Hidrólise de Proteína de Spirulina: Estudo Enzimático

XIII Congreso CYTAL - AATA
Facultad de Ciencias de la Alimentación, UNER,
Buenos Aires, Argentina, 19-21 de octubre 2011
ESTUDO DO GRAU DE HIDRÓLISE DA PROTEÍNA DA MICROALGA
Spirulina UTILIZANDO ENZIMA COMERCIAL MICROBIANA
C.R. Lisboa1*, S.P. Ferreira1, A.M. Pereira1, J.A.V. Costa1
1
Universidade Federal do Rio Grande – Escola de Química e Alimentos
Caixa Postal 474 – 96201-900 Rio Grande, RS, Brasil, [email protected]
Resumo: O objetivo deste trabalho foi estudar a obtenção de um hidrolisado protéico derivado de
biomassa microalgal utilizando uma enzima proteolítica, avaliando a influência da concentração de
enzima, de substrato e tempo de reação sobre o grau de hidrólise das proteínas. A microalga utilizada no
estudo foi Spirulina sp. LEB-18 e a enzima proteolítica comercial Protemax 580L. Foi utilizado um
planejamento fatorial 23 com três repetições no ponto central. Foram realizados 11 experimentos em
“shaker” a 180 rpm e temperatura constante de 60 ºC. A reação de hidrólise foi realizada durante 4h, e
analisado o grau de hidrólise em 0h, 1h, 2,5h e 4h. O maior grau de hidrólise atingido foi 66,7%, no qual
corresponde ao experimento 6 em 4h de reação, sendo o sistema reacional composto por 10 U.mL-1 de
enzima e 5 % de substrato. A variável concentração de substrato apresentou efeito significativo sobre o
grau de hidrólise.
Palavras-chaves: grau de hidrólise, Spirulina sp. LEB-18, planejamento fatorial
INTRODUÇÃO
As microalgas representam os microrganismos
fotossintéticos procarióticos e eucarióticos que
vivem em meio ambiente aquático (Vonshak,
1997). As cianobactérias são microrganismos
procarióticos fotossintetizantes que surgiram há
mais de 3 milhões de anos e formaram a atual
atmosfera com oxigênio, e desde então regulam a
biosfera do planeta retirando CO2 e produzindo O2
(Romano et al., 2000). A Spirulina é uma
cianobactéria que tem despertado interesse de
muitos pesquisadores devido ao seu elevado poder
nutricional, produção de substâncias de alto valor
agregado e propriedades nutracêuticas (Sarada et
al., 1999). Possui biomassa rica em proteínas (60 a
70%), apresentando um grande potencial para a
extração de biocompostos com alto valor agregado.
A hidrólise de proteínas é basicamente o resultado
da clivagem de suas ligações peptídicas, liberando
peptídios de diferentes tamanhos e aminoácidos
livres. Para romper as ligações peptídicas e preparar
os hidrolisados são indicados três métodos
principais: as hidrólises enzimática, alcalina e ácida
(Bernardi, 2000; Clemente, 2000; Furlan e Oetterer,
2002). A hidrólise enzimática apresenta uma série
de vantagens sobre a hidrólise química, como
especificidade, controle do grau de hidrólise,
condições moderadas de ação, disponibilidade
comercial em larga escala, custo moderado, menor
teor de sal no produto final e formação mínima de
subprodutos (Mannheim e Cheryan, 1992; Pearce,
1995; Clemente, 2000). Por ser realizada em
condições brandas e controladas, garante a
manutenção da qualidade nutricional dos
hidrolisados e um perfil peptídico definido e
reprodutível. O grau de hidrólise (GH) é o
parâmetro utilizado para comparar hidrolisados
protéicos entre si (Adler-Nissen, 1986; Mahmoud et
al., 1992; Siemensma et al., 1993; Lahl e Braun,
1994).
Enzimas proteolíticas ou proteases catalisam a
quebra das ligações peptídicas em proteínas. Várias
enzimas têm sido utilizadas na extração enzimática
de proteínas. Entre estas, encontram-se a
pancreatina, as proteases alcalina, fúngica ou
bacteriana (Euber et al., 1991); uma endoprotease
(alcalase de grau alimentício do Bacillus
liccheniformis); um complexo de proteases
(flavourzima do Aspergillus oryzae) seguido de
uma preparação de carboidrase do Aspergillus
aculeatus e do Humicola insolens (Fischer et al.,
2001); endoprotease e amilase (Tang et al., 2002);
α-amilase (BAN 240 L) e protease (Promozyme
400 L) (Agboola et al., 2005).
O objetivo deste trabalho foi estudar a obtenção de
um hidrolisado protéico derivado de biomassa
microalgal utilizando uma enzima proteolítica,
avaliando a influência da concentração de enzima e
de substrato e tempo de reação sobre o grau de
hidrólise das proteínas.
MATERIAL E MÉTODOS
Microalga
Foi utilizada biomassa da microalga Spirulina sp.
LEB-18, da coleção do Laboratório de Engenharia
Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande.
Enzima
Utilizou-se a enzima comercial Protemax 580L de
Bacillus lichenformis, gentilmente cedida pela
Prozyn (São Paulo – SP). A atividade da enzima foi
definida como a quantidade de enzima que libera
1µg de tirosina por minuto, dentro das condições
usadas no estudo.
Atividade Enzimática
A atividade enzimática das proteases comerciais foi
determinada segundo o método descrito por Ma et
al., 2007.
Processo de Hidrólise Enzimática
As reações de hidrólise com a enzima Protemax
580 L foram realizadas em meio aquoso. O sistema
de reação foi composto pela biomassa de Spirulina,
previamente caracterizada quanto à composição
centesimal (AOAC, 2000), em tampão bicarbonato
carbonato de sódio pH 9,5 e enzima Protemax
580L, totalizando 100 mL. Os erlenmeyers foram
dispostos em “shaker” (Certomat BS-1) com
agitação de 180 rpm e temperatura constante de 60
°C, temperatura ótima de atividade da enzima, para
todos os experimentos. As quantidades de enzima e
biomassa foram adicionadas conforme estabelecido
no planejamento fatorial. A hidrólise enzimática foi
acompanhada durante um período de 4 h.
Determinação do grau de hidrólise
A análise de determinação do grau de hidrólise
(GH) foi realizada em 0h, 1h, 2,5h e 4h. Após
transcorrido cada tempo, alíquotas de 1 mL de
hidrolisado foram inativadas pela adição de 9 mL
de solução de ácido tricloroacético (TCA) 6,25 % e
deixadas em repouso por 10 min. Posteriormente
foram centrifugadas por 5 min a 5000 rpm para
remoção do material insolúvel precipitado pelo
TCA. Determinou-se o teor de proteínas solúveis no
filtrado utilizando o método de Folin-Lowry,
expresso em mg de albumina. O grau de hidrólise
foi estimado segundo o método descrito por Hoyle
e Marrit (1994) com modificações, sendo expresso
como a porcentagem de proteínas solúveis no TCA
em relação à quantidade de proteína inicial total, e
calculado segundo a Equação (1):
%GH =
( PS tempot − PS tempo 0 ) × 100
Ptotal
(1)
onde o branco, PS tempo 0, correspondeu à quantidade
de proteína solúvel em TCA 6,25 % antes da adição
da enzima; PS tempo t foi a quantidade de proteína
solúvel em determinado tempo após a adição da
enzima e Ptotal foi a quantidade de proteína total na
amostra determinada por micro Kjeldahl (N x 6,25).
Planejamento Fatorial
Neste estudo o planejamento fatorial foi utilizado
para verificar quais das variáveis apresentaram
efeitos significativos sobre o grau de hidrólise.
Assim, foi estudada a influência da concentração de
enzima, concentração de substrato e o tempo de
reação. O teor inicial do substrato, a concentração
de enzima adicionada e o tempo de reação foram as
variáveis estudadas através de planejamento
fatorial. Foi realizado um planejamento fatorial tipo
23 com três repetições no ponto central,
considerando como variável dependente o grau de
hidrólise das proteínas. As análises foram
realizadas em duplicata e os dados tratados através
do software Statistica 5.0. A Tabela 1 apresenta os
níveis e valores das variáveis independentes
utilizadas no planejamento fatorial.
Tabela 1. Níveis e valores das variáveis
independentes de concentração de substrato, de
concentração de enzima e de tempo utilizados no
planejamento fatorial 23.
Variáveis
Níveis
independentes
-1
0
+1
CE (U.mL-1)
5
7,5
10
CS (%)
5
7,5
10
t (min)
60
150
240
CE = concentração de enzima; CS = concentração
de substrato; t = tempo.
A influência da concentração de enzima, da
concentração de substrato e do tempo de reação
sobre a resposta grau de hidrólise foi avaliada
estatísticamente de modo a fazer análise de efeitos e
verificação de modelos empíricos através dos
coeficientes de regressão e análise de variância
(ANOVA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 2 apresenta a composição centesimal
média e o desvio padrão da microalga Spirulina sp.
LEB-18 utilizada neste estudo.
Tabela 2. Composição centesimal da microalga
Spirulina sp. LEB-18
Spirulina sp. LEB-18
Determinações
(%)
Umidade
Proteínas
Cinzas
Lipídios
(X ± D.P ) *
11,99 ± 0,07
51,66 ± 1,87
7,84 ± 0,02
7,06 ± 0,11
*médias ( X ) e desvios padrões (D.P)
A porcentagem de proteínas da biomassa da
microlga foi utilizada para calcular a quantidade de
biomassa necessária para obter as suspensões de
cada experimento estudado. Os valores encontrados
de composição centesimal foram semelhantes aos
encontrados por MORAIS et al., 2009.
A Tabela 3 apresenta a matriz do planejamento
fatorial com as variáveis reais e codificadas,
correspondentes aos valores máximos alcançados
em cada experimento para o grau de hidrólise.
Tabela 3. Matriz do planejamento fatorial 23 e a
resposta grau de hidrólise.
Valores codificados
GH
Exp.
CE
CS
t
(%)
(U.mL-1)
(%)
(min)
1
-1
-1
-1
55,7
2
+1
-1
-1
60,2
3
-1
+1
-1
35,8
4
+1
+1
-1
37
5
-1
-1
+1
62,9
6
+1
-1
+1
66,7
7
-1
+1
+1
39,9
8
+1
+1
+1
43,7
9
0
0
0
54,7
10
0
0
0
54,3
11
0
0
0
55,2
Exp. = experimento, CE = concentração de enzima,
CS = concentração de substrato, t = tempo de
reação, GH = grau de hidrólise.
O GH apresentou uma variação de 35,8 % a 66,7 %
dentre os experimentos estudados. Sendo que o
maior GH (66,7 %) foi alcançado no experimento 6
em 4 h de reação, correspondendo ao sistema
reacional composto por 10 U.mL-1 de enzima e 5 %
de substrato. Schmidt e Salas-Mellado (2009)
estudando a influência da ação da enzima comercial
Alcalase 2.4L de Bacillus lichenformis no GH das
proteínas do peito de frango, obtiveram uma
variação de 20,93 % a 57,42 %.
Os dados obtidos no planejamento experimental
foram tratados com seus valores codificados. A
resposta grau de hidrólise foi tratada a 95% de
confiança. Calculou-se o coeficiente de regressão
para a resposta, permitido a obtenção um modelo
codificado linear de primeira ordem, conforme a
Equação (1), que descreve a resposta, em função
das variáveis independentes.
Grau de Hidrólise = 51,56 + 1,53CE – 11,25CS +
2,93T
(1)
A Tabela 4 refere-se à analise de variância para
resposta grau de hidrólise
Tabela 4. Análise de variância para a avaliação da
significância estatística do modelo para a resposta
grau de hidrólise
Fonte de
Variação
SQ
GL
MQ
F cal
Regressão
1100,49
3
366,83 57,2
Resíduo
44,91
7
6,42
44,51
5
Falta de ajuste
0,41
2
Erro puro
1145,406
10
Total
R= 0,96079; F(0,95; 3,7) = 4,35
Verifica-se na Tabela 4 que o coeficiente de
correlação obtido para o grau de hidrólise foi de
0,96079 e o F calculado foi 13,71 vezes maior que
o valor tabelado, portanto tornando o modelo
preditivo e significativo possibilitando a construção
da Figura 1.
(A)
(B)
(C)
Figura 1. Superfícies de resposta para o grau de
hidrólise (a), (b) e (c).
Na figura 1(a), observa-se que se atingem valores
em torno de 63% de grau de hidrólise quando o
sistema é composto pela menor concentração de
enzima (5 U.ml-1) e menor concentração de
substrato (5%). Observa-se na figura 1(b) que
quando o sistema é composto pela maior
concentração de enzima (10 U.mL-1) e maior tempo
(240min), podendo-se atingir resultados em torno
de 54%. Já na figura 1(c), o grau de hidrólise pode
atingir valores superiores a 65% quando o sistema
composto pela menor concentração de substrato
(5%1) e maior tempo de reação (240min).
Ao analisarmos os resultados, pode-se observar
que, para a resposta grau de hidrólise, quando o
sistema é composto pela menor concentração de
substrato e maior tempo de reação, obtêm-se
melhores resultados.
A Figura 2 apresenta os efeitos obtidos das
variáveis estudadas no grau de hidrólise das
proteínas da biomassa de Spirulina LEB 18,
utilizando a enzima Protemax 580L.
50
Grau de Hidrólise (%)
40
30
20
10
0
-10
-20
Média
CE*
CS*
t*
CExCS
CExt
CSxt
*p<0,05
Figura 2. Efeitos principais e de interação da
concentração de enzima (CE), concentração de
Substrato (CS) e tempo (min) sobre o Grau de
Hidrólise.
Na figura 2 pode-se observar que todas as variáveis
estudadas apresentam efeitos significativos sobre a
resposta.
Pode-se observar que o aumento da concentração
de enzima de 5U.mL-1 para 10 U.mL-1, bem como o
aumento do tempo de reação de 60 min para 240
min, influenciaram positivamente a resposta,
aumentando-a em cerca de 3,05% e 5,85%,
respectivamente. No entanto, a concentração de
substrato apresentou um efeito contrário,
diminuindo a resposta em 22,50%. Já as interações
entre as variáveis não apresentaram efeito
significativo sobre a resposta grau de hidrólise.
Schmidt e Salas-Mellado (2009) estudando o grau
de hidrólise nas proteínas de carne de frango
verificaram um efeito negativo para a concentração
de substrato, ocorrendo comportamento semelhante
no estudo de Centenaro (2008) que estudaram a GH
das proteínas de pescado.
O presente estudo, mostrou que quando aumentouse a concentração de substrato esta gerou um efeito
inibidor na hidrólise das proteínas. Este tipo de
inibição causada pela elevada concentração de
substrato, conforme Whitaker (1994), citado por
Tardioli (2003), comporta-se como uma competição
acompetitiva, pois uma segunda molécula de
substrato se liga a um local próximo ao sítio ativo
da enzima, reduzindo a velocidade inicial de
reação, impedindo que a primeira molécula se ligue
corretamente ao sítio ativo ou que ela seja
transformada em produto.
CONCLUSÕES
A enzima comercial Protemax 580L apresentou
atividade enzimática sobre a biomassa da microalga
Spirulina, obtendo-se hidrolisados protéicos com
diferentes graus de hidrólise. O grau de hidrólise
variou de 35,8 % a 66,7 % dentre os experimentos
estudados, sendo o maior GH alcançado no
experimento 6 em 4h de reação, correspondendo ao
sistema reacional composto por 10 U.mL-1 de
enzima e 5 % de substrato. A análise estatística dos
resultados mostrou que as variáveis, concentração
de enzima, concentração de substrato e tempo de
reação obtiveram efeito significativo sobre a
resposta grau de hidrólise, sendo que o aumento da
concentração de substrato diminui o grau de
hidrólise em 22,50%.
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