de hidrólise
variou de 35,8 % a 66,7 % dentre os experimentos
estudados, sendo o maior GH alcançado no
experimento 6 em 4h de reação, correspondendo ao
sistema reacional composto por 10 U.mL-1 de
enzima e 5 % de substrato. A análise estatística dos
resultados mostrou que as variáveis, concentração
de enzima, concentração de substrato e tempo de
reação obtiveram efeito significativo sobre a
resposta grau de hidrólise, sendo que o aumento da
concentração de substrato diminui o grau de
hidrólise em 22,50%.
REFERÊNCIAS
Adler-Nissen, J. (1986), Enzyme hydrolysis of food
proteins. Elsevier Applied Science Publishers,
England., 427p.
Agboola, S., NG, D. and MILLS, D. (2005),
Characterization and functional properties of
Australian rice protein isolates. Journal of
Cereal Science, Vol. 41(3), pp. 283-290.
AOAC - Association of Official Analytical
Chemists. Official Methods of Analysis of
AOAC international. 17th ed, Washington, D.
C., 2000.
Bernardi, C. R. (2000), Preparo de hidrolisados
protéicos e análise de aminoácidos por duas
metodologias. Dissertação de Mestrado.
Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis, Brasil.
Centenaro, G. S e Mellado, M. S. (2008), Influência
das concentrações de enzima e de substrato no
grau de hidrólise e no conteúdo protéico de
hidrolisados
enzimáticos
de
corvina
(Micropporogonias furnieri). B.CEPPA, Vol.
26(1), pp. 61-70.
Clemente, A. (2000), Enzymatic protein
hydrolysates in human nutrition. Trends in
Food Science & Technology, Vol. 11(7), pp.
254-262.
Euber, J. R., Puski, G. and Hartman Jr., G. H.
(1991), Method for making soluble rice protein
concentrate and the product produced
therefrom. United States Patent n. 4.990.344.
Fischer, M., Kofod, L. V., Schols, H. A., Piersma,
S. R., Gruppen, H. and Voragen, A. G. (2001),
Enzymatic extractability of soybean meal
proteins and carbohydrates: heat and humidity
effects. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, Vol. 49(9), pp. 4463-4469.
Furlan, E. F. e Oetterer, M. (2002), Hidrolisado
protéico de pescado. Revista de Ciência &
Tecnologia, Vol. 10(19), pp. 79-89.
Hoyle, N. and Merritt, J. H. (1994), Quality of fish
protein hydrolysate from herring (Clupea
harengus). Journal of Food Science, Vol.
59(129), pp. 76−79.
Lahl, W. J. and Braun, S. D. (1994), Enzymatic
production of protein hydrolysates for food
use. Food Technology, Vol. 48(10), pp. 68-71.
Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A.L. Farr and R. J.
Randall, 1951. Protein measurement with the
Folin-Phenol reagents. J. Biol. Chem, Vol. 93,
pp. 265-275.
Ma, C., Ni, X., Chi, Z., Ma, L. and Gao, L. (2007),
Purification and Characterization of Chunling
Ma, Xiumei Ni, Zhenming Chi, Liyan Ma,
Lingmei Gaoa Alkaline Protease from the
Marine Yeast Aureobasidium pullulans for
Bioactive Peptide Production from Different
Sources. Marine Biotechnology, Vol. 9, pp.
343-351.
Mahmoud, M. I., Malone, W. T. and Cordle, C. T.
(1992), Enzymatic hydrolysis of casein: effect
of degree of hydrolysis on antigenicity and
physical properties. Journal of Food Science,
Vol. 57, pp. 1223-1229.
Mannheim, A. and Cheryan, M. (1992), Enzymemodified proteins from corn gluten meal:
preparation and functional properties. Journal
of the American Oil Chemists Society, Vol. 69,
pp. 1163 - 1169.
Morais, M. G. (2009), Pilot scale semicontinuous
production of Spirulina biomass in southern
Brazil. Aquaculture, Vol. 294, pp.60 – 64.
Pearce, R. J. (1995), Food functionality success or
failure for dairy based ingredients. Australian
Journal of Dairy Technology, Vol. 50(1), pp.
15-23.
Romano, I., Bellitti, M. R., Nicolaus, B., Lama, L.,
Manca, M. C., Pagnotta, E. and Gambacorta,
A. (2000), Lipid profile: a useful
chemetoxonomic marker for classification of a
new cyanobacterium in Spirulina genus,
Phytochemistry, Vol. 54, pp. 289-294.
Sarada, R., Pillai, M.G and Ravishankar, G.A.
(1999), Phycocyanin from Spirulina sp:
Influence of processing of biomass on
phycocyanin yield, analysis of efficacy of
extraction methods and stability studies on
phycocyanin, Process Biochemistry, Vol. 34,
pp. 795 -801.
Schmidt, C. G. e Salas-Mellado, M. (2009),
Influência da ação das enzimas Alcalase e
Flavourzyme no grau de hidrólise das proteínas
de carne de frango. Química Nova, Vol. 32(5),
pp. 1144-1150.
Siemensma, A. D., Weijer, W. J. and Bak, H. J.
(1993), The importance of peptide lenghts in
hypoallergenic infant formulae. Trends in Food
Science & Technology, Vol. 4, pp. 16-21.
Tardioli, P. W.; (2003), Hidrólise controlada de
proteínas do soro de queijo usando
carboxipepidases e alcalase imobilizadas
multipontualmente em agarose. Tese de
Doutorado, Universidade Federal de São
Carlos, Brasil.
Tang, S., Hettiarachchy, S. and Shellhammer, T. H.
(2002), Protein extraction from heat-stabilized
defatted rice bran.1. Physical processing and
enzyme treatments. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, Vol. 50(25), pp. 7444-7448.
Vonshak, A. (1997), Spirulina platensis
(Arthrospira). Physiology, Cell-biology and
Biotechnology, London: Taylor & Francis.