ANÁLISIS POR INSTRUMENTACIÓN TAREA 1 ALLINSON

ANÁLISIS POR INSTRUMENTACIÓN
EAP BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS, GRASAS Y MINERALES
Docente: Mejía Domínguez Cecilia
Alumna: Allinson Brighitte La Madrid Napuri
16 de Abril del 2018
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS, GRASAS Y
MINERALES
I.
FUNDAMENTOS TEÓRICOS:
 Es necesario realizar un análisis para determinar proteínas, grasas y minerales
en los alimentos para asegurar que sean aptos para el consumo y para asegurar
que cumplen con las características y composición que se espera de ellos.
II.
PRINCIPALES METODOS PARA DETERMINAR PROTEINAS
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Método kjeldahl
Método de Dumas
Método de Kofranyi
Método de Biuret
Método de Bradfort
Método de Lowry
Método de Sorensen
Método de Espectroscopia infrarroja
Método de Espectrofotometría
Métodos Turbidimetrico
Método de Espectroscopia Electrónica
1. Método de Kjendahl
En el trabajo de rutina se determina mucho más frecuentemente la proteína total
que las proteínas o aminoácidos individuales. En general, el procedimiento de
referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no
proteínas como las proteínas verdaderas (Aurand et al, 1987).
El método se basa en la determinación de la cantidad de Nitrógeno orgánico
contenido en productos alimentarios, compromete dos pasos consecutivos: a) La
descomposición de la materia orgánica bajo calentamiento en presencia de ácido
sulfúrico concentrado. b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la
muestra.
Durante el proceso de descomposición ocurre la deshidratación y carbonización de
la materia orgánica combinada con la oxidación de carbono a dióxido de carbono.
El nitrógeno orgánico es transformado a amoniaco que se retiene en la disolución
como sulfato de amonio. La recuperación del nitrógeno y velocidad del proceso
pueden ser incrementados adicionando sales que abaten la temperatura de
descomposición (sulfato de potasio) o por la adición de oxidantes (peróxido de
hidrógeno, tetracloruro, per sulfatos o ácido crómico) y por la adición de un
catalizador. (Nollet, 1996)
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
Dificultades químicas y prácticas
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Digestión prolongada.
Conversión cuantitativa de nitrógeno a amoníaco.
Espumosidad excesiva.
Acción corrosiva de ácido sulfúrico sobre el sistema de extracción de humos.
Consideraciones ambientales respecto a descarga de humos y contaminación
de aguas con catalizadores metálicos.
Soluciones
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Aumentar relación sulfato de potasio/ácido sulfúrico (1 g.l ml) t° 370-410°C.
Uso de catalizadores metálicos.
Uso de H202.
Ventajas
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Apropiado para varios tipos de productos.
Alta fiabilidad.
Usado como método de referencia.
Desventajas
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Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.
Uso de catalizadores tóxicos o caros.
Elección del factor de conversión.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
En la mezcla de digestión se incluye sulfato sódico para aumentar el punto de
ebullición y un catalizador para acelerar la reacción, tal como sulfato de cobre. El
amoniaco en el destilado se retiene o bien por un ácido normalizado y se valora por
retroceso, o en ácido bórico y valora directamente. El método Kjeldahl no
determina, sin embargo, todas las formas de nitrógeno a menos que se modifiquen
adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos. (Pearson, 1993).
Para convertir el nitrógeno a proteína se emplea el factor de 6.25 el cual proviene
de la consideración de que la mayoría de las proteínas tienen una cantidad
aproximada de 16% de nitrógeno.
2. Método de Dumas
Se caracteriza por pirolisis completa de la muestra
y medición del contenido de nitrógeno de los gases
de combustión. El nitrógeno puede ser medido con
manómetro después de absorber el dióxido de
carbono en una solución alcalina o por
conductividad térmica en métodos automatizados.
Ventaja
Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el método de Kjeldahl en
análisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores levemente mayores.
Desventajas
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Incluye nitrógeno inorgánico.
Requiere pequeñas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente dividida y
homogénea para minimizar el error de muestreo.
Este método no puede aplicarse a material húmedo por lo que debe efectuarse
un secado previo.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
3. Determinación de Nitrógeno no proteico
Pesar con exactitud 0,5-1 gr de muestra y dispersarla en 10 ml de agua destilada.
Agregar 10 ml de ácido tricloroacético 24%, homogeneizar y centrifugar. Tomar una
alícuota de sobrenadante límpido y determinar N por el método de Kjeldahl.
4. Determinación de Nitrógeno álcali lábil: Método de
Determinación de proteínas en leche por destilación directa.
Kofranyi
Es un método rápido basado en la liberación de amoníaco cuando la leche es
calentada a ebullición en solución alcalina. La mayor parte del amoníaco liberado
proviene de la rápida hidrólisis de glutamina y asparagina.
MÉTODOS EXTRACTIVOS COLORIMÉTRICOS
a) Método de Biuret
La reacción se caracteriza por una coloración púrpura cuando los iones cúpricos son
complejados por los enlaces peptídicos a pH alcalino. El matiz del color depende del
tipo de proteína y su intensidad depende del contenido de proteína presente.
Reactivo utilizado Solución alcalina conteniendo iones cúpricos complejados con
tartrato de sodio y potasio.
Lectura: 550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces.
Ventajas
 No hay interferencia de aminoácidos libres
 Pequeña influencia de la composición del aminoácido en el desarrollo de color.
La operación es simple y se puede manejar números grandes de muestras.
Desventajas
 Interferencia de amoniaco, buffer, detergentes, etc.
 Baja sensibilidad.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
b) Método "dye-binding"
Se caracteriza por la formación de un coágulo de proteína coloreado e insoluble
producto de la reacción de la proteína con una solución coloreada de ácido
sulfónico a pH 2. El anión coloreado se une por asociaciones electrostáticas a los
sitios básicos de la proteína, por ejemplo, a los grupos Mamino de lisina, guanidina
de arginina, imidazol de histidina y aminos terminales. Además, se producen
atracciones intermoleculares por interacciones hidrofóbicas entre la proteína y la
mitad no iónica del anión y entre el anión unido a proteína y la mitad no iónica del
anión en solución. El coágulo se separa por filtración y se mide colorimétricamente
el exceso de tintura en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido
de proteína.
Lectura A 595 nm
Consideraciones
El método es empírico por lo que se debe buscar la concentración de tintura ideal
que sature la proteína y forme el coágulo pero que no pierda sensibilidad.
Ventajas
 Útil en análisis de rutina de muestras similares. Económico y rápido. Preciso
como el método de Kjeldahl. Usado como método de referencia.
Desventajas
 Dificultad en encontrar tinturas puras. Desuniformidad en la calidad de las
tinturas de un lote de fabricación a otro, por lo que se requiere la calibración del
método con cada lote. No es aplicable a alimentos que varíen su contenido en
grupos aminos (proteólisis, pardeamiento).
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
c) Método de Bradford
Rango: 0.01-0.5 mg/ml
Reactivos:
Solución colorante: Disolver 100 mg de Serva Blue G (Serva, Westbury, NY) o
Coomassie Brilliant Blue G-250 en una mezcla de 100 ml de ácido fosfórico 85% y
50 ml de etanol 95%. Una vez que el colorante se disolvió completamente, llevar a
1 litro con agua destilada fría. NaOH 1M.
Procedimiento:
Prender el espectrofotómetro 15 min antes de usarlo. Poner 20l de muestra en
un tubo de hemólisis. Agregar 50l de NaOH 1N (alternativamente, el NaOH puede
agregarse al reactivo de color en la relación 50l/ml). Agregar 1 ml de reactivo de
color e incubar 5 min. Medir la absorbancia a 590 nm en cubetas de vidrio o
poliestireno.El azul brillante G- 250 se adhiere a la proteína.
El colorante se torna de rojizo a azulado y el máximo de absorción del colorante
cambia de 465 nm a 595 nm. El cambio en la absorbancia a 595 nm es proporcional
a la concentración de proteína en la muestra.
d) Método de Lowry
Se basa en la reacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con las proteínas. Si bien el
mecanismo de reacción no está bien dilucidado, se sabe que la tirosina, y en menor
extensión la cisteína, la cistina, la histidina y las uniones peptídicas, reaccionan
reduciendo al molibdato a azul de molibdeno. La reacción también puede
producirse en presencia de tungstato, para generar azul de molibdeno
y tungsteno.
El complejo da un color azul característico que se mide a 745-750 nm.
Los iones Cu2+ en medio alcalino facilitan la reacción de reducción del
reactivo de Folin formando un complejo con la unión peptídica a través
del nitrógeno involucrado en el enlace y reduciéndose a Cu1+. El Cu1+ y
los residuos involucrados reducen entonces al reactivo de Folin
generando el color característico.
Interferencias:
 Fenoles excepto nitrofenoles y otras sustancias reductoras (mercaptoetanol,
ditiotreitol, etc.) por reducción del reactivo de Folin.
 Glicina: por disminuir la intensidad del color desarrollado.
 Sustancias o buffers que acidifiquen el medio.
 Agentes quelantes del cobre.
Rango: 0.05-0.4 mg/ml
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
Reactivos:
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Na2CO3 2% en NaOH 0.1N: Solución A
CuSO4.5H2O 1.0%
Tartrato de Na y K 2%
Solución de Folin: Reactivo de Folin Ciocalteau diluido con agua destilada 1:1
Ventajas
 Alta sensibilidad
 Fácil de operar
 Fácil de manejar un gran número de muestras
Desventajas
 La respuesta del color varía de acuerdo al tipo o composición de la proteína.
 Interfieren muchos compuestos
 Inestabilidad del reactivo Folin Ciocalteau a pH alcalino.
 La curva estándar no es lineal para altas concentraciones de proteínas por lo
tanto es necesario diluir mucho antes de medir.
e) Determinación de Nitrógeno amínico: Método de Sorensen
Sirve para determinar N amínico en muestras líquidas o extractos. La finalidad es
poder determinar la concentración de amoníaco o grupos amino libre de
aminoácidos, péptido y proteínas. Es útil para dosar aminoácidos libres en jugos de
fruta, el grado de hidrólisis de una proteína, o amonio después de la destrucción de
materia orgánica en el método de Kjeldahl, etc.
Determinación:
Neutralizar 10 ml de muestra con NaOH 0,1 N
usando fenolftaleína como indicador. Es
importante no excederse en el agregado de
NaOH, detenerse en el punto en que aparece una
débil coloración rosada que persiste por 30 seg.
Otra posibilidad es utilizar un pH neutro y llegar a
pH 8.
Agregar 10 ml de formol neutralizado recientemente con fenolftaleína y titular de
inmediato la acidez liberada con NaOH 0,1 N hasta ver el punto final. Tomar este
último valor para el cálculo de N amínico y el primero para el cálculo de la acidez.
Cálculo:
g %N = VNaOH NNaOH 0,014 x 100/peso de muestra
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
MÉTODOS INSTRUMENTALES PARA DETERMINAR PROTEÍNA
1. Espectroscopia infrarroja
La espectrofotometría en el IR es una valiosa técnica para la identificación y
determinación de aminas primarias y secundarias en presencia de aminas terciarias
en mezclas. Los análisis por lo general se llevan a cabo en disoluciones
de tetracloruro de carbono y en celdas de 10 cm. Las aminas primarias se
determinan directamente midiendo la absorbancia de una combinación de la banda
de tensión N-H alrededor de 5000 cm-1 (2.0 μm); en esta región no absorben ni las
aminas secundarias ni las terciarias, estas tienen varias bandas de absorción
superpuestas en la zona de 3300 a 10 000 cm-1 (1 a 3 μm), debido a las vibraciones
de tensión N-H y sus sobretonos, mientras que las aminas terciarias no pueden
presentar estas bandas.
De este modo, una de esas bandas permite hallar concentración de la amina
secundaria después de corregir la absorción por la amina primaria.
Ventajas
 Rápido, análisis de multicomponentes No destructivo.
Desventajas
 Interferido por agua.
 Proceso de calibración complejo.
2. Espectroscopia infrarroja reflectante
La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiación infrarroja
(0,75-2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada.
Consideración
Es necesaria la calibración contra un conjunto de muestras estadísticamente
significativas, analizadas por métodos de referencia tradicionales.
Ventajas
 Rápido, análisis de multicomponentes.
 Aplicable a materiales sólidos.
 Cuantifica proteína en presencia de agua.
Desventajas
 Interfieren almidones y lípidos.
 Desplazamiento de espectro de reflectancia por humedad contenida en
las partículas.
 Proceso de calibración complejo.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
3. Espectrofotometría ultravioleta
Mide proteínas en solución con absorción máxima a 280 nm atribuible a los
anillos aromáticos de tirosina y triptófano y entre 180-220nm.
Ventajas
 Rápido, no destructivo.
 Útil para monitorear eluentes en columnas cromatográficas.
Desventaja
 Interferencia de otros compuestos (ácidos nucleicos, nucleótidos).
4. Métodos refractométricos
Mide la refracción directa de la proteína en solución o el cambio de índice
de refracción causado por la remoción de la proteína de la solución.
5. Método turbidimetrico
La turbidez producida cuando una proteína se mezcla con alguno de los
precipitantes comunes (ácido tricloroacético 3-10%, ácido sulfosalicílico y
ferrocianuro de potasio en ácido acético) para proteínas en bajas
concentraciones se puede utilizar como un índice de la concentración de
proteínas.
Las técnicas turbidimétricas son rápidas y convenientes, sin embargo las
principales desventajas que presentan es que las proteínas difieren en la
velocidad de precipitación así como no permiten diferenciar entre proteínas
y compuestos insolubles en ácidos tales como ácidos nucleicos. (Layne,
1957)
6. Espectroscopia electrónica
Irradiación del material con rayos X y cuantificación de los fotoelectrones
liberados característicos al átomo de N del grupo amida de la proteína.
Ventajas
 Buena correlación con contenido de N total.
 Pueden determinarse simultáneamente otros grupos de interés (grupos
sulfuras de aminoácidos).
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
7. Absorción a 280 nm.
La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm., la cual se
atribuye al grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptófano. La
cuantificación de proteínas basada en la absorción en la región de UV, tiene
la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña
o destruye durante la determinación. Se toma en cuenta la absorción del
disolvente, ya que este puede absorber en la misma región. Este método
sufre interferencias de compuestos que contengan anillos de purina y
pirimida. Se realiza una comparación con una proteína estándar, de la que
se debe conocer su composición. (Nollet, 1996)
Ventajas
 Rápida y no destructiva
 Alta sensibilidad
 Baja dependencia de la respuesta de la señal a la composición del
aminoácido.
 Baja interferencia de ácidos nucleicos y nucleótidos.
Desventajas
 La interferencia de otros compuestos que absorben en UV.
 Se necesita usar muestras limpias y lámparas relativamente nuevas.
III.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE
LA PROTEINA
Los resultados de la proteína se expresaron como porcentaje (%) de nitrógeno que
contiene la muestra multiplicado por el factor proteínico
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
IV.
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PRINCIPALES MÉTODOS PARA DETERMINAR GRASAS
Método de Extracción de Rose-Gottlieb
Métodos butirométricos
Método de Goldfish
Método de Bligh – Dyer
Método de Gerber
Método de Mojonnier
Índice De Refracción
Índice De Acidez
Índice de Peróxidos
Índice de yodo
Determinación del Contenido de Grasas Sólidas (SFC) en Grasas Comestibles utilizando
el analizador de RMN Spin Track
Espectroscopia de reflectancia en el Infrarrojo cercano
1. Método de extracción intermitente (método Soxhlet)
En este procedimiento se emplea un equipo diseñado de modo que una porción
fresca del solvente esté en contacto con la muestra por un tiempo relativamente
largo. Uno de los aparatos más usualmente empleados para realizar esta
determinación es el llamado equipo Soxhlet, el cual consta de un tubo extractor
provisto de un sifón y una tabuladora lateral.
Dicho extractor está conectado por su extremo inferior, a través de uniones
esmeriladas a un balón en el cual se coloca el solvente (generalmente éter de
petróleo o éter etílico); mientras que en el extremo superior se ajusta un
condensador vertical que actúa como refrigerante. En el tubo extractor se coloca
un dedal poroso que contiene la muestra y permite la entrada del éter al tiempo
que un tapón de algodón impide la salida del sólido.
El equipo se coloca en una fuente de calor a la temperatura de ebullición del
solvente, el cual se evapora, asciende por la tabuladora lateral del extractor, se
condensa en el refrigerante y cae sobre la muestra acumulándose en el tubo
extractor y atravesando las paredes porosas del dedal para hacer contacto con la
muestra y solubilizar las grasas presentes.
Cuando el nivel del solvente en el tubo extractor sobrepasa el nivel del sifón, el
extractor se descarga y pasa al balón el éter conteniendo la grasa extraída, para a
partir de ese instante, dar comienzo nuevamente el ciclo de evaporación del
solvente, condensación, caída sobre la muestra, acumulación en el aparato de
extracción y descarga. Una vez que el equipo ha estado funcionando el tiempo
especificado para cada tipo de alimento (nunca menor de 2 horas), el solvente se
elimina del balón por evaporación, quedando entonces en este último el residuo
lipídico extraído, el cual se determina por diferencia de pesada entre la masa del
balón que contiene el residuo y la masa del balón vacío, previamente tarado.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
Los resultados se expresan en porciento según:
% 𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂 =
𝐦(𝐠𝐫𝐚𝐬𝐚)
𝐦(𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚)
% 𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂 =
𝐦(𝐛𝐚𝐥ó𝐧 𝐠𝐫𝐚𝐬𝐚) − 𝐦(𝐛𝐚𝐥ó𝐧 𝐯𝐚𝐜í𝐨)
𝒙𝟏𝟎𝟎
𝐦(𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚)
El método Soxhlet se emplea para determinación de grasa
cruda o extracto etéreo libre en productos sólidos, tales
como cárnicos, cereales, frutas y vegetales y otros de
naturaleza similar.
2. Método de Extracción de Rose-Gottlieb
Este método se basa en la extracción de la grasa a partir de una solución alcohólico
amoniacal con éter etílico y éter de petróleo, seguido de una evaporación del
solvente y posterior pesada del residuo lipídico.
En este procedimiento la muestra se coloca en un matraz de extracción provisto de
un tapón de vidrio esmerilado, al cual se añade una mezcla alcohólico amoniacal y
luego una cierta cantidad de éter etílico. Se cierra el extractor y se agita la mezcla
durante un minuto para acelerar el proceso de solubilización de las grasas en el éter.
Posteriormente el matraz se deja en reposo al menos por 2 horas o se centrifuga
durante 5 minutos a 500-600 rpm hasta que la capa de éter etílico esté totalmente
límpida y separada de la fase acuosa. Luego se trasvasa la fase etérea, por
decantación a un erlenmeyer o matraz de fondo plano y se realiza una segunda
extracción sobre la fase acuosa añadiendo éter de petróleo y siguiendo el
procedimiento arriba indicado. La capa etérea se trasvasa al mismo erlenmeyer de
la primera extracción y el solvente se elimina por destilación y posterior secado en
estufa. Finalmente, el erlenmeyer conteniendo la grasa se pesa en balanza analítica
y los resultados se expresan en porciento según:
𝐦(𝐠𝐫𝐚𝐬𝐚)
% 𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂 =
𝐦(𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚)
% 𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂 =
𝐦(𝐛𝐚𝐥ó𝐧 𝐠𝐫𝐚𝐬𝐚) − 𝐦(𝐛𝐚𝐥ó𝐧 𝐯𝐚𝐜í𝐨)
𝒙𝟏𝟎𝟎
𝐦(𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚)
El método de extracción de Rose-Gottlieb se emplea para muestras líquidas y
encuentra su mayor aplicación en la determinación de grasas en leches naturales,
pasteurizadas, esterilizadas, evaporadas, condensadas, concentradas y leche en
polvo.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
Los solventes utilizados y el número de extracción que se realiza pueden variar en
función del tipo de producto. Así mismo en casi todos los casos suele realizarse un
ensayo en blanco, cuya magnitud debe restarse al peso del residuo lipídico obtenido
durante la extracción en la muestra.
Las diferencias fundamentales entre este procedimiento y la extracción con el
equipo Soxhlet radican en que aquí no se recircula el solvente de extracción y el
tiempo de análisis se reduce considerablemente.
3. Métodos butirométricos
Los métodos butirométricos se fundamentan en
la liberación de la grasa presente en la muestra
por adición de ácido sulfúrico que hidroliza las
sustancias proteicas. La fracción lipídica así
liberada se separa por centrifugación y se mide
directamente la altura de la columna de grasa separada en la escala graduada de un
instrumento.
El procedimiento de determinación consiste en añadir al butirómetro, que contiene
la muestra previamente medida, ácido sulfúrico concentrado y alcohol isoamílico.
El butirómetro se cierra con un tapón de goma y se agita vigorosamente hasta la
total disolución de la fase proteica. Se calienta entonces la mezcla en baño de agua
(60-70ºC) durante 15-20 minutos y se centrifuga por espacio de 3-5 minutos a 8001000 rpm para separar la fase lipídica. Finalmente se coloca de nuevo el instrumento
en baño de agua (60- 70ºC) durante 5 minutos y se lee directamente el porciento de
grasa en la escala del butirómetro.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
4. Método de Goldfish
Es una extracción continua con un disolvente orgánico. Éste se calienta, volatiliza
para posteriormente condensarse sobre la muestra. El disolvente gotea
continuamente a través de la muestra para extraer la grasa. El contenido de grasa
se cuantifica por diferencia de peso entre la muestra o la grasa removida (Nielsen,
2003).
Colocar un vaso para Goldfisch en la estufa a 100ºC hasta peso constante,
aproximadamente 2 horas.
Pesar de 4 a 5 g de muestra sobre un papel, enrollarlo y colocarlo en un cartucho de
celulosa, tapar con un algodón. Situar el cartucho en un recipiente con el fondo
perforado y colocarlo en el sostenedor del equipo.
Adicionar en el vaso para Goldfisch aproximadamente 40 mL del disolvente éter
etílico) y colocarlo en el equipo mediante un anillo de hierro con empaque de hule.
Subir la parrilla girando hacia un lado y al contrario. Calentar hasta la extracción
completa de la grasa. Para verificar que se ha extraído toda la grasa, dejar caer una
gota de la descarga sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar
residuo de grasa
Al finalizar, cambiar el sostenedor del cartucho por un recipiente sin perforación y
calentar de nuevo para recuperar el disolvente del vaso.
Quitar el vaso del equipo y secar el extracto en una estufa a 100ºC por 30 min.,
enfriar y pesar. Calcular el porcentaje de grasa. (Pomeranz, 2000)
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
5. Método de Bligh – Dyer
El método de Bligh – Dyer así como su modificación por Hanson y Olley proporciona
un método rápido para la extracción de lípidos de tejidos y productos alimenticios
que contienen una cantidad significativa de agua. El método se basa en la
homogenización de la muestra con cloroformo, metanol y agua en proporciones
tales que se forme una sola fase miscible con el agua de la muestra. Al añadir
alícuotas de cloroformo y agua se logra la separación de fases. El material lipídico se
encuentra en la fase no acuosa, mientras que el material no lipídico se encuentra en
la fase acuosa. Los lípidos se pueden extraer de 2 gr de muestra seca hasta 20 gr de
muestra húmeda.
El contenido de agua de la muestra se ajusta a 16 ml para conservar la proporción
de cloroformo, metanol y agua la cual es esencial si se pretende una separación de
fases y una extracción cuantitativa de lípidos. La ventaja de este procedimiento es
que las etapas de filtrado y lavado son eliminadas. Sin embargo no es un método
muy cuantitativo y tiene un elevado margen de error para muestras secas de
cereales. (Rossell y Pritard, 1991).
6. Método de Gerber
Éste, así como los demás métodos volumétricos presentan un carácter un tanto
cuanto empírico ya que varios factores afectan la gravedad específica de la grasa
separada, variaciones propias de la grasa, ácidos grasos presentes, solubilidad de la
grasa en los disolventes, etc. Con estos métodos volumétricos la muestra se sitúa
en un butirómetro y se descompone utilizando ácidos o álcalis de manera que la
grasa es liberada, esta se separa por métodos mecánicos (centrifuga) y se colecta
en el cuello calibrado. (Boekenoogen, 1964)
7. Método de Mojonnier
La grasa es extraída con una mezcla de éter etílico y éter de petróleo en un matraz
de Mojonnier, la grasa extraída se pone a peso constante y es expresada en
porcentaje de grasa por peso. La prueba de Mojonnier es un ejemplo de extracción
discontinua con disolvente. Esta extracción no requiere remover previamente la
humedad de la muestra. (Nielsen, 1998)
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
8. Índice De Refracción
Es el cambio de dirección que experimenta una onda al pasar de un medio a otro
distinto. Es una constante que depende del carácter y del estado de la sustancia
analizada. En general los Índices de refracción de las sustancias grasas oscilan entre
1.4600 y 1.5000 a más o menos 15 o 20 grados centígrados. Como es una constante
es importante tanto para identificar como para el análisis cuantitativo. Además, está
relacionado con el peso molecular y la instauración. Es un índice rápidamente
determinable y es muy útil para seguir un proceso de hidrogenación y sirve para
determinar el IY. El aumento de la temperatura y de los ácidos grasos libres baja el
Índice de Refracción. Para los aceites la determinación se hace a 25 grados
centígrados, para las grasas parcialmente hidrogenadas a 40, para grasas
hidrogenadas a 60 y para ceras a 80. Se pueden hacer las determinaciones a otras
temperaturas, pero se deben hacer las correcciones.
Si es un aceite se suma si la temperatura es mayor de 25 grados y el factor es
0.000385, igualmente se resta si la temperatura es menor de 25 grados.
Si es una grasa se emplea el factor 0.000365.y se suma o resta de igual forma.
Para hacer esta medición se emplea el refractómetro de ABBE con escalas de 1.3 a
1.7. Si el equipo permite calibrar la temperatura se debe hacer antes de empezar el
análisis.
9. Índice De Acidez
El índice de acidez se define como los miligramos de NaOH o KOH necesarios para
neutralizar los ácidos grasos libres presentes en 1 gramo de aceite o grasa, y
constituye una medida del grado de hidrólisis de una grasa.
Todos los aceites y las grasas tienen ácidos grasos libres y algunos los tienen en
grandes cantidades. La causa de la existencia de ácidos grasos libres es la actividad
enzimática de las lipasas. Todas las semillas y los frutos oleaginosos tienen presentes
algunas de estas enzimas lipolíticas que se encuentran tanto en el embrión como en
el mesocarpio del fruto. Por este motivo, el aceite de arroz y el de palma, por lo
general, tienen una acidez muy alta. Hidrolíticas. Los aceites extraídos de semillas
descompuestas tienen acidez alta, al igual que los aceites almacenados durante
mucho tiempo.
El comportamiento del Índice de Acidez (expresado como % de Ácido Oleico)
durante el almacenamiento en los aceites y grasas comestibles evidencia un
incremento en una primera etapa, como resultado de la actividad enzimática de las
lipasas, hasta alcanzar un valor máximo, a partir del cual comienza a disminuir. Esta
disminución pudiera ser explicada por el hecho de que los ácidos grasos libres hayan
comenzado a oxidarse a compuestos oxigenados, como por ejemplo los
hidroperóxidos, por la acción de agentes químicos (oxígeno, temperatura,
luz, trazas metálicas) o agentes bioquímicos (microorganismos, enzimas lipoideas)
o la combinación de ambos, en función de las condiciones de almacenamiento y de
la composición del aceite almacenado.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
Este comportamiento permite inferir que la determinación del Índice de Acidez no
ofrece por sí sola información concluyente sobre el estado cualitativo de un aceite.
Así, un valor bajo pudiera indicar: o bien que el producto está poco hidrolizado, o
bien que el estado de deterioro es más avanzado y que parte de los ácidos grasos
libres han comenzado a oxidarse.
De ahí la necesidad de realizar otros análisis (Índices de Peróxidos, Yodo y
Saponificación, entre otros), si se desea obtener información fidedigna del
estado de un aceite o grasa
10. Índice de Peróxidos
Se expresa como los mili equivalentes de oxigeno activo presentes en 1000 g
de aceite o grasa, y nos proporciona información sobre el grado de oxidación de
un aceite. En las primeras etapas de la rancidez oxidativa se producen diversos
peróxidos que modifican las propiedades sensoriales de la grasa, por lo que la
prueba del índice de peróxido sólo es representativa en las primeras etapas de
la oxidación de grasas.
11. Índice de yodo
El índice de yodo es una medida del grado de insaturación de los componentes de
una grasa. Será tanto mayor cuanto mayor sea el número de dobles enlaces por
unidad de grasa, utilizándose por ello para comprobar la pureza y la identidad de las
grasas (p.e., el índice de yodo del ácido oleico es 90, del ácido linoleico es 181 y del
ácido linolénico 274). A la vez que los dobles enlaces de los ácidos grasos
insaturados se determinan también las sustancias acompañantes insaturadas, por
ejemplo, los esteroles. El yodo por sí mismo no reacciona con los dobles enlaces. En
su lugar se utilizan bromo o halogenuros mixtos como ICl o IBr. El método recibe
distintos nombres dependiendo del reactivo empleado. La adición de halógenos a
los dobles enlaces depende de la constitución y configuración de los compuestos
insaturados, del tipo de halógeno y de disolvente, así como delas condiciones
externas. La reacción no es cuantitativa. Por ello, para que los resultados sean
repetibles, hay que establecer exactamente unas condiciones de trabajo
estandarizadas e indicarla metodología utilizada.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
MÉTODOS INSTRUMENTALES PARA DETERMINAR GRASA
1. Determinación del Contenido de Grasas Sólidas (SFC) en Grasas Comestibles
utilizando el analizador de RMN Spin Track
La determinación del contenido de Grasas Sólidas por RMN se basa en la medición
directa de la proporción entre las fases sólidas y líquidas de la muestra.
Después de la excitación de la muestra al aplicar un pulso de RF de 90o una FID (Decaída
de Inducción Libre) es generada. La FID es la señal que se forma durante el proceso de
relajación de los protones (hidrógenos) al volver éstos a su estado de equilibrio. La FID
contiene contribuciones de las dos fases (sólida y líquida). Los protones de la fase líquida
son más rápidos que los protones de la fase sólida causando la caída de la señal de la
fase sólida antes de la caída de la fase líquida. La información aportada por las dos fases
de la FID es de gran importancia al calcular el contenido SFC.
Fig. 1. Determinación del SFC usando el FID
El valor SFC se determina mediante dos puntos de medida en la FID. La amplitud de la
FID en el punto S corresponde a la totalidad de los protones en ambas fases, sólida y
líquida, mientras el punto L corresponde a los protones de la fase líquida sola. La
proporción específica se calcula utilizando la formula enseñada en Fig. 1. Esta
proporción se considera como el valor SFC de la muestra.
El factor-F (f) permite predecir el valor de la amplitud de la FID inmediatamente después
del pulso RF de 90o que es imposible medir directamente debido al tiempo muerto. El
factor-F aumenta la precisión de los análisis y se determina su valor durante el
procedimiento de calibración.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
El volumen de la muestra es de 1-3 ml. El ciclo para el análisis SFC es de una curva de
fundición de 6 puntos mediante el uso de contenedores especiales, controlados por
termostatos, para las muestras:

La muestra a analizar se funde a 80 – 100°C y mantenida durante 15 min. Se
prepara 6 muestras.

La temperatura de todas las muestras se mantiene a 60oC durante 5-15 min.

La temperatura de todas las muestras se mantiene a 0oC durante 60 min.

Cada muestra se mantiene a una temperatura requerida para el análisis
(típicamente 10oC / 15oC / 20oC / 25oC / 30oC / 35oC) durante 30 - 35 min.

Cada muestra se introduce en la sonda e inicia el proceso de su análisis. El ciclo
completo requiere 110 minutos. El análisis del SFC por RMN no necesita más de 6
segundos. También es posible utilizar una sola muestra para todo el ciclo, pasando
por las diferentes temperaturas, pero no es muy recomendable porque requiere
casi doble el tiempo.
2. Espectroscopia de reflectancia en el Infrarrojo cercano
La espectroscopia en el infrarrojo cercano se ha convertido en una técnica importante
para la determinación rutinaria de los constituyentes en sólidos finamente divididos. De
hecho, es ampliamente utilizada en la determinación de proteínas, humedad, almidón,
aceites, lípidos y celulosa en productos agrícolas tales como granos y aceites de
semillas.
En la espectroscopia de reflectancia en el Infrarrojo cercano la muestra finamente
pulverizada se irradia con una o más bandas de radiación de longitud de onda
comprendida entre 1 y 2.5 μm, o 10 000 y 4000 cm-1. Se produce una reflectancia
difusa, en la que la radiación penetra a través de la superficie de la capa de partículas,
excita los modos de vibración de las moléculas del analito, y luego se dispersa en todas
las direcciones. De este modo, se produce un efecto de reflectancia que depende de la
composición de la muestra.
V.


EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE
LAS GRASAS
Los resultados se informan en % de materia grasa en base seca o húmeda.
Índice de Acidez (expresado como % de Ácido Oleico)
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
VI.
PRINCIPALES METODOS PARA DETERMINAR MINERALES






Determinación de cenizas en seco
Determinación de cenizas en húmedo
Método Mohr (Determinación de cloruros)
Método AOAC 944.02 (Determinación de hierro)
Determinación de calcio (Método AOAC 944.03). Titulación con permanganato
Determinación de calcio (Método NOM-187-SSA1/SCFI-2002). Formación de
complejo con EDTA.
DETERMINACIÓN DE CENIZAS
El valor principal de la determinación de cenizas (y también de las cenizas solubles
en agua, la alcalinidad de las cenizas y las cenizas insolubles en ácido) es que supone
un método sencillo para determinar la calidad de ciertos alimentos, por ejemplo en
las especias y en la gelatina es un inconveniente un alto contenido en cenizas. Las
cenizas de los alimentos deberán estar comprendidas entre ciertos valores, lo cual
facilitará en parte su identificación. (Kirk et al, 1996)
En los vegetales predominan los derivados de potasio y en las cenizas animales los
del sodio. El carbonato potásico se volatiliza apreciablemente a 700°C y se pierde
casi por completo a 900°C. El carbonato sódico permanece inalterado a 700°C, pero
sufre pérdidas considerables a 900°C. Los fosfatos y carbonatos reaccionan además
entre sí. (Hart, 1991)
Para la determinación de cenizas se siguen principalmente 2 métodos, en seco y
vía húmeda.
1. Determinación de cenizas en seco
La determinación en seco es el método más común para cuantificar la totalidad de
minerales en alimentos y se basa en la descomposición de la materia orgánica
quedando solamente materia inorgánica en la muestra, es eficiente ya que
determina tanto cenizas solubles en agua, insolubles y solubles en medio ácido.
En este método toda la materia orgánica se oxida en ausencia de flama a una
temperatura que fluctúa entre los 550 -600°C; el material inorgánico que no se
volatiliza a esta temperatura se conoce como ceniza. (Nollet, 1996)
Ventajas:
 Es simple
 No se requiere atención durante la generación de cenizas
 No se requieren reactivos
 Se pueden manejar muchas muestras es un método estándar para la
determinación de cenizas.
 Se puede determinar cualquier tipo de materia inorgánica.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
Desventajas:
 Se requiere alta temperatura
 El equipo es caro
 Hay perdidas por volatilización
 Hay interacciones entre minerales y recipientes
 Hay absorción de elementos traza por recipientes de porcelana o sílice
 Poca utilidad para análisis de Hg, As, P y Se.
 Calentamiento excesivo puede hacer ciertos componentes insolubles
 Hay una dificultad de manejo de cenizas por ser higroscópicas, sensibles a la luz.
2. Determinación de cenizas en húmedo.
La determinación húmeda se basa en la descomposición de la materia orgánica en
medio ácido por lo que la materia inorgánica puede ser determinada por gravimetría
de las sales que precipiten, y también por algún otro método analítico para las sales
que permanezcan en disolución acuosa o ácida. Para la determinación húmeda se
dan cenizas alcalinas, ácidas y neutras y esto se basa en el tipo de anión o catión ya
sea metálico o complejo de tal forma hay minerales como tartratos, citratos que
producirán cenizas con un carácter alcalino. Es necesario tomar en cuenta que
también un índice de alcalinidad de cenizas es muestra del contenido de carbonatos
en disolución acuosa. Las ventajas y desventajas de estos métodos se muestran en
la tabla 2. (Nollet, 1996)
Ventajas:
 Relativamente no se requiere alta temperatura
 El dispositivo es simple
 La oxidación es rápida
 Se mantiene la disolución acuosa lo cual es bueno para análisis mineral
 El equipo no es caro
 No hay volatilización de minerales
Desventajas:
 Se requieren altas cantidades de materiales corrosivos
 Se requieren ácidos explosivos
 Se requiere estandarizar los reactivos
 Las reacciones son fumantes
 Manejar sistemáticamente varias muestras no es sencillo
 El procedimiento es tedioso y gasta mucho tiempo
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
3. Método Mohr (Determinación de cloruros)
El método se utiliza para determinar iones cloruro y bromuro de metales alcalinos,
magnesio y amonio. La valoración se hace con solución patrón de nitrato de plata.
El método se basa en la formación de un precipitado ladrillo proveniente del
cromato de plata formado a partir del precipitado de cloruro de plata, una vez que
todo el Cl- haya reaccionado con el nitrato de plata. (Nielsen, 1998)
Cl-+ Ag+
AgCl (Precipitado blanco)
+
2 Ag + CrO4=
AgCrO4 (Precipitado rojo ladrillo)
La solución debe tener un pH neutro o cercano a la neutralidad. Un pH de 8.3 es
adecuado para la determinación.
Medir 10 mL de una solución al 1% de su muestra en un matraz Erlenmeyer de 150
mL, adicionar 15 mL de agua destilada y 1 mL de cromato de potasio al 5%,
posteriormente titular con una solución patrón de nitrato de plata 0.1N hasta que
aparezca un precipitado seguido de un color rojo ladrillo que permanezca por lo
menos 30 segundos.
NOTA. En caso de que la solución problema presente sólidos en suspensión filtre
antes de realizar la determinación.
EN CENIZAS:
Obtener por calcinación a 500-550°C las cenizas. En un matraz cónico o en crisol de
porcelana blanca lavar las cenizas con un mínimo de agua. Agregar 1 mL de solución
de cromato de potasio al 5% y titular con solución 0.1M de nitrato de plata hasta que
aparezca un color naranja.
4. Método AOAC 944.02 (Determinación de hierro)
La ortofenantrolina reacciona con el Fe2+ ,originando un complejo de color rojo
característico (ferroína) que absorbe notablemente en las regiones del espectro
visible de alrededor de 505 nm. El Fe 3+ no presenta absorción a esa longitud de
onda y debe ser reducido a Fe 2+ mediante un agente reductor apropiado, como la
hidroxilamina, (en forma de clorato para incrementar su solubilidad). (Boumans et
al, 1997)
La reducción cuantitativa de Fe3+ a Fe 2+ ocurre en pocos minutos en un medio ácido
(pH 3-4) de acuerdo a la siguiente ecuación:
4 Fe 3+ + 2 NH2OH → 4 Fe 2+ +N2O + 4 H+ + H2O
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
Después de la reducción del Fe 3+ a Fe 2+ , se da la formación de un complejo con la
adición de ortofenantrolina. En un medio acido la ortofenantrolina se encuentra en
su forma protonada como ion 1,10-fenantrolin (FenH+).
La reacción de complejación puede ser descrita por la siguiente ecuación: (La
estructura química del complejo se muestra en la figura 2)
Fe 2+ + 3 FenH+ → Fe(Fen)3 3+ + 3 H+
Fig. 2. Estructura química de la ferroína.
Consiste en 3 moléculas de OP
(ortofenantrolina) alrededor de un
átomo central de Fe. Los átomos de
carbono de la ferroína están
representados con sombras grises. Los
átomos de N están representados en
blanco
Dilución de las cenizas: Al crisol frío añadir con pipeta y en la campana 2mL de HCl
concentrado para disolver las cenizas. Evaporar en la campana, enfriar añadir 1 mL
de HCl conc. y 3.5 mL de agua destilada, con un agitador de vidrio tratar de disolver
las cenizas en su totalidad. Pasar cuantitativamente el líquido en un matraz aforado
de 50 mL. Volver a lavar el crisol con agua por dos o tres veces más, pasando los
líquidos de lavado al matraz y después aforar.
Cuantificación del fierro: Filtrar la solución de cenizas y tomar alícuotas de 10 mL.
Desarrollar el color añadiendo en el siguiente orden: 1 mL de solución clorhidrato
de hidroxilamina (al 10%) y agitar, 5 mL de buffer de acetatos (8.3 g de acetato de
sodio anhidro y 12 mL de ácido acético en 100 mL) y agitar y 1 mL ortofenantrolina
(0.1g en 80mL de agua destilada a 80°C, enfriar y aforar a 100 mL) y agitar. Dejar en
reposo entre 10 y 15 min. Leer a 530 nm frente a un blanco preparado con agua
tratada de la misma manera. Es muy importante añadir los reactivos en el orden
descrito.
La concentración de fierro se obtiene interpolando en una curva patrón preparada
a partir de una solución de sulfato ferroso amoniacal (3.512 g de
Fe(NH4)2(SO4)2*6H2O en agua con unas gotas de HCl y aforar a 500 mL, diluyendo
10 mL a 1 L) tratada de la misma forma, en concentraciones de 0.01 a 0.1 mg/mL de
fierro.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
5. Determinación de calcio (Método AOAC 944.03). Titulación con
permanganato
El Calcio se precipita a pH 4 como oxalato (si hay fosfato presente se puede eliminar
con ácido acético), posteriormente el oxalato se disuelve en ácido sulfúrico
liberando ácido oxálico el cual se titula con una solución valorada de permanganato
de potasio. (James, 1999)
Las reacciones involucradas son:
1. Precipitación del Calcio con Oxalato de Amonio.
CaCl2 + (NH4)2C2O4 → 2NH4Cl + CaC2O4
2. Liberación del ácido oxálico por la acción del ácido sulfúrico sobre el oxalato de
calcio CaC2O4 + H2SO4 → CaSO4 + H2C2O4
3. Titulación del ácido oxálico con permanganato de potasio
5H2C2O4 + 2KmnO4 + 3H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 10CO2
6. Determinación de calcio (Método NOM-187-SSA1/SCFI-2002).
Formación de complejo con EDTA.
Cuando se añade a una muestra conteniendo Calcio (o Magnesio), ácido
etilendiaminotetracético (EDTA) o su sal, los iones se combinan con el EDTA. Se
puede determinar Calcio en forma directa, añadiendo NaOH para elevar el pH de la
muestra entre 12 y 13 unidades, para que el magnesio precipite como hidróxido y
no interfiera, se usa además, un indicador que se combine solamente con el calcio
(azul de hidroxinaftol).
En el análisis de Calcio la muestra es tratada con NaOH 4N para obtener un pH de
entre 12 y 13, lo que produce la precipitación del magnesio en forma de Mg(OH)2.
Enseguida se agrega el indicador azul de hidroxinaftol que forma un complejo de
color rosa con el ion calcio y se procede a titular con solución de EDTA hasta la
aparición de un complejo color púrpura:
Reacciones :
Ca+2 + Mg+2 + NaOH (4N) --------->Mg (OH)2 + Ca+2
Ca+2 + Indicador (azul hidroxinaftol) ------> [azul hidroxinaftol- Ca++] (color rosa)
[azul hidroxinaftol - Ca++] + EDTA --------> [ EDTA - Ca+2 ] + azul hidroxinaftol (color
púrpura)
A 50 mL de muestra se añaden 2 mL de solución de hidróxido de sodio 1N o
un volumen suficiente para obtener un pH de 12-13 y una punta de espátula
de indicador, y se valora con solución de EDTA 0,01M hasta viraje de rosa a
púrpura.
VII.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE
LOS MINERALES
 Los minerales son expresados en mg; por ejemplo Calcio, Fosforo, Hierro etc. Y
en ug o mcg como el Selenio, Manganeso, Cobre, Yodo, etc.
BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
BIBLIOGRAFÍA
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