GUIA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA (2)

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA
GUIA DE
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
2014
1
DOCENTES DE LA CÁTEDRA:
CELIA BOWEN FERNÁNDEZ
Dra. Bioquímica y Farmacia especialización Bioquímica Clínica
Docente de la facultad de Medicina de la Pontificia
Universidad Católica del Ecuador
MARCELA MARDONES
Lcda. Bioquímica Clínica
Docente de la facultad de Medicina de la Pontificia
Universidad Católica del Ecuador
LOIDA VELASQUEZ
Dra. Patóloga Clínica
Docente de la facultad de Medicina de la Pontificia
Universidad Católica del Ecuador
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ÍNDICE
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….…………………… 4
PRÁCTICA N° 1
Bioseguridad…………………………………………………………………………………….
5
PRÁCTICA N° 2
Coloraciones……………………………………………………………….……….…………….11
PRACTICA No.3
Medios de cultivos……………………………………………………………………………....20
PRACTICA No. 4
Antibiograma………………………………………………………………………………….….32
PRACTICA NO. 5
Identificación de cocos Gram positivos…………………………..……………..………….38
PRACTICA No. 6
Orina……………………………………………………………………….………………………46
PRÁCTICA No. 7
Identificación bioquímica de bacilos Gram negativos…………………………….……..52
PRÁCTICA No. 8 (PRIMERA PARTE)
Coprológico y coproparasitario……………………………….…………………….…...…..57
PRÁCTICA No. 8 (SEGUNDA PARTE)
Examenes en heces fecales……………………………………………………..……………66
PRÁCTICA No. 9
Esputo…………………………………………………………………………………….………70
PRÁCTICA No. 10
Malaria o paludismo…………………………………………………………….………….…..76
PRÁCTICA No. 11
Infecciones de transmisión sexual…………………………………………..…………..….79
PRACTICA No. 12
Técnicas básicas de inmunología…………………………………………..……………....86
PRÁCTICA No. 13
Micosis…………………………………………………………………….…………………..….91
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………….....…96
3
INTRODUCCIÓN
El diagnóstico de las infecciones y el estudio de la Microbiología Médica se basan fundamentalmente
en métodos de laboratorio. Mediante estos métodos se hicieron precisamente los más grandes
descubrimientos en Microbiología, Genética e Inmunología. Los estudiantes de Medicina deben, por
tanto estar familiarizados con éstos y por ello en la Facultad de Medicina de la PUCE se incluye una
Unidad destinada a cumplir con este paso importantísimo en la formación de sus alumnos. La presente
guía fue realizada pensando sobre todo en el/la estudiante de medicina de cuarto nivel, que requiere
complementar el estudio teórico de la Microbiología Médica con la observación directa y, en muchos
casos, de la puesta en práctica de los métodos utilizados habitualmente en esta ciencia. La
metodología expuesta en cada una de las prácticas es sencilla y fácil de ejecutar, pero no por ello deja
de ser suficiente, en el sentido de que son pasos que se siguen en la rutina diaria del laboratorio. Al
inicio de cada práctica se hace una explicación acerca de la importancia y aplicabilidad del método, su
correlación clínica diversos aspectos de interés médico. Luego se entra directamente en la parte
práctica y al final se exponen algunas preguntas de consulta para estimular en el estudiante el afán de
investigación en esta apasionante rama de la Medicina. El empezar hablando sobre Bioseguridad tiene
un doble objetivo: que los estudiantes aprendan ros protocolos de manejo muestras biológicas,
potencialmente infecciosas, y de los materiales de laboratorio; y, por otro lado, inducir en ellos la
formación de hábitos y actitudes acordes con su condición de futuro miembros del equipo de salud.
Muchos de los métodos expuestos a continuación son de uso diario, no solo en los laboratorios, sino
también en los consultorios médicos. La realización de un examen en fresco y una tinción básica de una
muestra de una secreción corporal, es rápida y sencilla y con el conocimiento básico adquirido en este
curso se convertirá en una herramienta muy útil para ayuda en el diagnostico y en el tratamiento de las
infecciones.
Dra. Celia Bowen Fernández
Dr. Francisco Pérez Pazmiño
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PRÁCTICA N° 1
BIOSEGURIDAD
CONTEXTUALIZACIÓN
Observa el video en el siguiente link https://www.youtube.com/watch?v=tXt7Zs5GBMw e
imagina los riesgos a los que nos exponemos cuando no cumplimos las normas de
bioseguridad.
CONCEPTUALIZACIÓN
La
seguridad
en
el
laboratorio
se
puede
definir
como:
"La situación carente de riesgo o con un riesgo limitado, que resulta del cumplimiento de un
conjunto de normas y prácticas para lograr este fin"
1. Medidas generales de seguridad
Barrera
La seguridad como prevención viene definida por una serie de barreras. Si estas fallan y
ocure un accidente, es preciso efectuar un tratamiento precoz y adecuado para evitar un
daño
mayor
y
posteriormente
hacer
un
diagnóstico
del
fallo.
Las barreras se rompen por fallos humanos y/o errores mecánicos.
Barreras primarias: Las localizadas en tomo al origen del riesgo, como son: - Contenedores,
equipo e instrumental correcto y "buena práctica” (la técnica de trabajo ordenada v rigurosa es
probablemente la mejor protección que existe) - Uso de desinfectantes y cabinas de
seguridad.
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Barreras secundarias: Localizadas en el círculo del operador, incluirán:
 La higiene personal rigurosa.
 La vacunación • Programas de salud laboral.
 Vestimenta: usode ropa adecuada, guantes, gafas, pelo recogido.
 No frotarse los ojos o la nariz con las manos contaminadas.
 No inhalar los aerosoles producidos durante la centrifugación, la sedimentación o el
derrame de cultivos líquidos.
 Evitar ingerir microorganismos por accidente, al llevarse los dedos o el lápiz a la boca.
 No sufrir inoculación percutánea, por ejemplo, al pincharse con una aguja.
 No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos.
 No colocarse o quitarse lentes de contacto.
 No pipetear con la boca.
 Presuponer que todos los pacientes están potencialmente infectados por HIV u otros
patógenos transportados por la sangre.
 Las heridas en las manos deben vigilarse, ya que pueden ser una puerta de entrada a la
infección. En caso de tenerlas, deben cubrirse adecuadamente con material resistente al
agua.
 Lavarse a conciencia las manos y otras superficies de la piel tras quitarse los guantes e
inmediatamente después de cualquier contaminación.
Barreras terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio: Evitan que los riesgos de
laboratorio puedan repercutir en la comunidad.
 Ningún material tóxico o infeccioso abandone el laboratorio.
 Acceso restringido a determinadas áreas de laboratorio.
6


Contenedores especiares para material bio-peligroso, autoclaves e incineradores para
desechos contaminados.
Acceso al laboratorio únicamente al personal capacitado.
DESINFECCIÓN, DESCONTAMINACIÓN Y ESTERILIZACIÓN Existen muchos agentes
químicos o físicos para eliminar los microorganismos podemos distinguir tres grupos:
 Agentes antisépticos: son germicidas químicos para la utilización en la piel como por
ejemplo; alcohol, iodóforos, etc.
- Agentes desinfectantes: destruyen microorganismos en superficies e instrumentos, como por
ejemplo: soluciones fenólicas al 3 o 5%, hipocloritos.
- Agentes esterelizantes: destruyen toda forma de vida incluidas las esporas. Por ejemplo: los
sistemas de autoclave, calor seco, óxido de etileno.
Eliminación de residuos peligrosos Todos los materiales contaminados son agentes
potencialmente infecciosos que deben ser descontaminados antes de su eliminación. Esto
implica porciones no utilizadas de las muestras de los pacientes, cultivos de las muestras y
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cultivos almacenados de microorganismos e instrumentos descartables, por ejemplo,
escalpelos y jeringas con agujas. Los residuos infecciosos se deben descontaminar mediante
autoclave, incinerador o cualquiera de los diversos métodos alternativos de tratamiento de
residuos.
2. Símbolos de riesgo en los reactivos
3. Manejo del mechero de Bunsen
La llama más utilizada en el laboratorio es la producida por la combustión de un gas
(propano,
butano
o
gas
ciudad),
con
el
oxígeno
del
aire.
La combustión completa (con exceso de oxígeno) produce agua y dióxido de carbono, una
llama poco luminosa y de gran poder calorífico.
La combustión incompleta produce, además de dióxido de carbono y agua, carbono,
monóxido de carbono y otros productos intermedios, da origen a llamas de bajo poder
calorífico y altamente luminosas (debido a la incandescencia de las partículas de carbono que
se producen).
Para controlar las llamas se utiliza el mechero de laboratorio que, a pesar de existir diversos
tipos, el mecanismo de funcionamiento es similar en todos ellos. La llama utilizada es la de
combustión completa, que es de mayor poder calorífico y no deposita hollín en el material de
trabajo de laboratorio que es expuesto a la misma.
Encendido del mechero: Cerrar totalmente la entrada de aire, abrir ligeramente la llave de
paso del gas y acercar, lateralmente, una cerilla encendida a la boca del cañón. Regular la
llave hasta obtener una llama con la altura deseada, gradualmente, abrir la entrada de aire.
No abrir repentinamente porque puede apagarse el mechero.
Para obtener mayor temperatura, abrir más el flujo de gas y la entrada de aire.
EL MECHERO SE APAGA AL CERRAR LA LLAVE DE GAS.
8
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
Actividad 1: Video de Bioseguridad Tarea
Estimados estudiantes, por favor subir un video a la plataforma Moodle con las
respectivas fotos sobre el cumplimiento de las normas de Bioseguridad de cada una de las
prácticas realizadas, así como también cuando estás no son cumplidas. No olvidar colocar las
reflexiones debajo de cada foto respecto al aprendizaje obtenido.
Nota: Este portafolio será entregado al finalizar las prácticas del primer parcial el cual debe
tener una duración de aproximadamente 4 a 5 minutos
Actividad 2: Responda al siguiente cuestionario:
1. Definición de seguridad en el laboratorio.
2. Mencione cinco ejemplos (c/u) de barreras primarias, secundarias y terciarias.
3. ¿Cuál es la diferencia entre desinfección, descontaminación y esterilización? (ejemplo de
c/u).
4. ¿En qué nivel de enseñanza se ubica un laboratorio básico de enseñanza y qué equipos
de seguridad necesita? (Revisar Manual de Bioseguridad OMS)
5. ¿Qué requisitos necesita un laboratorio básico de enseñanza?
6. ¿Cuál es el símbolo de peligro biológico?
7. ¿Cómo debe protegerse el personal de laboratorio?
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8. ¿Qué procedimientos debe tener en cuenta el personal o los estudiantes durante su
trabajo en el laboratorio?
Manual Bioseguridad OMS, tercera edición, Ginebra 2005 (Leer lás págs.
1,2,3,10,11,12) Archivo
10
PRÁCTICA N° 2
COLORACIONES
OBJETIVOS



Realizar coloraciones: simples, diferenciales
Diferenciar que tipos de muestras se utilizan para cada coloración.
lnterpretar y evaluar correctamente los resultados obtenidos en tas distintas
coloraciones y discernir si la coloración fue bien realizada.
CONTEXTUALIZACIÓN
La coloración Gram debe su nombre al bacteriólogo danés Chistian Gram en 1884. La
tinción de Gram aporta dos ideas básicas para la definición de las bacterias: el color que
adquieren tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas. En lo relativo a
la coloración tenemos:
- Gram positivos color azul-violeta
- Gram negativos color rojo-rosado
CONCEPTUALIZACIÓN
Coloración Gram
Las bacterias se clasifican en Gram positivas y en Gram negativas de acuerdo a los
componentes químicos de su pared celular. Las Gram positivas poseen una pared
celular poco permeable y resisten la decoloración. Las Gram negativas poseen una
pared celular más permeable, se decoloran y luego adquieren la coloración de la
safranina.
La coloración Gram consiste en una técnica de tinción que utiliza 4 componentes: un
colorante básico (cristal violeta), un mordiente (lugol), un decolorante (alcohol
cetona) y un colorante de contraste (safranina).
11
12
Racimos: forma típica de Staphylococcus sp, como S. aureus
Tetradas: forma típica de Micrococcus sp
Cadenas: forma típica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo
B.
Bacilos Gram-negativos
•
Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli
•
Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae
Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis
13
También Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos.
Acinetobacter puede ser pleomórfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.
Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-variable.
•
Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C.
jejuni
•
Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp
a. Realización de la extenslón
 Producto lÍquido: Depositar en el centro de un portaobjetos una pequeña cantidad del
producto a examinar y extenderlo con la ayuda de un asa de platino o una pipeta de
modo que la extensión sea lo más fina y homogénea posible. Un producto denso puede
ser diluido antes ligeramente.
 Cultivo en medio sólido: depositar en un portaobjetos una gotita de agua ó solución
salina estéril y disociar en ella una pequeña cantidad de cultivo. Extender para obtener
un frotis fino y homogéneo.
 Sangre: hacer un frotis como para un examen hematológico, depositar sobre el primer
tercio de un portaobjetos limpio y desengrasado una pequeña gotita de sangre. Hacer
contactar con la misma un portaobjetos de bordes esmerilados, que se inclinará 45 °C.
La sangre alcanza por capilaridad todo el borde del portaobjetos que se empujará hacia
14

la parte libre del primer portaobjetos que contenga la gota de sangre, haciéndolo de un
solo movimiento, sin detener ni volver atrás.
Órganos: seccionar un pequeño fragmento. Sujetarlo con una pinza, secar el trozo
seccionado sobre un papel secante, haciendo seguidamente con ésta porción una
extensión o una serie de aposiciones, sin apoyar demasiado, de manera que se
obtengan preparaciones finas.
b. Secado
Dejar secar por sí solo el frotis. Se puede acelerar la desecación calentando ligeramente con
un mechero Bunsen, pero sin calentar jamás brutalmente.
c. Fijación
Cuando la extensión esté bien seca, proceder a la fijación. Sólo algunas
coloraciones
especiales no deben ir precedidas de una fijación. Él motivo de la misma es hacer adherir el
frotis al portaobjetos y fijar la morfología de las bacterias, células, por coagulación rápida de
las proteínas.
Puede ser por:
 Alcohol flameado: Es la técnica más general. Verter sobre la preparación algunas gotas
de alcohol absoluto. Después de algunos segundos de contacto, escurrir lo mejor
posible e inflamar después el alcohol restante.
 Por el calor: Aplastar la llama de un mechero Bunsen 2 a 3 veces contra la parte
inferior de la preparación, que sujetaremos con unas pinzas. Este método debe
rechazarse para los productos patológicos puesto que altera la morfología de los
elementos celulares.
 Por el alcohol en frío: Recubrir la preparación con alcohol etílico absoluto o metílico.
Dejar actuar 1 o 2 minutos. Escurrir y dejar secar.
 Por el ácido ósmico: Ciertas coloraciones necesitan una fijación previa por el ácido
ósmico en solución acuosa al 1 por 100. Exponer la extensión húmeda a los vapores de
ácido ósmico durante algunas decenas de segundos. Fijar seguidamente con alcohol
flameado o con alcohol metílico.
Examen de las preparaciones teñidas
Las preparaciones coloreadas se examinan con el objetivo de inmersión (100x) sin usar
cubreobjetos.
Depositar sobre el frotis una gota de un aceite especial (aceite de inmersión).
Descender primero el objetivo de 10 x, una vez enfocado pasar al lente de 100 x
sumergiéndolo en la gota, comprobar el enfoque microscópico con el tornillo
micrométnco.
CUADRO GENERAL SOBRE LA RECOLECCIÓN Y EL MANEJO DE LAS MUESTRAS
MUESTRA
Líquidos corporales:
amniótico, abdominal,
ascítico, biliar, articular,
PREPARACIÓN DEL PACIENTE
Desinfectar la piel antes de aspirar la muestra
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pericárdico, pleural
Oído externo
Absceso superficial
Absceso profundo
Catéteres
IV,
clavos,
válvulas prostáticas
Orina, chorro medio previa
higiene
Punción suprapúbica
Sangre o médula ósea
Tracto
Cérvix
genital
femenino:
Tracto GI: aspirado gástrico
Hisopado rectal
Cultivo de materia fecal
Vías respiratorias inferiores
Vías
respiratorias
superiores: nasofaringe
Faringe (fauces)
Eliminar la costra con solución fisiológica estéril
Limpiar la zona con solución fisiológica estéril o alcohol al
70%. Pasar el hisopo sobre los bordes de la herida
Limpiar la zona con solución fisiológica estéril o alcohol al
70%. Aspirar el material de la pared o extraer tejido.
Desinfectar la piel antes de la extracción. No cultivar
catéteres de Foley; se obtienen cultivos cuantitativos de los
catéteres IV al hacer rodar el segmento sobre el agar 4 veces
con un fórceps estéril; valores ≥ 15 colonias se asocian con
significado clínico.
Mujeres: limpiar la zona con un antiséptico suave, luego
enjuagar con agua; mantener separados los labios mayores y
comenzar a evacuar en el inodoro; recoger el chorro medio
después de eliminar varios ml.
Varones: limpiar el glande con un antiséptico suave, luego
enjuagar con agua; retraer la piel del glande; recoger el
chorro medio después de eliminar varios ml.
Desinfectar la piel. Aspiración con aguja por encima de la
sínfisis pubiana, a través de la pared abdominal, hasta la
vejiga llena
Desinfectar el sitio de punción venosa con alcohol al 70% y
desinfectante, p. ej., betadina. Extraer sangre durante el
episodio febril; extraer dos muestras, de brazo izquierdo y
derecho; no extraer más de tres muestras en un periodo de
24 horas
Eliminar moco antes de recolectar la muestra. No usar
lubricante en el espéculo; usar ,medio de transporte para
clamidias, de ser necesario; tomar muestra de la profundidad
del canal endocervical.
Recolectar temprano por la mañana, antes de que el paciente
coma o salga de la cama. La mayoría de los aspirados
gástricos se obtienen de lactantes o para BAAR
Insertar el hisopo aproximadamente 2,5 cm por dentro del
esfínter anal
Cultivo de rutina debe incluir Salmonella, Shiguella y
Campilobacter; especificar Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas,
Yersinia, escherichia coli O157:H7, según necesidad
Esputo: Enjuagar o hacer gárgaras con agua antes de la
recolección
Insertar un hisopo flexible a través de la nariz, hasta la
nasofaringe posterior, y rotar durante 5 segundos; muestra
de elección para Bodertella pertussis
Pasar el hisopo por la faringe posterior y las amígdalas;
cultivo de rutina solo para Streptococcus grupo A (S.
pyogenes)
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Coloración de Ziehl Neelsen
El bacilo de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, es resistente a los ácidos y se
tiñe de rojo con la coloración de Ziehl Neelsen con la fucsina fenicada. No se pueden
decolorar por medio de ácidos o etanol (son bacilos alcohol-ácido resistentes o BAAR),
en tanto que casi todos los demás microorganismos se tiñen de azul.
Colorante base (fucsina), mordiente (calor), decolorante (alcohol-ácido), colorante de
contraste (azul de metileno).
•
Es una técnica de tinción diferencial que se basa en que las paredes celulares de
ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena
larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos.
•
Por esto se denominan Bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR.
La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese
la pared bacteriana que contiene ceras.
Uso:
Para
identificación
de
bacilo
tuberculoso
(Acido
Desventaja: Emisión de vapores fenólicos por el calentamiento.
alcohol
resistente)
EXAMEN DE LAS PREPARACIONES
Utilice el objetivo de inmersión en aceite (100x):
Los bacilos de la tuberculosis (BAAR):
 Son de color rojo fuerte: destacan sobre un fondo azul
 Tienen fórma recta o ligeramente curva
 Son muy pequeños (1 - 4µ)
 Son frecuentemente granulosos
 Se disponen en grupos de 3 a 10 bacilos que asemejan a trozos de hilos o parecen
formar letras torcidas
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Cómo examinar las preparaciones
Haga un examen completo del primer portaobletos empleando el objetivo de inmersión (100x)
en aceite, con iluminación máxima y sin filtro de color.
Placa positiva: una vez que se hayan examinado 10 bacilos resistentes a los ácidos.
Registro de los resultados
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
Experimentación
1. Durante la clase los estudiantes deben aprender a manejar el mechero de Bunsen y el
uso de las asa microbiológicas.
2. Realizarán frotis de muestras biológicas líquidas, sólidas y de esputo.
3. Efectuarán tinciones como la coloración Gram (dos placas por grupo) y BAAR (una
placa por grupo). Por favor traer mascarilla.
4. Realizar el portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma Moodle.
RESPONDER AL CUESTIONARIO:
1. ¿Cuáles son los reactivos y tiempos empleados para la coloración Gram y BAAR?
2. ¿Porqué la Escherichia coli puede adquirir el color de la safranina?¿De qué está
compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
3. ¿Porqué el Staphylococcus aureus adquiere el color del cristal violeta y no el de la
safranina? ¿De qué está compuesta su pared celular? Explique brevemente.
4. ¿Porqué el bacilo de Koch se tiñe con la fucsina fenicada y no con el azul de metileno?
¿De qué está compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
5. ¿Cómo realiza una placa con frotis para coloración Gram de una muestra de orina y de
un agar sangre?
6. ¿Cómo realiza una placa con frotis para coloración BAAR de una muestra de esputo y
de orina?
7. ¿Cual es el método para observar las placas teñidas con Gram o BAAR en el
microscopio?
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8. ¿Qué debe realizar para recolectar muestras de médula ósea, pleural y de la faringe?
9. Problema: María Augusta tiene un resultado de BAAR de 1 a 9 bacilos en 100 campos.
¿Cuál es la interpretación de este resultado?
10. ¿Qué coloración adquiere el Streptoccocus pneumoniae cuando se lo tiñe con ZhielNeelsen? ¿Es posible diferenciarlo de otras bacterias?
11. ¿Qué coloración adquiere el Micobacterium tuberculosis cuando se lo tiñe con Gram?
¿Es posible identificarlo mediante esta técnica?
12. ¿Qué errores observaron durante la práctica en cuanto a la realización de los frotis,
coloración y manejo del microscopio?
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PRACTICA No.3
MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS:
 Conocer la importancia y los diferentes medios de cultivo para el crecimiento bacteriano
 Realizar tomas de muestras y siembras en medios de cultivo como agar sangre
 Observación en los medios de cultivo las diferentes colonias bacterianas en crecimiento
y realización de coloración Gram
CONTEXTUALIZACIÓN
Excepto algunas raras excepciones, todo examen bacteriológico incluye el cultivo del producto
a examinar. El cultivo bacteriano tiene tres propósitos principales:
 Facilitar el crecimiento y aislamiento de todas las bacterias presentes en una infección.
 Determinar cuáles bacterias que se desarrollan es más probable que sean la causa de
la infección y cuáles son contaminantes probables o colonizadores.
 Obtener desarrollo suficiente de las bacterias relevantes en clínica para permitir su
identificación y caracterización.
 Necesario para los estudios complementarios como los de la sensibilidad de las
bacteriuas a los distintos antibióticos.
El cultivo es el proceso de crecimiento de microorganismos mediante la toma de bacterias de
un sitio de infección (el ambiente in vivo) por métodos de recolección de muestra y
crecimiento en un ambiente artificial en el laboratorio (el ambiente in vitro).
REQUERIMIENTOS PARA EL DESARROLLO BACTERIANO
Las bacterias pueden ser divididas en autótrofas y heterótrofas. Las primeras comprenden las
bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrógeno de la atmósfera y de la materia
inorgánica simple. Las bacterias heterótrofas reguieren compuestos orgánicos más complejos
como fuente de carbono y nitrógeno, así como proteinas o sus derivados, también requieren
carbohidratos y grasas. Este último grupo de organismos es el más importante en
bacteriología médica.
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Proteínas. Se suministran generalmente como "peptonas', que se encuentran disponibles, en
el comercio, preparadas por digestión parcial de carne con enzimas pépticas; consisten en
polipéptidos, dipéptidos y aminoácidos.
Carbohidratos. Suministran carbono para la síntesis, y además su fermentación libera
energia utilizable en el metabolismo.
Factores accesorios de crecimiento. Son también requeridos por algunas bacterias. Entre
ellos están las vitaminas del complejo B (tiamina, ácido nicotínico, piridoxina, biotina). Estas
suministran enzimas necesarias que las bacterias son incapaces de sintetizar. Otros factores
necesarios para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos más complejos, como el
suero, la sangre, la yema de huevo, etc.
Sales minerales. Elementos como potasio, sodio, calcio, etc. también son requeridos por
algunas bacterias en su desarrollo.
Atmósfera. Algunos microorganismos precisan de una atmósfera con oxígeno para su
desarrollo (aerobios obligados); otros, son incapaces de producirse en presencia de oxígeno
libre (anaerobios obligados) en tanto, que los de un, tercer grupo, aunque pueden crecer en
una atmósfera con oxígeno, logran sobrevivir y crecer sin él (anaerobios facultativos).
Algunos grupos bacterianos, especialmente los gonococos y los neumococos, prefieren una
atmósfera en la que haya una concentración de CO2 de 5 a 10 %.
Presión Osmótica. Las células pueden encogerse y ser destruidas (plasmólisis) en
soluciones hipertónicas; inversamente, se rompen (plasmoptisis) por entrada de agua, en las
soluciones hipotónicas,
Temperatura. La temperatura en la cual el microorganismo bacteriano crece mejor, es
considerada como temperatura óptima. Para la mayoría de las bacterias patógenas del
hombre es de 37 °C. El desarrollo bacteriano tiene lugar entre límites de temperatura cuyos
extremos son designados como mínimos y máximos.
Para la mayoría de las bacterias patógenas del hombre los límites se encuentran entre 15 y
40°C. La temperatura en la cual en un tiempo dado mueren las bacterias es conocido como
punto término letal. Las bacterias que son congeladas, no mueren, sino que inhiben su
crecimiento. Los microorganismos importantes en bacteriología médica son generalmente
mesofílicos (límites entre 5 y 43°C). Sin embargo, hay microorganismos que pululan entre
límites de temperatura mucho más bajas (psicrofílicos), o bien, superiores (termofílicos). Los
primeros son encontrados en el suero y en el agua fría, los últimos en la materia orgánica en
fermentación.
Luz. La mayoría de las bacterias se desanollan mejor en ausencia de luz. La luz del sol, con
su componente ultravioleta, puede incluso ser letal.
Reacción. La mayoría de las bacterias crecen mejor en un medio ligeramente alcalino (pH 7.2
a 7.6), pero existe también un límite de potencialidad bastante amplio. Los hongos crecen con
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facilidad en medios ácidos (pH 5) mientras que el medio especial para el crecimiento del
Vibrio cholerae debe ser marcadamente alcalino (pH 9.6)
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
De acuerdo a su consistencia
Líquidos: Utilizados generalmente para obtener crecimiento rápido y masivo; en estos medios
las bacterias conservan su forma original y características.
Semisólidos: Útiles para investigar movilidad y conservar las bacterias por períodos largos,
contienen de 1-1 5% de agar
Sólidos: Especialmente útiles para el aislamiento de bacterias y observación de colonias,
contienen de 2 a 3 % de agar
CLASIFICACIÓN Y FUNCIONES DE LOS MEDIOS
Los medios se clasifican de acuerdo con su función y uso. En el diagnóstico bacteriológico
hay cuatro categorías generales de medios: enriquecimiento, apoyo, selectivo y diferencial.
Los medios de enriquecimiento contienen nutrientes específicos requeridos para el
desarrollo de determinados patógenos bacterianos que pueden estar presentes solos o con
otras especies bacterianas en una muestra del paciente. Este tipo de medios se utiliza para
favorecer el desarrollo de un determinado patógeno bacteriano, a partir de una mezcla de
microorganismos, por el uso de especificidad de nutrientes. Un ejemplo de estos medios es el
agar amortiguado con carbón y extracto de levadura que proporciona L-cisteína y otros
nutrientes necesarios para el crecimiento necesario de Legionella pneumófila, el agente
etiológico de la enfermedad de los legionarios.
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Los medios de apoyo o universales contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la
mayoría de los microorganismos sin requerimientos especiales y sin brindar ventaja alguna en
el crecimiento de un microorganismo en particular.
Los medios selectivos contienen uno o más agentes que inhiben todos los microorganismos
excepto los que son buscados. En otras palabras, estos medios seleccionan el crecimiento de
ciertas bacterias e inhiben el de otras. Los agentes inhibidores utilizados para este propósito
son colorantes, sales biliares, alcoholes, ácidos y antibióticos. Un ejemplo es el agar con
alcohol feniletílico, que inhibe el desarrollo de bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios
facultativos, y permite el crecimiento de cocos Gram positivos.
Los medios diferenciales emplean un factor (o factores) que permite que las colonias de una
especie o tipo bacteriano exhiban ciertas características metabólicas o de cultivos que pueden
utilizarse para diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo agar placa.
Medios de transporte: En algunas circunstancias puede haber una demora entre la
extracción de una muestra y su cultivo. Muchos microorganismos pierden su viabilidad cuando
se almacenan en medios ordinarios de laboratorios. Se dispone de varios medios de
transporte, que consisten en agentes reductores como el tioglicolato o la cisteina en cierto
número de tipos de medios salinos altamente amortiguados (buffered).
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Un ejemplo de medio de transporte es el medio de Stuart. Se utiliza en una unidad
descartable de cultivo, denominado Culturette, que consiste en un tapón estéril de poliestireno
y una ampolla del medio de Stuart. Después de recoger la muestra, se coloca en el tubo y se
aplasta la ampolla para liberar el medio alrededorr del extremo de tapón. Este tipo de medio
no es adecuado para aislar anaerobios sensibles al oxígeno.
Es importante destacar que muchos medios utilizados en el diagnóstico bacteriológico
cumplen más de una función. Por ejemplo, el agar MacConkey es tanto diferencial como
selectivo, debido a que inhibe el desarrollo de la mayoría de las bacterias grampositivas. Otro
ejemplo es el agar sangre de carnero. Éste es el medio de apoyo más común utilizado en el
diagnóstico bacteriológico, debido a que permite el desarrollo de muchos microorganismos.
Sin embargo, en muchos casos este agar es también diferencial, porque la apariencia de las
colonias producidas por ciertas especies bacterianas es muy diferente.
Medios en placas para la bacteriología de rutina
Medio
Agar alcohol feniletílico
Agar chocolate
Componentes/comentarios
Objetivo principal
Agar base nutritivo. El feniletanol Aislamiento selectivo de
inhibe
el
crecimiento
de cocos
grampositivos
y
microorganismos gramnegativos
bacilos
anaerobios
gramnegativos
Medio extremadamente nutritivo , Cultivos de especies de
preparado con adición de sangre de Haemophilus y especies
cordero calentada sobre 80ºC hasta patógenas de Neisseria
que el medio se torne parduzco,
para liberar la hemoglobina y
entregar al medio todos los factores
de crecimiento
Agar
Columbia Agar base Columbia con 10 mg de
colistina-ácido
colistina por litro, 15 mg de ácido
nalidíxico (CNA)
nalidíxico por litro y sangre de
carnero al 5%
Agar con bilis y esculina Agar base nutritivo con citrato
férrico. La hidrólisis de la esculina
por los estreptococos del grupo D le
otorga un color castaño al medio; el
desoxicolato de
sodio
inhibe
muchas bacterias
Agar eosina azul de Base de peptona con lactosa y
metileno (EMB)
sacarosa, eosina y azul de metileno
que actúan como indicadores
Aislamiento slectivo
cocos grampositivos
de
Aislamiento diferencial e
identificación presuntiva de
estreptococos grupo D y
enterecocos
Aislamiento y diferenciación
de
bacilos
entéricos
fermentadores
y
no
fermentadores de lactosa
Agar Hektoen entérico Base de peptona con sales biliares, Medio
diferencial
y
(HE)
lactosa, sacarosa, salicina y citrato selectivo,
para
el
24
de amonio férrico. Los indicadores aislamiento y diferenciación
son el azul de bromotimol y la de especies de Salmonella
fucsina ácida
y Shiguella de otros bacilos
entéricos gramnegativos
Agar MacConkey
Base de peptona con lactosa. Los Aislamiento y diferenciación
microorganismos grampositivos son de
bacilos
entéricos
inhibidos por el cristal violeta y las gramnegativos
sales biliares. Rojo neutro como fermentadores
y
no
indicador
fermentadores de la lactosa
Agar manitol salado
Base de peptona, manitol y rojo Aislamiento selectivo de
fenol
como
indicador.
La estafilococos
concentración de sal al 7,5% inhibe
la mayoría de las bacterias
Agar sangre
Agar con sustrato nutritivo (extracto Cultivo de microorganismos
de levadura,peptona, hidrolizado de con
requerimientos
hígado), cloruro de sodio, con 5% especiales
de
cultivo,
de sangre de cordero
determinación
de
reacciones hemolíticas
Agar Thayer-Martin
Agar sangre base enriquecido con Selectivo
para
N.
hemoglobina y suplemento B; los gonorrhoeae
y
N.
microorganismos
contaminantes meningitidis
inhibidos por colistina, nistatina,
vancomicina y trimetoprima
Caldo
para Caldo base de peptona con glucosa Medio
líquido
selectivo
gramnegativos (GN)
y manitol. El citrato de sodio y el (enriquecimiento)
para
desoxicolato de sodio actúan como patógenos entéricos
agentes inhibidores
Caldo selenito
Caldo base de peptona. El selenito Enriquecimiento para el
de sodio resulta tóxico para la aislamiento de las especies
mayoría de las Enterobacteriaceae
de Salmonella
Caldo tetrationato
Caldo base de peptona. Las sales Selectivo para especies de
biliares y el tiosulfato de sodio Salmonella y Shigella
inhiben
los
microorganismos
grampositivos y Enterobacteriaceae
Caldo de tioglicolato
Digerido pancreático de caseína, Favorece el crecimiento de
caldo de soja y glucosa que anaerobios,
aerobios,
enriquece el desarrollo de la microaerófilos
y
mayoría de los microorganismos. El microorganismos exigentes
tioglicolato y el agar reducen el
potencial rédox
Caldo tripticasa soja Caldo enriquecido con múltiples Caldo de enriquecimiento
(TSB)
propósitos que puede favorecer el utilizado para el subcultivo
crecimiento de muchas bacterias de diversas bacterias de
con requerimientos especiales de cultivos primarios en placas
cultivo y sin ellos
de agar
25
MEDIOS USADOS PARA EL AISLAMIENTO PRIMARIO
La velocidad, la especificidad del procedimiento de ensayo y la economia de la prueba
son tres factores que el laboratorio de microbiología clínica debe tener en cuenta en los
procedimientos de diagnóstico. Cuando es posible identificar un microorganismo con rapidez y
certeza, se puede tratar al paciente de una manera más rápida y aumenta así la posibilidad de
su curación. Por consiguiente, la elección de un medio de aislamiento de las especies
microbianas es sumamente importante. Suele ser dictado por la fuente de la muestra,
materias fecales, orina, líquido cefalonaquídeo, etc. y por el tipo del agente infeccioso del cual
se sospecha que causa la infección. Cierto número de microorganismos fisiológicamente
diferentes podran provocar la infección. Por lo general el microbiólogo clínico utiliza más de un
tipo de medio, así como condiciones ambientales distintas para el aislamiento primario; por
ejemplo, el cultivo es incubado por vía aerobia y anaerobia. Los medios más comúnmente
recomendados para el aislamiento primario son: tioglicolato, agar sangre, feniletilalcohol,
agar eosina-azul de metileno (EMB), agar chocolate.
CARACTERÍSTICAS DE LA COLONIA
Es importante destacar las características clave de una colonia bacteriana para toda
identificación bacteriana; el éxito o el fracaso de los procedimientos posteriores de
identificación a menudo dependen de la precisión de estas observaciones. Los criterios
utilizados con frecuencia para caracterizar el crecimiento bacteriano son:






Tamaño de la colonia (por lo común calculado en milímetros o descrito en términos
relativos como cabeza de alfiler, pequeño, medio, grande)
Pigmentación de la colonia
Forma de la colonia (incluye forma, elevación y bordes de la colonia
Aspecto de la superficie de la colonia (p. ej., brillante, opaca, roma, transparente)
Cambios en los medios con agar como resultado del crecimiento bacteriano (p. ej.,
patrón hemolítico en agar sangre, cambios en el color de los indicadores de pH,
corrosión de la superficie del agar)
Olor (ciertas bacterias producen olores característicos que pueden ayudar a la
identificación preliminar.
Clasificación de los medios de cultivos de acuerdo a su empleo
Método de placas: El propósito de utilizar medios sólidos pulverizados en cajas de Petri,
consiste en inocular cantidades sucesivamente menores de material en el rnedio, de manera
que en algún tiempo los microorganismos sean colocados en una capa tan delgada que les
permita el crecimiento de colonias individualbs aisladas.
Para realizar un cultivo bacteriano es necesario tomar el asa e introducirla al fuego para que
se esterilice, dejar enfriar unos segundos y tomar la muestra que se va a estudiar; abrir la caja
petri y flamear delante del mechero, con el asa impregnada de la muestra se efectúa un
pequeño inóculo en el borde, de allí se parte la primera estriación; luego de la esquina de una
26
de las estrías de la primera estriación se realiza la segunda estriación y finalmente de la
esquina de una de las estrías de la segunda estriación, se realiza la tercera estriación,
procurando hacer las estrías mucho más separadas de las dos primeras, con la finalidad de
separar las colonias que sean sembradas; se tapa la caja y se lleva a la incubadora,
colocándola de lado contrario al que se sembró y se la deja en las condiciones apropiadas
para el crecimiento de cada bacteria (temperatura, atmósfera, potencial rédox, tiempo, etc.)
Debe trabajarse siempre cerca de un mechero de Bunsen al inocular, ya que la corriente
asendente de aire va por la flama, arrastra el polvo, etc.; con el aire hacia arriba, alejándole de
la placa, y cuando el aire se enfría, el polvo se precipita lejos de la placa.
A menudo se reciben torundas para cultivo; en vez de recogerse material con el asa, deben
emplearse las torundas corno material primario de inoculación a partir del cual se distribuye
con el asa en la forma descrita más adelante. Deben ser subrayados ciertos puntos de
importancia sobre el uso del método de placas; por ejemplo, las placas deben estar
preferentemente secas antes de usarse, para que los microorganismos no se extiendan,
impidiendo la formación de colonias aisladas.
Medios inclinados: Este tipo de cultivo es empleado principalmente para resembrar cepas
aisladas, sea para identificación ulterior o para base de cultivo. Se requiere práctica y siempre
debe hacerse cerca del mechero de Bunsen; el cuello del tubo o del frasco debe ser flameado
antes de recubrirlo o de volver a colocar el tapón de algodón (método que se usará en la
práctica No. 7 Pruebas bioquímicas).
Cultivos por agitación: Este medio de cultivo es de empleo particular en el aislamiento de
anaerobios esporulados.
Cultivos por picadura: En este método de material para investigación es colocado en un
alambre recto e introducido al medio. Debe tenerse cuidado en hacer que el trayecto de la
salida sea el mismo que el de entrada. Ciertos microorganismos tienen un aspecto
característico en el cultivo hendido. El método puede ser también empleado para conservar
los cultivos patrón y para comprobar la licuefacción de la gelatina (método que se usará en la
práctica No. 7 Pruebas bioquímicas).
Cultivos líquidos: Al inocular un medio líquido como el agua de peptona o el caldo con
tioglicolato, el tubo se inclina y el material se extrae el asa por frotamiento contra la pared del
tubo. Cuando éste se endereza, el material se encuentra bajo la superficie del medio.
27
FACTORES DETERMINANTES EN LA PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE
CULTIVO
Los factores siguientes son importantes en la preparación de un medio de cultivo:
1. Fluidez: El medio deshidratado comercialmente disponible o la mezcla del propio
microbiólogo se disuelve en primer término en agua. Si se requiere un medio sólido, se
agrega agar.
2. pH: Se verifica el pH del medio y se regula si es preciso. En preparaciones comerciales
no suele ser necesario el ajuste. Para amortiguar los propios medios sintéticos se
utilizan generalmente buffers de fosfato, porque el crecimiento óptimo de la mayor parte
de las bacterias se encuentran en el intervalo de amortiguación de los iones fosfato: 6.6
a 7.2.
3. Esterilización: Se debe esterilizar el medio. Este procedimiento asegura la destrucción
de todos los microorganismos no deseados que están presentes durante su
preparación. Si los componentes del medio son estables al calor se lleva a cabo la
esterilización en un autoclave (121°C durante 15 minutos). Si se requiere sangre y
ciertos componentes inestables, como antibióticos o compuestos oxidables al calor en
el medio, se los debe esterilizar por separado mediante filtración u otros procesos, y
luego se agregan al medio esterilizado cuando éste se enfría hasta una temperatura de
50°C.
4. Tensión de oxígeno:
4.1. Aislamientos de aerobios: como la respiración es su única fuente de energía,
los microorganismos aerobios deben tener una provisión adecuada de oxígenó en
su ambiente, se pueden satisfacer las demandas de oxígeno de las siguientes
maneras:


Agitando o haciendo girar medios de cultivo en varios dispositivos de agitación
automática También se pueden cultivar microorganismos aerobios sin agitación.
Se puede hacer burbujear aire filtrando a través de recipientes de cultivo. Algunos
microorganismos aerobios requieren una tensión de dióxido de carbono (CO2) para su
crecimiento en un cultivo
4.2. Aislamiento de anaerobios: Su aislamiento requiere la recolección de
muestras adecuadas, el transporte de estas muestras y métodos de cultivo en
condiciones anaerobias. Algunas de las técnicas químicas y físicas de las cuales
dispone el microbiblogo para aislar anaerobios menos sensibles son las siguientes:

Agentes reductores como el tioglicolato de sodio, la cisteína o el ascorbato pueden ser
agregados al medio de cultivo. En estas condiciones es posible cultivar anaerobios en
presencia de oxígeno porque estos agentes reductores absorben el oxígeno libre y lo
ponen fuera del alcance de las bacterias.
28

Se pueden mezclar ácido pirogálico y carbonato de sodio en una cápsula o un frasco,
que luego se coloca en un recipiente sellable más grande que contiene los frascos de
cultivo o las placas de agar. Cuando se mezclan el ácido pirogálico y el carbonato de
sodio, se absorbe oxígeno y se libera CO2, creando de este modo un ambiente
anaerobio.

El sistema GasPak es el más comunmente empleado en los laboratorios químicos. Se
agrega una cantidad específica de agua al contenido de un sobre de papel de aluminio
descartable. Se coloca en envoltorio en el recipiente junto con los cultivos inoculados.
Se cierra herméticamente, y el agua agregada al envoltorio genera la producción de
hidrógeno e hidróxido de carbono. Con la ayuda de un catalizador que se encuentra en
la tapa del recipiente, cualquier cantidad de oxígeno presente en el Gaspak se
combina con el hidrógeno formando agua y de este modo produce un medio
anaerobio. Se utilizan otras técnicas como el tubo enrollado y la caja anaerobia con
guantes para aislar los anaerobios más sensibles.
5. Temperatura: El medio se debe incubar a una temperatura que permite el crecimiento
óptimo de las especies bacterianas. La mayoría de los laboratorios químicos tienen
estufas con controles automáticos de témperatura. El conocimiento de las necesidades
térmicas de un microorganismo es tan importante como cualquiera de los factores
físicos y químicos ya examinados. La mayoría de las bacterias patógenas se cultivan
entre los 35 y 40°C, con verificaciones muy cuidadosas para prevenir fluctuaciones.
Algunos patógenos, como Neisseria gononhoeae, son sumamente sensibles a la
temperatura.
PRESERVACIÓN DE MICROORGANISMOS AISLADOS
Muchos microorganismos infecciosos son sumamente sensibles a las condiciones
ambientales fuera del huésped. Estas especies deben ser identificadas con la mayor rapidez
posible. Se puede preservar la mayor parte de los microorganismos para una futura
identificación o para procedimiento experimentales. Pero si se dejan las colonias aisladas
originales sobre la superficie del agar, se deshidratarán y morirán en pocas semanas. Por lo
tanto, es necesario transferirlas a medios adecuados con intervalos regulares. Se pueden
utilizar diversas técnicas:
Subcultivo: El método más tradicionalde preservación es por subcultivos en medios que
estimulan el crecimiento. El subcultivo se realiza a intervalos, regulares, que pueden variar de
un día a varias semanas segun la especie.
Después de un subcultivo en una superficie de agar o en un caldo, se conserva la muestra a
temperaturas de refrigeración (4°C). A 4°C la muestra es aún metabólicamente activa, y en su
mayor parte las células mueren en pocos días o en algunas semanas. Además, el subcultivo
se presta a una posible contaminación o a una pérdida del cultivo por accidentes de
laboratorio.
Reducción metabólica: Se puede reducir el metabolismo de los microorganismos
colocándolos en un medio que contiene elementos nutritivos mínimos. Se dejan los cultivos en
29
tales medios mínimos de agar y luego se sellan con cera para preservarlos a las temperaturas
de refrigeración. Una varilla de agar del cultivo se puede recubrir con parafina líquida y
almacenar durante años, se ha aplicado esta técnica para la preservación de los hongos. A
menudo se almacenan las bacterias esporuladas en suelo estéril. En primer término se seca
el suelo a la temperatura del ambiente y luego se almacena a la temperatura de refrigeración.
Desecación: Algunas bacterias se preservan por desecación. Se colocan grandes
concentraciones de la muestra en discos de cera u otro material adecuado y luego se pasan a
un desecador. Se elimina el aire en el desecador mediante una bomba de vacío. Después del
secado, se pueden almacenar los discos de cera en recipientes estériles a 0-5°C.
Congelación: La mayoría de las Bacterias pueden ser congeladas en varios tipos, de medios,
se congelan rápidamehte las muestras a temperaturas de -20 a 30°C para mantener la mayor
parte de las células en un estado viable. Se han empleado con éxito temperaturas ultrabajas
utilizando el hidrógeno líquido, a fin de almacenar y preservar una amplia variedad de células,
incluso hongos, virus, y hematíes.
Congelación-desecación (liofilización): La formación de cristales de hielo producidos
durante el proceso de congelación pueden dañar las células. Si se congela en primer término
la muestra en un baño que contiene hielo seco y acetona o alguna otra mezcla, se puede
extraer el agua que contiene por sublimación y prevenir así ese inconveniente. Se emplea
comúnmente esta técnica para preservar cultivos y para remitirlos por correo
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
EXPERIMENTACIÓN:
1. Los estudiantes procederán a realizar siembras en agar sangre cuyos resultados se
observarán en la siguiente semana.
2. Se evaluará el portafolio de coloraciones
3. Realizar el portafolio de la práctica e incluir los resultados, reflexiones y el cuestionario en el
mismo.
RESPONDER AL SIGUIENTE CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
¿Qué necesitan las bacterias heterótrofas para su crecimiento?
¿Cuáles son los requerimientos necesarios para el crecimiento bacteriano?
¿Qué significa la plasmólisis y la plasmoptisis?
¿Cuál es la temperatura óptima de crecimiento para la mayoría de bacterias que son
patógenas para el hombre?
5. Escriba un ejemplo de medios de cultivo de acuerdo a la categoría para el diagnóstico
bacteriológico.
6. Complete: El medio de cultivo llamado agar………………………………………….es
aquel que al ser calentado a ………..°C libera la hemoglobina y factores de crecimiento.
30
7. El
agar
MacConkey
se
considera
un
medio……………………………………………………..porque permite reconocer las
bacterias que fermentan o no la lactosa, también es considerado un medio selectivo ya
que contiene …………………………………………………………y violeta cristal que
inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas.
8. ¿Cómo se llama el medio de cultivo que sirve para el asilamiento selectivo de cocos
Gram positivos y bacilos anaerobios Gram negativos, inhibiendo el crecimiento de
bacilos Gram negativos?
9. Escriba el nombre de un medio de cultivo que permita el crecimiento de especies de
Neisseria (gonorrhoeae y N. meningitis).
10. Escriba el nombre de un medio de cultivo que reducen el potencial rédox favoreciendo
el crecimiento de anaerobios.
11. Mencione los criterios utilizados con frecuencia para caracterizar el crecimiento
bacteriano.
12. Mencione los 5 factores determinantes para la preparación de un medo de cultivo.
31
PRACTICA No. 4
ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS:
 Conocer y realizar el método convencional de difusión en discos
 Interpretar la sensibilidad y resistencia que presentan diferentes bacterias a los
antibióticos
CONTEXTUALIZACIÓN
Las enfermedades infecciosas siempre han sido un problema grave para el hombre, el
hallazgo de sustancias eficaces que pudieran ser utilizadas en el tratamiento de estas
enfermedades se remonta al siglo XVll en el que ya se emplearon sustancias químicas como
la quinina para la malaria.
Hacia el año de 1900, el trabajo de Paul Ehrlich marca el inicio de la quimioterapia como
ciencia pues este científico establece los principios de la toxicidad selectiva, el desarrollo de la
resistencia a los medicamentos y el uso de la terapia combinada para combatir dicha
resistencia.
Antimicrobiano o antibiótico es una sustancia producida por microorganimos o de manera
sintética, que tiene la capacidad de actuar sobre otros microorganismos inhibiéndolos o
destruyéndolos.
TÉCNICA DE BAUER.KIRBY MODIFICADA PARA MEDICIÓN DE LA
SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
Reactivos y Materiales
1. Agar de Mueller Hinton: Preparar el agar de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Una vez salido del autoclave permitir que el medio alcance entre 45 y 50°C, es
recomendable para asegurarse de tener esta temperatura colocar el medio que sale del
autoclave, en un baño María a 48°C y mantenerlo ahí por un tiempo prudencial hasta
32
que la temperatura interna del medio contenida en el recipiente alcance la temperatura
deseada.
En condiciones asépticas dispensar el medio en cajas petri estériles de 100 mm de
diámetro y permitir que solidifique el medio, cuidar de obtener un espesor de 4mm. Una
vez solidificadas colocar una de las cajas en la estufa a 37°C, para control, chequear
hasta al día siguiente por ausencia de microorganismos. Seleccionar una caja de lote
preparado y someter a la prueba de inhibidores de timidina y timina utilizando
Streptococcus faecalis ATCC 29212 o 33186 y colocar un disco de cotrimoxazol. Un
agar de Mueller Hinton fiable debe mostrar una sensibilidad bien diferenciada de 20
mm de diámetro. Las cajas que no se utilicen deben colocarse en funda plástica y
guardarlas en la nevera en posicióri invertida. Conservarlas en refrigeración hasta dos
semanas.
2. Caldo de Tripticase Soya (TSB): Para la suspensión se debe preparar de acuerdo a
las recomendaciones del fabricante un caldo de tipo de digerido de soya y caseína y
dispensar 4 ó 5 ml de este caldo en tubos adecuados.Un caldo se coloca en la estufa
para control y los otros se almacenan en la nevera.
3. Agua destilada estéril y solución salina estéril al 0.85 %
4. Discos de antibióticos
5. Frascos con etanol al 70 %
6. Pinzas
7. Hisopos estériles
8. Regla en milímetros o plantilla de lectura
9. Mechero
10. Desinfectante TEGO
Preparación del patrón de turbidez MacFrarland #0.5
Reactivos: Cloruro de Bario 0.048M (1.75%p/v), Acido Sulfúrico 0.3N (1% p/v).
Añadir 0.5 ml de Cloruro de Bario a 99.5ml de Acido Sulfúrico. La densidad óptica en un
espectrofotómetro a 625nm que debe dar 0.08 a 0,10 de absorvancia.
Técnica
Una vez sembrado y obtenido el crecimiento de los microorganismos de una muestra clínica,
“evaluar correctamente” el hallazgo antes de decidir la realización del antibiograma.
Seleccionar 4 a 5 colonias similares del microorganismo suceptible de practicar el
antibiograma y colocarlas en el caldo de cultivo.
Incubar a 35°C y mantenerlos en esa temperatura de 2 a 5 horas. Ajustar la turbidez del
cultivo a la turbidez del estándar MacFarland #0.5. Si la turbidez del cultivo sobrepasa a la del
estándar diluir con agua destilada estéril a la concentración deseada.
33
En las bacterias exigentes tales como Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y
Streptococcus pneumoniae, obviar el paso de crecimiento en caldo y preparar un inóculo
directamente en 4 a 5 ml de solución salina y ajustarlo con el estándar MacFarland # 0,5 para
luego inocularlo en las cajas petri.
lntroducir un aplicador estéril en el caldo de crecimiento, eliminar el exceso por rotación en las
paredes del tubo luego inocular en un sentido en toda la superficie de la caja petri y repetir el
paso anterior en dos sentidos diferentes para finalizar la inoculación pasar el aplicador por la
periferia del medio de cultivo.
Permitir secar la siembra mediante el reposo por un lapso de 3 a 5 minutos y no más allá de
15 minutos.
lntroducir la pinza en el frasco de alcohol y pasarla por el mechero esperar hasta que el fuego
de la pinza se consuma. Colocar los discos de los antibióticos seleccionados con la pinza e
impregnarlos en la superficie de las placas inoculadas haciendo una ligera presión sobre ellos.
Los discos deben quedar a una distancia de 15 mm de los bordes de la placa y
suficientemente alejados entre ellos para evitar la sobreposición de halos.
.
La selección de los agente antimicrobianos se denominan batería de antimicrobianos, las
decisiones finales con respecto al contenido de la batería deben ser tomadas por el
laboratorista, el personal médico (en particular de los especialistas en enfermedades
infecciosas) y de la farmacia.
El siguiente paso es incubar a 35°C en un ambiente de aerobiosis sin CO2 ya que puede
alterar el pH de la superficie y consecuentemente el desarrollo de los microorganismos
inoculados, excepto para Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae cuyas variaciones
de estandanzación fueron determinadas bajo ese parámetro, chequear adecuadamente la
temperatura de la incubadora ya que si sobrepasa la temperatura ideal puede afectar la
prueba.
34
Luego de 16 a 18 horas de incubación se procede a la lectura de las zonas, de inhibición, para
ello se puede utilizar una regla o también se puede utilizar plantillas previamente diseñadas
para el efecto. Una vez hecha la lectura de los halos de inhibición se procede a comparar con
las tablas pertinentes para establecer la categoría con la cual será clasificado el
microorganismo para cada uno de los antibióticos.
Métodos de prueba
Métodos que miden directamente la actividad de antimicrobianos en forma directa
Las mediciones directas de la actividad antimicrobiana se hacen mediante:



Métodos de prueba de sensibilidad convencionales, como dilución en caldo, dilución en
agar y difusión con discos (la explicada anteriormente)
Sistemas comerciales de pruebas de sensibilidad
- Métodos de microdilución en caldo
- Derivados de la dilución en agar
- Derivados de la difusión en agar
- Sistemas automatizados de prueba de sensibilidad a antimicrobianos
Pruebas especiales de screening e indicadoras
CRITERIOS PARA EL CONTENIDO Y USO DE BATERÍAS DE ANTIMICROBIANOS
Identificación del microorganismo o grupo: los antimicrobianos a los que le
microorganismo es intrínsecamente resistente se excluyen de rutina de la batería. Por
ejemplo vancomicina no se usa para bacilos gramnegativos.
Patrones de resistencia adquiridos frecuentes en la flora microbiana local: si la
resistencia a un agente determinado es frecuente, la utilidad del agente puede presentar
limitaciones suficientes como para que no se justifique la realización de pruebas de rutina
y solo los antimicrobianos más potentes se incluyen en la batería de prueba. A la inversa,
puede que no sea necesario que los agentes más potentes integren la batería de prueba
si la sensibilidad a agentes menos potentes es frecuentes.
Método de prueba de sensibilidad a antimicrobianos usados: en función del método
de prueba, algunos agentes no detectan la resistencia de forma confiable, y no deben
incluirse en la batería. Por ejemplo, la resistencia de Streptococcus Pneumoniae a la
cefotaxima no puede detectarse por difusión con discos, por lo que no debe formar parte
de una batería de prueba con discos.
Localización de la infección: los agentes antimicrobianos, como nitrofurantoína, que
solo alcanzan niveles efectivos en el aparato urinario, no deben incluirse en baterías
probadas contra aislamientos bacterianos provenientes de otros sitios del cuerpo (es
decir, deben ser capaces de lograr la aproximación anatómica).
Disponibilidad de los agentes antimicrobianos: las baterías de prueba de agentes
antimicrobianos se seleccionan por su capacidad de detectar resistencia bacteriana a
agentes utilizados por el personal médico al que presta servicios el laboratorio.
35
El NCCLS publica tablas actualizadas que enumeran los posibles agentes antimicrobianos a
incluir en las baterías de prueba contra determinados microorganismos o grupos de
microorganismos.
DISCOS DE ANTIBIÓTICOS USADOS PARA GÉRMENES GRAM POSITIVOS Y GRAM
NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE AMBULATORI
GRAM POSITIVOS
Oxacilina (ox)
Eritromicina (E)
Clindamicina (cc)
Cefoxitin (fox)
Sulfas (sxt)
Ciprofloxacina (cip)
Vancomicina (va)
GRAM NEGATIVOS
Ampicilina (am)
Cefuroxima (cxm)
Ampicilina + sulbactam (sam)
Gentamicina (gm)
Norfloxacina (nor)
Nitrofurantoína (fm)
Sulfas (sxt)
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
EXPERIMENTACIÓN
1. Continuando con la práctica anterior, cada estudiante realizará la observación de las
colonias sembradas en agar sangre y realizará la coloración Gram de dos
colonias diferentes, observar en el microscopio y anotar los resultados de todos los del
equipo de trabajo en un cuadro para el informe pendiente.
2. Se realizará el antibiograma y su respectiva interpretación. Trabajo grupal.
RESPONDA AL SIGUIENTE CUESTIONARIO:
1. ¿Cómo se llama la técnica empleada en clases para medición de sensibilidad de
antimicrobianos?
2. ¿Para qué sirve el caldo de tripticasa soya en el antibiograma?¿Qué tipo de medio es:
enriquecimiento, universal, selectivo, etc.?
3. ¿Se puede realizar el antibiograma únicamente con el resultado Gram? ¿Qué falta
realizar antes?
4. ¿Se compara el patrón de turbidez Mac Farland con el cultivo realizado en el medio de
Muller Hinton o con el caldo de cultivo TSB?
5. ¿Qué debe hacer cuando la turbidez supera al patrón Mac Farland?
6. ¿A qué temperatura se debe incubar el cultivo líquido (TSB) y el sólido (Muller Hinton?
¿Porqué?
7. ¿Por qué razón se debe obviar el crecimiento de bacterias como Haemophilus
influenzae, Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus pneumoniae en el caldo de TSB?
¿Qué debe hacer?
8. ¿A qué distancia se deben poner los discos de antibióticos en el medio de Muller
Hinton?¿Porqué?
9. ¿Se puede utilizar Vancomicina en un antibiograma para la Escherichia coli? ¿Porqué?
10. ¿Porqué razón la Nitrofurantoína no debe ser utilizada para las vías respiratorias?
36
11. ¿Podemos utilizar la Ampicilina para bacterias cuyo resultado Gram es: cocos Gram
positivos dispuestos en cadena?
12. ¿Cómo se llama el método convencional empleado para realizar el antibiograma
empleado en la práctica de nuestra clase?
37
PRACTICA NO. 5
IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS
OBJETIVOS:
 Conocer los diferentes fundamentos de las pruebas empleadas para la identificación
 Realizar los diferentes métodos de identificación de las familias y géneros de cocos
Gram positivos
 Reconocer algunas especies mediante las técnicas de identificación empledas
FAMI LIA Micrococcaceae
Son cocos gram positivos, aparecen solos, en pares, tetradas, paquetes de ocho y en
racimos. No mótiles, no esporulados, catalasa (+), reducen nitratos a nitritos.
Las colonias son redondas, lustrosas, blancas aunque también existen especies pigmentadas.
Forman esta familia especies Saprófitas, parásitas y patógenas que se encuentran
distribuidas ampliamente en la naturaleza
Los gérieros Micrococcus y Staphylococcus forman parte de la flora humana y de animales
pero también existen ciertas especies patógenas para el hombre.
El géneio Staphylococcus contiene tres especies de importancia clínica:
Staphylococcus aureus: (facultativo anaerobio)
38
Puede infectar cualquier parte del cuerpo humano, es la causa más común de infecciones
supurativas, en casos severos puede producir septicemias, es frecuentemente el agente
causal de la ostiomielitis.
Cepas de S. aureus cuando crecen en altas concentraciones de CO2 (30%) pueden producir
una enterotoxina termoestable, causante de envenenamiento por alimentos.
Otras cepas producen una toxina epidermolítica (exfoliativa) causante del síndrome de piel
escaldada.
Staphylococcus epidermidis:
Se lo encuentra en el aire y en la piel. Normalmente no patógeno, pero puede causar
infecciones secundarias de la piel, heridas posquirurgicas y endocarditis posoperatorias.
Staohylococcus saprofiticus:
Se lo encuentra en el aire, polvo y productos animales. Generalmente considerados no
patógenos, pero en ocasiones puede producir infecciones urinarias.
Micrococos: (estrictos aerobios)
Forman parte de la flora normal de la piel y mucosas.
Las coloirias son blancas y chiclosas.
Peptococcus:
Son anaerobios estrictos se los considera los Estafilococos anaeróbicos, se los encuentra en
cultivos de heridas profundas.
39
FAMILlA Streptococcaceae
Son cocos gram positivos que se dividen en un solo plano, formando pares o cadenas,
aerobios y anaerobios facultativos. No producen esporas, no son mótiles. Son catalasa
negativa.
Este género contiene organismos patógenos para el hombre. Los más importantes
son:
GRUPO A: Streptococcus pyogenes
GRUPO B: Streptococcus agalactiae (pigmento)
GRUPO D: Enterococcus faecalis
Streptoccocus pneumoniae y grupo viridans
Enfermedades: faringitis estreptocócica, escarlatina, endocarditis, neumonías, infecciones en
el R.N.
40
Además las infecciones causadas por Estreptococos del grupo A pueden llevar a síndromes
post-infecciosos de fiebre reumática, cardiopatías reumáticas y glomérulo nefritis aguda.
Los estreptococos tienen hemolisinas que actúan de diferente manera en agar sangre:
Hemólisis beta: zona clara alrededor de la colonia
Hemólisis alfa: zona de hemólisis incompleta (verde).
Hemólisis gamma: ausencia de hemólisis
Streptococcus pneumoniae
Son dipldcocos gram positivos, con los extremos alargados en forma de lanza, también se
agrupan en cadenas; no forman esporas, no mótiles, poseen una cápsula formada de
polisacáridos específicos, lo que permite una tipificación con antisueros específicos.
Patógenos para el hombre, producen neumonías, meningitis, otitis y endocarditis. Crecen bien
en agar sangre y chocolate en atmósferas que contienen el 10% de CO2.
PRUEBAS DE LABORATORIO
-Catalasa: la catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H 2O2) en
oxígeno y agua.El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo oxidativo o aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido
de hidrógeno es letal para las células bacterianas.
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2H2O2
2H2O
+
O2 (burbujas de gas)
Procedimiento: En una placa portaobjetos añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%
(diluir la solución al 30% con agua destilada), transferir células del centro de una colonia bien
aislada y mezclar. La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o
efervescencia indica una reacción positiva.
-Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteíca de composición química desconocida, con
actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina,
provocando la formación de un coágulo visible en un sistema analítico adecuado. En el
laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al S. aureus
(coagulasa positivo) de otros estafilococos y micrococos.us (coagulasa positivo) de otros
estafilococos y micrococos. La coagulasa se halla en 2 formas, “libre” y “fija”, cada una de las
cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas separadas.
Prueba en tubos (coagulasa libre):
1. Colocar asépticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo
estéril.
2. Mezclar por rotación suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido.
3. Colocar el tubo en la incubadora de 4 a 24 horas. Observar la formación de un coagulo
visible.
La reacción se considera positiva ante cualquier grado de coagulación visible dentro del
tubo.
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-Novobiocina: Se usa el agar Mueller-Hinton, como el antibiograma ó también en agar
sangre.
Se utiliza para identificar que tipo de Staphylococcus coagulasa negativos es. Pueden ser
sensibles o no a la novobiocina (5 µg). Staphylococcus epidermidis es sensible, mientras que
Staphylococcus saprophyticus no lo es.
Procedimiento: Se toma un agar Muller Hinton ó agar sangre y en un lado de la placa se
estria con el asa en forma continua la cepa del Staphylococcus coagulasa negativo, con una
pinza estéril se coloca el disco de novobiocina en el centro del estriado realizado se incuba a
35°C por 18 horas.
Interpretación de resultados: Un halo de inhibición de crecimiento menor o igual a 16 mm
correswponde Staphylococcus saprofiticus. Un halo de inhibición mayor de 16 mm
corresponde al Staphylococcus epidermidis (también pueden ser otros estafilococos
negativos).
-Bacitracina: las pruebas presuntivas en la identificación del EbHGA (Estreptococo beta
hemolítico del grupo A) se basan en la susceptibilidad e inhibición del crecimiento en una
placa de agar sangre, y que tienen la mayor parte (95%) de las cepas al ponerlas en contacto
con discos que contienen dosis bajas (0.04U) de bacitracina.
Procedimiento: Se toma un agar sangre y en un lado de la placa se estria con el asa en
forma continua la cepa de estreptococo beta hemolítico, con una pinza estéril se coloca el
disco de bacitracina en el centro del estriado realizado. La placa de agar sangre es incubada a
35-37° C durante toda la noche. Los resultados son cualitativos y es positiva para
estreptococo beta hemolítico del grupo A si se encuentra cualquier halo de inhibición
alrededor del disco.
-Camp: Se realiza en agar sangre. Se usa para poder identificar que estreptococo puede ser
(A, B, D). Se basa en que los estreptococos del grupo B (Streptococcus agalactiae) producen
un factor llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de
hemólisis producida por un estafilococo productor de ßlisina.
Procedimiento: La prueba se realiza en agar sangre, colocando una estría del estreptpcoco
sospechoso del grupo B y luego se coloca otra estría en forma perpendicular del estafilococo
productor de ß lisina, el resultado es positivo cuando hay la presencia de una zona de
potenciación de la hemólisis en forma de puntas de flecha en el lugar donde se contactan las
dos estrías. La ß lisina aumenta la zona de hemólisis producida por un estreptococo del grupo
B.
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-Bilis esculina: Los estreptococos del grupo D crecen rápidamente en el agar bilis esculina e
hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde
oliva hasta negro. Las sales biliares presentes inhiben el desarrollo de la flora acompañante.
-Optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae (sensibles) y
otras especies de estreptococos a hemolíticos (resistentes). La sensibilidad a la optoquina es
una medida de la fragilidad de la membrana celular bacteriana. La optoquina, que es el
clorhidrato de etilhidrocupreína.
Procedimiento: Se toma una suspensión de colonias puras en caldo Mueller Hinton o
tioglicolato y con un hisopo se estría una placa de agar sangre de carnero al 5 %. Sobre la
estría se coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmósfera de CO2 al 5 %(jarra con vela)
durante 24 hs. a 35° C.
Interpretación: Sensible, cuando hay inhibición alrededor del disco. Se considera como punto
de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm). Resistente, cuando el
crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de halos intermedios deben
resolverse por acumulación de pruebas a favor o en contra.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
EXPERIMENTACIÓN
1. Se realizarán pruebas de:
- Catalasa para diferenciar a la familia Micrococcaceae de Streptcoccoceae
-Coagulasa para identificar al Staphylococcus aureus
-Novobiocina, bacitracina, optoquina, Camp
- Diferenciar hemólisis en agar sangre
2. Realizar el portafolio de la práctica correspondiente y colocar los resultados obtenidos.
RESPONDA AL SIGUIENTE CUESTIONARIOCUESTIONARIO:
1. ¿Qué técnicas diagnósticas se utilizan en el laboratorio para identificar a los a los
Staphylococcus y a los Streptococcus?
2. ¿Cómo se presentan en la coloración Gram las bacterias pertenecientes a la familia
Micrococcaceae y la Streptococcaceae?
3. ¿Cómo identificamos al Staphylococcus aureus del Strpetoccous pyogenes? Mencione
varias técnicas de identificación que ayuden para este propósito.
4. Según el grado de hemólisis clasifique a varias especie de Streptococcus y coloque
además las diversas pruebas con las que se las puede identificar.
5. María Teresa presenta una herida post-quirúrgica con abundante pus, su médico
solicita realizar exámenes microbiológicos para detectar el microorganismo presente:
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a. ¿Cuales serían los pasos para la identificación del microorganimo luego de tomar la
muestra? Coloque los resultados obtenidos en cada paso.
b. ¿Cuál sería el microorganismo presente según los resultados del literal 5.1.?
c. ¿Qué antibióticos emplearía?
6. José Antonio presenta fiebre reumática, su médico solicita realizar exámenes
microbiológicos para detectar el microorganismo presente:
a. ¿Cuales serían los pasos para la identificación del microorganimo luego de tomar la
muestra? Coloque los resultados obtenidos en cada paso.
b. ¿Cuál sería el microorganismo presente según los resultados del literal 6.1.?
c. ¿Qué antibióticos emplearía?
7. Utilizando una foto explique la prueba de Camp.
8. Verdadero o falso:
Es mejor sembrar al Streptococcus pneumoniae en agar chocolate que en agar sangre
(justifique su respuesta).
9. Mencione dos diferencias entre enterococos y no enterococos.
10. ¿Por qué razón especies de bacterias del género Micrococcus crecen bien en agar
sangre en una atmósfera con oxígeno?
11. ¿Cómo identificaría al Staphylococcus saprofyticus del Streptococcus pneumoniae?.
Mencione dos pruebas microbiológicas.
12. ¿Según el grado de hemólisis como puedo identificar al Streptococcus pneumoniae del
Streptococcus pyogenes?. Mencione dos pruebas microbiológicas.
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PRACTICA No. 6
ORINA
OBJETIVOS:
 Conocer la forma adecuada de recolección de una muestra de orina tanto en hombres
como en mujeres
 Realizar el examen elemental y microscópico de orina y Gram gota fresca
 Conocer la realización de un urocultivo y los diferentes microorganismos que pueden
estar presentes
CONTEXTUALIZACIÓN
El examen general de orina de rutina ó urianálisis es una de las primeras pruebas usadas
para la identificación de patología en las vías urinarias y es parte indispensable de la patología
clínica. Puede proporcionar una estimación de la función renal, dar información sobre las
posibles causas de disfunción e incluso puede indicar enfermedad sístémica. El examen
general de orina es un estudio cuidadoso y sistemáticos de las própiedades físicas, químicas
y microscópicas de la orina. Aunque los datos que se obtienen sólo en ocasiones ayudan a
dar un diagnóstico tentativo, al mismo tiempo sirven de guía para seleccionar pruebas más
específicas para un diagnóstico definitivo.
RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
Obtención limpia del chorro medio de orina
-La información adecuada al paciente es esencial, deben prepararse pautas para la obtención
apropiada de la muestra en una tarjeta impresa, con el procedimiento descrito y
prefentemente ilustrado para asegurar el cumplimiento por parte del paciente.
-Debe indicarse al paciente que se lave y enjuague bien las manos
-Luego que higiniece bien el área periuretral con un antiséptico suave para evitar la
contaminación.
-Indicar al paciente que se enjuague muy bien, porque el antiséptico puede ser
bacterioestático, en las mujeres se debe hacer que escurra el agua de adelante hacia atrás.
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-Una vez completada la higiene, el paciente debe retraer los labios vaginales o el glande del
pene, empezar a orinar. En cuanto cierta cantidad de orina haya limpiado la entrada uretral
obtener una muestra de orina del chorro medio de la micción, se coloca el frasco de
recolección en posición con la mano libre, sin tocar la superficie de el borde interno de la
abertura con los dedos, es importante indicar a los varones que la punta del pene no debe
tocar ninguna de las partes del frasco recolector en ningún momento.
-Cuando la muestra esté dentro del frasco, se tapa tan pronto como sea posible para evitar la
contaminación bacteriana proveniente del aire. Es indispensable no tocar la superficie intena
de la tapa. El frasco de recolección debe ser estéril.
-Llevar de inmediato al laboratorio, cuando hay que esperar más de una hora se debe
refrigerar.
ELEMENTAL Y MICROSCÓPICO DE ORINA (EMO)
Consta de tres partes:
- Macroscópico: color, aspecto, olor,
Parámetro
determinado por
la concentración
de la orina.
Dependiente
especialmente de
pigmentos
urocrómicos,
urobilina y
uroeritrina
En condiciones
referenciales, la orina
presenta un color de
amarillo pálido a ambar
oscuro.
*Blanco: Presencia de quilo ó pus.
*Amarillo/Naranja: Bilirrubina,
Urobilina, colorantes de alimentos,
derivados del caroteno.
*Rosa/Rojo: Eritrocitos, Hemoglobina,
Mioglobina, Colorantes de alimentos,
antocianinas.
El color de la orina puede
variar desde blanco hasta
castaño o negro; También
puede ser Anaranjado,
Rosa, Rojo Púrpura Azul ó
verde.
*Rojo/púrpura: Porfobilina,
porfobilinógeno, uroporfirina.
*Castaño /Negro: Bilirrubina, Fenol,
Melanina, Porfirinas.
*Azul/Verde: Biliverdinas, Complejo de
vitamina B.
- Químico: pH, densidad, leucocitos, nitritos, proteinas, glucosa, urobilinógeno, bilirrubina,
cuerpos cetónicos, sangre.
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- Microscópico: leucocitos, eritrocitos, células bajas, células altas (se reporta número por
campo en 10 campos con lentes 40x), moco, bacterias, cristales, parásitos, hongos (se
reporta por cruces en 10 campos con lentes 40x) y cilindros se reporta número por placa (con
lentes de 10x).
Células epiteliales bajas
Hematíes
GRAM GOTA FRESCA
La observación en fresco permite descartar o afirmar la presencia de bacterias, al teñirlas con
la coloración de Gram tenemos ya una orientación sobre que microorganismo puede ser el
causante de infección urinaria.
En un examen en fresco de una orina normal puede haber escasísimo número de células
epiteliales, hematíes y leucocitos.
CULTIVOS DE ORINA (Urocultivos)
Los organismos que pueden encontrarse en la orina incluyen: Escherichia coli, Proteus,
Pseudomona aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, enterococos,
Mycobacterum tuberculosis, Serratia, Klebsiella y Enterobacter.
48
Una vez recogida la muestra en las condiciones anteriormente descritas se debe proceder a
cultivar enseguida, no debe pasar más de una hora entre la recogida de la muestra y el
cultivo.
El cultivo de la muestra de orina comprenderá preferiblemente una técnica cuantitativa y otra
cualitativa.
Puesto que en la orina nos encontramos con organismos Gram positivos y negativos es
necesario realizar cultivos para ambos grupos.
Así se utilizará agar sangre para los Gram positivos (se puede añadir ácido nalidixico
colimicina para evitar crecimiento de Gram negativos) y Mc Conkey o EMB para los Gram
negativos.
El cultivo cuantitativo de la orina puede verificarse bien con una asa de 0.001ml, se utiliza
muestra no centrifugada.
El número total de bacterias encontradas por mililitro es el siguiente se cuenta cuantas
colonias crecieron y se multiplica por 1000.
Una bacteriuria infenor o igual a 10.000 gérmenes por ml se considera que no tiene
significación patológica, más allá de los 100,000 gérmenes por ml, la infección urinaria es
prácticamente segura.
Entre 10.000 y 100.000 gérmenes por ml, la repetición del examen y el contexto clínico son
indispensables para una correcta interpretación.
La presencia de 104 /ml de un solo tipo de bacilo Gram negativo es una indicación consistente
de infección de vias urinarias, en especial en varones. En algunas ocasiones en mujeres
jóvenes con disuria e infección de vías urinarias agudas tendrán 102 o 103 por mililitro.
Es importante la identificación del microorganismo causante de la infección y que el cultivo
sea puro para luego realizar un antibiograma.
Así, la interpretación de los resultados del cultivo de orina depende del método de recogida y
entrega al laboratorio, de los tipos y número de bacterias presentes y de la valoración de
estos hallazgos en relación con el cuadro clínico del paciente.
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PRUEBA DE BAAR EN ORINA
Cuando se sospecha de una infección tuberculosa del aparato urinario, deberá examinarse el
sedimento de la orina centrifugada por media hora a 3000 rpm por seis días consecutlvos. Se
recomienda la recogida de la orina matutina pero todo su volumen en recipientes estériles.
Las extensiones del sedimento se tiñen mediante la coloración de Ziehl Neelsen y se busca la
presencia de organismos ácido resistentes.
Para el reporte igual que para esputo, si se siembra esta muestra en medio de Lowenstein
Jensen se debe tratar previamente a la muestra por digestión como a la muestra de esputo.
50
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
EXPERIMENTACIÓN
1. Cada grupo de trabajo recibirá una muestra de orina para que le realicen un EMO,
Gram gota fresca y un urocultivo. Para esta actividad los estudiantes deben revisar los
procedimientos mencionados y la manera en que se deben reportar. Se evaluará el
informe durante la clase.
2. Realizar un portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma Moodle.
51
PRÁCTICA No. 7
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACILOS GRAM NEGATIVOS
OBJETIVOS:


Mediante el empleo de medios de cultivos identificar enterobacterias
Realizar la correcta interpretación de las reacciones de los medios de cultivos mediante
la intervención de enzimas y cambios de pH
1. ENSAYO DEL ROJO DE METILO (RM/VP)
Principio
El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo
fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa
en ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan
ácido pirúvico producen ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan,
en cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El
indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es útil
para la diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo
negativo).
Procedimiento y resultado:








Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.
Incubar a 35º C por un mínimo de 48 horas.
Transferir 2.5 ml de la suspensión a un tubo.
Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.
Agregar 5 gotas del indicador rojo metilo y observar si hay cambio de color.
Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas más.
52
2. ENSAYO DE VOGES-PROSKAUER
Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido pirúvico
un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como
productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el
camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y
2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos
metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un
complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de alfa-naftol antes
del agregado de KOH.
Procedimiento y resultados:






Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo de RM/VP
Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horas
Agregar unas gotas del reactivo de alfa-naftol
Agregar unas gotas del reactivo de KOH
Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos
Observar la formación de un color rosado a rojo
3.PRUEBA DE LA UREA
Principio
La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por acción de la ureasa da 2
moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza
independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de
la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del medio. Es una
actividad característica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de
Escherichia (-) y Proteus (+ rápido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de
Yersinia pestis (-)
Procedimiento y resultados

Con un asa estéril se toma abundante material y se inocula por punción
53



Se incuba a 37ºC y se efectúan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos
negativos se observan diariamente por 4 a 7 días para detectar reacciones tardías
que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados día por día.
Ensayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del
mismo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.
4. PRUEBA DEL SIM (H2S, indol, motilidad)



Determinar si la bacteria a través de Triptofanasas puede degradar el Triptófano a
indol.
Determinar si hay producción de H2S a partir de aminoácidos azufrados dando como
resultado un color negro
Determinar si la bacteria es móvil mediante la difuminación de la misma hacia los lados,
de lo contrario, la bacteria sólo crece en la línea de inoculación
Principio del Indol
El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio
rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos
aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido
para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del
aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar
de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+)de Salmonella (-).
Procedimiento y resultados
 Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular en el medio SIM.
 Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
 Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
 Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el medio y el reactivo.
 Si el ensayo es negativo no hay cambio ded c o hay un color amarillo en la
interfaseolor, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.
54
5. AGAR KLIGLER (TSI)
Principio
El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%).
Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán
de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estría permanecerá ácida
(amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que
no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán productos
alcalinos y el medio permanecerá rojo. La producción de SH2 se manifiesta por un
ennegrecimiento del medio.
Resultados
 Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, lactosa (E.
coli)
 Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente
(Shigella spp.)
 Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa)
 Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp)
 Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.)
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6. PRUEBA DE LA LISINA (CARBOXILASA-DIHIDROLASA)
Principio
La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo
carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. La decarboxilación de
lisina da cadaverina (diaminas). Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se
debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos
etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6.0),
apareciendo color amarillo. La acidificación es necesaria para que ocurra la
decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el
pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de
Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter
agglomerans (-)
Procedimiento y resultados:







Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos
Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril.
Incubar a 37ºC
Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día
Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento
Ensayo negativo: color amarillo
Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo
es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo)
7.PRUEBA DEL CITRATO
Principio
Es uno de los test del IMVIC (Indol, Rojo de metilo, Vogues-proskauer y Citrato) usado
para diferenciar enterobacterias. Hay microorganismos capaces de utilizar el citrato como
única fuente de carbono produciendo alcalinidad, se detecta en un medio de cultivo con
56
citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio
Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a
pH 7,6. Cuando el resultado es positivo el medio de cultivo se vuelve azul y cuando es
negativo se mantiene verde.
Procedimiento
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en
un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir
falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C
durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría,
acompañado o no de un viraje del indicador al azul.
Resultados
(+)Klebsiella spp , ( - ) Escherichia Coli
8. FENILALANINA DESAMINASA
Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un ácido
carboxílico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen ácido fenilpirúvico que
con Fe3Cl en solución ácida produce un color verdoso ( resultado positivo) y cuando es
negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo).
7. MALONATO
El fundamento es igual al citrato, de esta manera se puede observar si se utiliza al
malonato como fuente de carbono.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
1. Efectuar la siembra en los medios de cultivo para la identificación de bacilos Gram
negativos, partiendo de un medio Mac conkey en donde un microorganismo "x" se ha
desarrollado. Trabajo grupal, venir estudiando la práctica, se evaluará durante la
clase.
2. Realizar el portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma Moodle.
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PRÁCTICA No. 8 (PRIMERA PARTE)
COPROLÓGICO Y COPROPARASITARIO
Objetivos:
-Realizar el examen coproparasitario utilizando soluciones apropiadas
-Identificar diversos parásito causantes de infecciones
1. Obtención de la muestra para el examen coproparasitario:
-Recoja las heces directamente en un recipiente adecuado, limpio y seco, sin contaminarla
con orina, agua o cualquier material extraño proveniente del suelo (el agua o la orina pueden
destruir los trofozoitos si están presentes)
-Muestras frescas deben ser examinadas o procesadas dentro de los 30 minutos posteriores a
la recolección pues es más probable que en estas se encuentren trofozoitos mótiles. Las
muestras blandas pueden ser examinadas hasta después de 2 horas.
-Guardar a temperatura ambiente máximo por 1 a 2 horas. En refrigeración hasta por 48 horas
si no dispone de preservantes.
- Preserve las muestras tan pronto como sea posible. La muestra debe ser dividida y
guardadas en dos diferentes preservantes: formalina al 40% y PVA.
-Usando los recipientes adecuados. Añada un volumen de heces a 3 volumenes del
preservante.
-Asegúrese de que la muestra se mezcle bien con el preservante (heces formadas necesitan
ser bien desarmadas).
-Asegúrese de que el recipiente esté bien sellado. Refuerce con parafilm y otro material.
Guarde el recipiente en una funda plástica.
Observaciones:
- Ciertas drogas y compuestos pueden provocar que la muestra sea insatisfactoria para la
examinación. Las muestras deben recolectarse antes de que estas sustancias sean
administradas o después de que los efectos hayan pasado. Tales sustancias incluyen:
antiácidos, caolín, aceite mineral y otras sustancias que contengan aceites, antidiarreicos no
absorbibles, bario o bismuto (se necesitan 7 a 10 días para superar estos efectos), agentes
antimicrobianos (2 a 3 semanas) y pigmentos biliares (3 semanas).
- La recolección de la muestras deberá repetirse si la primera examinación es negativa. Si es
posible, deben examinarse 3 muestras con intervalos de 2 a 3 días.
- Al momento de recibir la muestra fíjese que esté en el recipiente adecuado y correctamente
identificada: nombre, número, edad, fecha, hora de recolección de la muestra.
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2. Examen corpológico y coproprasitario
a. Macroscópico:
Examine macroscópicamente usando un aplicador para detectar la presencia o ausencia de:
proglótides, escólex o gusanos adultos. Puede encontrar proglótides mótiles de tenias entre o
sobre las heces. Ocasionalmente puede encontrar en la superficie de las heces gusanos de
Ascaris y Enterobius.
COLOR: la dieta es el factor determinante de mayor importancia
OLOR: el olor normal de las heces no es muy desagradable y se debe al indol y al escatol
(sustancias aromáticas provenientes de la desaminación y descarboxilación del triptófano por
las bacterias). Las dietas a base de carne lo hacen más desagradable al igual que la
presencia de metano, ácido sulfhídrico y metilmercaptano; las dietas vegetarianas y leche lo
producen casi nulo.
CONSISTENCIA: normalmente la deposición debe ser sólida, formada, es decir cilíndrica y
consistente, para mantener esta forma después de excretada. Mientras mayor es el tiempo da
tránsito intestinal mayor es la firmeza de las heces en términos generales. Los niños tienden a
presentar heces fecales más blandas.
La consistencia de las heces fecales debe reportarse como: dura, pastosa, blanda,
semilíquida y liquida. La consistencia pastosa es la normal
La consistencia de las heces nos puede dar una idea del estado de vida del parásito que
buscamos, así para protozoarios intestinales: las formas quísticas serán posiblemente más
observadas en heces formadas o semiformadas, pastosas; mientras que los trofozoitos se
hallarán en heces semilíquidas y líquidas.
En el caso de los helmintos intestinales, huevos, larvas se pueden encontrar en heces fecales
de cualquier consistencia. Se puede sospechar de infección amebiana cuando las heces
fecales están Iíquidas y gaseosas.
59
MOCO: su aparición suele ser reconocida macroscópicamente. Si está mezclado con las
heces, dando un aspecto brillante, procede del intestino delgado. Moco en colon distal, moco
opaco, mezclado con células epiteliales, sangre o pus es indicativo de un proceso inflamatorio
(enteritis o colitis).
El moco también está presente en heces fecales de pacientes con infección donde se hallarán
trofozoitos.
RESTOS ALIMENTICIOS: normalmente no hay restos alimenticios macroscópicos o estos
son escasos. La digestión deficiente en algunos tramos del tubo gastrointestinal se evidencia,
en el examen coprológico, por la aparición de restos alimenticios ingeridos, siempre que el
defecto no haya sido compensado en tramos inferiores. Sin embargo señala trastornos
anteriores al colon: gástricos, pancreáticos de intestino delgado, etc.
Para el uso clínico corriente basta la observación macroscópica de las heces y el examen
microscópico de las preparaciones clásicas
En general, una aceleración global del tránsito gastrointestinal determina la presencia de
restos groseros de los alimentos en las heces (lientería) y al examen macroscópico la
aparición de esteatorrea, creatorrea y amilorrea.
SANGRE: normalmente no debe existir sangre macroscópica. Patológicamente se observa en
hemorroides, tumores de colon distal, etc.
b. Microscópico:
Para el examen microscópico se necesita de las siguientes soluciones:
Solución salina al 0,85%:
- Conserva la motilidad de los trofozoitos,
- No es buena par la identificación definitiva de ciertas especies de protozoarios intestinales
en su fase quística debido a que la estructura interna está probremente definida
- Los trofozoitos se presentan mótiles, transparentes, refráctiles y se pueden observar dentro
de ellos glóbulos rojos fagocitados.
- Los quistes aparecen redondos, contorno definido, se ven bien los cuerpos cromatoides
(refráctile
- Para huevos y larvas de helmintos intestinales también es muy útil esta solución.
Solución de lugol:
- Hace más notable la estructura interna de los parásitos intestinales.
Los quistes se tiñen rnuy bien con el lugol haciendo posible la identificación correcta de la
especie: se puede observar el número y estructura del nucleo, la cromatina toma un color café
60
oscuro, el citoplasma un color amarillo o naranja, las masas de glucógeno se tiñen de café
rojizo. Los cuerpos cromatoides son menos visibles que en solución salina
- Destruye la motilidad de los trofozoitos.
- Se observan mejor las caracterfsticas morfológicas de huevos y larvas de helmintos
intestinales.
-Facilita también la observación de los siguientes elementos:
CÉLULAS:
- La presencia de células epiteliales es indicativo de irritación gastrointestinal.
- Los eritrocitos no deben ser observados en condiciones normales. Su presencia evidencia
sangrado en la parte baja del apararato digestivo.
- Los leucocitos normalmente no se observan o son escasos. Números elevados aparecen
en las inflamaciones gastrointestinales; indican principalmente infección bacteriana. Se
pueden observar macrófagos y leucocitos en los casos de disentería amebiana crónica con
invasión bacteriana secundaria. Los eosinófilos son numerosos en la amebiasis
especialmente en la fase aguda.
- Los PMN (polimorfonucleares) pueden ser identificados por presentar forma redonda o
irregular, de 10 a 20 µ, citoplasma claro, refringente, granuloso y el núcleo escasamente
notable. Se los puede observar mejor si se añade una gota de ácido acético al 10% a la
emulsión de heces. Se debe informar en que cantidad se encuentran por campo. Si se
observan más de 10 leucocitos por campo, se hace una lámina y se colorea con Wright, se
hace el recuento diferencial y si hay mayor cantidad de neutrófilos (polimorfonucleares) la
infección es causada por bacterias, si hay mayor cantidad de mononucleares la infección es
de tipo viral.
CRISTALES:
- Oxalato de calcio, y fosfato triple: son encontrados con frecuencia y carecen de
significado clínico al igual que escasos cristales de ácidos grasos.
- Cristales de hematoidina: son agujas amarillas que se presentan en grupo o haces
después de hemorragia intestinal.
- Cristales de Charcot-Leyden: tienen forma de rombos alargados, normalmente se
encuentran en el citoplasma de los eosinófilos. Se observan ocasionalmente en las
infecciones parasitarias, especialmente en amebiasis invasora.
ALIMENTOS NO DIGERIDOS:
- Sustancias vegetales: las células vegetales se observan en varias etapas de
descomposición. Los pelos vegetales son de tamaño variable (50-300µ), truncos en un
extremo y delgados en el otro, curvos, de color amarillo pálido o transparentes.
En su interior se observa un conducto central estrecho, vacío, entre dos capas transparentes
que refractan la luz. Los pelos vegetales se asemejan a las larvas de Strongyloides.
- Sustancias animales: las fibras de carne digerida tiene un tamaño de 100-200µ, de forma
oval, rectangular, redondeada, De color amarillo o trasparente, sin gránulos ni estriaciones en
su interior. Poseen estriaciones longitudinales y transversales cuando no han sido digeridas
adecuadamente,
61
- Gránulos de almidón: pueden estar bien, parcial o no digeridos. Su tamaño va de 50-100µ,
de forma redonda u oval y contorno irregular. El almidón no digerido se torna azul, violeta o
negro si se añade lugol. En solución salina aparecen blancos o amarillo grisáceos.
- Grasas: glóbulos de grasa neutra aparecen de tamaño variable, perfectamente redondos,
contomo bien definido, uno o varios anillos que refractan la Iuz intensamente. En lugol se los
ve de color naranja, amarillo o rojo. Los ácidos grasos se observan como agujas incoloras. Se
puede usar también una tinción Sudán para su identificación.
FLORA INTESTINAL
- Levaduras: Cándida es un habitante normal del intestino humano. Aparecen de forma
redonda u oval, a menudo con brotes, de 5-8µ, conteniendo de 3 a 6 gránulos en posición
excéntrica. En solución salina se las ve con paredes gruesas y bastante refráctiles. Con lugol
aparecen de color pardo. Raras veces se observa pseudohifas o pseudomicelios. También
puede aparecer en heces fecales artrosporas, que, son otra clase de hongos, tienen forma
rectangular y citoplasma claro; éstas deben ser reportadas. Cándida puede producir
candidiasis o moniliasis intestinal especialmente después de tratamientos prolongados con
antibióticos o en pacientes inmunodeprimidos. Un número significativo de micelios, hifas o
cualquier otra clase de esporas deben ser reportados.
-Bacterias: la flora bacteriana normal constituye un tercio del peso de las heces secas.
Predominan en el adulto la flora gramnegativa especialmente el colibacilo. En los lactantes
predomina la flora grampositiva. Tanto en lugol como en solución salina solo se aprecia si se
trata de cocos y/o bacilos.
TECNICAS DE CONCENTRACIÓN DE HECES FECALES
Cuando en los montajes directos de heces fecales no se encuentran parásitos o estos son
raros se procede a concentrar la muestra
Esto hace posible:
- Examinar una mayor cantidad de muestra en menor volumen
- Detectar parásitos que se encuentran en número reducido
- Liberar los organismos de los restos fecales: bacterias, restos alimenticíos mal digeridos
Los procedimientos desarrollados son aplicables para la concentracion de huevos larvas de
helmintos y quistes de protozoarios, pero no para trofozoitos de protozoos.
Técnicas:
- Flotación
- Sedimentación
Principio:
Se basan en la diferencia de peso especlfico de los parásitos y el medio de suspención
empleado.
La flotacipn debe permitir que los organismos floten.
La sedimentación debe favorecer el asentamiento
62
PARÁSITOS
a. Nemátodos: Gusanos redondos
 Ascaris lumbricoides: Se observan huevos que miden aprox. 45-75 x 30-50
micras, presenta una célula rodeada por tres capas, producen una patología de
dolor de estómago y desnutrición.


Tricocéfalo: El huevo mide de 50-55 x 22-25 micras. Tiene la forma de balón de
fútbol americano, produce anemia intensa, dolores abdominales, prolapso rectal
ocasional.
Uncinarias: Tienen una forma elíptica, están cubiertas de una membrana lisa,
transparente y fina, mide de 60 - 40 x micras producen anemia.

Strongyloides stercolaris: Se observan larvas. Produce diarrea, vómito,
desnutrición.
 Enterobius vermiculares (Oxyurus):Los huevos son ovoides con una cara
convexa y una plana, presenta una membrana interna y delicada y otra gruesa
hialina y mamelonada, mide de 50-60 x 20-30 micras. Produce prurito en la región
perianal, insomnio, cambios de conducta
.
b. Céstodos: Gusanos planos
 Taenia solium: Los huevos miden 20-30 x 30-40 micras, son ovoides con
membrana gruesa, amarillenta que se encuentra estriada en forma de empalizada y
encierra un embrión de seis ganchos poco visibles. Produce trastornos nerviosos.
63

Hymenolepis nana : Huevos ovoides, mide aprox. 50 micras tiene una membrana
interna y una externa, también puede causar trastornos nerviosos.
c. Protozoarios: Amebas
 Entamoeba histolítica: Se observan quistes que miden aprox. 20 micras, se
observa con uno a cuatro núcleos. Pueden causar lesión de la mucosa intestinal.

Entamoeba coli: Son quistes más grandes que los de histolítica, tiene más de
cuatro núcleos. Es considerada como no patógena.

Endolimax nana: Los quistes son ovalados miden de 6 - 10 micras presentan de
uno a cuatro núcleos.
Iodamoeba bütschlii: Su quiste se caracteriza por la presencia de una vacuola de
yodo, no es una ameba patógena.

64

Gardia lamblia: Es una ameba en forma de pera simétricamente lateral, con un
extremo ancho y redondeado, el quiste presenta cuatro núcleos y dos cuerpos
parabasales, produce una diarrea amarillenta y vómito.
d. Tremátodos : Forma de hoja plana

Fasciola hepática: Daño en hígado . quistes.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
Recolectar las evidencias de la práctica y adjuntarlo al portafolio de la segunda parte.
65
PRÁCTICA No. 8 (SEGUNDA PARTE)
EXÁMENES EN HECES FECALES
OBJETIVOS:
-Conocer y poner en práctica diversas pruebas químicas en heces fecalesque ayudan a
diagnosticar enfermedades de origen gastrointestinal
-Realizar siembras y coloraciones en heces fecales sospechosas de microorganimos
bacterianos infecciosos
ANALISIS QUÍMICOS
Reacción química, pH: Las heces normales son neutras o ligeramente alcalinas, pero esto
depende de múltiples factores: dietéticos, endógenos, etc. por lo que las variaciones tanto en
la salud como en la enfermedad son irregulares y de escaso valor clínico. Para su medición
se emplea una tira de papel indicador universal. Sobre el cual se aplica una pequeña cantidad
de material fecal. Se espera unos minutros y se compara con la escala de colores.
Azúcares reductores: tienen importancia en diarreas de infantes, especialmente si padecen
intolerancia o mala absorción de carbohidratos. Para su examinación se utiliza pastillas
Clinitest, las cuales reaccionan con cualquier sustancia reductora de las heces como glucosa,
lactosa, sacarosa, maltosa, etc.
Pigmentos biliares: en el examen coprológico de un individuo sano no debe encontrarse
bilirrubina ni biliverdina. La presencia de estos puede deberse a tránsito o ictericia hemolltica.
La ausencia de estercobilina y estercobilinógeno (no hay pigmentos biliares en la luz
intestinal) indica una ictericia obstructiva con heces acólicas.
Grasas: la presencia de un exceso de grasas (esteatorrea) en las deposiciones obedece a
mecanismos tales como tránsito acelerado, déficit enzimático, hipersecreción endógena.
Pueden estar presentes las grasas neutras sin desdoblar o los ácidos grasos y jabones.
Se realiza tinciones con Sudán lll o lV para cualificarlas. También se realiza dosificación de
grasas. Se considera patológica la materia fecal que contiene una cantidad total de grasas por
encima del 30%.
66
Rotavirus: Los rotavirus del grupo A constituyen la principal causa de gastroenteritis grave en
niños de todo el mundo. Producen unos 125 millones de infecciones cada año en los países
en desarrollo y son causa de más de 800.000 fallecimientos anuales. Las infecciones
humanas son producidas principalmente por rotavirus del grupo A y, en menor medida, o con
otras características epidemiológicas, por los grupos B y C.
Sangre oculta: el examen químico de sangre en las deposiciones tiene interés cuando se
sospecha de la existencia de hemorragias digestivas subclínicas, es decir, sin que se avisen
visiblemente en forma de melenas, las causas pueden ser neoplásicas o inflamatorias. Por
ejemplo en la parasitosis por anquilostoma o tenias.
La pérdia de 50 - 75 ml sangre (tubo gastrointestinal superior) provoca una coloración roja
oscura, negra de las heces (melena). Una hemorragia de 2 a 3 días ocasiona pérdidas de más
de 1000 ml de sangre. La sangre oculta puede persistir hasta 5 a 12 días. Heces de un color
rojizo brillante se presentan por pérdidas más leves (tubo gastrointestinal bajo). Se debe
además descartar una coloración anormal de las heces causada por colorantes de alimentos.
Causas de hemorragia gastro-intestinal:
Pruebas para la detección de sangre oculta en las heces:
Principio: determinan la actividad de la peroxidasa y seudoperoxidasa en los
hematíes incluida la hemoglobina.
lndicadores: guayaco (menos sensible), ortotoluidina, ortodinisidina y bencidina.
Muestra Fecal con peroxidasa o seudoperoxidasa presentes en los hematíes + H202
Resultado:
Indicadores oxidado (compuesto de quinona) de color azul ( en el caso dei
guayaco); o en función del reactivo.
La intensidad del color en la prueba depende de:
- actividad enzimática de la hemoglobina u otras peroxidasas,
- presencia de otro material colorante,
- presencia o ausencia de inhibidor
- sensibilidad del material de la prueba
La pérdida normal de sangre va de 2 a 2.5 ml diariamente en el tubo gastrointestinal,
Ánte una pérdida mayor (5 a 10 ml de sangre diariamente) se necesita una prueba.
67
Causas para el aparecimiento de falsos positivos y falsos negativos son:
- la mioglobina y hemoglobina de la carne y el pescado ingeridos tienen actividad de la
peroxidasa.
- fármacos como la aspirina y el hierro incrementan las hemorragias del tubo gastrointestinal.
- las bacterias de los intestinos, las verduras y las frutas digeridas como lo rábanos, los nabos,
los plátanos, la uva negra, las peras, las ciruelas, tanhbién contienen peroxidasa
- la vitamina C y otros antioxidantes puede suprimir la actividad de la peroxidasa y dar un
resultado falsamente negativo.
DETERMINACIÓN DE PMN EN HECES FECALES
Leucocitos fecales suelen encontrarse en las infecciones bacterianas del intestino provocadas
por microorganismos como:
- Salmonella spp.
- Shigella spp.
- Yersinia spp.
- Escherichia coli invasiva
Así como por procesos inflamatorios no bacterianos como:
- Colitis ulcerosa
- Colitis asociada a antibióticos
En las heces de la diarrea secundaria a virus, bacterias toxínicas y parásitos no suelen
encontrarse leucocitos fecales.
Técnica para la detección de PMN:
MUESTRA: Heces fecales frescas
Preparación del frotis:
- Realice un frotis delgado con la porción más representativa, de preferencia las áreas donde
esté presente moco.
- Deje secar al aire
- Técnica de tinción:
- Cubra el portaobjetos con colorante Wrigth y deje 3 minutos.
- Coloque agua corriente, sople suavemente sobre el colorante y deje 3 minutos más.
- Deseche el colorante y lave.
- Deje secar y observe con lente de 100x y aceite de inmersión.
Observación:
- Realice una observación sistemática de varios campos hasta obtener 100 células
- Mientras cuenta las 100 células debe diferenciar las clases de células blancas.
Resultados:
La morfología y propiedades de tincilón de los PMN en esta muestra son los mismos que los
estudiados en Hematología, la diferencia es que se los observa más pequeños.
68
Reporte:
- Si hay variedad de leucocitos se reporta como % de PMN (diferencial)
lnterpretación:
Mayor cantidad de neutrófilos: infección bacteriana
Mayor cantidad de mononucleares: infección viral
PMN
Neutrófilos
Mononucleares
Linfocitos y Monocitos
COPROCULTIVO
Obténgase la muestra de una evacuación, tracto rectal o escobillado anal.
Suspéndase una pequeña cantidad en caldo GN (enriquecimiento para Salmonella y
Shiguella) y un medio diferencial para bacterias que no fermenten la lactosa (EMB ó
Macconkey), las no fermentadoras son las patógenas, Hektoen Agar e identificación de las
colonias aisladas con una bioquímica o APl.
Para la determinación de bacterias específicas como Campylobacter se siembra en medios
específicos para estas bacterias.
Medio de transporte: Cary Blair
Caldo GN
Agar Mac conkey
coconkeyconkey
Agar entéri:o Hektoen
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
Colocar en el portafolio la primera parte de la práctica y adjuntar reportes de exámenes de
heces fecales: Coprocultivo, PMN, sangre oculta y pH, incluir reflexiones.
69
PRÁCTICA No. 9
ESPUTO
OBJETIVOS:
-Obtener muestras de esputo válidas que provengan del sistema respiratorio inferior
-Detectar diferentes microorganismos que pueden causar infecciones en las vías respiratorias
bajas mediante el análisis del esputo utilizando diversas técnicas microbiológicas
CONTEXTUALIZACIÓN
En las condiciones habituales de la clínica diaria, no es una muestra representativa de la
situación existente en el tracto respiratorio inferior por su mezcla con secreciones procedentes
de todo el árbol traqueo-bronquial y con la flora saprófita de la orofaringe. No obstante es un
método fácil y rápido cuya utilidad o relación entre resultado obtenido y verdadera etiología
depende en gran medida de su correcta obtención, control de calidad antes de iniciar su
procesamiento, tipo de agente que se pretenda detectar y valoración adecuada del resultado.
El análisis del esputo es una herramienta básica, útil y comúnmente utilizada en el campo de
la Medicina debido a que la técnica de obtención de la muestra es relativamente sencilla y
segura. Permite el estudio, diagnóstico y seguimiento de múltiples enfermedades de tipo
inflamatorio, infeccioso y/o tumoral, tanto pulmonares como sistémicas que cursen con
afectación pulmonar.
TÉCNICA PARA LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Material necesario:
- Frasco estéril de boca ancha y hermético.
- Suero fisiológico estéril y nebulizador.
Técnica:
-Enjuagar la boca con agua destilada estéril o solución salina.
-Obtener el esputo tras una expectoración profunda, preferentemente matinal.
-De no producirse expectoración espontánea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones
de suero fisiológico estéril (15 ml durante 10 minutos), siendo útil además realizar un drenaje
postural o fisioterapia respiratoria.
70
-Volumen de muestra requerido: de 2 a 10 Ml
Transporte y conservación:
Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si esto no es posible, conservar en
frigorífico a 4°C.
Observaciones:
- Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibiótico.
- No es útil para anaerobios.
- No son inoculables las secreciones de sospechosa procedencia
- La expectoración debe rechazarse hasta obtener un esputo de calidad suficiente (más de 25
leucocitos polimorfonucleares y menos de 10 células epiteliales por campo 10x).
EXAMENES
a) Examen macroscópico:
La descripción del esputo o de las secreciones producidas con la tos debe comprender
el color, la consistencia, aspecto, el olor entre otros, así:

Consistencia y aspecto: el esputo puede describirse como líquido (seroso) mucoide,
purulento, sanguinolento o en cualquier combinación de dichas posibilidades.
71




Aspecto normal: el esputo es de aspecto claro y acuoso y cualquier opacidad procede
de material celular en suspensión.
Color: el color del esputo está determinado por las sustancias que contiene y con
frecuencia puede indicar el proceso patológico.
Olor: en los esputos normales y patológicos no se detecta ningún olor, pero si se ha
producido una descomposición microbiana tanto dentro de cuerpo como después de la
expectoración pueden presentarse diversos olores.
Observaciones diversas: masas caseosas, masas bronquiales, broncolitos, tapones de
Dittrich, cuerpos extraños y parásitos.
Este análisis nos ayuda a tener un diagnóstico previo de lo que podría tener el paciente,
por ejemplo, los esputos muy abundantes y purulentos sugieren un absceso pulmonar o
una bronquiectasia; los esputos sanguinolentos, sangrado (hemoptisis); los esputos
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espumosos y teñidos de sangre, edema pulmonar; los esputos abundantes y mucinosos,
carcinoma de células alveolares.
b) Examen microscópico:
Tómense porciones de moco, pus, material caseoso. Examínese en forma de preparación
húmeda y frotis coloreado.

Sin teñir (preparación húmeda): La presencia de unas cuantas células epiteliales
escamosas indica una mezcla profusa de la saliva y las mucosidades nasofaríngeas.
Tales muestras no reflejan procesos bronquiales o pulmonares y se deben rechazar
para luego solicitar al paciente una nueva muestra tomada en forma adecuada y que no
sea rechazada. Luego de que la muestra es acepatada búsquense hongos, parásitos,
masas de piocitos, eritrocitos, glóbulos grasos, fibras elásticas (índice de destrucción
pulmonar), diferentes tipos de células de descamación.

Muestra coloreada: Hágase tinción de Gram para determinar bacterias dominantes,
tinción de Kinyoun o de Ziehl-Neelsen para determinar la presencia de bacilos alcohol
ácido resistentes, la tinción de Wright para eosinófilos en el asma bronquial y para
histoplasma.
c) Siembra en medios de cultivos:
 Para cultivos rutinarios bacterianos realizarlo en placas de agar sangre, en otros
medios seleccionados como MacConkey agar y caldo de tioglicolato.
 Si se sospecha una micosis, hágase cultivo en condiciones anaeróbicas sobre placas
de agar sangre y medio de Sabouraud. Los enfermos bajo tratamiento con antibióticos,
frecuentemente presentan un gran número de levaduras en el esputo. Candida y
Aspergillus pueden ser importantes en pacientes en estado de inmunodepresión.
 Cultivo para bacilo Tubercuiloso (Lowenstein Jensen)
 Puede requerirse de cultivos especiales para Mycoplasma, virus, etc,
 Los cultivos anaerobios para padecimientos como absceso pulmonar y neumonía por
aspiración son importantes.
 En los niños se deberá hacer cultivo de materiales tomados directamente de la faringe,
ya que frecuentemente es imposible obtener el esputo. Este procedimiento puede dar
información sobre la flora pulmonar. Si se encuentra colocado un tubo endotraqueal se
deberá cultivar el material aspirado.
d) Estudio citológico de las células del esputo: tinción de Papanicolaou o Giemsa
PROCESOS CLÍNICOS EN QUE EL MÉDICO NECESITA UN EXAMEN DE ESPUTO
Enfermedades
Bronquitis: Es una inflamación de las vías aéreas bajas. Sucede cuando la tráquea y los
bronquios, situados entre los pulmones, se inflama a causa de una infección o por alguna
otra causa. La bronquitis aguda generalmente sigue a una infección respiratoria viral. La
bronquitis crónica es una afección prolongada. Las personas tienen tos que produce moco
73
excesivo.
Tuberculosis pulmonar: Es una enfermedad infecciosa, causada por Mycobacterium
tuberculosis. Infecciones ocasionadas por micobacterias atípicas (bacilos tuberculoides)
tales como: M. Kansasii, M. marinum, M. flavescens, M. gordonae, M. obuense.
Neumonía bacteriana: Pulmonía o neumonitis es una enfermedad inflamatoria de los
pulmones. La neumonía puede afectar a un lóbulo pulmonar completo (neumonía lobular), a
un segmento de lóbulo, a los alvéolos próximos a los bronquios (bronconeumonía) o al tejido
intersticial (neumonía intersticial). La neumonía bacteriana es una infección de los pulmones
causada por bacterias. El Streptococcus pneumoniae, un organismo Gram positivo que a
menudo coloniza la garganta, es la bacteria que con más frecuencia causa neumonía en
todos los grupos de edad excepto en recién nacidos. Otra causa importante de neumonía por
bacterias Gram positivas es la causada por el Staphylococcus aureus. También ocasionan
neumonía bacterias del género Pseudomonas (bacilos Gram negativos), Klebsiella (bacilos
Gram negativos), Haemophilus influenza (cocobacilo Gram negativo).
Neumonía viral: Es una inflamación (irritación e hinchazón) de los pulmones causada por
una infección con un virus que puede ser influenza, parainfluenza, adenovirus, rinovirus,
virus del herpes simple, virus sincicial respiratorio, hantavirus y citomegalovirus.
Neumonía atípica: Se refiere a la neumonía causada por ciertas bacterias a saber:
Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae y Chamydophila pneumoniae.
Enfermedades pulmonares parasitarias: Se producen más comúnmente por un nemátodo
como el Strongyloides stercoralis o el Ascaris lumbricoides. También están enfermedades
pulmonares causadas por parásitos trematodos como el Paragonimus westermani.
Fibrosis quística (FQ): Es una enfermedad hereditaria frecuente que afecta al organismo
en forma generalizada, causando discapacidad progresiva y muerte prematura.
Neoplasias pulmonares: Tumores o cánceres del pulmón. Se atribuye al hábito de fumar,
asbesto, derivados del carbón, radiaciones ionizantes, óxido de hierro, gas mostaza, níquel,
petróleo, uranio y cloruro de vinilo.
Asma bronquial: Es una enfermedad en la que se inflaman los bronquios, lo que produce
obstrucción de las vías aéreas, marcada por ataques recurrentes de disnea paroxística, con
producción de silbido debido a la contracción espasmódica de los bronquios.
Esputo: mucoide viscoso generalmente presenta eosinofilia.
Neumoconiosis: Condición caracterizada por la deposición permanente de cantidades
sustanciales de partículas de materia en los pulmones, generalmente de origen ocupacional
o ambiental, y por la reacción tisular a su presencia. Como por ejemplo al inhalar polvo de
piedras, arenas o pedernales que contienen bióxido de silicio, con formación de cambios
fibróticos nodulares generalizados en ambos pulmones.
Neumonía por hongos: Infecciones con hongos del género Aspergillus, Pneumocistis,
Blastoyces dermatitidis, Coccidioides immitis (generalmente se presenta en pacientes con
SIDA), Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum. La infección ocasionada por el
Histoplasma capsulatum, está considerada una de las principales micosis endémicas del
continente americano.
Neumonía por aspiración: Tipo de neumonía que se produce por la aspiración de
alimentos, de líquidos, o del contenido gástrico en el tracto respiratorio superior.
Absceso pulmonar: Es la inflamación de los pulmones y de las vías respiratorias que llevan
a ellos (bronquios) debido a la inhalación de materiales extraños.
74
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN:
- Se realizará el examen macroscópico de la muestra y se observará una preparación
húmeda para rechazar o aceptar la muestra de esputo.
- Examen microscópico: Montaje húmedo directo y con KOH (para visualizar hongos),
GRAM y BAAR .
- Realizar el portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma.
75
PRÁCTICA No. 10
MALARIA O PALUDISMO
CONTEXTUALIZACIÓN
Los parásitos causantes de la malaria o paludismo son protozoarios esporózoarios del género
Plasmodium. Las dos especies que existen en el Ecuador, en las zonas tropicales y
subtropicales son Plasmodium vivax y Plasmodium falciplarum.
Se transmiten por la picadura de un vector, el mosquito del género Anopheles.
DIAGNOSTICO POR LABORATORIO
Cllnicamente la malaria puede confundirse con otras enfermedades febriles. Si el paciente ha
tomado drogas antipalúdicas que no curaron su malaria, el diagnóstico se hace diffcil.
El diagnóstico principal se hace por la búsqueda de parásitos circulantes, aunque a veces se
recomienda mejor realizar la prueba luego del paroxismo febril, para poder localizar los
trofozoitos jóvenes.
El examen se hace por frotis de gota gruesa teñidos con Giemsa, o por frotis extendidos
teñidos con Wright y Giemsa. También existen pruebas para la detección del antígeno del
parásito y reacciones inmunológicas para demostrar la presencia de anticuerpos.
En la sangre circulante se pueden encontrar todas las formas del ciclo eritrocito (merozoitos,
trofozoitos o formas anilladas, esquizontes), incluso a veces los gametocitos, a excepción de
los esquizontes de Plasmodium falciparum.
El recuento de parásitos es importante para determinar el grado de infeccion, seguir la
evolución del paciente, para el pronóstico y para la evaluación de la eficacia del tratamiento.
Gota gruesa
Es más eficaz que el extendido, pues permite visualizar mayor numero de parásitos, por la
mayor cantidad de sangre que se estudia en cada campo microscópico. Es necesario lisar los
eritrocitos para permitir la visualización de los parásitos.
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Frotis extendido
Facilita la observación del detalle mor'fológico de los parásitos y su relación con los entrocitos,
por lo tanto permite confirmar la especie con mayor certeza.
MUESTRAS
Se puede utilizar sangre totalobtenida en un tubo que contenga EDTA. Muchas veces resulta
conveniente también tornar una muestra capilar para realizar los frotis. No se recomienda usar
sangre con heparina o con citrato de sodio.
COLORACION DE GIEMSA
Fundamento: Los parásitos causantes der patudismo se encuentran en la sangre; una parte
de su evotución ocurre en el interior de los glóbulos rojos. Estos parásitos se detectan en
extensiones sanguíneas teñidas con los colorantes de Giemsa.
Preparación de las extensiones sanguíneas
-Cuando se debe obtener la muestra.- Por lo general los parásitos son más numerosos en la
sngre al final de un ataque de fiebre. La recolección de sangre se debe hacer invariablemente
antes de que se administren medicamentos antipalúdicos.
- Preparar un frotis sanguíneo para un examen minucioso por especies
- Preparar una gota gruesa para detección de los parásitos
- No se recomienda conservar los frotis sin tinción durante más de 4 días.
Tinción
Antes de teñirlas fijense las extensiones solo con metanol (2 a 3 minutos). Evítese que este
alcohol toque las gotas gruesas.
1. Haga una dilución delcolorante de giemsa 1:10 con agua amortiguada,
2. Coloque los portaobjetos en una bandeja de tinción y cúbralos con el colorante diluido.
3. Deje reposar por 30 minutos.
4. Lave la tinción con agua amortiguada.
5. Escurra el agua y deje secar el frotis
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DEL PARÁSITO:
77
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACION



Realizar frotis extendidos y de gota gruesa y teñirlos
Observar placas positivas al microscopio con el lente de inmersión
Realizar el portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma Moodle.
78
PRÁCTICA No. 11
INFECCIONES DE TRANSMISIÓN SEXUAL
CONTEXTUALIZACIÓN
La importancia de este tipo de infecciones es cada vez mayor, pues su incidencia va cada vez
en aumento. Varios son los factores que intervienen: aumento de densidad y movilidad de las
poblaciones, dificultad para lograr cambios en la inadecuada conducta sexual de las personas.
Además se debe tomar en cuenta que para la mayoría de estas infecciones no existen
todavía vacunas disponibles.
Cuando se sospecha clínicamente de una infección de transmisíón sexual (lTS) se hacen
pruebas específicas para confirmar el diagnóstico. Estas pueden consistir en análisis de
sangre, orina, estudios del flujo vaginal o del líquido seminal, y pruebas inmunológicas. Un
aspecto muy importante en el diagnóstico es recordar que se pueden producir infecciones
múltiples.
CLASIFICACIÓN DE LAS I.T.S
De acuerdo a su característica clínica, a su forma de presentación (infección o enfermedad
infecciosa) y al microorganismo que las producen, las ITS se clasifican en:
1. ENFERMEDADES QUE CURSAN CON EXUDADO GENITAL:
- Neisseria gonorrhoeae (gononea)
- Chlamypia trachomatis, serotipos D-K (uretritis)
- Ureaplasma urealyticum (uretritis)
- Candida spp. (Vaginitis, infecciones del prepucio, e IVU)
- Trichomonas vaginalis (vaginitis, uretritis)
- Gardnerella vaginalis (Vaginosis bacteriana)
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OTROS: Staphylococcus aureus
2. ENFERMEDADES QUE CURSAN CON TUMORACIONES Y/O ULCERACIONES
GENITALES:
- Treponema pallidum (sífilis)
- Haemophilus ducreyi (chancro blando)
- Chlamydia trachomatis, serotipos L 1, L2, L3 (linfogranuloma venéreo)
- Calymniatobacteriu m g ranu lomatis (granuloma inguinal)
- Sarcoptes scabiei y Phtirus pubis (ectoparásitos).
- HPV (papiloma y cáncer cervicat), HSV 1 y 2 (hárpes genitat), EBV (Mononuóleosis
infecciosa)
3. INFECCIONES CON SINTOMATOLOGíA VARIADA O CON LARGOS PERiODOS
ASINTOMÁTICOS:
HAV, HBV, HCV (hepatitis)
CMV, HVZ, HIV (SIDA)
DIAGNÓSTICO POR LABORATORIO
De acuerdo a estos grupos de clasificación, el diagnóstico se realiza con los siguientes
métodos:
GRUPO 1: métodos propios, muchas veces el éxito o fracaso der estudio recae en la
experiencia del microbiólogo
GRUPO 2: diagnóstico clínico primario, confirmación por técnicas parasitarias, bacterianas y
pruebas serológicas (inmunológicas)
GRUPO 3: pruebas inmunológicas
Neisseria gonorrhoeae (gonococo)
Son diplococos GRAM (-), semejando granos de café, en frotis directo, se los obserya dentro
de leucocitos, para crecer necesitan medios de cultivo enriquecidos: agar sangre, chocolate,
Thayer-Martin. Necesitan atmósferas de CO2 del 5 al 10%.
Las colonias son pequeñas, grises, suaves, no producen hemólisis en agar sangre. Se las
reconoce por ser oxidasa (+) y fermentar glucosa.
El gonococo es el agente causal de la gonorrea (enfermedad venérea), puede producir
uretritis, prostatitis, epididimitis, cervicitis, salpingitis, faringitis, vulvo-vaginitis en niñas,
ceguera en el RN e infecciones en articulaciones. El humano es el único huésped natural del
gonococo.
80
Ureaplasma urealyticum
Puede ser responsable de uretritis no gonococcicas en varones.
Son difíciles de aislar, requiere de medios de cultivo especiales. Las colonias tienen
apariencia de huevos fritos, muy pequeñas.
Cultivos: caldos de peptona con infusión de corazón y 2% de agar (pH7.8), 7% de líquido
ascítico humano o de suero de animal (caballo o conejo), 37°C por 48 a 96 horas.
Muestras: Hisopos rectales, secreciones uretrales o genitales.
El diagnóstico puede también ser serológico.
Cándida albicans
Es una levadura oval que produce un seudomicelio en cultivo, en los tejidos y exudados. Son
Gram positivas. En agar Sabouraud crecen colonias blandas color cremoso.
Puede causar vulvovaginitis, con irritación, prurito y secreción.
Muestras: raspados, exudados
Pruebas: Gram y cultivos en medios comunes o Agar de Nickerson.
81
Trichomonas vaginalis
Es un parásito protozoario mastigophoro (flagelado). Tiene forma de pera, con una membrana
ondulante alineada, posee un flagelo posterior recto y 4 flagelos anteriores.
Se la puede observar en ftotis directos de secreciones vaginales.
Muestras: secreciones uretrales y vaginares, los frotis se los puede teñir con hematoxilina,
Wright-Giemsa o tiñción de Gram.
Gardnerella vaginalis
Se lo aísla de mujeres que sufren vaginitis, sepsis neonatal, bacteremia post partum, y de
hombre con uretritis no específica.
En los frotis húmedos produce “células indicadoras” (células guía o clue cells), que son células
epitetiates vaginales con muchos bastoncillos minúsculos. Se ha comprobado que estas
bacterias no requieren ningún factor especial de crecimiento y se los observa como
cocobacilos gram negativos. Las colonias son pequeñas grises, beta hemolíticas.
Una prueba rápida de su presencia es colocar unas gotas de KOH al 10% en preparaoiones
en fresco de secreciones vaginales; es característico encontrar un olor a pescado por la
presencia de aminas.
82
Treponerrna pallidum
Son espiroquetas muy mótiles, no se le puede cultivar in vitro.
Se puede hacer la observación directa en microscopio de campo oscuro en líquidos tisulares
exprimidos de las lesiones superficiales tempranas.
El diagnóstico se lo hace en base a pruebas serológicas: tesis no treponémicos para
screening: VDRL o su variante, el RPR. EI test confirmatorio es el FTA-Abs (prueba
Treponémica)
Haemophilus ducreyi
Causa la enfermedad venérea “chancroide" (chancro blando), que es una úlcera desgarrada
de los genitales.
Son cocobacilos Gram-negativos- pequeños, dificiles de cultivar, puesto que requieren del
llamado factor X, crece mejor a partir de raspados de la base de la úlcera sembradas en agar
chocolate con 1% de isovitalex vancomicina (3g/ml).
Se incuba en atmósferáde CO2 al 10%, a 37°C.
Chlamydia trachomatis
Son bacterias parásitas intracelulares estrictias, no mótiles. Gram negativas.
83
lntracelularmente forman inclusiones (micro cotonias). Son metabólicamente muy activas, Se
colorean bien con Giemsa
Producen linfogranuloma venéreo (serotipos L1, L2 y L3), que se caracteriza por adenitis
inguinal supurativa, o uretritis inespecífica (serotipos-k).
Para su diagnostico se necesitan técnicas especiales como cultivos celulares, que son
técnicas complejas y poco utilizadas de forma rutinaria, por lo que se prefiere el diagnóstico
inmunológico para encontrar anticuerpos séricos. También existen pruebas para detectar el
antÍgeno en orina o en secreción vaginal.
Calymatobacterium granulomatis
Caúsa de la enfermédad venérea'"granuloma inguinale", caracterizada por la presencia de
hinchazones en los genitales, nalgas y abdomen con lesiones granulornatosas que pueden
ser ulcerativas o sangrantes.
Es un bacilo Gram negativo, no mótil, pleomórfico, con extremos redondeados, que se colorea
bipolarmente y aparece como "imperdibles".
Difícil de cultivar, Requrere de bajas tensiones de oxfgeno. Se pueden utilizar embriones de
pollo de 5 días y se desarrolla después de las 72 horas a 35°C.
Hérpes virus 1
El HSV-2 causa el herpes genital. El herpes genital primario puede ser grave y durar largo
tiempo. Produce lesiones vesículo-ulcerativas en el pene del varón o cuello, vulva, vagina y
periné en la mujer. Las lesiones son dolorosas y se acompañan de fiebre, malestar general y
linfadenopatía inguinal.
El diagnóstico del laboratorio se realiza por aislamiento del virus de las lesiones, pero más
prácticos resultan los tests inmunológicos.
HAV, HBV y HCV
Son los virus de la hepatitis. El HAV se transmite por vla oral-fecal y los otros dos por contacto
sexual o por vfa parenteral. El diagnóstico se realiza por pruebas inmunológicas.
VIH
Pertenece a los retrovirus. La enfermedad (SIDA) se caracteriza por una, depresión del
sistema immunitario y por desarrollo de neoplasias poco comunes como el Sarcoma de
Kaposiy por otras infecciones oportunistas graves.
El diagnóstico de laboratorio se hace por aislamiento del virus por PCR, conteo de linfocitos
CD4 de sangre periférica, médula ósea o plasma. Las pruebas inmunológicas con suero del
paciente por ELISA (test de screening) y la confirmacrón por la técnica de Western-Blot.
84
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN



Observar placas en el microscopio e identificar varios microorganismos productores
de ITS, tomando las respectivas fotos para que puedan realizar las reflexiones dentro
del informe, además incluir fotos del color y aspecto secreciones vaginales de acuerdo
al agente etiológico (mirar cuadro de clasificación de ITS grupo 1).
Realizar un cuadro con los microorganismos presentes en la clasificación (grupo 1, 2 y
3) en el que se colocarán las diferentes técnicas de identificación que tiene cada
microorganismo para ser detectados.
Realizar el portafolio de la práctica y subirla a la plataforma Moodle.
85
PRACTICA No. 12
TÉCNICAS BÁSICAS DE INMUNOLOGÍA
Objetivos:


Realizar varias pruebas inmunológicas que permitan comprender el fundamento de
las reacciones basadas en la unión antígeno-anticuerpo para identificar diferentes
microorganismos infecciosos.
Desarrollar destrezas metodológicas de laboratorio que ayuden a efectuar este tipo de
pruebas.
CONTEXTUALIZACIÓN
Las reacciones de antígeno y anticuerpo son muy específicas. Un antígeno reaccionará sólo
con el anticuerpo estimulado por antígenos de su propia clase o muy relacionados. Debido a
su elevada especificidad, las reacciones entre un antígeno y un anticuerpo pueden usarse
para identificar uno por medio del otro.
Esta especificidad es la base de las reacciones serológicas. Las posibles reacciones cruzadas
entre antígenos relacionados pueden limitar la especificidad de la prueba.
Las reacciones de antígenos con anticuerpos se utilizan para identificar componentes
específicos en mezclas. Los microorganismos y otras células poseen diversos antígenos, y
por tanto, pueden reaccionar con numerosos anticuerpos diferentes.
Antígeno: sustancia que reacciona con anticuerpos o receptores de células T, despertadas por
inmunógenos.
Anticuerpo: Proteína producida a causa de la introducción de un antígeno, y que tiene la
capacidad de combinarse con el antígeno que estimuló su producción.
86
REACCIONES ANTÍGENO ANTICUERPO EN EL LABORATORIO
Los diferentes tipos de reacciones de antígenos con anticuerpos utilizan la ventaja de las
distintas características físicas o biológicas de sus reactantes y de acuerdo con ellas, se
escogen las más adecuadas con fines de diagnóstico.
Aglutinación: el antígeno es particulado (por ejemplo bacterias, eritrocitos) o está
recubriendo partículas inertes de látex. El anticuerpo une a las partículas en forma
entrelazada y las agrupa (aglutinina). Esta prueba puede hacerse en un tubo o por gotas en
un portaobjetos. Cuando se usan eritrocitos se llama hemaglutinación
Precipitación: en las reacciones de precipitación (precipitina), el antígeno esta en solución. El
anticuerpo entrelaza las moléculas de antígeno en proporciones y agregados variables
(precipitados). Las reacciones de precipitación pueden efectuarse en soluciones o en un
medio semisólido (agar).
Radioinmunoanálisis (RIA): este método cuantifica antígeno que pueden ser marcados con
radioactividad. Se basa en la competencia por el anticuerpo específico entre una
concentración conocida de material marcado y una concentración desconocida de material no
marcado. Más adelante los complejos que se forman entre antígeno y anticuerpo pueden
separarse y la cantidad de radiactividad se mide.
87
Análisis inmunosorbente con enzima enlazada (ELlSA): Este método tiene numerosas
variantes depende de la conjugación de una enzima o un antígeno o un anticuerpo. La enzima
se detecta por análisis de su actividad con su sustrato.
Para medir antígenos, anticuerpos conocidos se fijan a una fase sólida, se incuba con
diluciones del suero problema, se lava e incuba de nuevo con una anti- inmunoglobulina
marcada con una enzima. La actividad enzimática medida por adición del sustrato específico
con desarrollo de color es una función directa de la cantidad de anticuerpo unido.
lnmunofluorescencia: Colorantes fluorescentes pueden unirse por covalencia a moléculas
de anticuerpo y hacerse visibles con ayuda de luz ultravioleta en el microscopio de
fluorescencia. Este anticuerpo, marcado puede usarse para identificar antígenos por ejemplo
en la superficie de bacterias como estreptococos, treponemas o en células en cortes
histológicos u otro tipo de muestras.
88
Fijación de complemento: El sistema de complemento está constituido por 20 o más
proteínas plasmáticas que interactúan entre si y con las membranas celulares. Cada
componente proteínico debe ser activado en secuencia, en condiciones apropiadas para que
la reacción progrese. Los complejos de antígenos con anticuerpos se cuentan entre los
activadores y la prueba de fijación del complemento puede usarse para identificar a uno de
ellos si el otro se conoce.
Pruebas de hemaglutinación: ciertos virus aglutinan los eritrocitos de algunas especies
(hemaglutinación activa). Esta acción puede ser inhibida por anticuerpo dirigido en forma
específica contra el virus (es decir inhibición de la hemaglutinación) efecto que puede usarse
para medir la presencia y concentración de ese anticuerpo.
Inmunocromatografía: La prueba es un inmunoensayo que emplea reactivos únicos para la
detección rápida y segura de anticuerpos contra el VIH-1 y el VIH-2 en suero y plasma
humanos sin instrumental. Las proteínas recombinantes que representan las regiones
inmunodominantes de las proteínas envoltura y gag de VIH-1 y VIH-2 son inmovilizadas en la
región de Prueba de la tira de nitrocelulosa y un agente bioquímico que reconoce anticuerpos
humanos dispersados en la región de control de la tira. Las proteínas de VIH-1 y VIH-2,
unidas a oro coloidal, son impreganadas por debajo de la región de Prueba del dispositivo.
Una banda estrecha de la membrana es también sensibilizada como región de control.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN

Realizar la punción venosa mediante la técnica al vacío.
89


Efectuar varias pruebas inmunológicas tales como: ASTO, VDRL, HIV y observar sus
resultados.
Realizar el portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma Moodle.
90
MICOSIS
La Micologia es el estudio de los hongos. Un hongo es un protista eucariótico (posee un
núcleo verdadero), que está caracterizado por la ausencia de clorofila y por la presencia de
quitina en la pared celular. La estructura básica puede ser filamentosa: mohos y setas o
unicelular,levaduras.
Hay alrededor de 100.000 especies de hongos de los cuales aproximadamente 50 son
consideradas patógenas. Además hay una lista creciente de organismos oportunistas que
pueden causar enfermedad en el paciente comprometido.
Hasta que punto debe ser un hongo identificado es una decistión clínica y a veces académica.
Frecuentemente una identificación es realizada para eliminar la posibilidad de que el aislado
sea un patógeno verdadero. La especificación deberá ser interpretada sólo cuando sea
clínicamente relevante o académicamente importante.
COLECCIÓN DE ESPECÍMENES
La técnica para la colección de material para cultivo de hongos es importante, ya que muchas
levaduras y mohos no patógenos: Son frecuentes contaminantes en especímenes clínicos y
pueden crecer más y enmascarar los hongos patógenos significantes.
Especínenes cutáneos y superficiales
Suspender la medicación, lavar con agua y jabón secar bien al aire. Todo material puede ser
transportado al laboratorio en un sobre de papel limpio y estéril. El material es viable por
meses.
Piel: Las lesiones cutáneas requieren raspados del borde activo. Material suficiente y
representativo para cultivo y examen microscópico deberá ser colectado y transportado al
laboratorio.
91
Pelo: Los pelos infectados deben ser arrancados y enviados al laboratono.
Uñas: Las uñas infectadas no deben ser cortadas con tijeras. No colecte detritus de debajo de
la uña infectada. Primero, remueva la parte superficial no infectada de la uña por raspado.
Cuando se alcanza la porción enferma, remuévala por raspado y envíela al laboratorio.
Especímenes subcutáneos
Todo material debe ser enviado al laboratorio en un contenedor estéril. Transporte e
inoculación rápida son necesarios ya que muchos especímenes pueden también contener
bacterias que pueden crecer y enmascarar y consecuentemente inhibir o retardar el
aislamiento de los hongos patógenos.
Especímenes sistémicos (tejidos profundos)
92
Esputo, secreciones traqueales, secreciones bronquiales y respiratorias bajos un buen
especímen de esputo es de 5 a 10 ml de material recientemente descargado del árbol
bronquial, con cantidades mlnimas de contaminantes orales o nasales.
Tres especímenes pequeños de este tipo son mejores que un especimen coleccionado de 24
horas de volumen total igual. El hecho de que el especimen sea obtenido por la mañana
temprano o a otra hora no es importante a pesar que muchos pacientes producen más esputo
poco después de levantarse en la mañana. El esputo debe ser colectado usando un
contenedor estéril. Esputos inducidos deben también ser colectados en un contenedor estéril.
Aspirados traqueales y secreciones bronquiales pueden ser enviados en tubos de ensayo con
tapón de caucho u otros contenedores estériles apropiados,
Lavados gástricos
Lavados gástricos en ayunas deberán ser colectados cuando no sea posible obtener esputo.
Deberán ser colectados en tubos estériles. Una serie de tres especímenes es recomendada.
Orina
El espécimen de elección es la porción media del chorro de la micción de la mañana obtenida
limpiamente. Múltiples especímenes de este tipo son superiores a un especimen recolectado
de 24 horas. Mantener refrigerado antes de procesar.
Fluidos pleural, espinal, articular y otros
Los especímenes de fluidos deben ser remitidos en contenedores estériles, prefieren grandes
cantidades de especimen ya que muy pocos organismos pueden estar presentes. Examine
mientras estén frescos o refrigérelos.
Médula ósea
Los especímenes de médula ósea son enviados en 0,1 ml de anticoagulante EDTA.
Tejidos
Los especímenes de tejido deben ser remitidos en un contenedor estéril. Si el tejido está seco,
mójelo tigeramente con solución salina al 0.85% y refrigérelo hasta ser procesado. Todo tejido
debe ser molido o finamente cortado cuidadosamente.
PROCEDIMIENTO PRIMARIO DE INOCULACIÓN PARA CULTIVOS DE
93
HONGOS
Examen macroscópico
Examen microscópico directo del material clínico (KOH 10%)
Coloraciones: Gram, azul de metileno, tinta china, ácido resistente.
Cultivos
Reportes preliminares:
Dentro de 24 horas de la recepción de especfmenes con el resultado de la coloración
Después de 7 días de incubación (si no se detecta crecimiento) reportando “No hay
crecimiento en siete días”
Reportes finales:
Los reportes finales serán enviados al completarse los procedimientos de identificación o
después de 28 días de incubación si no hay evidencia de crecimiento fungal.
94
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN

Examinar microscópicamente con KOH al 10 ó 20% o en forma directa las muestras
entregadas y realizar la interpretación de los elementos entregados.

Observar placas teñidas con Gram y comparar entre las muestras.

Revisar los medios de cultivos con crecimiento de hongos y compare con cultivos
bacterianos.

Realice reflexiones sobre los resultados obtenidos junto con las fotos respectivas
95
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