Galactosemia tipo III En los seres humanos, las mutaciones en GALE resultan en un trastorno autosómico recesivo conocido como galactosemia de tipo III, una enfermedad rara caracterizada por la incapacidad para metabolizar galactosa con síntomas que pueden incluir cataratas de inicio temprano, daño hepático, sordera y retraso mental. Se cree que estos síntomas ocurren como resultado de la acumulación de metabolitos intermedios de galactosa y la reducción de especies de azúcares de UDP (Uridina difosfato), que son necesarios para la glicosilación (La glucosilación es un proceso bioquímico en el que se adiciona un glúcido a otra molécula. Esta molécula se denomina aceptor. La molécula aceptora puede ser de muchos tipos, por ejemplo de naturaleza protéica o lipídica). Otros tipos de galactosemia se tratan con una dieta sin galactosa. Sin embargo, debido al doble papel de GALE, se recomienda a los pacientes con galactosemia de tipo III que sigan una dieta galactoserestra para evitar la deficiencia de UDP-gal. Esta dieta solo alivia parcialmente los graves síntomas de la galactosemia tipo III, y se ha propuesto que los pacientes reciban UDP-galNAc como tratamiento adicional. Figura 1 El papel de GALE en la biosíntesis de diferentes azúcares UDP. Las enzimas en la vía Leloir están en caja. GALE participa en el tercer paso de la vía Leloir y en la producción de UDPgalNAc y UDP-glcNAc. También están representadas otras vías metabólicas que participan en la producción de UDP-glc y UDPglcNAc. El nematodo de vida libre C. elegans ha sido muy útil para estudios de desarrollo, enfermedad y otros procesos biológicos, incluyendo la glicosilación Se han producido diferentes mutaciones que afectan a las enzimas involucradas en la síntesis de proteoglicanos, N-glicosilación, O-glicosilación y síntesis de quitina y glicolípidos Aislados en este organismo. Estudios genéticos y bioquímicos han demostrado que la mayoría de los genes implicados en la glicosilación se conservan en humanos. Curiosamente, la mayoría de las mutaciones que afectan el proceso de glicosilación muestran defectos de desarrollo. Por ejemplo, la mayoría de los mutantes defectuosos en la invaginación epitelial vulvar, la clase mutante sqv, resultado de los genes implicados en la biosíntesis de la condroitina glicosaminoglicana, y mutaciones que afectan a la N-glicosilación conducen al desarrollo de las gónadas deformadas. Uno de los genes implicados en el desarrollo de las gónadas es el MIG-17, miembro de la familia ADAM (desintegrina y metaloproteasa). MIG-17 es una glicoproteína que es secretada por las células musculares y se difunde a la membrana basal de la gónada, donde su función es necesaria. Las mutaciones que afectan al estado de glicosilación del MIG-17 previenen la localización del MIG-17 en la membrana basal y, como consecuencia, exhiben un defecto de migración de las gónadas similar al de los mutantes mig-17. El análisis de los mutantes en los que se afecta la migración gonadal ha permitido la identificación de muchos elementos diferentes implicados en el proceso de glicosilación, lo que indica que C. elegans es un modelo apropiado para estudiar los mecanismos de glicosilación durante el desarrollo. El proceso de glicosilación de proteínas comienza en el retículo endoplásmico (ER), que también es responsable del plegamiento de proteínas, tráfico, control de calidad, degradación y la respuesta coordinada a la acumulación de proteínas desplegadas. Tres proteínas, conservadas en todos los metazoos, están implicadas en la detección del estrés causado por la acumulación de proteínas desplegadas de la proteína quinasa PERK (quinasa de retina endoplasmática de tipo quinasa de proteína quinasa); El factor de transcripción ATF-6 (factor de transcripción activador 6); Y XBP-1 (proteína de unión a Xbox), un factor de transcripción que se activa después de la escisión del ARN mensajero xbp-1 por IRE-1 (enzima que requiere inositol 1, endonucleasa residente en el ER). Estos sensores activan la vía de respuesta de la proteína desplegada (UPR), iniciando una respuesta compleja que implica la degradación de las proteínas, interrumpe la traducción general y mejora la expresión de chaperones, como las proteínas de choque térmico hsp-4 y hsp-3 en C. elegans. En este estudio, hemos informado de la caracterización de dos mutaciones en la C. elegans GALE ortholog, un knockout alelo, y una reducción de la función alelo. Encontramos que la pérdida de función de gale-1 en C. elegans es letal. El mismo efecto letal también se ha demostrado en Drosophila y ha sido la hipótesis para los seres humanos. Esta condición complica el análisis fenotípico y es diferente a la condición encontrada en la galactosemia de tipo III en humanos, en la que los pacientes muestran una reducción de la actividad GALE pero nunca una completa falta de actividad. Estudiamos el alelo de reducción de la función gale-1 (pv18) en detalle porque este alelo permite estudios fisiológicos y genéticos. Se observó que los cambios en el perfil UDP-azúcar encontrado en gale-1 (pv18) son coherentes con una reducción de la actividad de GALE. El aumento del nivel de UDP-gal puede explicarse por la incapacidad de metabolizar la galactosa en la dieta, y la fuerte reducción de los niveles de UDP-galNAc puede atribuirse al hecho de que GALE es la principal enzima responsable de la biosíntesis de UDPgalNAc. Por el contrario, UDP-glc y UDP-glcNAc se sintetizan también por vía independiente de GALE (Figura 1), lo que puede explicar por qué los cambios observados en los niveles de estos azúcares no son estadísticamente significativos. Estos datos, junto con la naturaleza recesiva de gale-1 (pv18), sugieren fuertemente que se trata de un alelo viable de reducción de la función similar a la situación descrita en pacientes con galactosemia tipo III. Aunque todos los homólogos GALE son capaces de metabolizar UDP-gal y UDP-glc, no todas las especies son capaces de interconectar UDP-glcNAc y UDP-galNAc. La fuerte reducción de UDP-galNAc observada en el gale-1 (pv18) mutante indica que C. elegans GALE-1 puede lograr esta reacción, al igual que GALE humanos. Los pacientes afectados por la galactosemia tipo III son sensibles a la galactosa en la dieta, probablemente como resultado de la acumulación de metabolitos tóxicos de la galactosa intermedia. Como era de esperar, los animales gale-1 (pv18) son hipersensibles a una dieta rica en galactosa, que ha sido reportada no sólo para humanos, sino también para Drosophila y Saccharomyces cerevisiae. Los efectos tóxicos de concentraciones elevadas de galactosa observadas en C. elegans incluyen retraso en el desarrollo y detención en etapas L1. Sorprendentemente, este efecto se produce añadiendo no sólo galactosa, sino también otros azúcares, aunque sólo con galactosa se observa un efecto dosis-dependiente, lo que sugiere una interacción más directa con este azúcar o con metabolitos derivados de galactosa. En este trabajo, también hemos observado que una disminución en la función de GALE-1 activa la ruta de respuesta de proteína desplegada, posiblemente generando un estrés crónico ER. El azúcar reducido en gale-1 (pv18), UDP-galNAc, no participa en la glicosilación llevada a cabo en el ER, lo que sugiere que el estrés observado en este organelo puede ser causado no por una reducción de este sustrato en el ER sino por La glicosilación incorrecta de proteínas implicadas en las funciones de ER o quizás por alteraciones de la relación UDP-glucosa / galactosa. De hecho, se ha demostrado que el aumento de galactosa o metabolitos galactosados induce la activación de la respuesta de estrés ER por un mecanismo desconocido en un modelo de células humanas de galactosemia. Gale1 (pv18) los animales son hipersensibles a los patógenos humanos. Aunque no conocemos la naturaleza de esta sensibilidad, la investigación sugiere que el estrés de ER está implicado. Esto puede deberse a un posible deterioro de la secreción de proteínas, entre ellas las proteínas antimicrobianas, o al colapso de ER por el aumento del estrés de ER sobre la infección bacteriana. Curiosamente, la hipersensibilidad a patógenos también se ha descrito para los pacientes con galactosemia tipo I. Este fenotipo que observamos en el modelo de C. elegans para la galactosemia tipo III puede ser conservado en humanos y podría tener implicaciones médicas en el manejo de pacientes con galactosemia de tipo III. En resumen, hemos caracterizado dos mutaciones en el gen afectado en la galactosemia tipo III, un alelo knockout que presenta un fenotipo letal y un alelo de reducción de la función que es más similar a las mutaciones encontradas en pacientes humanos. Los estudios genéticos que usan el alelo de reducción de función han generado hallazgos que pueden tener implicaciones médicas: hipersensibilidad a los patógenos humanos y estrés elevado en ER. Además, se observaron fuertes defectos de desarrollo en la migración de las gónadas y en la formación de la vulva. Este organismo modelo y los mutantes descritos aquí serán útiles no sólo para aprender acerca de esta enfermedad, sino también para realizar pruebas de complementación de diferentes alelos humanos, pruebas de eficacia de fármacos o pantallas de fármacos a gran escala y por lo tanto pueden ser de especial interés para diseñar tratamientos para Galactosemia de tipo III. The Structural and Molecular Biology of Type III Galactosemia La galactosemia de tipo III es una enfermedad genética causada por mutaciones en el gen que codifica la UDP-galactosa-4-epimerasa. Una variedad de diferentes mutaciones puntuales localizadas en todo el gen puede ser responsable. Los principales efectos causantes de la enfermedad de estas mutaciones parecen ser una reducción de la constante de velocidad catalítica (kcat) y un aumento en la sensibilidad proteolítica de la proteína. Muchas de las mutaciones están distantes del sitio activo de la enzima y por lo tanto se debe suponer que afectan al pliegue total de la proteína. Aunque la enfermedad fue previamente clasificada en una forma severa, o generalizada, y en una forma esencialmente benigna, o periférica, esta distinción ha sido borrada por el trabajo reciente. En lugar de dos condiciones separadas, ahora parece que la galactosemia tipo III es un continuo y que los síntomas variarán dependiendo de la mutación(es) llevada(s) por el paciente individual. Esta nueva forma de ver la enfermedad tiene implicaciones para el tratamiento y el seguimiento a largo plazo de los pacientes. Las galactosemias son un grupo de enfermedades causadas por el metabolismo aberrante de la galactosa de azúcar. En el mundo desarrollado, por lo general se detectan mediante rutina de detección de recién nacidos. Dado que la galactosa, el epímero C-4 de la glucosa, no puede ser metabolizada directamente por la vía glicolítica, se convierte en glucosa-6-fosfato a través de la vía Leloir (La ruta de Leloir es una ruta metabólica del catabolismo de la D-galactosa,es decir de la galactólisis. Fue nombrada así en honor a Luis Federico Leloir, bioquímico argentino y premio Nobel de química en 1970. En los seres humanos esta ruta metabólica se lleva a cabo principalmente en el hígado) (Figura 1). Figura 1. La vía Leloir del metabolismo de la galactosa. Aunque la glucosa y la galactosa (a) difieren solamente en su estereoquímica en la posición 4, se requiere una vía separada (b) para convertir la galactosa en el glucosa-1-fosfato metabólicamente más útil. Las mutaciones en GALT, GALK1 y GALE dan lugar a galactosemia de tipos I, II y III, respectivamente. Esta vía consta de cuatro enzimas: 1. 2. 3. 4. galactosa mutarotasa (GALM, EC 5.1.3.3) galactoquinasa (GALK1, EC 2.7.1.6) galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT, EC 2.7.7.12) UDP-galactosa-4-epimerasa GALE, EC 5.1.3.2). Se han detectado mutaciones en estas enzimas (excepto la galactosa mutarotasa) que dan lugar a la galactosemia. Aunque hay rasgos comunes entre estas diferentes deficiencias (aumentos en las concentraciones de galactosa en sangre y el desarrollo de cataratas de inicio temprano) existen diferencias suficientes para distinguir tres tipos de galactosemia. La galactosemia de tipo III (OMIM # 230350) es causada por mutaciones en GALE. En comparación con los tipos I y II galactosemia, sólo un número relativamente pequeño de pacientes se han caracterizado en el nivel de genotipo y fenotipo. Se consideró que la enfermedad existía en dos formas: la forma severa, o generalizada, y la forma periférica mucho más suave. Los pacientes no tratados de la forma generalizada tienen actividad GALE baja (o cero) en todos los tejidos y típicamente desarrollan cataratas dentro de los primeros meses de vida; Estos son seguidos de daño hepático, renal y cerebral. El tratamiento actual para todos los tipos de galactosemia es la restricción de la galactosa dietética (y sus precursores como la lactosa). En casos de galactosemia de tipo II, esto puede ser bastante eficaz. Sin embargo, lo es menos en el caso de la galactosemia generalizada de tipo III. Esto es probable que sea en parte porque la galactosa no puede ser completamente eliminada de la dieta en estos pacientes, ya que GALE de mamíferos es responsable no solo de la interconversión de UDP-galactosa y UDP-glucosa sino también de UDP-N-acetilgalactosamina y UDP-N-acetilglucosamina. Estas moléculas son precursores clave para la síntesis de restos de azúcar en glicoproteínas. De hecho, la alteración del metabolismo del amino-azúcar puede ser un factor causal en la patología de galactosemia de tipo III. Dado que la galactosa no puede eliminarse completamente de la dieta, se produce una acumulación de la galactosa-1-fosfato intermedia tóxica que es probable que sea un segundo factor responsable de la patología. En contraste, en la forma periférica la actividad de GALE se reduce en la sangre, pero parece normal en otros tejidos. Las razones de esto no se conocen. Los síntomas son mucho más suaves; De hecho, algunos pacientes no pueden sufrir síntomas aparte de niveles alterados de galactosa y galactosa-1-fosfato sanguíneo. En tales casos no se considera necesaria ninguna intervención terapéutica. Mutaciones en udp-galactosa 4-epimerase asociadas con galactosemia de tipo iii La asociación entre una forma de galactosemia y una actividad reducida de UDP-galactosa-4epimerasa se observó por primera vez por Gitzelmann. Nuestra comprensión de este vínculo fue reforzada por la determinación de la secuencia del gen que codifica GALE y la posterior caracterización de la enfermedad asociada a mutaciones. Actualmente, se han detectado 22 mutaciones de este tipo que dan como resultado cambios de aminoácidos en la proteína y una que da como resultado una terminación prematura. De estas mutaciones, sólo una -V94M- está asociada con la forma más severa y generalizada de la enfermedad. Una sustitución de aminoácidos, V180A, se detecta comúnmente, pero no parece estar asociada con la enfermedad. Por lo tanto, es probable que surja ya sea de un error en la secuencia original o un polimorfismo en la posición correspondiente en el gen. Muchas de estas proteínas mutantes han sido estudiadas ya sea como proteínas aisladas, en extractos celulares o en sistemas modelo tales como cultivo celular o levadura. Los principales resultados de estos estudios se resumen en la Tabla 1. Los principales factores en la causalidad de la enfermedad parecen ser la reducción de la eficacia catalítica (causada principalmente por una reducción en el número de rotación, kcat) y la estabilidad disminuida. Esta estabilidad reducida da como resultado una mayor susceptibilidad de algunas proteínas mutantes a una digestión proteolítica limitada in vitro ya cantidades disminuidas de proteína intacta in vivo. La mutación asociada con la forma generalizada de la enfermedad, V94M, tiene uno de los números de rotación más deteriorados (de las mutaciones hasta ahora caracterizadas), pero no parece ser menos estable que el tipo salvaje (como se juzga por la proteolisis limitada). Una comprensión más completa de la relación entre los efectos funcionales de las mutaciones y la enfermedad-causalidad no es posible debido a dos factores -el número relativamente pequeño de pacientes caracterizados y el hecho de que muchos individuos galactosemicos son heterocigotos. Por ejemplo, G90E tiene un número de volumen de negocios que está deteriorado en una medida aún mayor que V94M y tiene una sensibilidad proteolítica más alta que el tipo salvaje. Sin embargo, sólo se ha observado en un paciente heterocigótico que fue clasificado como sufriendo de la forma periférica de la enfermedad. Sin embargo, parece probable que si un paciente era homocigótico para esta mutación, sus síntomas serían muy probablemente al menos tan graves como para los homocigotos V94M. Dado que GALE es un dímero, hay tres dímeros posibles en los heterocigotos (dos homodímeros diferentes y un heterodímero). Aunque es difícil recrear heterodímeros aislados in vitro, se han proporcionado considerables conocimientos sobre la función de los heterodímeros relevantes desde el punto de vista médico mediante estudios de diferentes mutaciones coexpresadas en la levadura S. cerevisiae. La expresión de GALE humano de tipo salvaje complementa la deleción de la levadura GALE (Gal10p) y permite el crecimiento en galactosa. La co-expresión de N34S o L313M con el tipo salvaje causó actividad reducida, lo que sugiere que estas mutaciones pueden ser negativos dominantes (parciales). Por el contrario, la coexpresión de V94M con el tipo salvaje no mostró ningún efecto negativo dominante. TERAPIAS Y TRATAMIENTOS La terapia habitual para todos los tipos de galactosemia es restringir la ingesta dietética de galactosa y su lactosa precursora. Sin embargo, este es un tratamiento insatisfactorio en el caso de galactosemia de tipo III ya que se requieren pequeñas cantidades de galactosa para la biosíntesis de UDP-galactosa. Una alternativa ideal para este tratamiento sería alguna forma de terapia génica que permitiera la restauración parcial de la actividad de GALE. Esto podría tomar la forma de reemplazo directo del gen GALE o la reingeniería de vías alternativas del metabolismo de la galactosa como se ha sugerido para la deficiencia de GALT. Incluso si el tratamiento, en efecto, causó la conversión de los síntomas de la forma generalizada a la periférica, sería una gran mejora en la calidad y cantidad de vida para los pacientes. Sin embargo, el número relativamente pequeño de pacientes y los problemas recientes con las tecnologías de terapia génica significan que esta solución es poco probable que esté disponible en un futuro próximo. En el caso de la galactosemia tipo I, donde se cree que la acumulación de galactosa-1-fosfato es un factor importante en la partenogénesis, se ha sugerido que la inhibición de GALK1 podría ser una estrategia terapéutica viable. Aunque esto imitaría los efectos de la galactosemia de tipo II, los síntomas de esta son bastante leves y se superponen con los del tipo I. Una estrategia similar, presumiblemente, reduciría los niveles de galactosa-1-fosfato en la galactosemia de tipo III. Sin embargo, no abordaría la falta de producción de UDPgalactosa y UDP-N-acetilgalactosamina en estos pacientes. Este problema tendría que ser abordado en cualquier terapia potencial para la galactosemia de tipo III. También necesitaremos más estudios bioquímicos sobre las enzimas mutantes con el fin de mejorar nuestra comprensión de las correlaciones genotipo-fenotipo. Estos estudios bioquímicos deben incluir experimentos para determinar cómo las mutaciones causantes de la enfermedad afectan el sistema de enzimas que catalizan la vía Leloir así como el GALE aislado. Estos estudios serán más informativos cuando se consideren junto con modelos in vivo tales como los sistemas de levaduras y linfoblastos. De esta manera se puede desarrollar un cuadro integrado de las causas bioquímicas y fisiológicas de la enfermedad. the metastability of human udp-galactose 4’-epimerase (gale) is increased by variants associated with type iii galactosemia but decreased by substrate and cofactor binding La galactosemia tipo III es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones que afectan la actividad de la UDP-galactosa-40-epimerasa (GALE). Se evaluó el impacto de cuatro variantes asociadas a la enfermedad (p.N34S, p.G90E, p.V94M y p.K161N) sobre la estabilidad conformacional y la dinámica de GALE. Los estudios de desnaturalización térmica mostraron que el GALE de tipo salvaje se desnaturaliza a temperaturas cercanas a las mutaciones fisiológicas y asociadas a la enfermedad a menudo reducen la estabilidad térmica de GALE. Esta desnaturalización está bajo control cinético y resulta en parte de la disociación de los dímeros. Los ligandos naturales, NAD+ y UDP-glucosa, estabilizan GALE. Los estudios de proteólisis mostraron que los ligandos naturales y las variaciones asociadas a la enfermedad afectan la dinámica local en la región N-terminal de GALE. La cinética de proteolisis siguió un modelo de dos etapas irreversible en el que la proteína intacta se escindió en Ala38 formando un intermedio de larga vida en el primer paso. NAD+ reduce la velocidad de la primera etapa, aumentando la cantidad de proteína no digerida mientras que la UDP-glucosa reduce la velocidad de la segunda etapa, aumentando la acumulación de la intermedia. Las variantes asociadas a la enfermedad afectan estas tasas y las cantidades de proteína en cada estado. Nuestros resultados también sugieren la comunicación entre los dominios en GALE. Se plantea la hipótesis de que, in vivo, las concentraciones de ligandos naturales modulan la estabilidad de GALE y que debe ser posible descubrir compuestos que imitan los efectos estabilizadores de los ligandos naturales superando la desestabilización inducida por mutación.
