EDTA Es la sal Na2, K2 o K3 del EDTA. Respeta la morfología eritrocitaria y leucocitaria. (Hasta 2 horas). Conserva las células hasta por 24 horas a 4 ºC. Inhibe la aglutinación plaquetaria. La concentración recomendada de EDTA es de 1,5 mg/mL. de sangre. RESPETAR EL VOLUMEN CITRATO DE SODIO Impide que el calcio se ionice. De elección para pruebas de hemostasia, donde se emplea en proporción de 1: 9 (0,5 mL de ACG para 4,5 mL de sangre total). La muestra se debe centrifugar lo antes posible y se debe procesar antes de las 4 horas de la extracción. 2 Perfil que agrupa una serie de parámetros que evalúan la integridad cualitativa y cuantitativa de los elementos celulares presentes en la sangre. RECUENTO LEUCOCITARIO RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS HEMOGLOBINA HEMATOCRITO Análisis cuantitativo y cualitativo de los parámetros relacionados con los leucocitos o glóbulos blancos en la sangre periférica. RECUENTO TOTAL DE LEUCOCITOS RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS RECUENTO TOTAL DE LEUCOCITOS PRINCIPIO La sangre anticoagulada se deposita en un líquido que permite evidenciar los leucocitos, manteniéndolos visibles, mientras que los eritrocitos son hemolizados. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS - Microscopio. - Cámara de Neubauer. - Pipeta de Thoma. - Solución de Turk al 1%. - Contador manual. PROCEDIMIENTO 1. Se aspira la sangre con la pipeta de Thoma hasta la marca de 0,5 y se limpia la punta. 2. Con la misma pipeta cargar hasta la marca de 101 la sol. de Turk (sin burbujas). 3. Tapar ambos extremos y homogenizar por 2’-3’. 4. Montar la laminilla de vidrio en la cámara para recuento que debe estar limpia y seca. 5. Agitar la pipeta, descartar las cuatro primeras gotas y luego colocar una gota en la cámara. 6. Deje reposar por 3 minutos. 7. Con objetivo de 10x contar en 4 cuadrados grandes angulares. RECUENTO TOTAL DE LEUCOCITOS Además de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes, se deben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la línea horizontal superior y vertical exterior, o de lo contrario, todos los leucocitos, adheridos a la línea horizontal inferior y vertical interior. FÓRMULA VALORES REFERENCIALES 5 000 - 10 000 Leucocitos/mm3 PROCEDIMIENTO 1. Se examina la lámina a pequeño aumento para comprobar si los elementos celulares están bien distribuidos. 2. Si es favorable se examina con el objetivo de inmersión. La parte ideal para visualizar células para la fórmula leucocitaria es en la parte final del cuerpo y comienzos de la cola, recorriendo la lámina hasta contar 100 leucocitos (agranulocitos y granulocitos). 3. A medida que se va contando, se va anotando el número de cada una de las clases de glóbulos blancos observados. RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS Corresponde a la cantidad de eritrocitos presentes en sangre periférica por unidad de volumen de sangre, que usualmente es el microlitro (ul.). RECUENTO MANUAL RECUENTO ELECTRÓNICO • Procedimiento tedioso. • Alto consumo de tiempo. • Coeficiente de variación muy amplio (10-22%). • Procedimiento rápido y simple. • Coeficiente de variación inferior al 1%. RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS PRINCIPIO: La sangre se diluye en un líquido que permite observar claramente los hematíes, luego esta dilución se coloca en una cámara de Neubauer y se cuentan en el microscopio a un objetivo de 40x. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS - Microscopio. - Cámara de Neubauer. - Pipeta de Thoma. - Diluyente de Hayem. - Contador manual. PROCEDIMIENTO 1. Se aspira la sangre con la pipeta de Thoma hasta la marca de 0,5 y se limpia la punta. 2. Con la misma pipeta cargar hasta la marca de 101 el diluyente de Hayem. 3. Tapar ambos extremos y homogenizar por 2’-3’. 4. Agitar la pipeta, descartar las cuatro primeras gotas y luego colocar una gota en la cámara. 5. Deje reposar por 3 minutos. 6. Con el objetivo de 40x contar sobre el cuadrado grande central de la cámara (sólo en 5 cuadrados pequeños). RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS Se debe contar sobre el cuadrado grande central de la cámara sólo en 5 cuadrados pequeños (ABCD y E): uno central y cuatro angulares (80 cuadritos en total), se incluyen las células que cubren o tocan por dentro o por fuera las líneas limitantes superior e izquierda en el cuadrado pequeño del recuento y no se consideran los correspondientes a los límites inferior y derecho. FÓRMULA VALORES REFERENCIALES Hombres: 4.5 – 5.5 mill./mm3. Mujeres: 4 – 5 mill./mm3. RN: 5 – 6 mill./mm3. Representa la fracción de volumen eritrocitario y corresponde al volumen ocupado por los eritrocitos en relación con el volumen total de sangre, que es expresado en porcentaje o una fracción decimal de ésta. HEMATOCRITO ELECTRÓNICO HEMATOCRITO MANUAL • Macrométodo. • Microhematocrito. • Medida directa independiente. e • Cálculo matemático que relaciona el recuento de eritrocitos y el VCM. • Es 2% a 3% menor que el hematocrito manual. EQUIPOS Y MATERIALES - Capilares rojos y azules (75mm x 1,5 mm). - Plastilina. - Microcentrífuga. PROCEDIMIENTO 1.Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejo del dedo, o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosa con EDTA. Debe llenarse aprox. 70%-80% del capilar. 2.Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina. 3.Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de la microcentrífuga, con el extremo ocluido adherido al reborde externo de la plataforma. 4.Centrifugar por 5 minutos entre 10 000- 12 000 rpm. VALORES REFERENCIALES Hombres: 40% - 50% Mujeres: 38% - 44% Recién nacidos: 50% - 58% HEMOGLOBINA Es la proteína transportadora de oxígeno. Representa hasta el 32% de la masa total del eritrocito. Es el mejor índice para medir la capacidad transportadora de gases, tanto para oxígeno (O2) como para dióxido de carbono (CO2) por parte del eritrocito. MÉTODO MANUAL MÉTODO ELECTRÓNICO HEMOGLOBINA Principio: La sangre se diluye en líquido de Drabkin, el cual hemoliza y convierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemoglobina). Esta solución se lee por medio de un espectrofotómetro. Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina que contenga la sangre. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS - Hemoglobinómetro. - Pipeta de Sahli. - Tubos de ensayo. - Líquido de Drabkin. PROCEDIMIENTO 1.En un tubo de 13x100 colocar exactamente 5 mL. de reactivo de Drabkin. 2.La sangre que puede utilizarse es de punción del dedo (sangre capilar) o de sangre venosa recién extraída. 3.Con una pipeta automática o pipeta de Sahli se toma exactamente 0,02 mL (20 ul.) de sangre total, luego limpiar la punta de la pipeta y se vierte en el tubo que contiene reactivo de Drabkin y se mezcla. 4.Dejar en reposo entre 5 a 15 minutos. 5.Leer la absorbancia con filtro verde a 540 nm. llevando a cero el equipo con agua destilada/Drabkin. HEMOGLOBINA En las soluciones de referencia comerciales casi siempre indica la concentración en miligramos por 100 mL (generalmente en mg%). Se preparan diluciones con líquido de Drabkin de tal manera que los patrones contengan concentraciones de 60 mg, 40 mg, 20 mg de CNHi. Leer los tubos en absorbancia con filtro verde a 540 nm, llevando el fotómetro a cero con el líquido de Drabkin. Para calcular la concentración de hemoglobina en cada tubo, realizar el siguiente cálculo: Hb en g/100 mL. = P x D 1000 P: [ ] del patrón D: Dil. de la muestra de sangre que es 251 veces. 60 mg. :15 g/100mL. 40 mg. : 10 g/100 mL. 20 mg. : 5 g/100 mL. VALORES REFERENCIALES Niños al nacer: 13,6 - 19,6 g/dL. Niños de 1 año: 11,3 - 13,0 g/dL. Mujeres: 11,5 - 16,5 g/dL. Hombres: 14,0 - 18,0 g/dL. Conjunto de pruebas que exploran la participación de todos los componentes de la hemostasia: endotelio vascular, actividad plaquetaria, factores plasmáticos y fibrinolíticos. TP RECUENTO DE PLAQUETAS TPTA FIBRINÓGENO TIEMPO DE COAGULAC. Y DE SANGRÍA Explora la vía extrínseca de la coagulación. Puede prolongarse por: anticoagulantes orales (cumarínicos), déficit de vitamina K, enfermedad hepática, CID, disfibrinogenemia y déficit aislado de FVII (también es útil para la sospecha de los déficits de FII, FV, FX). Muy utilizada con fines de screening, diagnóstico y control del tratamiento con anticoagulantes orales. ÍNDICE DE QUICK (%) Es otra forma de expresar el tiempo de protrombina, en tanto por ciento (%) respecto a un plasma control. Los valores normales oscilan en torno a un 70120%. RATIO INTERNACIONAL NORMATIZADO (INR) Indica la relación entre un lote particular de factor tisular con una muestra normalizada a nivel internacional. El rango normal para una persona sana es de 0,8 a 1,2. VALORES REFERENCIALES 10-14 segundos Principio: Mide el tiempo en que tarda en coagular una muestra de plasma, desprovisto de plaquetas y anticoagulado con citrato sódico, al ponerlo en contacto con una suspensión de tromboplastina cálcica (sustituto de la tromboplastina tisular fisiológica). 1. Agregar en un tubo la cantidad a trabajar de reactivo para MATERIALES Y TP e incubar por 5-10 minutos. REACTIVOS 2. En otro tubo añadir 50 uL. de plasma del paciente e incubar por 5 minutos. - Plasma citratado. 3. Agregar 100 uL. del reactivo incubado al tubo que - Reactivo para TP. contiene el plasma del paciente y simultáneamente disparar - Pipetas. el cronómetro. Agitar levemente para homogenizar y dejar - Tubos de ensayo. incubando por aprox. 8-10 segundos. - Baño María. 4. Remover el tubo del baño maría e inclinarlo para verificar - Cronómetro. la formación del coágulo. 5. De no haberse formado, se sigue incubando el tubo y se repite el punto anterior cada 4 seg. hasta observar la PROCEDIMIENTO coagulación y se para y anota el tiempo exacto. MATERIALES Y REACTIVOS - Plasma citratado. - Cefalina caolín. - Cloruro de calcio. - Pipetas. - Tubos de ensayo. - Baño María. - Cronómetro. V. R. : 33-48 seg. PROCEDIMIENTO PRINCIPIO: Mide la fase intrínseca de la coagulación, en presencia de una “tromboplastina parcial” (cefalina), la cual sustituye la acción del factor plaquetario tres. Se obtiene máximo efecto de contacto por adición del caolín. 1. Preincubar 50 uL. de cloruro de calcio por 5 minutos. 2. En un tubo de ensayo agregar 50 uL. de plasma y 50 uL. de cefalina caolín e incubar por 5 minutos. 3. Luego añadir 50 uL. de cloruro de calcio previamente incubado y simultáneamente disparar el cronómetro. Agitar levemente el tubo para homogenizar y dejar incubando por aprox. 30 a 32 seg. 4. Remover el tubo del baño maría e inclinarlo para verificar la formación del coágulo. 5. . De no haberse formado, se sigue incubando el tubo y se repite el punto anterior cada 4 seg. hasta observar la coagulación y se para y anota el tiempo exacto. Es una glicoproteína presente en el plasma y en los gránulos plaquetarios. Última proteína de la cascada de la coagulación (Factor I) y es el factor que se encuentra en mayor concentración plasmática. MATERIALES Y REACTIVOS - Plasma citratado. - A (Trombina). - B (Sol. De Imidazol). - Pipetas. - Tubos de ensayo. - Baño María. - Cronómetro. PROCEDIMIENTO PRINCIPIO: Mide la cantidad de fibrina generada al añadir trombina al plasma del paciente. 1. Incubar el reactivo A por 5 minutos. 2. En un tubo de ensayo preparar una dilución 1:10 del plasma del paciente con Reactivo B. 2. Precalentar 100 uL. de la dilución por 2 minutos. 3. Finalizado el tiempo se agrega 50 uL. de reactivo A y se registra el tiempo de formación del coágulo. VALORES REFERENCIALES: 200-400 mg/dL. Desempeñan una función importante en el mecanismo de la hemostasia, así como en la respuesta de la lesión vascular. La detención de la hemorragia depende de la formación de un trombo plaquetario que se consolida con la formación de fibrina por activación del mecanismo de la coagulación; su disminución o incorrecto funcionamiento se relaciona con transtornos hemorrágicos. MÉTODO MANUAL MÉTODO AUTOMATIZADO *RECUENTO EN CÁMARA DE NEUBAUER Principio: El recuento de plaquetas se realiza en la cámara de Neubauer previa lisis de los hematíes. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS - Sangre con EDTA. - Cámara de Neubauer. - Oxalato de Amonio 1%. - Pipetas. - Tubos de ensayo. - Microscopio. PROCEDIMIENTO 1. Homogenizar bien la muestra obtenida con EDTA. 2. Hacer una dilución de 20 uL. de sangre total con 380 uL. de oxalato de amonio en un tubo (dil. 1/20). 3. Dejar en reposo por 15 minutos en una gradilla. 4. Agregar una gota de la dilución en la cámara de Neubauer, dejar en reposo por 15 minutos y tapar con un papel húmedo para evitar su evaporación. 5. Enfocar a 40x y contar las plaquetas en el cuadrado central de 1 mm2 *RECUENTO EN CÁMARA DE NEUBAUER FÓRMULA VALORES REFERENCIALES: 150 000 – 450 000 plaquetas/mm3 *RECUENTO EN LÁMINA Se obtiene el promedio de la suma del total de plaquetas contadas en 10 campos con objetivo de 100x de un frotis sanguíneo y se multiplica por 20 000. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS - Sangre con EDTA. - Lámina portaobjetos. - Col. Wright. - Aceite de inmersión - Contador de células. - Microscopio. VALORES REFERENCIALES: 150 000 – 450 000 plaquetas/mm3 PRINCIPIO: Se observa la formación del coágulo en tubos en condiciones estandarizadas; esta prueba mide el mecanismo intrínseco de la coagulación. - Tubos de ensayo. - Materiales para punción venosa. - Baño María. - Cronómetro. PROCEDIMIENTO MATERIALES Y EQUIPOS VALORES REFERENCIALES: 5-10 minutos. 1. Extraer poco más de 3 mL. de sangre venosa. Cronometrar el tiempo desde que se extrae la sangre. 2. En dos tubos de ensayo, agregar 1 mL. de sangre en cada uno, taponar con parafilm e incubar. 3. A los 5 minutos, sacar el primer tubo del baño maría e inclinar hacia un plano de 90º en rotación a intervalos de 30 segundos hasta que la sangre coagule. 4. Inmediatamente después, examinar el segundo tubo y verificar el tiempo de la formación del coágulo. 5. Se reporta como tiempo de coagulación la media de los dos tubos. La lesión estandarizada de un número pequeño de capilares, nos permite observar la retracción del capilar, la cantidad y calidad de las plaquetas, al medir el tiempo que tarda en cesar la hemorragia. PRINCIPIO: Con una lanceta se hace una incisión estandarizada en el lóbulo de la oreja. La sangre fluye por esta incisión y se mide el tiempo que transcurre hasta que se detiene el sangrado. - Lanceta estéril. - Alcohol. - Papel secante. - Cronómetro. VALORES REFERENC.: 1-3 minutos. PROCEDIMIENTO MATERIALES 1. Dar masaje suave al lóbulo de la oreja, limpiarla con alcohol y dejarlo secar. 2. Hacer una punción de 2 a 3 mm de profundidad con la lanceta (movimiento rápido y firme). Simultáneamente poner en marcha el cronómetro. 3. Con una tira de papel secante, absorber cada 15 segundos la gota de sangre sin tocar la herida. 4. Parar el cronómetro en el momento en que el papel secante ya no se manche de sangre. Su estudio consiste en precisar e informar las alteraciones morfológicas de los elementos formes de la sangre; este es un examen sencillo, poco costoso, rápido en la realización del informe de sus resultados, pero a la vez requiere de mucho cuidado y experiencia. *ALTERACIONES MORFOLÓGICAS 29 *ALTERACIONES POR EL TAMAÑO *ALTERACIONES POR LA TINCIÓN 30 *ALTERACIONES POR INCLUSIONES CITOPLASMÁT. 31 32 33
