Subido por john jairo sarmiento

Galactosemia tipo III Resumen

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Galactosemia tipo III
En los seres humanos, las mutaciones en GALE resultan en un trastorno autosómico recesivo
conocido como galactosemia de tipo III, una enfermedad rara caracterizada por la incapacidad para
metabolizar galactosa con síntomas que pueden incluir cataratas de inicio temprano, daño hepático,
sordera y retraso mental. Se cree que estos síntomas ocurren como resultado de la acumulación de
metabolitos intermedios de galactosa y la reducción de especies de azúcares de UDP (Uridina
difosfato), que son necesarios para la glicosilación (La glucosilación es un proceso bioquímico en el
que se adiciona un glúcido a otra molécula. Esta molécula se denomina aceptor. La molécula
aceptora puede ser de muchos tipos, por ejemplo de naturaleza protéica o lipídica). Otros tipos de
galactosemia se tratan con una dieta sin galactosa. Sin embargo, debido al doble papel de GALE, se
recomienda a los pacientes con galactosemia de tipo III que sigan una dieta galactoserestra para
evitar la deficiencia de UDP-gal. Esta dieta solo alivia parcialmente los graves síntomas de la
galactosemia tipo III, y se ha propuesto que los pacientes reciban UDP-galNAc como tratamiento
adicional.
Figura 1 El papel de GALE en la biosíntesis de diferentes azúcares UDP. Las enzimas en la vía
Leloir están en caja. GALE participa en el tercer paso de la vía Leloir y en la producción de UDPgalNAc y UDP-glcNAc. También están representadas otras vías metabólicas que participan en la
producción de UDP-glc y UDPglcNAc.
El nematodo de vida libre C. elegans ha sido muy útil para estudios de desarrollo, enfermedad y
otros procesos biológicos, incluyendo la glicosilación Se han producido diferentes mutaciones que
afectan a las enzimas involucradas en la síntesis de proteoglicanos, N-glicosilación, O-glicosilación
y síntesis de quitina y glicolípidos Aislados en este organismo. Estudios genéticos y bioquímicos
han demostrado que la mayoría de los genes implicados en la glicosilación se conservan en
humanos. Curiosamente, la mayoría de las mutaciones que afectan el proceso de glicosilación
muestran defectos de desarrollo. Por ejemplo, la mayoría de los mutantes defectuosos en la
invaginación epitelial vulvar, la clase mutante sqv, resultado de los genes implicados en la
biosíntesis de la condroitina glicosaminoglicana, y mutaciones que afectan a la N-glicosilación
conducen al desarrollo de las gónadas deformadas. Uno de los genes implicados en el desarrollo de
las gónadas es el MIG-17, miembro de la familia ADAM (desintegrina y metaloproteasa). MIG-17
es una glicoproteína que es secretada por las células musculares y se difunde a la membrana basal
de la gónada, donde su función es necesaria. Las mutaciones que afectan al estado de glicosilación
del MIG-17 previenen la localización del MIG-17 en la membrana basal y, como consecuencia,
exhiben un defecto de migración de las gónadas similar al de los mutantes mig-17. El análisis de los
mutantes en los que se afecta la migración gonadal ha permitido la identificación de muchos
elementos diferentes implicados en el proceso de glicosilación, lo que indica que C. elegans es un
modelo apropiado para estudiar los mecanismos de glicosilación durante el desarrollo.
El proceso de glicosilación de proteínas comienza en el retículo endoplásmico (ER), que también es
responsable del plegamiento de proteínas, tráfico, control de calidad, degradación y la respuesta
coordinada a la acumulación de proteínas desplegadas. Tres proteínas, conservadas en todos los
metazoos, están implicadas en la detección del estrés causado por la acumulación de proteínas
desplegadas de la proteína quinasa PERK (quinasa de retina endoplasmática de tipo quinasa de
proteína quinasa); El factor de transcripción ATF-6 (factor de transcripción activador 6); Y XBP-1
(proteína de unión a Xbox), un factor de transcripción que se activa después de la escisión del ARN
mensajero xbp-1 por IRE-1 (enzima que requiere inositol 1, endonucleasa residente en el ER). Estos
sensores activan la vía de respuesta de la proteína desplegada (UPR), iniciando una respuesta
compleja que implica la degradación de las proteínas, interrumpe la traducción general y mejora la
expresión de chaperones, como las proteínas de choque térmico hsp-4 y hsp-3 en C. elegans.
En este estudio, hemos informado de la caracterización de dos mutaciones en la C. elegans GALE
ortholog, un knockout alelo, y una reducción de la función alelo. Encontramos que la pérdida de
función de gale-1 en C. elegans es letal. El mismo efecto letal también se ha demostrado en
Drosophila y ha sido la hipótesis para los seres humanos. Esta condición complica el análisis
fenotípico y es diferente a la condición encontrada en la galactosemia de tipo III en humanos, en la
que los pacientes muestran una reducción de la actividad GALE pero nunca una completa falta de
actividad. Estudiamos el alelo de reducción de la función gale-1 (pv18) en detalle porque este alelo
permite estudios fisiológicos y genéticos. Se observó que los cambios en el perfil UDP-azúcar
encontrado en gale-1 (pv18) son coherentes con una reducción de la actividad de GALE. El
aumento del nivel de UDP-gal puede explicarse por la incapacidad de metabolizar la galactosa en la
dieta, y la fuerte reducción de los niveles de UDP-galNAc puede atribuirse al hecho de que GALE
es la principal enzima responsable de la biosíntesis de UDPgalNAc. Por el contrario, UDP-glc y
UDP-glcNAc se sintetizan también por vía independiente de GALE (Figura 1), lo que puede
explicar por qué los cambios observados en los niveles de estos azúcares no son estadísticamente
significativos. Estos datos, junto con la naturaleza recesiva de gale-1 (pv18), sugieren fuertemente
que se trata de un alelo viable de reducción de la función similar a la situación descrita en pacientes
con galactosemia tipo III. Aunque todos los homólogos GALE son capaces de metabolizar UDP-gal
y UDP-glc, no todas las especies son capaces de interconectar UDP-glcNAc y UDP-galNAc. La
fuerte reducción de UDP-galNAc observada en el gale-1 (pv18) mutante indica que C. elegans
GALE-1 puede lograr esta reacción, al igual que GALE humanos.
Los pacientes afectados por la galactosemia tipo III son sensibles a la galactosa en la dieta,
probablemente como resultado de la acumulación de metabolitos tóxicos de la galactosa intermedia.
Como era de esperar, los animales gale-1 (pv18) son hipersensibles a una dieta rica en galactosa,
que ha sido reportada no sólo para humanos, sino también para Drosophila y Saccharomyces
cerevisiae. Los efectos tóxicos de concentraciones elevadas de galactosa observadas en C. elegans
incluyen retraso en el desarrollo y detención en etapas L1. Sorprendentemente, este efecto se
produce añadiendo no sólo galactosa, sino también otros azúcares, aunque sólo con galactosa se
observa un efecto dosis-dependiente, lo que sugiere una interacción más directa con este azúcar o
con metabolitos derivados de galactosa.
En este trabajo, también hemos observado que una disminución en la función de GALE-1 activa la
ruta de respuesta de proteína desplegada, posiblemente generando un estrés crónico ER. El azúcar
reducido en gale-1 (pv18), UDP-galNAc, no participa en la glicosilación llevada a cabo en el ER, lo
que sugiere que el estrés observado en este organelo puede ser causado no por una reducción de este
sustrato en el ER sino por La glicosilación incorrecta de proteínas implicadas en las funciones de
ER o quizás por alteraciones de la relación UDP-glucosa / galactosa. De hecho, se ha demostrado
que el aumento de galactosa o metabolitos galactosados induce la activación de la respuesta de
estrés ER por un mecanismo desconocido en un modelo de células humanas de galactosemia. Gale1 (pv18) los animales son hipersensibles a los patógenos humanos. Aunque no conocemos la
naturaleza de esta sensibilidad, la investigación sugiere que el estrés de ER está implicado. Esto
puede deberse a un posible deterioro de la secreción de proteínas, entre ellas las proteínas
antimicrobianas, o al colapso de ER por el aumento del estrés de ER sobre la infección bacteriana.
Curiosamente, la hipersensibilidad a patógenos también se ha descrito para los pacientes con
galactosemia tipo I. Este fenotipo que observamos en el modelo de C. elegans para la galactosemia
tipo III puede ser conservado en humanos y podría tener implicaciones médicas en el manejo de
pacientes con galactosemia de tipo III. En resumen, hemos caracterizado dos mutaciones en el gen
afectado en la galactosemia tipo III, un alelo knockout que presenta un fenotipo letal y un alelo de
reducción de la función que es más similar a las mutaciones encontradas en pacientes humanos. Los
estudios genéticos que usan el alelo de reducción de función han generado hallazgos que pueden
tener implicaciones médicas: hipersensibilidad a los patógenos humanos y estrés elevado en ER.
Además, se observaron fuertes defectos de desarrollo en la migración de las gónadas y en la
formación de la vulva. Este organismo modelo y los mutantes descritos aquí serán útiles no sólo
para aprender acerca de esta enfermedad, sino también para realizar pruebas de complementación
de diferentes alelos humanos, pruebas de eficacia de fármacos o pantallas de fármacos a gran escala
y por lo tanto pueden ser de especial interés para diseñar tratamientos para Galactosemia de tipo III.
The Structural and Molecular Biology of Type III Galactosemia
La galactosemia de tipo III es una enfermedad genética causada por mutaciones en el gen que
codifica la UDP-galactosa-4-epimerasa. Una variedad de diferentes mutaciones puntuales
localizadas en todo el gen puede ser responsable. Los principales efectos causantes de la
enfermedad de estas mutaciones parecen ser una reducción de la constante de velocidad catalítica
(kcat) y un aumento en la sensibilidad proteolítica de la proteína. Muchas de las mutaciones están
distantes del sitio activo de la enzima y por lo tanto se debe suponer que afectan al pliegue total de
la proteína. Aunque la enfermedad fue previamente clasificada en una forma severa, o generalizada,
y en una forma esencialmente benigna, o periférica, esta distinción ha sido borrada por el trabajo
reciente. En lugar de dos condiciones separadas, ahora parece que la galactosemia tipo III es un
continuo y que los síntomas variarán dependiendo de la mutación(es) llevada(s) por el paciente
individual. Esta nueva forma de ver la enfermedad tiene implicaciones para el tratamiento y el
seguimiento a largo plazo de los pacientes.
Las galactosemias son un grupo de enfermedades causadas por el metabolismo aberrante de la
galactosa de azúcar. En el mundo desarrollado, por lo general se detectan mediante rutina de
detección de recién nacidos. Dado que la galactosa, el epímero C-4 de la glucosa, no puede ser
metabolizada directamente por la vía glicolítica, se convierte en glucosa-6-fosfato a través de la vía
Leloir (La ruta de Leloir es una ruta metabólica del catabolismo de la D-galactosa,es decir de la
galactólisis. Fue nombrada así en honor a Luis Federico Leloir, bioquímico argentino y premio
Nobel de química en 1970. En los seres humanos esta ruta metabólica se lleva a cabo
principalmente en el hígado) (Figura 1).
Figura 1. La vía Leloir del metabolismo de la
galactosa. Aunque la glucosa y la galactosa (a) difieren
solamente en su estereoquímica en la posición 4, se
requiere una vía separada (b) para convertir la
galactosa en el glucosa-1-fosfato metabólicamente más
útil. Las mutaciones en GALT, GALK1 y GALE dan
lugar a galactosemia de tipos I, II y III,
respectivamente.
Esta vía consta de cuatro enzimas:
1.
2.
3.
4.
galactosa mutarotasa (GALM, EC 5.1.3.3)
galactoquinasa (GALK1, EC 2.7.1.6)
galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT, EC 2.7.7.12)
UDP-galactosa-4-epimerasa GALE, EC 5.1.3.2).
Se han detectado mutaciones en estas enzimas (excepto la galactosa mutarotasa) que dan lugar a la
galactosemia. Aunque hay rasgos comunes entre estas diferentes deficiencias (aumentos en las
concentraciones de galactosa en sangre y el desarrollo de cataratas de inicio temprano) existen
diferencias suficientes para distinguir tres tipos de galactosemia.
La galactosemia de tipo III (OMIM # 230350) es causada por mutaciones en GALE. En
comparación con los tipos I y II galactosemia, sólo un número relativamente pequeño de pacientes
se han caracterizado en el nivel de genotipo y fenotipo. Se consideró que la enfermedad existía en
dos formas: la forma severa, o generalizada, y la forma periférica mucho más suave. Los pacientes
no tratados de la forma generalizada tienen actividad GALE baja (o cero) en todos los tejidos y
típicamente desarrollan cataratas dentro de los primeros meses de vida; Estos son seguidos de daño
hepático, renal y cerebral. El tratamiento actual para todos los tipos de galactosemia es la restricción
de la galactosa dietética (y sus precursores como la lactosa). En casos de galactosemia de tipo II,
esto puede ser bastante eficaz. Sin embargo, lo es menos en el caso de la galactosemia generalizada
de tipo III. Esto es probable que sea en parte porque la galactosa no puede ser completamente
eliminada de la dieta en estos pacientes, ya que GALE de mamíferos es responsable no solo de la
interconversión de UDP-galactosa y UDP-glucosa sino también de UDP-N-acetilgalactosamina y
UDP-N-acetilglucosamina. Estas moléculas son precursores clave para la síntesis de restos de
azúcar en glicoproteínas. De hecho, la alteración del metabolismo del amino-azúcar puede ser un
factor causal en la patología de galactosemia de tipo III. Dado que la galactosa no puede eliminarse
completamente de la dieta, se produce una acumulación de la galactosa-1-fosfato intermedia tóxica
que es probable que sea un segundo factor responsable de la patología. En contraste, en la forma
periférica la actividad de GALE se reduce en la sangre, pero parece normal en otros tejidos. Las
razones de esto no se conocen. Los síntomas son mucho más suaves; De hecho, algunos pacientes
no pueden sufrir síntomas aparte de niveles alterados de galactosa y galactosa-1-fosfato sanguíneo.
En tales casos no se considera necesaria ninguna intervención terapéutica.
Mutaciones en udp-galactosa 4-epimerase asociadas con galactosemia de tipo iii
La asociación entre una forma de galactosemia y una actividad reducida de UDP-galactosa-4epimerasa se observó por primera vez por Gitzelmann. Nuestra comprensión de este vínculo fue
reforzada por la determinación de la secuencia del gen que codifica GALE y la posterior
caracterización de la enfermedad asociada a mutaciones. Actualmente, se han detectado 22
mutaciones de este tipo que dan como resultado cambios de aminoácidos en la proteína y una que
da como resultado una terminación prematura. De estas mutaciones, sólo una -V94M- está asociada
con la forma más severa y generalizada de la enfermedad. Una sustitución de aminoácidos, V180A,
se detecta comúnmente, pero no parece estar asociada con la enfermedad. Por lo tanto, es probable
que surja ya sea de un error en la secuencia original o un polimorfismo en la posición
correspondiente en el gen. Muchas de estas proteínas mutantes han sido estudiadas ya sea como
proteínas aisladas, en extractos celulares o en sistemas modelo tales como cultivo celular o
levadura. Los principales resultados de estos estudios se resumen en la Tabla 1.
Los principales factores en la causalidad de la enfermedad parecen ser la reducción de la eficacia
catalítica (causada principalmente por una reducción en el número de rotación, kcat) y la estabilidad
disminuida. Esta estabilidad reducida da como resultado una mayor susceptibilidad de algunas
proteínas mutantes a una digestión proteolítica limitada in vitro ya cantidades disminuidas de
proteína intacta in vivo. La mutación asociada con la forma generalizada de la enfermedad, V94M,
tiene uno de los números de rotación más deteriorados (de las mutaciones hasta ahora
caracterizadas), pero no parece ser menos estable que el tipo salvaje (como se juzga por la
proteolisis limitada). Una comprensión más completa de la relación entre los efectos funcionales de
las mutaciones y la enfermedad-causalidad no es posible debido a dos factores -el número
relativamente pequeño de pacientes caracterizados y el hecho de que muchos individuos
galactosemicos son heterocigotos. Por ejemplo, G90E tiene un número de volumen de negocios que
está deteriorado en una medida aún mayor que V94M y tiene una sensibilidad proteolítica más alta
que el tipo salvaje. Sin embargo, sólo se ha observado en un paciente heterocigótico que fue
clasificado como sufriendo de la forma periférica de la enfermedad. Sin embargo, parece probable
que si un paciente era homocigótico para esta mutación, sus síntomas serían muy probablemente al
menos tan graves como para los homocigotos V94M. Dado que GALE es un dímero, hay tres
dímeros posibles en los heterocigotos (dos homodímeros diferentes y un heterodímero). Aunque es
difícil recrear heterodímeros aislados in vitro, se han proporcionado considerables conocimientos
sobre la función de los heterodímeros relevantes desde el punto de vista médico mediante estudios
de diferentes mutaciones coexpresadas en la levadura S. cerevisiae. La expresión de GALE humano
de tipo salvaje complementa la deleción de la levadura GALE (Gal10p) y permite el crecimiento en
galactosa. La co-expresión de N34S o L313M con el tipo salvaje causó actividad reducida, lo que
sugiere que estas mutaciones pueden ser negativos dominantes (parciales). Por el contrario, la coexpresión de V94M con el tipo salvaje no mostró ningún efecto negativo dominante.
TERAPIAS Y TRATAMIENTOS
La terapia habitual para todos los tipos de galactosemia es restringir la ingesta dietética de galactosa
y su lactosa precursora. Sin embargo, este es un tratamiento insatisfactorio en el caso de
galactosemia de tipo III ya que se requieren pequeñas cantidades de galactosa para la biosíntesis de
UDP-galactosa. Una alternativa ideal para este tratamiento sería alguna forma de terapia génica que
permitiera la restauración parcial de la actividad de GALE. Esto podría tomar la forma de
reemplazo directo del gen GALE o la reingeniería de vías alternativas del metabolismo de la
galactosa como se ha sugerido para la deficiencia de GALT. Incluso si el tratamiento, en efecto,
causó la conversión de los síntomas de la forma generalizada a la periférica, sería una gran mejora
en la calidad y cantidad de vida para los pacientes. Sin embargo, el número relativamente pequeño
de pacientes y los problemas recientes con las tecnologías de terapia génica significan que esta
solución es poco probable que esté disponible en un futuro próximo. En el caso de la galactosemia
tipo I, donde se cree que la acumulación de galactosa-1-fosfato es un factor importante en la
partenogénesis, se ha sugerido que la inhibición de GALK1 podría ser una estrategia terapéutica
viable. Aunque esto imitaría los efectos de la galactosemia de tipo II, los síntomas de esta son
bastante leves y se superponen con los del tipo I. Una estrategia similar, presumiblemente, reduciría
los niveles de galactosa-1-fosfato en la galactosemia de tipo III. Sin embargo, no abordaría la falta
de producción de UDPgalactosa y UDP-N-acetilgalactosamina en estos pacientes. Este problema
tendría que ser abordado en cualquier terapia potencial para la galactosemia de tipo III.
También necesitaremos más estudios bioquímicos sobre las enzimas mutantes con el fin de mejorar
nuestra comprensión de las correlaciones genotipo-fenotipo. Estos estudios bioquímicos deben
incluir experimentos para determinar cómo las mutaciones causantes de la enfermedad afectan el
sistema de enzimas que catalizan la vía Leloir así como el GALE aislado. Estos estudios serán más
informativos cuando se consideren junto con modelos in vivo tales como los sistemas de levaduras
y linfoblastos. De esta manera se puede desarrollar un cuadro integrado de las causas bioquímicas y
fisiológicas de la enfermedad.
the metastability of human udp-galactose 4’-epimerase (gale) is increased by variants
associated with type iii galactosemia but decreased by substrate and cofactor binding
La galactosemia tipo III es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones que afectan la
actividad de la UDP-galactosa-40-epimerasa (GALE). Se evaluó el impacto de cuatro variantes
asociadas a la enfermedad (p.N34S, p.G90E, p.V94M y p.K161N) sobre la estabilidad
conformacional y la dinámica de GALE. Los estudios de desnaturalización térmica mostraron que
el GALE de tipo salvaje se desnaturaliza a temperaturas cercanas a las mutaciones fisiológicas y
asociadas a la enfermedad a menudo reducen la estabilidad térmica de GALE. Esta
desnaturalización está bajo control cinético y resulta en parte de la disociación de los dímeros. Los
ligandos naturales, NAD+ y UDP-glucosa, estabilizan GALE. Los estudios de proteólisis mostraron
que los ligandos naturales y las variaciones asociadas a la enfermedad afectan la dinámica local en
la región N-terminal de GALE. La cinética de proteolisis siguió un modelo de dos etapas
irreversible en el que la proteína intacta se escindió en Ala38 formando un intermedio de larga vida
en el primer paso. NAD+ reduce la velocidad de la primera etapa, aumentando la cantidad de
proteína no digerida mientras que la UDP-glucosa reduce la velocidad de la segunda etapa,
aumentando la acumulación de la intermedia. Las variantes asociadas a la enfermedad afectan estas
tasas y las cantidades de proteína en cada estado. Nuestros resultados también sugieren la
comunicación entre los dominios en GALE. Se plantea la hipótesis de que, in vivo, las
concentraciones de ligandos naturales modulan la estabilidad de GALE y que debe ser posible
descubrir compuestos que imitan los efectos estabilizadores de los ligandos naturales superando la
desestabilización inducida por mutación.
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