UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUÍZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DECANATO PROYECTO DE TESIS I. GENERALIDADES 1. Título del Proyecto Aislamiento y caracterización molecular de bacterias sulfato-oxidantes presentes en la sangre del molusco bivalvo “Anadara tuberculosa concha negra” (Sowerby 1833). 2. Personal investigador 2.1.Autor Joselyn Marilyn Zavala Arellano 2.2.Asesor Maria Victoria Lora Vargas 2.3.Co-Asesor Benoit Diringer 3. Carrera Profesional-Especialidad Biología- Biología Pesquera 4. Tipo de Investigación 4.1.De Acuerdo al fin que se persigue Básica 4.2.De acuerdo a la técnica de contrastación Descriptiva 5. Régimen de investigación Libre 6. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto El muestreo se realizará en los Manglares de Puerto Pizarro, Tumbes, Perú y el análisis de las muestras se llevará a cabo en el laboratorio de la empresa Inca Biotec S.A.C –Tumbes. 7. Duración del Proyecto 8 meses 8. Fecha Probable de inicio y término 8.1.Inicio Noviembre 2016 8.2.Termino Junio 2017 9. Cronograma de Actividades Actividades (Fases) PLANEAMIENTO Revisión bibliográfica Elaboración del proyecto Presentación del proyecto Aprobación del proyecto Implem. Del Proyecto EJECUCIÓN Recolección de muestras Procesamiento de muestras Registro de datos Análisis de datos COMUNICACIÓN Análisis e interpretación Elaboración del informe Presentación del informe 2016 NOV DIC ENE FEB 2017 MAR ABR MAY JUN x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 10. Recursos disponibles 10.1. Personal Asesor del Proyecto de Tesis: María Victoria Lora Vargas Co-Asesor: Benoit Diringer Equipo Técnico de laboratorio de Inca Biotec S.A.C 10.2. Equipos e instrumento Centrifugadora Impresora Multifuncional Lapto Toshiba Cámara digital Canon Refrigeradora Coldex USB DTSE3 Autoclave 18L GREETMED Mod:XY-28OD Esterilizador em seco. Equipo Vortex Kit cámara de electroforesis Clearver Scientific Ltd CS-300V 22 X 12.5 x 9cm Termociclador Biometra Transiluminador de luz UV Balanza gramera OHaus 600g Vernier Cámara de flujo laminar Jeringas 1m Pinzas Bisturí Tubos Falcon 50ml Tubos Falcon 15 ml Tubos eppendorf 1.5 ml Marcador Puntas con filtro 50 µl y 500 µl 03 Micropipetas Axygen 20-200 µl ,100-1000 µl, 0.510 µl. Láminas portaobjetos Láminas cubreobjetos Bitácora Cinta adhesiva Tijera Placas Petri 100x15mm Borosilicato PETRIQ Probetas graduadas b/vidrio hexagonal normax 100ml 10.3. Matraces pirex 100ml Royos de papel aluminio Doc. Papel kraft Royo de bolsas transparentes Royo de papel toalla Toca Cubre boca Guantes de nitrilo Guantes de latex Palas pequeñas Bolsas Ziploc Guardapolvo blanco Eppendorf biophotometer model AG Material y Reactivos 01 Kit extracción de ADN. 02 tubos de primer´s universales 16S ARNr (27F1492R). 06 tubos de primer´s específicos para genes involucrados en la oxidación de azufre. 01kit de PCR Thermo Scientific 05 Galones de Agua Destilada Fosfato dipotasico hidrogenado Sulfato de Magnesio Sulfato de amonio Sulfato de hierro ectahidratado frasco Agar bacteriológico (AGAR AGAR) x 1 kg Merck. Agar TSA (Agar Tripticasa de soya) Cloruro de sodio. 10.4. Local Laboratorios de biología molecular de la empresa Inca Biotec S.A.C, Tumbes. Centro Colectivo Educativo Experimental de Biología Biotecnología Acuática y Acuícola de Puerto Pizarro CEBAP y 11. Presupuesto 01.00 Bienes 01.10 Materiales de escritorio………………………………. S/.170 1 USB Kingston 3 Marcadores 1 Tijera 1 Bitácora 1 Cinta adhesiva 2 Millares de hojas A4 de 75gr 12 Folders A4 de cartón 3 Lapicero 1 Resaltadores 01.20 Materiales e instrumentos de Laboratorio…………S/.64000 1Centrifugadora Eppendorf biophotometer model AG 1Termociclador Biometra 1Refrigeradora Coldex 1Autoclave 18L GREETMED Mod:XY-28OD 1Equipo Vortex 1Kit cámara de electroforesis Clearver Scientific Ltd 1Transiluminador de UV 1Balanza gramera OHaus 600g 1Camara de flujo laminar 1Vernier 200 Puntas con filtro 50 µl 200 Puntas con filtro 500 µl 100 Tubos eppendorf 1.5 25 Tubos falcon 50ml 25 Tubos falcon 15 ml 20 Pinzas 40 Jeringas 40 Bisturí 03 Micropipetas Axygen 20-200 µl ,100-1000 µl, 0.5-10 µl 15 Placas Petri 10x15 mm Borosilicato PETRIQ 2 Probetas graduadas b/vidrio hexagonal normax 100ml 5 Matraces pirex 100ml 2 Royos papel aluminio 2 Doc. Papel kraf 2 Royos de Bolsa transparente 2 Royos de papel toalla 1 Caja cubre boca 1 Caja de guantes de nitrilo 1 Caja de guantes de latex 1 Caja de mascarilla S/.70,770 02.00 Servicios 5 Palas pequeñas 1 paquete de bolsas ziploc 1 caja de láminas portaobjetos 1 caja de láminas cubreobjetos 01 Kit de extracción de ADN 02 tubos de primer´s universales 16S ARNr (27F- 1492R) 06 tubos de primer´s específicos. 01Kit de PCR Thermo Scientific 5 galones de agua destilada Fosfato dipotasico hidrogenado Sulfato de magnesio Sulfato de amonio Sulfato de hierro ectahidratado 1 Frasco Agar bacteriológico (AGAR AGAR) x1kg Merk 1 frasco agar tripticasa de soya 01.30 Material para procesar los datos…………………….S/6000 1 Lapto Toshiba 1 USB Kingston Microsoft Excel 2013 Alineamientos de secuencia online (Blast) S/.3,100 01.40 Material fotográfico.......................................................S/.600 1 Cámara digital Canon 02.01 Pasajes y subvenciones...................................................S/.2400 Pasajes Alimentación Hospedaje 02.20 Publicaciones…………………………………………..S/.400 1 Impresa multifuncional Hp 1 Cartucho de tinta negra Hp 2 Cartuchos de tinta color Hp Empastado 02.30 Otros…………………………………………………… S/.300 TOTAL S/.73,870 12. Financiación Los gastos descritos en el presupuesto serán financiados por la empresa Inca Biotec S.A.C y otros por la tesista. II. PLAN DE INVESTIGACIÓN 1. Realidad Problemática 1.1.Identificación del Problema Anadara tuberculosa (Sowerby 1833) es un molusco bivalvo que habita los ecosistemas de manglar y que se distribuye desde Baja California en México hasta el norte del Perú. (Cruz and Borda, 2003). Estos moluscos viven específicamente asociada a los raíces de mangle, enterradas en el fango a una profundidad que varía de 1 a 30 cm (INRENA, 2007). Su importancia radica en que son la base de una pesquería completamente artesanal de subsistencia, sobre todo para las comunidades asociadas a estos ecosistemas y poseen escasos recursos económicos. Sin embargo, las actividades antropogénicas como la extracción, la destrucción del hábitat y la contaminación de los ecosistemas de manglar han conllevado a la disminución de los bancos naturales de A. tuberculosa (concha negra) en los últimos años a tal punto que es considerado una especie en situación vulnerable. Con respecto a ello, algunas poblaciones se encuentran cercanas del colapso en la mayoría de los países (Mora et al., 2011, Lucero, Cantera y Neira 2011).En Perú las poblaciones de A. tuberculosa de la región de Tumbes se han reducido en un 73,2% durante el periodo de 1996 a 2007(Ordinola et al., 2007; Vivar et al., 1996). Por consiguiente la extracción actual está limitada por una talla mínima de captura según la RM.N°209-2001 PE y por el periodo de veda reproductiva según la RM.N°014-2006-PRODUCE. Así, (Flores, et al., 2013) menciona “que la talla mínima de extracción de la concha negra es de 4.5 cm desde el 2001 y el cumplimiento del periodo de veda desde el 2006, sin embargo no se tiene una cuota máxima de extracción por lo que el número total capturado de concha negra depende de la habilidad del extractor”. A pesar de estas medidas drásticas de conservación, no se recupera las poblaciones si no al contrario siguen su descendencia y la situación poblacional de esta especie está en constante reducción. A consecuencia de ello y al posible impacto ambiental y también económico de la desaparición de este recurso representativo del manglar, se consideró una alternativa que podría mejorar la situación, a través del desarrollo de proyectos de manejo de producción de semillas en condiciones artificiales de laboratorio en Perú y Ecuador (Diringer et al., 2012). Cabe resaltar que estos proyectos dieron buenos resultados, sin embargo los cultivos enfrentaron altas mortalidades, debido a infecciones bacterianas a nivel de larvas y reproductores. Estos acontecimientos conllevaron a la realización de investigaciones basadas en microbiología, eco-fisiología y nutrición. Teniendo en cuenta que la concha negra tiene un hábitat aparentemente hostil ya que los suelos de manglar son sustratos lodosos que se caracterizan por el alto contenido de agua, sal, sulfuro de hidrógeno, bajo contenido de oxígeno y elevada proporción de humus (Cintrón-Molero & Schaeffer-Novelli, 1983) pero que parecen ser sumamente productivos. En este sentido nos damos cuenta que los ecosistemas manglares tienen altos contenidos de elementos tóxicos que entran en ciclos químicos y que son fuertemente influenciados por los microrganismos presentes, a través de diferentes procesos de reducción, oxidación, etc. Es por ello que se torna interesante investigar la relación entre animal, microbiota y hábitat, sobre todo centrarnos en el componente más tóxico que es el azufre que puede alcanzar niveles de hasta 0.1 kg S m–3 año–1 (Dent, 1992) Para mitigar la incidencia de estos componentes azufrados, varios moluscos bivalvos han desarrollados relaciones simbióticas con microorganismos que tienen la capacidad de transformar las formas más toxicas en compuestos relativamente neutros (Holguin and Bashan ,2007). En este sentido existe escasa información sobre la microbiota que habita en A. tuberculosa, es por ello que se plantea este proyecto con la finalidad de conocer y describir presencia de microorganismos simbióticos sulfatos oxidantes. 2. Problema ¿Existen bacterias SOB en la sangre del molusco bivalvo A. tuberculosa “Concha negra”? 3. Hipótesis Existen más de 1 un tipo de bacterias SOB utilizando las técnicas presentadas. 4. Justificación e importancia A. tuberculosa es una especie endémica del ecosistema manglar que está actualmente en situación de sobreexplotación debido a la fuerte demanda comercial para su consumo directo. Esta especie ha sido recolectada ancestralmente como un alimento básico y como un ingreso económico básico para las comunidades costeras. La mayoría de las poblaciones naturales de A. tuberculosa están sobreexplotadas y algunas poblaciones están a punto de colapsar en varios países. El hábitat natural en el que se desarrolla A. tuberculosa se caracteriza por altas concentraciones de azufre debido a la descomposición de materia orgánica y variaciones importantes de factores abióticos que, en su conjunto, probablemente estimulen el desarrollo de una microbiota particular que podría ser específica y beneficiaría a su supervivencia. En este aspecto el presente estudio se revela primordial para confirmar la presencia de microorganismos simbióticos de tipo SOB que podrían ser esenciales para el desarrollo acuícola sustentable de esta especie. 5. Objetivos 5.1.Objetivo general Aislar y caracterizar molecularmente bacterias sulfatooxidantes (SOB) provenientes de la sangre del molusco bivalvo A. tuberculosa (Concha negra) 5.2.Objetivos específicos Aislar SOB provenientes de A. tuberculosa usando medios selectivos. Caracterización molecular mediante secuenciación del gen 16S ARNr. Caracterización molecular dirigido al gen especifico soxB 6. Antecedentes A.tuberculosa (concha negra) es un molusco bivalvo de amplia distribución en la costa del Pacifico Oriental, su distribución geográfica comprende desde Laguna Ballena (México) hasta Tumbes (Perú). (Cabanilla, 2010). Se estima que más de dos mil personas viven de su explotación directa y un número aún no determinado que se dedica a su comercialización. (USAID 2012). En este contexto Marín (2013), demostró que el recurso concha negra en Puerto Pizarro, Tumbes, se encuentra en condiciones de sobreexplotación, mostrando que esta especie se encuentra en un 74% del máximo de rendimiento en su biomasa. El posible impacto socio-económico- ecológico de la desaparición de este recurso emblemático del ecosistema manglar ha conducido a proyectos de producción de semilla en condiciones artificiales de laboratorio en Perú (Diringer et al, 2012) y recientemente en Ecuador (Concepto Azul 2014). En ambos países los cultivos acuícolas sufrieron mortalidades inducidas por episodios de bacteriosis, en particular los relacionados a los géneros Vibrio y Pseudomonas. Estos eventos ocurren generalmente cuando existe un desequilibrio entre el animal, su microbiota y su medio. En este aspecto, la alta concentración de materia orgánica y la importante variación de factores abióticos en el lodo del manglar y agua intersticial deben estimular el desarrollo de una fauna particular que habita este ecosistema. Por consiguiente, se podría asumir que la microbiota de A. tuberculosa podría ser específica y beneficiaría la sobrevivencia en el lodo del manglar. Este concepto conocido como hologenoma considera al hospedero y su microbiota (holobionte) como única unidad de selección donde la plasticidad genética del huésped se ve reforzada a través de la capacidad de adaptación de su composición microbiana frente a un cambio ambiental(Zilber Rosenberg et al., 2008). Existe poca información acerca de la microbiota de la concha negra, pero estudios realizados han registrado que las concentraciones de Enterobacterias y coliformes en individuos de A. tuberculosa se encuentran por encima de los niveles recomendados para su consumo (Wong et al., 1997; Fernández et al., 1977). Recientemente, Sánchez et al. (2015), evaluaron 8 cepas de bacterias del tracto gastrointestinal de conchas negras adultas como probióticos potenciales para el cultivo de langostino Litopenaeus vannamei, identificando cepas de Bacillus (4), Citrobacter (1), Vibrio (1), Enterococcus (1) y Staphylococcus (1). Sin embargo estos primeros resultados fueron obtenidos mediante técnicas dependientes de cultivo que permiten la identificación de una pequeña fracción de la microbiota total (entre el 10% al 1%) (Streit, 2004). Justamente, resultados obtenidos mediante técnicas independientes de cultivo (metagenómica) que permiten obtener una visión completa de la microbiota (Diringer et al. 2016, Com.Pers), demostraron que la microbiota circulante de la sangre y gónadas de individuos recientemente extraídos del manglar está constituida principalmente por bacterias pertenecientes a los géneros Rubritepida sp. Proteus vulgaris, Kaistobacter sp., Nocardiodes sp., que son géneros muy poco conocidos y no previamente descritos en bivalvos. Además se realizaron tratamientos de dietas alimenticias para A. tuberculosa en paralelo por más de 4 meses, donde se observó que los individuos del tratamiento control (individuos que viven solo con agua de manglar filtrada, clorinada y neutralizada con tiosulfato) registraron una sobrevivencia del 94%. Esta observación en conjunto con una evaluación bibliográfica (Dubert et al.,2016; Xiao et al.,2016; Deng et al., 2009; Jin et al., 2005; Alarico et al., 2002; Roxon et al., 1977) de los géneros obtenidos por metagenómica sugiere que A. tuberculosa albergaría bacterias con capacidad de oxidación de azufre, en particular el thiosulfato, lo que permitiría explicar la importante sobrevivencia de estos individuos en condiciones de ayuno prolongado. En este sentido existen estudios sobre bacterias sulfato-oxidantes presentes en los ecosistemas y en los organismos. Así Behera et al. (2013) identificó por caracterización molecular los géneros Micrococcus, Bacillus, Pseudomonas y Klebsiella, capaces de oxidar el azufre presente en los suelos de manglar del delta del río Mahanadi. Así mismo, Rojas et al.(2013), realizó un estudio basado en cultivos microbianos de 75 microorganismos de los cuales 54 de ellos tenían la capacidad de oxidar azufre y solo tres: AZCT-M125-5, AZCT-M125-6 y AZCT-M125-7 eran capaces de crecer autotróficamente usando azufre elemental produciendo sulfato, además un análisis basado en la secuencia de genes 16SRNAr indicaron que los cultivos microbianos AZCT-M1255, AZCT-M125-6 estarían estrechamente relacionados con Thiooxidans Acidithiobacillus , mientras que la identificación de AZCT-M125-7 no fue posible. Consecuentemente hasta la fecha se han reportado 5 familias de bivalvos conocidas por albergar SOB (Mytilidae, Vesicomyidae, Solemiydae, Thyasiridae y Lucinidae). Estas familias se encuentran principalmente en aguas profundas, los que habitan en chimeneas hidrotermales pero también en ecosistemas no tan extremos como son los fangos y sedimentos de los herbales y los suelos del manglar (Dupperon et al, 2013) Sin embargo es importante comprender los mecanismos de acción para que exista una asociación de posible simbiosis entre microorganismos y huésped, sobretodo en la familia Lucinidae que es aquella que tiene más similitud con la familia Arcidae donde pertenece A. tuberculosa ya que ambas presentan sangre y hemoglobina , característica primordial. En este contexto, Brissac et al. (2010),realizó un análisis molecular comparativo de los huéspedes con secuencias del gen 18 S y 28S ARNr con bacterias simbiontes del gen 16S rRNA para determinar sobre qué ambiente evolutivo produce asociaciones modernas entre la familia Lucinidae y bacterias simbiontes, obteniendo como resultado que de todas la secuencias realizadas solo se encontraron 3 especies de bacterias simbiontes(16S ARNr), los cuales pertenecen al Filo Proteobacteria y se encuentran dentro de Lucinidae y dos de ellos se obtienen de los manglares donde habitan. No obstante, Gros et al. (2003),determinó que en las familias Assuggestedpreviously, Solemiydae y Vesicomyidae existe relación simbionte por transmisión vertical, mientras que en la familia Lucinidae por relación con el medio ambiente, basado en 2 pruebas experimentales tanto para conocer si es que las bacterias simbiontes son heredadas por transmisión vertical de padres a hijos o por una transmisión horizontal. 7. Materiales y Métodos 7.1.Material Ubicación de área de Muestreo La recolección del material biológico (A.tuberculosa) se llevará a cabo en los Manglares de Puerto Pizarro, Tumbes, Perú y el trabajo de laboratorio se realizará en la empresa biotecnológica Inca Biotec S.A.C, Tumbes, Perú. Población Serán recolectadas 15 individuos silvestres de A. tuberculosa a partir de los bancos naturales ubicados en los manglares de Tumbes, en las coordenadas 3°30’12.96”S - 80°23´55.87”O. Las muestras serán extraídas manualmente con el seguimiento de un Poblador extractor (Conchero), lavadas con agua de mar con el objetivo de eliminar detritus impregnado en las valvas, además serán seleccionados por sus tallas superiores o iguales a la talla mínima legal de extracción. Posteriormente serán trasladados a los laboratorios de Inca Biotec S.A.C en la ciudad de Tumbes, y ubicado en el área de recepción de muestras. Muestra Se extraerá la sangre de manera individual utilizando una aguja de calibre 25 junto con una jeringa de 1ml, el cual contendrá citrato de sodio al 10% y se insertará directamente en el musculo aductor posterior, se succionará un máximo de 0.5 ml el cual se mezclará con el citrato de sodio ya mencionado. 7.2.Metodología 7.3.Diseño de Contrastación de hipótesis: La contrastación de la hipótesis se hará a través del diseño de una sola casilla. (Goode y Hatt, 1986) Aislamiento y purificación de cepas sulfato-oxidantes Una vez obtenida mediante punción la sangre de A.tuberculosa en condiciones asépticas se inoculará 500µl de sangre de A. tuberculosa en tubos de centrifugación de 15ml que contengan 9 ml de medio liquido especifico 9K(Rojas et al,2013), se llevará a incubar a 37°C por 72 horas en homogenización constante , una vez visualizado el crecimiento se procederá a aislar las bacterias inoculando 20 µl de la muestra , se sembrará por el método de esparcido en placas Petri, que contengan medio sólido no selectivo Tripticasa Soya Agar(TSA sigma) suplementado con 2 % de cloruro de sodio y se evaluara el crecimiento por periodos de 18 a 48 horas a 37 °C. Se seleccionarán aquellas colonias que presenten morfología diferente. Una vez seleccionadas las colonias se iniciará la purificación mediante las siembras sucesivas por el método de estriado en placa. La pureza de cada cepa se verificará mediante tinción Gram y el proceso de aislamiento se repetirá hasta obtener cepas totalmente puras. Las bacterias puras serán sembradas en medio líquido Luria Bertani (LB sigma) suplementadas con 2% de cloruro de sodio. Para conservar las cepas se le agregará a cada una de ellas 25% de glicerol estéril (v/v) en 1ml de cultivo en fase estacionaria y se almacenará a -20°C. Extracción de ADN genómico Se extraerá 1 ml de cultivo de cada cepa que será centrifugado a 13000 rpm y el sobrenadante será descartado. El ADN del pellet será obtenido siguiendo el protocolo de extracción descrito por el fabricante (Kit Concepto azul). Posteriormente La concentración fue determinada por lectura de absorbancia a 260 nm y la pureza evaluada utilizando ratios A260/280 y A260/230 por espectrofotometría (Eppendorf biophotometer model AG) Caracterización molecular de las cepas sulfato oxidantes mediante amplificación del gen 16S ARNr Se realizará una amplificación de la región del gen 16S ARNr mediante una prueba PCR utilizando los iniciadores universales 27Fy 1492R, los cuales generan un producto de alrededor de 1500pb. Se le agregará un mix de PCR de un volumen final de 25 μl a cada una de las muestras de ADN, posteriormente serán colocados en un termociclador (Biometra) Los productos de PCR serán observados en un gel de electroforesis a una concentración de 1.5 % de agarosa, los amplicones de tamaño esperado serán enviados a secuenciar a MACROGEN USA. Procesamiento de datos La obtención de secuencias de nucleótidos de las cepas de interés será obtenido mediante secuenciamiento por Macrogen, dichas secuencias serán alineadas mediante programas on line para la identificación mediante homología de secuencia con la base de datos disponibles (Gen bank), que permitirá la determinación de microorganismos a nivel de género. Referencias Bibliográficas Abanto, P. M. (2013). Evaluación de Concha negra (Anadara tuberculosa y Anadara similis) en los manglares de Puerto Pizarro, Tumbes-Perú mediante un modelo de biomasa dinámica. Alarico, S., Rainy, F., Empadinhas, N., Schumann, P., Nobre, M., & Da Costa, M. (2002). Rubritepida flocculans gen.nov.,sp.nov,a mew slightly thermophilicimember of the alfha-1 sub class of the Proteobacteria. Syst ApplMicrobiol, 25(2), 178-206. Azul, C. (s.f.). Manual Práctico de Producción de Concha Prieta (Anadara tuberculosa) en condiciones de Laboratorio. Ecuador. Behera, B., Patra, M., Dutta, S., & Thatoi, H. 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