UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR CURSO DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS CICLO I AÑO 2020 Facilitador: José Ricardo Vides García, MSc UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS FISICOQÍMICOS - Estadística. Tendencias -Concepto general de validación - Concepto general de verificación - Tipo de métodos analíticos, criterio OSA - Parámetros de validación - Materiales analíticos utilizados en una validación - Cartas de control - Protocolos de validación - Informes de validación - Estudio de casos de validación de métodos analíticos fisicoquímicos SIGNIFICADO PRACTICO DEL CONCEPTO ESTADISTICA ESTADISTICA Repetir varias veces un proceso de medición en iguales condiciones o cambiando una condición Predecir valores con alta seguridad Determinar tendencias Encontrar un valor verdadero Comparar resultados Tomar decisiones APLICACIÓN DE LA ESTADISTICA DETERMINACIÓN DE TENDENCIAS Respuesta del Equipo 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 100 200 300 400 500 Estímulo DIFERENTES CONDICIONES: CAMBIA LA INTENSIDAD DEL ESTIMULO APLICACIÓN DE LA ESTADISTICA DETERMINACIÓN DE TENDENCIAS CARTA DE CONTROL 0,6512 Valor del Control 0,5829 0,5146 0,4463 0,3780 0,3097 0,2414 0,1731 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Corrida IGUALES CONDICIONES DE ANÁLISIS, DIFERENTE TIEMPO 28 29 30 APLICACIÓN DE LA ESTADISTICA DETERMINACIÓN DE TENDENCIAS Resultados en muestra B Resultados en muestra A COMPARACIÓN DE RESULTADOS EN DOS MUESTRAS, EN CONDICIONES IGUALES DE ANALISIS SE DETECTA CLARA DIFERENCIA ENTRE MUESTRAS APLICACIÓN DE LA ESTADISTICA DETERMINACIÓN DE TENDENCIAS COMPARACIÓN DE RESULTADOS EN DOS MUESTRAS, EN CONDICIONES IGUALES DE ANALISIS Resultados en muestra A Resultados en muestra B NO SE DETECTA CLARA DIFERENCIA ENTRE MUESTRAS APLICACIÓN DE LA ESTADISTICA DETERMINACIÓN DE TENDENCIAS COMPARACIÓN DE RESULTADOS EN DOS MUESTRAS, EN CONDICIONES IGUALES DE ANALISIS Resultados en muestra A Resultados en muestra C ¿ CONCLUSIÓN ? NO SE DETECTA CLARA DIFERENCIA ENTRE MUESTRAS APLICACIÓN DE LA ESTADISTICA DETERMINACIÓN DE TENDENCIAS Valor de referencia Precisión: Medida de la concordancia o Repetibilidad de las mediciones entre ellas mismas Exactitud: Medida de la concordancia de una medición con un valor de referencia considerado como verdadero DIFERENTES MÉTODOS DE ANÁLISIS APLICACIÓN DE LA ESTADISTICA DETERMINACIÓN DE TENDENCIAS ¿Cuántas réplicas se deben efectuar para tener una clara tendencia y así poder estimar un valor verdadero con suficiente seguridad? R/ La guía técnica del OSA G9.6 lo establece UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS Validación Primaria, conocida más como Validación VALIDACIÓN Validación Secundaria conocida más como Verificación UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS CONCEPTO DE VALIDACIÓN PRIMARIA O VALIDACIÓN Confirmación mediante suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista Se aplica cuando se crean nuevos métodos de ensayos Guía Técnica del OSA: G 9.6 Validación de Métodos Fisicoquímicos, Versión 2, 2017/05/23 UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS CONCEPTO DE VALIDACIÓN SECUNDARIA O VERIFICACIÓN Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos especificados Se aplica cuando se utilizan métodos de ensayos ya creados y validados OSA, UNE-EN ISO 9000:2000 UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS Estimación de varios parámetros Estudio a largo plazo VALIDACIÓN Desarrollo de un método nuevo Estudio completo de todo el método Estimación de pocos parámetros VERIFICACIÓN Estudio a corto plazo Aplicable a un método Estándar Aplicable a algunos pasos del Método UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS TIPOS DE MÉTODOS DE ENSAYO O ANALÍTICOS, CRITERIO OSA 1. Los normalizados: Los que se encuentran en referencias reconocidas internacionalmente ( AOAC, FDA, BAM, etc) y el usuario los utiliza tal como están publicados 2. Normalizados modificados: Los normalizados, los cuales el usuario los modifica. 3. No normalizados: Los que no se encuentran en referencias reconocidas Internacionalmente Dependiendo del tipo de Método de Ensayo, así serán los requisitos a cumplir, el objetivo de la Validación o los parámetros a calcular en la validación. UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS OBJETIVO DE LA VALIDACIÓN Métodos normalizados: Establecer los parámetros de calidad necesarios para la validación del Método Analítico, para proporcionar evidencias de que el personal del laboratorio domina el Método Normalizado y lo utiliza correctamente para los propósitos previstos UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS OBJETIVO DE LA VALIDACIÓN Métodos normalizados modificados: Establecer los parámetros de calidad necesarios para la validación del Método Analítico, para proporcionar evidencias de que la modificación efectuada al Método Normalizado, proporciona datos confiables y que el personal del laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente para los propósitos previstos UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS OBJETIVO DE LA VALIDACIÓN Métodos no normalizados: Establecer los parámetros de calidad necesarios para la validación del Método Analítico, para proporcionar evidencias requeridas, de que el Método, proporciona datos confiables y que el laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente para los propósitos previstos NOTAS Para la obtención de las evidencias objetivas, se necesita aplicar métodos estadísticos, independientemente del tipo de Método de Ensayo de que se trate. Aplicar métodos estadísticos, implica utilizar computadoras PARÁMETROS DE VALIDACIÓN, EN FUNCIÓN DEL TIPO DE MÉTODO Y PROPIEDAD MEDIDA Guía Técnica del OSA: G 9.6 Validación de Métodos Fisicoquímicos, Versión 2, 2017/05/23 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN, EN FUNCIÓN DEL TIPO DE MÉTODO Y PROPIEDAD MEDIDA Guía Técnica del OSA: G 9.6 Validación de Métodos Fisicoquímicos, Versión 2, 2017/05/23 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN, EN FUNCIÓN DEL TIPO DE MÉTODO Y PROPIEDAD MEDIDA Guía Técnica del OSA: G 9.6 Validación de Métodos Fisicoquímicos, Versión 2, 2017/05/23 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN, EN FUNCIÓN DEL TIPO DE MÉTODO Y PROPIEDAD MEDIDA Especificidad, Concepto: Capacidad de un método de medir solamente lo que se espera que mida AOAC Selectividad, Concepto: Extensión en la que un método puede utilizarse para determinar analitos particulares en mezclas o matrices sin interferencias de otros componentes con un comportamiento similar IUPAC 2001 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN, EN FUNCIÓN DEL TIPO DE MÉTODO Y PROPIEDAD MEDIDA Especificidad-Selectividad Obtener la señal analítica (cromatogramas, absorbancias, espectros, color, etc.), de todos los componentes de la muestra. - Observar que de señal solamente el analito buscado - Observar que no haya traslape de señales. - Calcular la recuperación del analito. Recuperaciones muy bajas (menores del 50%) indican fuerte interferencia; recuperaciones muy altas (mayores del 100%) indican la presencia de componentes que dan señal junto con la del analito PARÁMETROS DE VALIDACIÓN, EN FUNCIÓN DEL TIPO DE MÉTODO Y PROPIEDAD MEDIDA Respuesta del equipo Especificidad-Selectividad: Cromatografía Componente diferente al buscado Analito buscado Tiempo PARÁMETROS DE VALIDACIÓN, EN FUNCIÓN DEL TIPO DE MÉTODO Y PROPIEDAD MEDIDA Linealidad, Concepto: Característica de un método para obtener resultados de la prueba proporcionales a la concentración del analito AOAC OSA La linealidad se evaluará con la determinación de Intervalo lineal e Intervalo de trabajo OSA INTERVALO LINEAL E INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO LINEAL. CURVAS DE AJUSTE INTERVALO LINEAL E INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO LINEAL. CURVAS DE AJUSTE ¿Qué es lo que se pretende verificar o demostrar con este parámetro? Respuesta Sistema medición R/ Un rango de valores del estímulo en el cual la respuesta del sistema de medición es directa y da una respuesta lineal, con intercepto estadísticamente igual a cero, para predecir un estímulo desconocido a partir de una respuesta conocida del sistema de medición 12 y = 2,0141x - 0,0537 R² = 0,9997 10 x = (y+0.0537)/2.0141 8 6 4 2 0 -2 0,0 2,0 4,0 Estímulo 6,0 INTERVALO LINEAL E INTERVALO DE TRABAJO Estímulo 0.0 1.1 2.1 3.5 4.0 5.0 Estímulo 0.0 1.1 2.1 3.5 4.0 5.0 Resp. Sistema medición 0 2.1 4.2 7 7.9 10.1 Resp. Sistema medición 1.8 3.9 6.0 8.8 9.7 11.9 Respuesta Sistema medición INTERVALO LINEAL. CURVAS DE AJUSTE y = 2.0141x+1.825 12 10 8 6 y = 2,0141x - 0,0537 R² = 0,9997 4 2 0 -2 0,0 1,0 2,0 3,0 Estímulo 4,0 5,0 6,0 INTERVALO LINEAL E INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO LINEAL. CURVAS DE AJUSTE ESTIMULOS Y RESPUESTAS DE SISTEMAS DE MEDICION ESTIMULO Concentración Concentración Concentración Concentración Concentración Concentración Concentración Concentración RESP. DEL SISTEMA DE METODO O SISTEMA DE MEDICIÓN MEDICIÓN Humedad en harinas por calentamiento y Concentración gravimetría Concentración Acidez en licores por titulación o volumetría Concentración Metales pesados por AA Nitritos en agua por espectrofotometría Concentración UV-VIS Pesticidas por Cromatografía de gases o Concentración HPLC Absorbancia Metales pesados por AA Nitritos en agua por espectrofotometría Absorbancia UV-VIS Área de un pico Cromatografía de gases o HPLC INTERVALO LINEAL E INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO LINEAL. CURVAS DE AJUSTE MATERIAL ANALITICO: Estándares, patrones o materiales de referencia leídos directamente en un instrumento. Generalmente son Blancos Fortificados (BF) Agua destilada fortificada con plomo en la determinación de Plomo en agua de ríos, lagos, potables, etc. por AA BF Harina secada fortificada con agua, en la determinación de humedad en harinas por calentamiento y gravimetría LINEALIDAD INTERVALO LINEAL Conc. ug/L 0.0000 0.5000 1.0000 1.5000 3.0000 4.5000 1.7500 2 Absorb 0.0000 0.0048 0.0100 0.0150 0.0300 0.0450 0.01002 -0.00006 0.99998 Comportamiento Lineal: Gráfica: tendencia lineal Coef. Det. No se especifica pero puede ser >= 0.95 (Xi-Xprom) 3.063 1.563 0.563 0.063 1.563 7.563 Yci 0.000 0.005 0.010 0.015 0.030 0.045 2 (Yi-Yci) 0.0000000 0.0000000 0.0000000 0.0000000 0.0000000 0.0000000 2 Xi 0.000 0.250 1.000 2.250 9.000 20.250 0,0500 0,0450 0,0400 Absorbancia Est No. 1 2 3 4 5 6 Promedio Pendiente Intercepto Coef. Det 0,0350 0,0300 0,0250 0,0200 0,0150 0,0100 0,0050 0,0000 0,0000 1,0000 2,0000 3,0000 Conc. Analito 4,0000 5,0000 INTERVALO LINEAL GRAFICO DE RESIDUALES Est. No. Yi Yci Residual % Diferencia 1 0.0000 -0.00006 0.00006 2 0.0048 0.00494 -0.00014 -3.019 3 0.0100 0.00995 0.00005 0.464 4 0.0150 0.01496 0.00004 0.251 5 0.0300 0.02999 0.00001 0.039 6 0.0450 0.04501 -0.00001 -0.032 Yi: Absorbancia leída Yci Absorbancia estimada con la curva de calibración Residual = Yi-Yci 0,00010 Residual 0,00005 0,00000 -0,00005 -0,00010 -0,00015 -0,00020 0,0000 0,0100 0,0200 0,0300 Absorbancia leida 0,0400 0,0500 INTERVALO LINEAL CURVA DE AJUSTE CASO DEL MODELO LINEA RECTA EVALUACION DE LA LINEALIDAD DEL SISTEMA O LINEALIDAD DE CURVAS DE AJUSTE ,APLICANDO LA PRUEBA t-Student El intercepto debe ser estadísticamente igual a cero, lo que equivale a que su intervalo debe contener el valor cero. Abs (b) t calculado Sb Sy / x Sb Sxx (Xi X) 2 ( Xi ) Sy / x n Sxx 2 n = Cantidad de puntos en la curva de calibración GL = n-2 El NC no se especifica pero puede ser 99% t calculado debe ser menor o igual que t tabulado 2 ( Yi Yci ) n2 INTERVALO LINEAL CURVA DE AJUSTE CASO DEL MODELO LINEA RECTA EVALUACION DE LA LINEALIDAD DEL SISTEMA O LINEALIDAD DE CURVAS DE AJUSTE, APLICANDO LA PRUEBA t-Student El intervalo del intercepto puede calcularse así: Intervalo del intercepto = [b – (t tab)(Sb) ; b + (t tab)(Sb)] b: Intercepto T tab: Valor de t tabulado para un nivel de confianza y GL dados Sb: Desviación estándar del intercepto INTERVALO LINEAL CURVA DE AJUSTE CASO DEL MODELO LINEA RECTA COMPARACION DEL INTERCEPTO CON EL VALOR CERO ESTIMACION DEL INTERVALO DEL INTERCEPTO Sxx (Xi X) 2 S y/x 2 (Yi Yci) Sb Sy / x 2 S y/x Sxx Sy/x Sb GL t calculado t 0.01(4) 0.00000000725 14.375000 0.000085 0.000052 4 1.215674 4.604095 2 N 2 (Xi ) 2 Sy / x (Yi Yci ) N2 t calculado N Sxx 2 Abs (b) Sb Intervalo del intercepto = [b – (t tab)(Sb) ; b + (t tab)(Sb)] INTERVALO DEL INTERCEPTO Lim Inferior Lim Superior -0.0537783 0.0495464 NC = 99% Observación: t calculado es menor que t tabulado, por lo que el intervalo de intercepto contiene el valor cero. Cumple INTERVALO LINEAL CURVA DE AJUSTE CASO DEL MODELO LINEA RECTA Evaluación si el Intervalo del intercepto contiene el valor cero. Ejemplo 2 Sb Sy / x (Xi) 2 n Sxx Abs (b) t calculado Sb Est No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Promedio Pendiente Intercepto Coef. Corr Sy / x (Yi Yci ) Xi: C. ppm Yi: Resp Eq. 0 0.0 43 5.0 99 10.0 204 20.0 312 30.0 525 50.0 1061 100.0 1590 150.0 2112 200.0 Suma 62.8 10.61195 Sxx = -5.52801 Sy/x = 0.99999 Sb = 2 n2 Xi2 0.0 25.0 100.0 400.0 900.0 2500.0 10000.0 22500.0 40000.0 76425.0 40955.6 4.271 1.945 Yci = mXi + b Sxx (Xi X)2 (Xi-Prom)2 3941.0 3338.3 2785.5 1829.9 1074.4 163.3 1385.5 7607.7 18829.9 40955.6 n = t calc = Yci -5.528 47.532 100.591 206.711 312.831 525.070 1055.667 1586.265 2116.862 9 2.842 (Yi-Yci)2 30.559 20.537 2.533 7.350 0.690 0.005 28.440 13.953 23.640 127.7 CURVA DE AJUSTE CASO DEL MODELO LINEA RECTA Evaluación si el Intervalo del intercepto contiene el valor cero. Ejemplo 2 t calculado = 2.842 α= 0.05 NC = 95% GL = n-2 = 9-2 = 7 El valor absoluto de t calculado es mayor que t tabulado. El intercepto es estadísticamente diferente de cero, o el intervalo del intercepto no contiene el valor cero. NO cumple el requisito de linealidad. t (0.05, 7) = 2.365 Intervalo del intercepto = [b – (t tab)(Sb) ; b + (t tab)(Sb)] Intervalo del intercepto = [-5.528 – (2.365)(1.945) ; -5.528 + (2.365)(1.945)] Intervalo del intercepto = [-10.1279 ; -0.028] INTERVALO LINEAL E INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO LINEAL E INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO DE TRABAJO ¿Qué es lo que se pretende verificar o demostrar con este parámetro? R/ La buena concordancia entre el estímulo aplicado al sistema de medición (estímulo esperado) y el estímulo encontrado por el sistema de medición (estímulo experimental), evaluado dentro de un rango de valores del estímulo. Estímulo calculado 6 y=x R² = 1 Pendiente = 1 Intercepto =0 5 4 3 2 1 0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Estímulo esperado 5,0 6,0 INTERVALO LINEAL E INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO TRABAJO, CURVA DE AJUSTE Estímulo calculado 0 2 3 4 5 6 Estímulo calculado Estímulo esperado 0 2 3 4 5 6 6 y=x R² = 1 Pendiente = 1 Intercepto =0 5 4 3 2 1 0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 Estímulo esperado Es un indicador de la exactitud del método de medición o del sesgo de los resultados obtenidos al aplicar el método de medición. El OSA pide demostrar estadísticamente que el rango de valores probables de la pendiente contiene el valor uno, que equivale a demostrar que la pendiente es estadísticamente igual a uno INTERVALO LINEAL E INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO DE TRABAJO. ESTIMULO ESPERADO Y CALCULADO DE SISTEMAS DE MEDICION ESTIMULO ESPERADO Concentración Concentración Concentración Concentración Concentración Concentración Concentración Concentración ESTIMULO CALCULADO CON EL SISTEMA DE METODO O SISTEMA DE MEDICIÓN MEDICIÓN Humedad en harinas por calentamiento y Concentración gravimetría Concentración Acidez en licores por titulación o volumetría Concentración Metales pesados por AA Nitritos en agua por espectrofotometría Concentración UV-VIS Pesticidas por Cromatografía de gases o Concentración HPLC Concentración Metales pesados por AA Nitritos en agua por espectrofotometría Concentración UV-VIS Concentración Cromatografía de gases o HPLC INTERVALO LINEAL E INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO DE TRABAJO MATERIAL ANALITICO: Estándares, patrones o materiales de referencia Sometidos a todo el proceso analítico. Generalmente son Blancos Fortificados (BF) o Muestras Fortificadas (MF) Agua destilada fortificada con plomo en la determinación de Plomo en agua de ríos, lagos, potables, etc. por AA BF MF Harina secada fortificada con agua, en la determinación de humedad en harinas por calentamiento y gravimetría Muestra de tejido de pez fortificada con arsénico INTERVALO DE TRABAJO RELACION ENTRE CONCENTRACIÓN DEL BLANCO FORTIFICADO Y CONCENTRACIÓN LEÍDA 2 2 2 Nivel No. Conc. BF Conc. Leída (Xi-Xprom) Yci (Yi-Yci) 1 0.0000 0.0000 3.063 -0.008 0.000 0.000 2 0.5000 0.4800 1.563 0.493 0.000 0.250 3 1.0000 1.0000 0.563 0.994 0.000 1.000 4 1.5000 1.4800 0.063 1.495 0.000 2.250 5 3.0000 3.0200 1.563 2.997 0.001 9.000 6 4.5000 4.4900 7.563 4.500 0.000 20.250 1.7500 Pendiente 1.00191 Intercepto -0.00835 Coef. Det 0.99992 Comportamiento Lineal: Gráfica: tendencia lineal Coef. Det >= 0.98 5,0000 Concentración Leída Promedio Xi 4,5000 4,0000 3,5000 3,0000 2,5000 2,0000 1,5000 1,0000 0,5000 0,0000 0,0000 1,0000 2,0000 3,0000 Concentración Blanco Fortificado 4,0000 5,0000 INTERVALO DE TRABAJO GRAFICO DE RESIDUALES Nivel Yi Yci Residual 1 0.0000 -0.00835 0.00835 2 0.4800 0.49261 -0.01261 3 1.0000 0.99357 0.00643 4 1.4800 1.49452 -0.01452 5 3.0200 2.99739 0.02261 6 4.4900 4.50026 -0.01026 Yi: Concentración leída Yci Concentración estimada con la curva de ajuste Residual = Yi-Yci 0,02500 0,02000 Residual 0,01500 0,01000 0,00500 0,00000 -0,00500 -0,01000 -0,01500 -0,02000 0,0000 1,0000 2,0000 3,0000 Concentración Leída 4,0000 5,0000 INTERVALO DE TRABAJO Abs (m 1) t calculado Sm Sm S2 y / x Sxx S y/x 2 (Yi Yci) N 2 COPARACIÓN DE LA PENDIENTE CON EL VALOR UNO DETERMINACIÓN DEL INTERVALO DE LA PENDIENTE 2 S y/x Sxx Sm GL t calculado 0.000274 14.375000 0.004369 4 0.437903 t 0.01(4) 4.604095 INTERVALO DE LA PENDIENTE Lim Inferior 0.9817994 Lim Superior 1.0220267 NC = 99% Observación: t calculado es menor que t tabulado, por lo que el intervalo de la pendiente contiene el valor uno. Cumple 2 INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO A REPORTAR: Límite inferior del intervalo: LCM Límite superior del intervalo: Mayor concentración del analito que puede dar el equipo considerando el mayor factor de dilución, o Valor del analito que se puede calcular con la mayor respuesta del equipo correspondiente al estándar de mayor valor de la curva de calibración que antes ha sido evaluada (Evaluación de la Linealidad), considerando el factor de dilución de la muestra, especificado en el método analítico INTERVALO DE TRABAJO INTERVALO A REPORTAR: Ejemplo: Si la dilución es: 1,00 mL de Muestra Aforados a 100,0 mL Pendiente de la Curva de Calibración: 1.04275566 Intercepto de la Curva de Calibración: -0.0092742 Máxima absorbancia: Y máxima: 1.0200 Factor de dilución: 100/1 mL Concentración = [Y-b]/m Factor dilución Concentración = [1.0200 - (-0.0092742)]/(1.04275566) (100/1) Concentración = 98.7 unidades de la medida Concentración Superior del Rango de trabajo = 98.7 unidades VALOR VERDADERO En magnitudes continuas es imposible conocer el Valor Verdadero, por lo consiguiente el del Error y la exactitud. (Error = Valor observado menos valor verdadero. Entre más pequeño es el error, más grande es la exactitud) Solo podemos tener estimaciones de ellos EXACTITUD Es la proximidad de concordancia entre el resultado de una medición y el valor de referencia aceptado. (Guía EURACHEM) VALOR VERDADERO CONVENCIONAL Valor atribuido a una cantidad particular y aceptada, algunas veces por tener una incertidumbre apropiada para un propósito dado VIM Ejemplos -Valor reportado en un Material de Referencia - Valores reportados en Manuales EXACTITUD ESTIMADA EN UNA VALIDACION Exactitud: Recuperación expresada en tanto por uno multiplicada por 100. Sesgo en tanto por ciento: sesgo en tanto por uno multiplicado por 100 El sesgo en tanto por ciento o error relativo porcentual, es igual a la Exactitud menos 100 EXACTITUD ESTIMADA EN UNA VALIDACION CRITERIOS OSA RECUPERACIÓN, ESTIMADA EN UNA VALIDACION Utilizando Muestra Fortificada o Blanco Fortificado Recuperación en tanto por uno: Fracción de analito adicionada a una muestra de prueba, previa al análisis, que viene dada por la expresión: R= CF - CU CA CF: Cantidad de analito medida experimentalmente en muestra de prueba fortificada CU: Cantidad de analito medida experimentalmente en muestra de prueba no fortificada CF- CU: Recuperación observada CA: Cantidad adicionada de analito IUPAC RECUPERACIÓN, ESTIMADA EN UNA VALIDACION Utilizando Material de Referencia Certificado o Material de Referencia Recuperación en tanto por uno: Relación entre la concentración medida experimentalmente en el Material (valor observado Vo o Recuperación observada) y el valor declarado (valor esperado Ve o Recuperación esperada) R= Vo Ve RECUPERACIÓN, EXACTITUD ESTIMADAS EN UNA VALIDACION Ejemplo. Caso Muestra-Muestra Fortificada R= CF - CU CA FORTIFICACION DE LA MUESTRA Concentración de solución fortificante 10ug/mL Cantidad de fortificante adicionado 100uL Cantidad de Muestra a Fortificar 1.0g Cantidad de analito adicionada = CA = 1.0ug CF = (g Muestra fortificada analizada) (Conc. Muestra fortificada en ug/g) CU = (g Muestra no fortificada analizada) (Conc. Muestra No fortificada en ug/g) RECUPERACIÓN, EXACTITUD ESTIMADAS EN UNA VALIDACION Ejemplo. Caso Muestra-Muestra Fortificada NIVEL 1 MUESTRA NO FORTIFICADA R= CF - CU CA MUESTRA FORTIFICADA PARÁMETROS DE VALIDACIÓN Recup. g de Muest g de Muest Réplica Conc.: ug/g Conc.: ug/g tanto por Exactitud % Sesgo % analizados analizados uno 1 1.99 3.01 1.020 102.00 2.00 1.0000 1.0000 2 2.01 2.99 0.980 98.00 -2.00 1.0000 1.0000 3 2.00 3.01 1.010 101.00 1.00 1.0000 1.0000 4 2.02 3.00 0.980 98.00 -2.00 1.0000 1.0000 5 2.00 3.00 1.000 100.00 0.00 1.0000 1.0000 6 2.00 3.00 1.000 100.00 0.00 1.0000 1.0000 2.00 0.998 99.833 -0.167 Promedio 0.010 0.016 1.602 Desviación Estándar 0.516 Repetibilidad como CV Inc. Est. relativa por Rep. 0.005 0.016 1.602 Incert. estándar de la recuperación: Rango de Recup. o intervalo de confianza de la recuperación 95 [ 0.966 a 1.030] tanto por uno NC % 2 [ 96.6 a 103.0] % k RECUPERACIÓN, EXACTITUD ESTIMADAS EN UNA VALIDACION Ejemplo. Caso Material de Referencia Certificado Concentración Declarada ( 3.00 ± 0.03 RESULTADOS ANALÍTICOS MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO Réplica Conc.: ug/g 1 2 3 4 5 6 3.01 2.99 2.93 3.05 2.97 2.94 2.98 0.045 1.506 0.015 Promedio Desviación Estándar Repetibilidad como CV Inc. Est. relativa por rep. Incert. estándar de la recuperación: NC % k 95 2 Concentración calculada en MRC: ) ug/g PARÁMETROS DE VALIDACIÓN Recup. tanto Exactitud % por uno 1.003 0.997 0.977 1.017 0.990 0.980 0.994 0.015 100.33 99.67 97.67 101.67 99.00 98.00 99.389 1.497 0.015 1.497 Sesgo % 0.33 -0.33 -2.33 1.67 -1.00 -2.00 -0.611 Rango de Recup. o intervalo de confianza de la recuperación [ 0.964 a 1.024] tanto por uno [ 96.4 a 102.4] % [ ( 2.89 2.98 a ± 3.07 0.09 ] ug/g ) ug/g PRECISION Precisión, Concepto: Es la proximidad de concordancia entre los resultados de pruebas independientes, obtenidos bajo condiciones estipuladas. ISO PRECISION Repetibilidad: Condiciones de trabajo constantes a nivel macro Precisión Reproducibilidad: Se cambia el valor de una variable, en forma controlada PRECISION Repetibilidad: Precisión Precisión intermedia Condiciones de trabajo constantes a nivel macro Reproducibilidad dentro del Laboratorio Reproducibilidad: Reproducibilidad entre Laboratorios PRECISION La precisión puede expresarse como Desviación Estándar (S), como Coeficiente de Variación (CV) o como un Rango CV = S 100 X Rango: [a ; b] PRECISIÓN ESTIMADA EN UNA VALIDACION Condiciones de precisión intermedia: Analista, Equipo REPETIBILIDAD ESTIMADA EN UNA VALIDACION Nivel 1: Nivel Abajo Réplica 1 2 3 4 5 6 7 Promedio S CV Incert. Estándar Rel. Conc. mg/kg 2.56 2.47 2.49 2.53 2.48 2.57 2.55 2.52 0.04 1.63 0.02 CV = S 100 X Inc. Est. Rel. = S/Promedio mg/kg mg/kg % FRep =1 PRECISIÓN INTERMEDIA ESTIMADA COMO CV EN UNA VALIDACION ANÁLISIS DE VARIANZA: ANAVA Analista 1 Analista 2 Analista 3 Réplica 1 2.1 2.5 2.4 2 2.2 2.3 2.1 3 2.3 2.4 2.3 4 2.1 2.3 2.4 5 2.2 2.1 2.2 6 2.4 2.3 2.4 CV CMd CMe 100 X Analista … … … … … … … X: Promedio de todos los datos Suma de los cuadrados dentro de grupos CMd = Grados de Libertad dentro de grupos Suma de los cuadrados entre grupos CMe = Grados de Libertad entre grupos SCd = GLd SCe = GLe PRECISIÓN INTERMEDIA ESTIMADA COMO CV EN UNA VALIDACION ANÁLISIS DE VARIANZA: ANAVA 2 2 SCe = ∑ (Sum Gi) b -H H= ( ∑ Xij ) ab Grupo: 1, 2, 3, ... a Fila: 1, 2, 3, ... b a = Cantidad de grupos o Analistas b = Tamaño del grupo o réplicas por analista SCtotal = ∑ (Xij ) 2 - H SCd = SCtotal - SCe GLe = a-1 GLd = a(b-1) Réplica 1 2 3 4 5 6 Suma Gi (Suma Gi)2 Analista 1 2.1 2.2 2.3 2.1 2.2 2.4 13.3 176.89 Analista 2 2.5 2.3 2.4 2.3 2.1 2.3 13.9 193.21 Analista 3 2.4 2.1 2.3 2.4 2.2 2.4 13.8 190.44 Analista … 2.5 2.3 2.4 2.3 2.2 2.3 14 196 PRECISIÓN INTERMEDIA ESTIMADA COMO CV EN UNA VALIDACION ANÁLISIS DE VARIANZA: ANAVA. EJEMPLO CMd CMe CV 100 X Blanco Fortificado Nivel 1 Réplica 1 2 3 4 5 6 Prom Varianza Suma Gi (Suma Gi)2 SCe CMe = GLe SCe = ∑ (Sum Gi)2 b -H GLe = a-1 Analista 1 0.0153 0.0143 0.0143 0.0143 0.0153 0.0153 0.0148 0.0000003 0.0888 0.0079 Analista 2 0.0163 0.0153 0.0148 0.0143 0.0153 0.0143 0.0151 0.0000006 0.0903 0.0082 Sumatoria GLe = 2-1 =1 GLd = a(b-1) GLd = 2(6-1) GLd = 10 Promedio de todos los datos = 0.01493 0.0161 PRECISIÓN INTERMEDIA ESTIMADA EN UNA VALIDACION ANÁLISIS DE VARIANZA: ANAVA EJEMPLO. Continuación CMd CMe CV 100 X 2 CMd = (Xij) Réplica 1 2 3 4 5 6 Analista 1 0.00023 0.00020 0.00020 0.00020 0.00023 0.00023 a= 2 Suma Xij = 0.17917 Suma Xij2 = 0.00268 SCe = 1.8717E-07 GLe 1 CMe 0.00000019 PRECISION INTERMEDIA: Analista 2 0.00027 0.00023 0.00022 0.00020 0.00023 0.00020 CV = H= SCd GLd ( ∑ Xij )2 ab SCtotal = ∑ (Xij ) 2- H SCd = SCtotal - SCe b= 6 (Suma Xij)2 = 0.032101992 Sctotal = 0.0000046 SCd = 0.0000044 GLd 10 CMd 0.00000044 5.29 % LIMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN DEL MÉTODO Límite de detección: El menor contenido que puede medirse con una certeza estadística razonable o La menor concentración del analito en una muestra que puede detectarse, pero no necesariamente cuantificarse bajo las condiciones establecidas de la prueba. (Guía EURACHEM Límite de cuantificación: La menor concentración de un analito que puede determinarse con una precisión (repetibilidad) y una exactitud aceptables bajo las condiciones establecidas de la prueba. (Guía EURACHEM) LIMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN DEL MÉTODO CRITERIOS OSA LIMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN DEL MÉTODO RESULTADOS i 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S LDM LCM DE LOS BLANCOS FORTIFICADOS NIVEL 1 C: ug/g 0.00731 0.00741 0.00731 0.00731 0.00731 0.00731 0.00780 0.00781 0.00780 0.00780 0.00781 0.00781 0.00025 LDM = 3S 0.00075 LCM = 10S 0.00251 APLICACIÓN DE LDM Y LCM ND Menor que LCM Cuantificable Nivel del Analito LDM LCM Valores Mayores o Iguales a LCM: Cuantificables Valores Menores a LCM y Mayores o iguales que LDM, Reportar Menor que LCM Valores Menores LDM, Reportar ND ROBUSTEZ Prueba de Robustez: Estudio dentro del laboratorio para evaluar el comportamiento de un proceso analítico cuando se efectúan pequeños cambios en las condiciones ambientales y/o de operación, semejantes a aquéllos que pudieran surgir en los diferentes ambientes de prueba. La prueba de robustez permite obtener información de los efectos de cambios menores de una forma rápida y sistemática (Guía EURACHEM). ROBUSTEZ CRITERIOS OSA Aplica solamente para creación de métodos nuevos ESQUEMA DE YOUDEN Corrida Variable V1: A, a V2: B, b V3: C, c V4: D, d V5: E, e V6: F, f V7: G, g Resultado 1 2 3 4 5 6 7 8 A B C D E F G R1 A B c D e f g R2 A b C d E f g R3 A b c d e F G R4 a B C D E F g R5 a B c D e f G R6 a b C d E f G R7 a b c d e F g R8 A-a (R1 + R2 + R3+ R4)/4-(R5 + R6 + R7 + R8)/4 B-b (R1 + R2 + R5+ R6)/4-(R3 + R4 + R7 + R8)/4 C-c (R1 + R3 + R5+ R7)/4-(R2 + R4 + R6 + R8)/4 D-d (R1 + R2 + R5+ R6)/4-(R3 + R4+ R7 + R8)/4 E-e (R1 + R3 + R5+ R7)/4-(R2 + R4 + R6 + R8)/4 F-f (R1 + R4 + R5+ R8)/4-(R2 + R3 + R6 + R7)/4 G-g (R1 + R4 + R6+ R7)/4-(R2 + R3 + R5 + R8)/4 Valor Crítico: Raiz cuadrada de 2 por Desviación estándar de los resultados Si Abs(X - x) es menor que valor crítico, entonces el cambio no es sensible en el resultado INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN CONCEPTO CUANTITATIVO “Parámetro asociado con el resultado de una medición que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser atribuidos razonablemente al mensurando” VIM INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN CONCEPTO CUANTITATIVO La incertidumbre del resultado de una medición no debe interpretarse como representante del error, ni del error que queda después de la corrección del resultado de la medición para eliminar el sesgo Resultado corregido = Resultado inicial/recuperación La recuperación debe estar en tanto por uno INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN FORMAS DE EXPRESAR LA INCERTIDUMBRE 1. Como una Desviación Estándar (S): Incertidumbre estándar 2. Como kS: Incertidumbre estándar expandida, k: factor de cobertura = 2 3. Como S/X: Incertidumbre estándar relativa, donde X es el Resultado de la medición 4. Como (kS/X)100: Incertidumbre expandida relativa porcentual. X: Resultado de la medición PROCESO PARA ESTIMAR LA INCERTIDUMBRE Inicio Y = f(p,q,..) Definir el mensurando Ej.: d = m/V 2 PROCESO PARA ESTIMAR LA INCERTIDUMBRE 2 Identificar fuentes de incertidumbre 3 • Pesadas • Masas atómicas •Volumen, • etc. Utilizar diagramas de causa y efecto, Ishikawa o fishbone PROCESO PARA ESTIMAR LA INCERTIDUMBRE 3 Cuantificar los componentes de la Incertidumbre 4 PROCESO PARA ESTIMAR LA INCERTIDUMBRE 4 Convertir a Desviaciones Estándar 5 Sp, Sq, Sr, ... PROCESO PARA ESTIMAR LA INCERTIDUMBRE 5 Evaluar su contribución a Incertidumbre Combinada 6 PROCESO PARA ESTIMAR LA INCERTIDUMBRE 6 Calcular la Incertidumbre Combinada, Sc 7 PROCESO PARA ESTIMAR LA INCERTIDUMBRE 7 Convertir a Incertidumbre Expandida Fin kSc ESTIMACION DE LA INCERTIDUMBRE MENSURANDO R = (a) (b) (c)… (F1) (F2) (F3)… a, b, c, …variables que inciden directamente en el valor del mensurando R (Lo que se quiere medir) F1, F2, F3, … Factores de corrección para efectos sistemáticos. Si se desconoce el valor, entonces el factor F se le asigna el valor de la unidad EJEMPLO DE MENSURANDO, UTILIZANDO LA TECNICA CROMATOGRAFIA DE ESTANDAR EXTERNO [(Cc ± UCc] (P ± UP) (Fd ± UFd) [(F Rep ± URep] Cx= (g ± Ug ) (Rec ± URec) C x = Concentración a Reportar P = Pureza del Estándar Analítico Cc = Concentración dada por la curva de calibración Fd = Factor de Dilución de la muestra F Rep= Factor de Repetibilidad g = gramos de muestra Rec = Recuperación del analito EJEMPLO DE MENSURANDO, UTILIZANDO LA TECNICA CROMATOGRAFIA DE ESTANDAR INTERNO [(Cac ± UCac] (Cs ± UCs) (P ± UP) [(F Rep ± URep] Cx= (g ± Ug ) (Rec ± URec) C x = Concentración a Reportar Cs = Cantidad de estándar sustituto adicionado a la muestra Cac = Cantidad de analito entre Cantidad de estándar sustituto, dada por la curva de calibración P = Pureza del Estándar Analítico F Rep= Factor de Repetibilidad g = gramos de muestra Rec = Recuperación del analito INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN EVALUACIÓN TIPO A Efectuada dentro del Laboratorio por medio de réplicas del proceso de medición, en condiciones controladas de repetibilidad EVALUACIÓN TIPO B Efectuada por métodos diferentes al de las réplicas (Tipo A) INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO A Ejemplo 1: Cálculo de la Incertidumbre por la variación en el llenado de un frasco volumétrico de 25,00 mL. Calcular la desviación estándar del volumen medido, efectuando varias réplicas de pesado del agua contenida y evaluando el volumen utilizando la densidad del agua. INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO A DETERMINACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE POR REPETIBILIDAD DEL LLENADO DE UN FRASCO VOLUMÉTRICO DE 25 mL Réplica 1 2 3 4 5 6 7 Temperatura = 20° Densidad agua = masa agua: g 24.8978 24.9123 24.9365 24.8898 24.9245 24.8994 24.9287 Promedio S = Incertidumbre = C 0.99711 V : mL 24.9700 24.9845 25.0088 24.9619 24.9967 24.9716 25.0010 24.9849 0.0178 g/mL mL mL INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO A Ejemplo 2: Estimación de la Incertidumbre en la recuperación mediante el cálculo de la desviación estándar de una serie de recuperaciones INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO A DETERMINACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DE LA RECUPERACIÓN Réplica 1 2 3 4 5 6 7 Promedio S = incertidumbre= Recuperación 1.0005 0.9987 0.9965 1.0012 0.9689 0.9845 1.0090 0.9942 Tanto por uno 0.0133 Tanto por uno INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO A Ejemplo 3: Estimación de la Incertidumbre estándar relativa debido a la precisión del proceso analítico, mediante el cálculo de la Desviación Estándar Relativa de los resultados de una serie de réplicas del análisis de una muestra control INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO A DETERMINACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE ESTANDAR RELATIVA DEBIDO A LA PRECISIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO, OBTENIDA EN CONDICIONES DE REPETIBILIDAD Réplica 1 2 3 4 5 6 7 Promedio S Inc. Est. Rel Conc. mg/kg 2.56 2.47 2.49 2.53 2.48 2.57 2.55 2.52 0.0410 0.01626039 mg/kg mg/kg Inc. Est. Rel = S/Promedio FRep = 1 INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO B a) Cuando se da un intervalo con un nivel de confianza Dividir la incertidumbre entre el factor de cobertura correspondiente Ejemplo: 15,05 ± 0,03 nivel de confianza = 95% S = 0,03/2 = 0,02 INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO B b) Cuando se da un intervalo (± a) sin un nivel de confianza Hay que decidir si la distribución es Rectangular o Triangular INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO B Distribución S Rectangular Triangular a/Raíz(3) a/Raíz(6) INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO B Ejemplo 1: Un frasco volumétrico de 25 mL tiene la información ± 0, 03 mL a 20° C Asumiendo una distribución triangular tenemos: S = 0,03/Raíz(6) = 0,01 INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO B Ejemplo 2: Un certificado de un estándar analítico especifica una pureza mínima de 99 % Pureza: [99,0 ; 100] % (99,5 ± 0,5) % (0,995 ± 0,005) Asumiendo una distribución rectangular tenemos: S = 0,005/Raíz cuadrada(3) = 0,003 INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO B Incertidumbre debido a la imperfección del ajuste de la curva a los datos experimentales. Respuesta del Equipo 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0,0000 50,0000 100,0000 150,0000 200,0000 Estímulo, Concentración 250,0000 INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO B SXp Aju 2 ( Yi Yci ) 1 n2 (1 2 m n Y eq = mXp + b (Xp Xi) 2 ) 2 ( Xi ) 2 Xi n Yeq b Xp m Resp. del Eq. Incertidumbre debido a la imperfección del ajuste de la curva a los datos experimentales. Y = mX+b Xi: Estímulo, Conc. INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO A Respuesta del Equipo Incertidumbre debido a la Repetibilidad de la curva de calibración. 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0,0000 50,0000 100,0000 150,0000 200,0000 Estímulo, Concentración 250,0000 INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO A Repetir varias veces la curva de calibración. Calcular la desviación estándar de las pendientes (Sm) y de los interceptos (Sb), las pendientes promedios (m) y los interceptos promedios (b) Yeq b SXp Re p m, b m Y eq = mXp + b Sb S ( Yeq b )2 ( mm )2 Yeq b Xp m INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO A y B INCERTIDUMBRE POR CURVA DE CALIBRACION Scal Xp (SXp rep m, b) (SXp Aju ) 2 Yeq b Xp m 2 INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO B Incertidumbre en un Volumen medido debido a Temperatura ambiente diferente a la de la calibración del instrumento (20.0 C°) Incertidumbre Expandida = [V][Cd]Abs([T2-T1]). Se asigna una distribución rectangular V = Volumen nominal (medido) Cd = Coeficiente de dilatación del líquido (Se utiliza el del disolvente en caso de disoluciones) Abs = Valor absoluto T2-T1 = Diferencia de la temperatura de trabajo con respecto a la de la calibración INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR EVALUACIÓN TIPO B Ejemplo: Volumen de agua medido en un frasco volumétrico de 50 mL, a 23 °C Cambio de Temperatura: 3 C° Cd H2O = 2.1e10-4 /C° SV Temp = (50,00 mL)(2,1e-4 /C°) (3 C°) Raíz cuadrada(3) = 0,02 mL INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN PROPAGACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE Las incertidumbres estándar se pueden combinar para obtener un incertidumbre estándar combinada. PROPAGACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE Regla 1 Para modelos que involucran solamente suma o diferencia de cantidades: Y = p + q + ..., la incerteza estándar combinada está dada por: Sy = 2 2 Sp + Sq + ... PROPAGACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE Sy = Regla 1 2 2 Sp + Sq + ... Ejemplo: Y = (0,125 ± 0,005) mg/L + (1,10 ± 0,06) mg/L Considere k = 2 Y = 0,125 mg/L+ 1,10 mg/L = 1, 22 mg/L 2 Sy = (0,005/2 mg/L) + (0,06/2 mg/L) Y = (1,22 ± 0,06) mg/L 2 = 0, 03 mg/L PROPAGACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE Regla 2 Para modelos que involucran solamente productos o cocientes: Y = pq..., la incerteza estándar combinada está dada por: 2 Sy = [Y] Sp + P Sq q 2 +… PROPAGACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE Regla 2 Sy = [Y] Sp P 2 Sq q + 2 + ... Ejemplo: Y = 0,5(10,15 ± 0,10) mg/mL (12,00 ± 0,05) mL Considere k = 2 Y = 0,5(10,15) mg/mL(12,00) mL = 60,90 mg Sy = [60,90] mg Sy = 0,16 mg 2 (0,10/2 /10,15) + (0,05/2/12,00) Y = (60,90 ± 0,32) mg 2 PROPAGACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE Incertidumbre de Pesos Fórmulas Fórmula química: Ax By Cz S PF x S y S z S 2 2 A 2 2 B 2 2 C H2O Masa atómica H: 1.00794 g S= 0,00004 g Masa atómica O: 15,9994 g S= 0,0002 g PF H2O = 2(1,00794 g) + 15,9994 g = 18.0010 g SPF H2O = (2)2 (0.00004𝑔)2 + (1)2 (0.0002𝑔)2 SPF H2O = 0.0002 g REPORTE DE LA INCERTIDUMBRE El reporte debe contener el resultado junto con la incertidumbre expandida: Resultado ± Incertidumbre Expandida Debe aclararse el factor de cobertura y el nivel de confianza Ejemplo: Concentración de Metanol: (24,5± 0,2) mg/100 mL La incertidumbre reportada es de tipo expandida, con k = 2, nivel de confianza aproximado del 95% REPORTE DE LA INCERTIDUMBRE Se recomienda no utilizar más de tres cifras significativas para la incertidumbre y debe contener la misma cantidad de decimales de la magnitud medida EJEMPLOS a) (3,25 ± 0,25) mg/mL b) (0,00200 ± 0,00010) g/L c) (10,5 ± 0,1) ug/g REPORTE DE LA INCERTIDUMBRE Si la incertidumbre no es expandida, o sea que es Incertidumbre estándar, no se debe utilizar el símbolo ± Se debe expresar así: Resultado = X Incertidumbre estándar = a Ejemplo: Concentración de Etanol= 40,1 % v/v Incertidumbre estándar = 0, 3 % v/v ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EJEMPLO PRÁCTICO Calcule la incertidumbre de medir la densidad del Etanol, pesando 50,00 mL de liquido en un recipiente volumétrico y repitiendo varias veces el proceso, a 23° C . Mensurando inicial: d = m/V Diagrama Causa Efecto m Rep Cal m1 Rep Cal m0 d Temp Cal Rep V Diagrama Causa Efecto Simplificado m Cal Cal m1 m0 d m V Rep Temp Cal V Mensurando: d = (m)(FRep)/V Cuantificar Componentes de la Incertidumbre y convertir a incertidumbre estándar Calibración de la balanza: El certificado dice que esta incertidumbre es de ± 0,00020 g, con k= 2 S Cal = 0,00020 g/2 = 0,00010 g S2m Cal = S2mo (Cal) + S2 m1 (Cal) S2m Cal = (2)(0,00010)2 g2 = 2,0e-8 g2 Incertidumbre Estándar en la pesada S2m = S2m Cal S2m = 2,0e-8 g2 Sm = 2,0 e-8 g2 = 1,414e-4 g Calibración del frasco volumétrico de 50,00 mL En la superficie del frasco se especifica: ±0,05 mL a 20° C Considerando una distribución triangular: SV Cal= 0,05 mL/raiz(6) = 0,02 mL S2V Cal= 0,02 mL x 0,02 mL = 0,0004 mL2 Temperatura ambiente diferente a 20,0 C° Cambio de Temperatura: 3 C° Incertidumbre Expandida = [V][Cd]Abs([T2-T1]) Asumiendo distribución rectangular Cd Etanol = 1,0 x 10-3 /C° SV Temp = (50,00 mL)(1,0e-3 /C°) (3 C°) Raíz(3) S2V Temp = 0,0872 mL2 = 0,00757 mL2 = 0,087 mL Incertidumbre en el Volumen de aforo S2V = S2V cal + S2V Temp S2V = 0,0004 mL2 + 0,00757 mL2 S2V = 0,00797 mL2 SV = 0,09 mL NOTA: Se observa que SV Temp es determinante en el valor de SV Repetibilidad en el proceso: Se efectuaron réplicas de llenado del frasco volumétrico y pesada, en una balanza analítica: i masa/g d: g/mL 1 39,0039 0,78008 2 38,9610 0,77922 3 38,9376 0,77875 4 38,9922 0,77984 5 38,9532 0,77906 6 38,9688 0,77938 7 39,0016 0,78003 Prom 38,9740 0,77948 d = m FRep/V Volumen nominal = 50,00 mL Desviación Estándar de la densidad = 0,000512 g/mL Desviación Estándar Relativa de la densidad = 0,000657 S2V Rep= 4,32 e-7 TABLA DE INCERTIDUMBRES Descripción Valor X Incertidumbre Incert./X (Incert./X)2 Masa m 38,9740 1,41e-4 3,628e-6 1,32e-11 Volumen V 50,00 mL 0,09 mL 0,0018 3,24e-6 FRep 1 0,000657 0,000657 4,32e-7 Suma 3,67e-6 d = 0.7795 g/mL Sd= d Sm 2 + m Sv V 2 + SRep 2 FRep ( ) ( ) ( ) RESULTADOS FINALES d = 0,7795 g/mL Sd = 0,00149 g/mL Sd expandida = 2(0,00149 g/mL) = 0,00299 g/mL REPORTE: C = (0,7795 ± 0,0030) g/mL La incertidumbre reportada es de tipo expandida, con k=2, nivel de confianza aproximado del 95% DISCUSIÓN CONTRIBUCIONES A LA INCERTIDUMBRE DE LA DENSIDAD Descripción Masa m Volumen V Rep Densidad d S/X 0,00000362 0,0018 0,000657 0,00191 S/X*10000 0,0362 18 6,57 19,1 CONTRIBUCIONES A LA INCERTIDUMBRE DE LA DENSIDAD 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 m V Rep d INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN APLICACIONES COMPARACIÓN DE UNA MEDIDA CON UN PARAMETRO P p = parámetro a comparar X X p X X±I>p (a) X X>p P en X± I X<p P en X± I (b) (c) X±I<p (d) Solo casos (a) y (d) se detecta diferencia significativa INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN APLICACIONES COMPARACIÓN DE UNA MEDIDA CON UN PARAMETRO P Si “P” se encuentra dentro del rango de valores probables, entonces no se detecta diferencia significativa, caso contrario se detecta diferencia significativa Ejemplo: En una validación se midió la recuperación de analito, cuyo valor encontrado es 0,85 Se tienen varios rangos de recuperación requeridos. ¿En cuales se cumple el requisito de recuperación? a) [0,95 ± 0,10] [0,85 ; 1,05] b) [0,95 ± 0,05] [0,90 ; 1,00] c) [0,90 ± 0,05] [0,85 ; 0,95] INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN APLICACIONES Consideración importante: La incertidumbre relativa porcentual del resultado debe ser la adecuada o tener la calidad suficiente para que sea útil Ejemplo: 5,0 ± 4,0 mg/mL 4,0 Incertidum bre porcentual 100 80% 5,0 ¡¡¡ 80% de incertidumbre es un valor muy alto !!! INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN APLICACIONES Comparar cada resultado con el valor 4 mg/mL [5,0 ± 4,0] mg/mL % Incertidumbre = (4/5)100 = 80% [5,0 ± 3,0] mg/mL % Incertidumbre = (3/5)100 = 60% [5,0 ± 1,0] mg/mL % Incertidumbre = (1/5)100 = 20% [5,0 ± 0,5] mg/mL % Incertidumbre = (0.5/5)100 = 10% 5,0 mg/mL % Incertidumbre = ??? Para poder comparar mediciones debemos tener la incertidumbre y además ser adecuada INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN APLICACIONES COMPARACIÓN DE DOS MEDIDAS X X Y X ± Ix > Y±Iy (a) Y ± Iy en X ± Ix (b) X X Y ± Iy en X ± Ix (c) Solo casos (a) y (d) se detecta diferencia significativa X ± Ix < Y ± Iy (d) COMPARACIÓN DE DOS RESULTADOS CON INCERTIDUMBRE Si existen elementos en común entre los dos rangos, entonces se dice que no se detecta diferencia significativa. En caso contrario, se detecta diferencia significativa Ejemplos: a) [10,0 ± 1,0] mg/mL [9,0 ± 1,0] mg/mL [9,0 ; 11,0] mg/mL [8,0 ; 10,0] mg/mL No se detecta diferencia significativa COMPARACIÓN DE DOS RESULTADOS CON INCERTIDUMBRE Ejemplos: b) [10,0 ± 0,5] mg/mL [9,0 ± 0,1] mg/mL [9,5 ; 10,5] mg/mL [8,9 ; 9,1] mg/mL Se detecta diferencia significativa COMPARACIÓN DE DOS RESULTADOS CON INCERTIDUMBRE Ejemplos: c) Medida [10,0 ± 5,0] mg/mL % Incertidumbre [5,5 ; 15,0] mg/mL 50% [9,0 ± 0,1] mg/mL [8,9 ; 9,1] mg/mL 1,1% Máxima incertidumbre aceptada: 10% A pesar que los rangos tienen elementos en común, no se debe concluir que no se detecta diferencia significativa. No debemos aceptar el dato con 50% de incertidumbre COMPARACIÓN DE DOS RESULTADOS CON INCERTIDUMBRE Ejemplos: d) 10,0 mg/mL 9,0 mg/mL Comentario: ??? ¡¡ NO PODEMOS COMPARAR OBJETIVAMENTE LAS MEDICIONES !! UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS • Estándares de Trabajo • Blanco Reactivo de Laboratorio • Blanco Fortificado • Muestra • Muestra Fortificada • Material de Referencia Certificado UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS ESTÁNDARES DE TRABAJO Estándar que es utilizado rutinariamente para calibrar o chequear materiales de medición o instrumentos de medición Soluciones de concentración conocida, que contienen el analito a determinar UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS ESTÁNDARES DE TRABAJO APLICACIÓN: • Evaluar Especificidad-Selectividad • Elaborar curva de calibración • Determinar el ámbito de concentraciones que se leerá en el equipo UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS ESTÁNDARES DE TRABAJO CURVAS DE CALIBRACIÓN Y AJUSTE Y Y Y = aX b Y = mX + b X X UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS ESTÁNDARES DE TRABAJO ÁMBITO DE CONCENTRACIÓN QUE SE LEERÁ EN EL EQUIPO Y Y = mX + b Y2 Ámbito de Lectura: [Y1;Y2] Ámbito de Concentración: [X1;X2] Y1 X1 X2 X UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS BLANCO REACTIVO DE LABORATORIO Material similar a la que se analizará, que contiene todos los componentes involucrados en el proceso analítico, excepto el analito a determinar y que se somete a todo el proceso analítico UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS BLANCO REACTIVO DE LABORATORIO APLICACIÓN: • Evaluar contaminación • Evaluar Especificidad-Selectividad • Corregir el sesgo UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS BLANCO FORTIFICADO DE LABORATORIO Porción de muestra similar a la que se analizará, que contiene todos los componentes utilizados en el proceso analítico, excepto el que se busca determinar, a la cual se le ha agregado una cantidad conocida de analito y que se somete a todo el proceso de análisis. UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS BLANCO FORTIFICADO DE LABORATORIO APLICACIÓN: • Evaluar Especificidad-Selectividad • Calcular la Variabilidad o Precisión del Método • Calcular la Recuperación UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS MUESTRA ANALÍTICA Porción de muestra en la que se determinará el analito de interés. APLICACIÓN: • Calcular la precisión del método • Calcular la recuperación o el sesgo en conjunto con una Muestra analítica fortificada UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS MUESTRA ANALÍTICA FORTIFICADA Porción de muestra a analizar, a la que se le ha adicionado una cantidad conocida del analito a cuantificar. APLICACIÓN: • Calcular la recuperación del analito • Calcular la precisión del Método UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS MATERIALES ANÁLITICOS MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO Material de referencia que viene acompañado de un certificado, en el cual una o mas propiedades están certificadas por un procedimiento, el cual establece trazabilidad a una precisa medida de la unidad en la cual las propiedades son expresadas y en la cual cada valor certificado está acompañado de una incertidumbre y un nivel de confianza establecido. VIM UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS PEROTOCOLO DE VALIDACIÓN Queda de tarea investigarlo en la Guía G9.6 del OSA. Ver discusión No. 1 UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS INFORME DE VALIDACIÓN El informe de validación contendrá la información suficiente para poder concluir acerca de la validación que se ha desarrollado. Debe incluir: Hacer referencia al protocolo utilizado Parámetros validados y criterios de aceptación Resultados Analíticos Resultados Estadísticos Interpretación de resultados y/o conclusiones Cuadro resumen de los resultados obtenidos (parámetro, criterio, resultado y conclusión) Declaración de Aptitud del Método Datos crudos de la validación Además será autorizado por o las personas asignadas por el laboratorio. UNIDAD II, VALIDACIÓN DE MÉTODOS FISICOS Y QUÍMICOS ESTUDIO DE CASOS 1 Cuantificación de componentes 1.1 Gravimétricos 1.2 Volumétricos 1.3 UV-VIS 1.4 Absorción Atómica 1.5 GC 1.6 HPLC FIN DE PRESENTACIONES