ÍNDICE 1.- SALMONELLA 1.1 INTRODUCCIÓN 1.1.1 Taxonomía 1.2 CARACTERÍSTICAS 1.2.1 Estructura antigénica 1.2.2 Metabolitos 1.3 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN 1.3.1 Preentiquecimiento en medio líquido no selectivo 1.3.2 Entiquecimiento en medio líquido selectivo 1.3.3 Aislamiento diferencial sobre medio sólido 1.3.4 Confirmación bioquímica 1.3.5 Pruebas rápidas de detección en Samonella 1.3.6 Confirmación serológica 1.4 FUENTES DE TRANSMISIÓN 1.5 VECTORES ALIMENTARIOS 1.6 EFECTOS SOBRE LA SALUD 1.6.1 Fiebre tifoidea-paratifoidea 1.6.2 Salmonelosis 1.7 DIAGNÓSTICO 1.8 PROFILAXIS 1.8.1 Materia prima 1.8.2 Manipulado 1.8.3 Cocinado 1.8.4 Refrigerado 1.9 TRATAMIENTO 2.- INTOXICACIÓN BOTULÍNICA 2.1 INTRODUCCIÓN 2.2 VECTORES ALIMENTARIOS 2.3 CARACTERÍSTICAS DE C. BOTULINUM 2.4 TOXINA 2.4.1 Mecanismo de acción 2.5 SINTOMATOLOGÍA 2.6 PROFILAXIS 2.7 MÉTODOS DE DETECCIÓN 2.8 TRATAMIENTO BIBLIOGRAFÍA 1. SALMONELLA 1.1.- Introducción El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos Gram -, anaerobios facultativos flagelados que no desarrollan cápsula 1 ni esporas. Está considerado como un bacilo patógeno primario, como Shigella, Yersinia y ciertas cepas de E. coli. Existen alrededor de 2500 serotipos diferentes, clasificados en base a los antígenos O y H. Forman colonias típicas sobre medios de cultivo sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas definidas (Pascual y Calderón, 1999) Taxonomía La clasificación de esta especie ha sido complicada, viéndose modificada tras el aporte de estudios moleculares de DNA. Clásicamente se distinguían tres especies patógenas S. typhy, S. cholerae-suis y S. enteritidis, que a su vez se subdividían en más de 2000 serotipos en base a los antígenos flagelares H (proteico) y somáticos O (polisacárido). S. typhi posee además un antígeno de virulencia (Vi). a) patogenicidad en dos especies: b) S. enterica y S. bongori, En la actualidad, se han reagrupado en función de su siendo esta última no patógena para el ser humano. La especie S. entérica, a su vez se divide en seis subespecies: • • • • • • • I enterica. II salamae. IIIa arizonae. IIIb diarizonae. IV houtenae. V S. bongori, ya incluida en una especie distinta. VI indica. Y éstas a su vez, en diferentes serotipos. Por ejemplo S. enterica subsp. enterica (o subgrupo I), se divide en cinco serogrupos: A, B, C, D y E. con diferentes serotipos. Con el fin de simplificar esta terminología, se pueden agrupar en tres divisiones ecológicas: • Salmonella spp. adaptadas a vivir en el ser humano, entre ellas, S. typhi, S. paratyphi A, B y C. • Salmonella spp. adaptadas a animales, que pueden producir infección en el hombre, entre ellas, S. dublin, S. Gallinarum y S. cholerae-suis. • Salmonella spp. sin adaptación específica, que incluye a unas 1800 serovariedades de amplia distribución en la naturaleza, causantes de la mayor parte de las toxiinfecciones. En la actualidad, de acuerdo con las normas internacionales y al Reglamento Sanitario, la sola presencia de Salmonella en un alimento es causa de rechazo del producto, ya que esta toxiinfección es considerada una La presencia de cápsula depende del serovar en cuestión. Solo S. Typhi, S. Paratyphi C y S. Dublin presentan cápsula. (Comité científico de seguridad agroalimentaria de la CAE, 05/2008). 1 1 de las causas más importantes de enfermedades transmitidas por alimentos responsables de la mitad de todas las infecciones en humanos (CDC, 2013). Existen estudios que demuestran que una baja concentración de Salmonella (100 gérmenes/g) puede causar la enfermedad. 1.2.- Características Su morfología es de bacilos gruesos y cortos, con un agrupamiento celular en pares u ocasionalmente en cadenas cortas. Su tamaño es de 0.6 a 0.7 micras de grosor y 2-3 micras de largo. Crece a temperaturas comprendías entre 15 y 47ºC con un intervalo de pH entre 4 y 9.1. Resisten a temperaturas de refrigeración y congelación, así como a la desecación. Como enterobacterias, poseen algunas características generales de este grupo: son fermentadores de la glucosa, catalasa positiva, oxidasas negativo y suelen ser móviles. Al igual que la Escherichia, son bacterias que se multiplican en el intestino. No fermentan lactosa. Reducen nitratos a nitritos. Son citocromo-oxidasa negativos. Producen ácido sulfhídrico (S typhi es la única que no produce gas en la fermentación de los azúcares). Salmonella spp. presenta escasa especificidad por el hospedador, ya que se adapta muy bien a los animales y personas. Cuando llega a un alimento es capaz de multiplicarse a gran velocidad (duplicando su número cada 15 minutos a temperaturas superiores a 20ºC). Estructura antigénica • Somático O, lipopolisacárido de la pared celular, es termoestable. Es la base de la clasificación en subgrupos. • Flagelar H, de carácter proteico, secuencia de aminoácidos que forma la flagelina, es termolábil. Es la base de la clasificación de especies. • Envoltura Vi, termolábil, responsable de la virulencia de varias especies patogénicas en S. typhi. Impide la aglutinación de sueros anti O. Metabolitos · Endotoxina: toxina presente en la pared celular que sólo se libera tras la lisis de la misma. Produce fiebre, diarrea y vómitos. · Enterotoxina: sustancia (proteica) producida por la bacteria que afecta al tracto digestivo. · Citotoxina: Inhibe la síntesis proteica. 1.3.- Aislamiento e identificación Los métodos para la detección de Salmonella en alimentos están basados fundamentalmente en que su presencia suele ser menor que la de la flora acompañante. En el laboratorio se consideran todos estos factores permitiendo recuperarla mediante diferentes etapas (Pascual y Calderón, 1999): Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo 2 Etapa que consiste en la revivificación de las Salmonellas al diluir la muestra alimentaria en agua de peptona tamponada (APT) que mantiene unas condiciones constantes de pH y nutrientes permitiendo unas condiciones adecuadas para el desarrollo de Salmonella. Para ello se pesan 25g de alimento e introducen en 225mL de una solución de APT. Se mezcla e incuba a 37ºC durante 16-20h. Para el análisis de superficies, utilizando por ejemplo esponjas abrasivas, se incuba en 125mL de APT. Enriquecimiento en medio líquido selectivo Seguidamente una alícuota del proceso anterior se utiliza para sembrar en un medio selectivo (dilución 1:10) que estimula y favorece el crecimiento de Salmonella inhibiendo la flora acompañante, o bien realizarse un enriquecimiento sobre la muestra alimentaria diluida en APT al que se adiciona IRIS Salmonella como suplemento selectivo evitando el primer paso. Como medios líquidos selectivos para Salmonella se pueden utilizar: Caldo selenito- cistina. El selenito inhibe gran parte de la flora intestinal competitiva y la cistina favorece el crecimiento de Salmonella, incubando a 37ºC 18-24h. Caldo Rappaport- Vassiliadis. El verde de malaquita inhibe la flora acompañante. Los fosfatos mantienen constate el valor de pH durante la incubación y el cloruro magnésico que incrementa la presión osmótica, favorece el desarrollo de Salmonella. La recuperación óptima se obtiene incubando a 42ºC 18-24h. La aparición de turbidez en el tubo denota la presencia de Salmonella. Caldo tetrationato-bilis-verde brillante (Müller Kauffmann). El tetrationato inhibe el crecimiento de coliformes y otras bacterias intestinales. La bilis favorece el crecimiento de Salmonella e impide el desarrollo de la flora competitiva. El verde brillante inhibe las bacterias gram + y el carbonato mantiene constante el pH. Se obtiene una recuperación más favorable a 42ºC 18-24h. Aislamiento diferencial sobre medio sólido selectivo En esta etapa se estimula el crecimiento selectivo de Salmonella, permitiendo, a través de los diferentes medios, colonias con aspecto característico. Se recomienda hacer un cultivo en placa por duplicado incubando a 37ºC 24-48h.. - Agar verde brillante-rojo fenol (BGA). Colonias de color rosado, transparentes, rodeadas por un halo rojo por no tener metabolismo fermentativo de lactosa. - Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD). Colonias rojas por la fermentación de la xilosa y descarboxilación de la lisina, acompañada de un descenso de pH, cuyo interior se encuentra pigmentado de negro debido a la producción de SH2. - Agar Salmonella-Shigella (SS). La preencia de hierro y tiosulfato permiten la formaciñon de FeS, lo que conlleva al ennegrecimiento de las colonias. El verde brillante, sales biliares y citrato inhiben la 3 flora acompañante. La presencia de un halo rojizo alrededor de las colonias es indicativo de coliformes por su carácter fermentativo frente a la lactosa. - -Agar Hektoen (HE). Colonias verde- azuladas, pudiendo tener el centro negro. La presencia de sales biliares inhibe la flora competitiva. Este medio posee dos indicadores (azul de bromotimol y fuchina ácida) que permiten la diferenciación de las bacterias lactosa-positiva y lactosa-negativa. El tiosulfato sódico y citrato de hierro permiten la producción de sulfhídrico. - Agar sulfito bismuto (SB). Colonias negras (SH2 +) con borde claro y rodeadas de un precipitado negro brillante, por la reducción del bismuto. En ocasiones las colonias pueden ser verdes grises o marrones. - Agar manitol- lisina- cristal violeta- verde brillante ( MLCB). El carácter fermentativo sobre manitol desciende el pH, iniciando la descarboxilación de la lisina, apareciendo coloración negra que, unido a la producción de sulfhídrico muestra colonias grandes de color negro. - Agar cromogénico : Medio utilizado para la diferenciación selectiva de microorganismos utilizando sustratos cromogénicos que producen coloración característica para cada microorganismo. · Agar Compass Salmonella: Sirve para la detección específica de todas las cepas de Salmonella produciendo colonias rojo-magenta tras su incubación a 37ºC 24h. · Agar IRIS Salmonella: Se procede del mismo modo que para Compass Salmonella, obteniendo colonias magenta. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas Sobre las colonias sospechosas de la siembra en placa, se aíslan, como mínimo dos colonias con aspecto característico de Salmonella para realizarles pruebas bioquímicas. - En tinción Gram se mostrarán bacilos rosáceos, agrupados en forma de cadena. - Oxidasa (-): Determina la presencia de citocromo c oxidasa. Para ello se hace reaccionar una suspensión líquida de Salmonella en un disco impregnado con un reactivo (TMFD) virando a granate o azul oscuro al oxidarse (+), o bien a incoloro al reducirse (-). Las enterobacterias son oxidasa negativas. - Producción de ureasa: (-) Se realiza una siembra en tubos que contengan caldo urea e incubar a 37ºC a baño maría durante 2 h. Los microorganismos ureasa positivo crecen en el medio haciendo virar el indicador a rojo. - Descarboxilacion de la lisina: (+) Se siembra en caldo lisina a 37ºC 48h. Las bacterias que descarboxilan la lisina, producen cadaverina, se reconocen por la presencia de un color rojo-púrpura debido al aumento de pH. - Siembra en IMVIC. Utilizada para la identificación de enterobacterias, consiste en realizar cuatro pruebas bioquímicas (Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato) obteniendo resultados positivos o negativos según coloración, incubando a 37ºC 48h. (figura 7) 4 · Indol: determina si la bacteria posee triptofanasa, que hidroliza el triptófano del medio en indol y alanina. El indol se detecta empleando el reactivo de Kovacs. Un anillo rosa-rojizo en la superficie indica que se ha formado indol. · Rojo de metilo: Detecta la fermentación ácido-mixta a partir de algún carbohidrato fermentable (vg: glucosa) que descienden el pH del medio hasta 4-5, mostrándose al añadir rojo de metilo al cultivo. Una reacción positiva se denota con la coloración del tubo al rojo. · Voges-Proskauer: Detecta la fermentación butanodiólica, produciendo una gran cantidad de butanodiol. Mediante el uso de alfa-naftol y KOH al 40%, se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína). La acetoina en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo, y éste reacciona con compuestos que contengan guanidina, como la arginina, obteniendo una coloración roja. · Citrato: En esta última prueba se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y energía. Empleado el caldo Koser (con citrato) se detecta turbidez. También se puede utilizar agar citraro de Simmons: medio sólido con citrato sódico y un indicador ácidobase (azul de bromotimol). En este caso se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato (viraje a azul) El resultado de esta prueba para Salmonella spp es -+-+ (siendo variable el resultado para citrato dependiendo del serovar analizado). - Medio Kligler: Utilizado para la diferenciación de enterobacterias en base a su metabolismo fermentativo y la producción de sulfhídrico. Detecta la producción de ácido, gas y SH2. (figura 7) Para ello se realiza una siembra por picadura y en superficie en el tubo e incuba a 37ºC 24h. El medio contiene lactosa y glucosa como carbohidratos fermentables, rojo de fenol como indicador de pH, tiosulfato de sodio, citrato de hierro y amonio, que reaccionan con el sulfhídrico produciendo coloración negra en el tubo. Transcurrido el periodo de incubación se aprecia el fondo del tubo amarillo y la superficie rosa por la fermentación de glucosa, presencia de burbujas por la producción de gas y el ennegrecimiento del medio por la síntesis de SH2, lo que ayuda a identificar el serotipo bacteriano. Por ejemplo S. typhimurium no produce gas pero si sulfhídrico, al contrario que S. enteritidis. - Al sembrar en tubos de agar hierro triple azúcar (TSI) en superficie y por picadura y tras el periodo de incubación a 37ºC 24h se muestra una coloración roja en superficie y amarilla en el fondo, indicando que el microorganismo sólo fermenta glucosa. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, denota la producción de gas y el ennegrecimiento del medio que es productor de SH2. - Medio agar lisina hierro(LIA). Se realiza una siembra similar a la realizada en medio TSI obteniendo tras el periodo de incubación de 48 h a 37ºC el fondo del tubo de color rojo (glucosa +) con ennegrecimiento del medio (SH2 +). Pruebas rápidas para la detección de Salmonella Puesto que realizar todo el análisis para la identificación de Salmonella puede alargarse hasta los 7 días, se han optimizado nuevos métodos aplicados en laboratorio que permiten detectarla más rápidamente. 5 - Sistemas miniaturizados y kits comerciales: Sistemas rápidos basados en el metabolismo de sustratos específicos por parte de los microorganismos y su detección por medio de diversos indicadores, como por ejemplo la galería API, que consta de 21 test bioquímicos dispuestos en pocillos en los que se inocula una solución de las colonias sospechosas. Tras 18-24h a 37ºC se anotan los resultados positivos y negativos obteniendo un perfil numérico que se analiza mediante programas informáticos obteniendo la especie analizada con un intervalo de confianza. (vg: 4004550 S. typhi, 4404112 S. gallinarum). - Test ELISA: Se trata de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en la que se detecta un antígeno mediante un anticuerpo asociado a una enzima, capaz de generar un producto detectable, permitiendo identificar los anticuerpos de Salmonella. - También se pueden realizar métodos como la aglutinación en placa (AP), microaglutinación (MA) inmunofluorescencia (IF), entre otras, que permiten detectar anticuerpos contra Salmonella. - Análisis molecular: PCR. Mediante un proceso de purificación se trata la suspensión con las colonias aisladas con el fin de obtener el DNA. El extracto se trata con solución amortiguadora, primers o cebadores, los 4 tipos de desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs) y la DNA polimerasa o Taqpolimerasa y se introduce en un termociclador que permite amplificar la secuencia de interés. Un ejemplo es la amplificación de la región del gen InvA de Salmonella (Acosta, 2013) Confirmación serológica de las colonias sospechosas El análisis serológico permite identificar a nivel de especie. Para ello se depositan 3 gotas de suspensión microbiana de las colonias a analizar y se hacen reaccionar mezclándolas con suero polivalente O, H y utilizando la tercera como control. Finalmente se observa si aparece aglutinación obteniendo resultado positivo. En el caso de que exista aglutinación únicamente en el suero H, se añade al control antisuero Vi y se observa si se produce aglutinación. 1.4.- Fuentes de transmisión Salmonella es un agente productor de zoonosis de distribución universal (la segunda más declarada por detrás de Campylobacter con una tasa de 20.4 casos por cada 100.000 habitantes en 2011) (figura 9). Se transmite por contacto directo o contaminación cruzada durante la manipulación, procesado de alimentos o agua de distribución. Algunos serotipos presentan especificidad por el hospedador, por ejemplo las cepas de S. typhi y S. paratyphi están restringidas al ser humano, aunque algún serotipo de S. paratyphi puede infectar ocasionalmente ganado. Otros, como S. typhimurium y S. enteritidis, infectan a personas y animales, como aves, vacas, cerdos u ovejas. La bacteria vive en el tracto intestinal del hospedador infectado, por lo que, se transmite vía fecal-oral (WHO, 2011). En las infecciones por serotipos no tifoideos los humanos actúan como vectores, o bien por el consumo de diversos alimentos contaminados y exposición a animales, mientras que para las especies tifoideas se asocia con el consumo de alimentos o agua contaminada, siendo poco frecuente la transmisión entre personas. 6 Salmonella es común en la piel de algunos reptiles y anfibios, lo cual puede ser un foco importante cuando se manipulan a la vez este tipo de mascotas y alimentos. También pueden actuar las moscas como vector de Salmonella. Figura 9. Casos de salmonelosis en EU 2007-2011 (ECDC 2013) 1.5.- Vectores alimentarios El pienso es uno de los factores de riesgo en la epidemiología de la salmonelosis, los animales pueden infectarse por las bacterias procedentes del ambiente contaminado de las granjas (estudios ambientales del MARM indicaron niveles en torno a un 12.5% en fábricas), pájaros o roedores, y también del pienso que se les suministra para alimentación (3.5%). (3tres3, 2012) La Salmonella puede encontrarse en aves de corral, huevos (los huevos y ovoproductos representan la causa de la mitad de brotes de salmonelosis declarados a la EFSA, (AECOSAN, 2011)), carne de vacuno, así como en leche sin pasteurizar, pescado, frutas y vegetales crudos. También se puede contaminar a través del manipulado, como se indica en el apartado de fuentes de transmisión. Si está presente en el alimento, por lo general, no se ven afectadas sus cualidades organolépticas. Tiene cierta relevancia la presencia de este bacilo en agua de consumo, siendo más frecuente los casos debidos a S. typhimurium en aguas superficiales y subterráneas contaminadas. 1.6.- Efectos sobre la salud La salmonelosis se presenta a través de cuatro manifestaciones clínicas (Caffer et al., 2008): - Gastroenteritis (diarrea, náuseas y vómitos) - Bacteriemia o septicemia ( fiebre intermitente con hemocultivos positivos) - Fiebre tifoidea o paratifoidea (fiebre continuada con o sin diarrea) - Portador asintomático Fiebre tifoidea-paratifoidea Enfermedad de declaración obligatoria. El serovar typhi produce la fiebre tifoidea, mientras que el paratyphi A, B, C producen fiebre paratifoidea (suele ser menos grave). 7 Se produce por la ingestión de alimentos o aguas contaminadas. Tras un periodo de incubación de 10-15 días se atraviesa la barrera intestinal y pasa a la sangre, donde es captado por los fagocitos de hígado, bazo y médula ósea, donde se multiplica. Más tarde se vuelve a producir una bacteriemia (de nuevo pasa a sangre. Una vez en el intestino actúa inflamando las placas Peyer, formando ulceras, hemorragias, perforación intestinal, peritonitis, pudiendo causar la muerte si no es tratada. Salmonelosis Todas las cepas pueden producir esta toxiinfección alimentaria excepto los serovares typhi, paratyphi A que producían fiebre tifoidea únicamente (S. paratyphi B puede producir salmonelosis y fiebre tifoidea). Una vez se ingiere el alimento contaminado y tras 12 – 48 horas comienza la sintomatología náuseas, fiebre, dolor abdominal, diarrea, debilidad muscular, entre otras. Transcurridos 1-7 días cesan los síntomas. 1.7.- Diagnóstico Aunque existen pacientes que no presentan sintomatología, la mayoría de las personas experimentan: • Diarrea • Fiebre entre 8 y 72 horas después de la infección. • Dolor abdominal Otros síntomas que pueden darse son: • Dolor de cabeza • Náuseas, vómitos y pérdida de apetito • Mialgia • Erupción máculopapulosa en pecho y espalda (roséola tifoidea) • Somnolencia Estos síntomas suelen aparecer entre las 6 y 72 horas posteriores y desaparecen en un plazo de 4 a 7 días. La salmonelosis puede diagnosticarse mediante un cultivo bacteriano en muestra de heces. La mayoría de las personas mejora sin tratamiento, teniendo especial cuidado entre los grupos de riesgo (ancianos, niños pequeños y pacientes inmunodeprimidos) y en el caso de producirse una septicemia. La fiebre tifoidea ocurre frecuentemente en países en vías de desarrollo. S. typhi se acumula en la vesícula biliar, formando una biopelícula sobre las piedras biliares, permitiendo su resistencia y adaptación en el entorno. El hospedador puede no presentar síntomas de enfermedad, pero elimina esta bacteria por las heces. 1.8.- Profilaxis Como en toda actividad agroalimentaria debe realizarse un enfoque completo sobre la inocuidad de las materias primas y los productos procesados, con el fin de reducir una toxiinfección producida por Salmonella. 8 Los granjeros, la industria, los inspectores, vendedores y trabajadores del sector, así como los consumidores, forman todos ellos un eslabón importante en la seguridad alimentaria mediante la aplicación de sistemas preventivos. Los sistemas nacionales y regionales de vigilancia tienen un papel fundamental para detectar brotes de salmonelosis al inicio, evitando su propagación. (OMS 2013) Materia prima Se recomienda a los productores seguir un código de buenas prácticas de elaboración con el fin de prevenir la contaminación microbiana en productos frescos, entre las directrices se destaca el uso de residuos fecales tratados, la gestión del agua de uso, la utilización de piensos libres de microorganismos y el mantenimiento de las instalaciones y equipos, mejorando las condiciones higiénicas. Siendo la industria avícola uno de los focos de diseminación de Salmonella, se recomienda tratar a los polluelos recién nacidos con antibióticos o bien, con probióticos que colonizan el intestino con microflora beneficiosa antes de que la salmonella invada al polluelo, siendo uno de los tratamientos preventivos más efectivo en recién nacidos. En aves adultas tratarlas con antibióticos. Manipulado Separar carnes y pescados de productos vegetales en el transporte y refrigeración, utilizar utensilios de cocina diferentes así como evitar juntar alimentos cocinados y crudos para impedir que se produzca una contaminación cruzada. Lavado de manos, superficies y utensilios alimentarios con agua caliente y jabón antes y después de trabajar con alimentos, así como después de usar el baño o estar en contacto con mascotas. Se ha demostrado que el alcohol es efectivo como agente desinfectante tópico, además del cloro. (Alba y Araujo, 2008) Se recomienda el uso de papel desechable para la limpieza y el secado. Una correcta educación en seguridad alimentaria y buenas prácticas de manipulación es fundamental para obtener alimentos sanos y seguros. Cocinado: La bacteria puede sobrevivir si los alimentos no son cocinados alcanzando una temperatura interna mínima adeuada: • 62.8ºC para carne de vacuno, porcino o caprino ( 71.1ºC si procede de carne picada) • 62.8ºC para el pescado • 71.1ºC en huevos • 73.9ºC para aves de corral. • Sobras alimentarias recalentar hasta los 73.9ºC Las frutas y verduras deben lavarse adecuadamente antes de procesarlas o consumirlas. La acidificación de los alimentos también ayuda a prevenir que se produzca una contaminación en cualquier etapa posterior. La leche es pasteurizada industrialmente como método preventivo frente a microorganismos, debiendo evitarse la leche cruda o sus derivados. 9 Refrigerado Los alimentos perecederos, preparados o sobras alimentarias deben mantenerse a una temperatura inferior a 4.5ºC. Se puede congelar productos siempre que se alcance una temperatura por debajo de 18ºC y se descongelen en el refrigerador, con agua templada o en microondas (nunca a temperatura ambiente) antes de cocinarse siguiendo las recomendaciones del apartado anterior. 1.9.- Tratamiento En el cuadro gástrico, el tratamiento consiste en la rehidratación y reposición de electrolitos perdidos. En grupos de riesgo e infecciones graves (septicemias) se recomienda terapia antimicrobiana. Actualmente debido a la resistencia de algunas cepas se recomienda el uso de fluoroquinolonas o cefalosporinas (WHO, 2005). En los casos más graves puede acompañarse del uso de esteroides e incluso la extirpación de la vesícula biliar. 10 2. INTOXICACIÓN BOTULÍNICA 2.1.-Introducción El botulismo es un proceso tóxico producido por una toxina preformada en el alimento, elaborada por Clostridium botulinum en la etapa de crecimiento bacteriano, que bloquea los impulsos nerviosos siendo capaz de crear, al menos, cuatro cuadros clínicos diferentes por bloqueo de la transmisión neuromuscular (Pérez-Pérez et al, 2002). Existen cuatro formas de botulismo: • Botulismo cursado por intoxicación alimentaria, que es la principal vía de intoxicación. Se produce a través de la ingestión de la toxina en alimentos mal preparados o conservados inapropiadamente. (Se verá con más detalle en el apartado correspondiente) • Botulismo de las heridas, por producción de la toxina in vivo en heridas contaminadas, pudiendo provocar un cuadro neurodegenerativo tras un periodo de incubación de 10 días. . • El botulismo infantil se debe a la ingestión de la espora y posterior producción in vivo de la toxina en el intestino del lactante. • Botulismo indeterminado, conocido también por botulismo infeccioso entérico del adulto. Ocurre de manera similar al botulismo infantil, donde la toxina es producida en el intestino colonizado por C.botulinum, encontrándose únicamente esporas en el alimento sospechoso. Los primeros casos de botulismo se remontan al siglo IX, en el Oriente Medio, asociado con algunos tipos de embutidos. Aunque no fue hasta 1896 cuando se descubrió y aisló la bacteria causante de la enfermedad así como su toxina. En 1970 se aisló el último de los 8 serotipos de toxina botulínica que se conocen en la actualidad. En Europa, el 40% de los brotes de botulismo se producen en el hogar, debido a un mal cocinado o conservación de los alimentos, por lo que se recomienda seguir unas pautas de higiene y preparación adecuadas a fin de evitar el riesgo derivado (Elika, 2013). 2.2.- Vectores alimentarios C.botulimun es un microorganismo muy distribuido en el suelo. Sus esporas pueden sobrevivir en ambientes adversos como las capas más profundas del suelo, la arena de mar, lechos marinos o lodos de ríos y lagos. Entre los alimentos implicados destacan las carnes y productos cárnicos (contaminados a partir del suelo o heces, pudiendo tener el bacilo de forma natural en piel o intestino), sometidos a proceso de conservación, en productos como jamón ahumado, embutidos o patés entre otros. En pescados crudos (presencia en el intestino o contaminados en la captura) conservados en salados o ahumados 11 Figura 10. Características botulismo alimentario. (Elaboración propia) deficientes. También en conservas vegetales con bajo grado de acidez, como judías o espinacas, ya que como se ha indicado están expuestos a través de suelos contaminados. 2.3.-Características del microorganismo. C. botulinum es un bacilo Gram positivo de la familia Bacillaceae, anaerobio extricto, sin cápsula y formador de esporas resistentes, difíciles de inactivar. La espora no tiene únicamente el propósito de proteger frente a condiciones ambientales adversas, si no que proporciona un medio próspero para que las bacterias liberen su neurotoxina cuando comience a germinar. Bacilos rectos o ligeramente curvados de 2-10 x 0,5-2 micras. Sus esporas son ovales y deforman la célula cuando se producen. Son móviles mediante flagelos perítricos con 4 estructuras antigénicas: somática, flagelar, esporas y endotoxinas. Crecen a temperaturas entre 15-69ºC, aunque el rango de crecimiento óptimo es 25-35ºC. Toleran pH comprendidos entre 4.6 y 8 No crecen a concentraciones de sal superiores al 10%, o un a w < 0.935. En cuanto a su metabolismo, la mayor parte de las cepas fermentan carbohidratos. Son productoras de gas, ácido sulfhídrico y acetil metil carbinol. Las cepas de C. botulinum se clasifican en cuatro grupos en función de sus propiedades bioquímicas y su capacidad proteolítica (grupos I-IV) (AECOSAN, 2014) • I (proteolítico, toxinas A, B, F) • II (no proteolítico, toxinas B, E, F) • III (toxinas C, D) • IV (toxina G) 2.4.-Toxina Se trata de un veneno muy potente (10-10 g/kg mataría a un ratón). Existen al menos 7 serotipos de toxina botulínica, designadas con las letras A a G (el serovar C contiene dos componentes C1 y C2). Los tipos A, B, E, F, G son los únicos que afectan al hombre. La toxina A posee mayor afinidad por el tejido nervioso. Los tipos C, D y E producen enfermedades en otros mamíferos, aves y peces. Los genes codificantes de estas toxinas se encuentran en diferente localización dependiendo del serotipo y su síntesis es ejercida por un fago específico. Todas las neurotoxinas se producen en la fase de crecimiento y se liberan durante la lisis bacteriana, producida de manera espontánea, bajo la influencia de autolisinas producidas por la propia cepa de C. botulinum (Pérez-Pérez et al, 2002). 12 Están formadas como una única cadena polipeptídica simple de escasa actividad, que posteriormente sufre una modificación debido a la acción de proteasas, dando lugar a una cadena pesada (H) y una ligera (L) de aproximadamente 100 y 50 kDa respectivamente, unidas por enlace disulfuro. La cadena ligera, fracción realmente tóxica, posee actividad metaloendopeptidasa, se activa tras la reducción del puente disulfuro. La cadena Figura 12. Modelo de las cadenas H y L de las neurotoxinas de C. botulinum (Voet-Voet) pesada contiene dos dominios: uno es el responsable del proceso de translocación de membrana de la cadena ligera en el citosol de la neurona; el otro es responsable de la unión neuroespecífica de la molécula. Estas moléculas se absorben en diferentes áreas del intestino. (Cameán et al, 2012) Mecanismo de acción En alimentación, la intoxicación se produce al ingerir la toxina preformada. Se absorbe a nivel intestinal por endocitosis. La toxina es transportada vía linfática o sanguínea hasta las terminaciones nerviosas del sistema nervioso periférico, bloqueando la liberación del neurotransmisor acetilcolina. La toxina no interfiere en la síntesis y degradación de acetilcolina, si no que interviene produciendo la lisis del complejo de proteínas SNARE, encargadas del mecanismo de exocitosis por parte del nervio ( cada cadena L de los diferentes eserotipos dividen el complejo SNARE en un sitio específico) , lo que impide la transmisión del impulso nervioso causando una parálisis flácida de los músculos esqueléticos y fallo parasimpático (AECOSAN, 2016), con una tasa de mortalidad del orden del 10%. Figura 13.Mecanismo de inhibición del neurotransmisor acetilcolina (versión modificada de NOTIMEX) 2.5.-Sintomatología Las neurotoxina botulínica tiene un periodo de incubación generalmente de 18-36 horas tras la ingestión del alimento (puede presentarse entre las 4 horas posteriores hasta un máximo de 8 días), provocando parálisis flácida, pudiendo producir insuficiencia respiratoria y del habla. 13 Inicialmente se muestra un cuadro de fatiga intensa, debilidad y vértigo, seguido de visión borrosa, sequedad de boca y dificultad para tragar y hablar. Pueden darse otros síntomas como vómitos o diarrea, así como inflamación abdominal. El bloqueo de la acetilcolina produce la parálisis muscular, involucrando a los músculos del sistema respiratorio cardíaco, pudiendo causar la muerte. El botulismo infantil se produce en niños de entre 1 a 52 semanas de edad al ingerir el alimento contaminado (los principales vectores son la miel y el jarabe de maíz, si bien se han detectado en preparados para lactantes, cereales, verduras, infusiones, etc.). Las bacterias llegan al tracto intestinal y, debido a la inmadurez de la flora, las esporas botulínicas germinan (únicamente por los serotipos A y B) y liberan la toxina en el colon, donde es absorbida pasando a sangre y uniéndose a los nervios periféricos, impidiendo la liberación de la acetilcolina. El primer síntoma es el estreñimiento, posteriormente los síntomas observados incluyen constipación, letargo y falta de apetito, falta de expresión en el rostro, dificultad para tragar. En casos severos, produce parálisis pudiendo llegar a causar la muerte del lactante. 2.6.-Profilaxis Deberán incorporarse buenas prácticas de higiene y fabricación de productos alimentarios. También la verificación de cada una de las etapas del proceso mediante la implantación de un correcto APPCC, estudiando en qué procesos podría desarrollarse C. botulinum, controlando la integridad de los envases, y respetando los procesos de enfriamiento, almacenamiento y transporte en condiciones higiénicas. Se puede controlar el desarrollo de la toxina de C.botulinum a través de una limpieza adecuada del producto, utilizando alimentos frescos y minimizando la contaminación de productos cárnicos durante el sacrificio. La modificación de los factores de crecimiento como el pH (se inhibe la producción de la toxina a pH iguales o inferiores a 4.6), actividad de agua (valores de a w por debajo de 0.93 impiden el crecimiento del microorganismo), temperatura (tratamientos a pH ácidos y temperaturas de 121ºC durante 3 minutos inactivan las esporas de C. botulinum, las toxinas son relativamente sensibles al calor y se inactivan a 80ºC 10 minutos. Temperaturas de refrigeración a 4ºC inhiben la producción de las toxinas). También mediante el uso de conservantes químicos que inhiban el crecimiento (vg: nitritos en carne). La existencia de gas o hinchamiento en conservas puede ser indicativo de la acción proteolítica de las toxinas botulínicas, por lo que se recomienda desechar envases abollados, rotos o inflados. Se deben extremar las precauciones al elaborar conservas caseras, esterilizando los productos preparados en ollas a presión durante 30 minutos, refrigerándolos y almacenándolos en condiciones óptimas. 2.7.-Métodos de detección A pesar de su cuadro clínico claro, la forma más efectiva y directa de diagnóstico se realiza en laboratorio mediante la detección del microorganismo o sus neurotoxinas, si bien no es un procedimiento adecuado para laboratorios de análisis rutinarios ya que, por ser una sustancia extremadamente tóxica, deberán extremarse las medidas de seguridad. 14 Se confirma mediante el aislamiento microbiano a partir del alimento sospechoso y heces (en ocasiones la sintomatología del paciente requiere el uso de enemas para extraer una muestra) o vómitos de la persona infectada. Por otro lado puede realizarse un análisis para conocer el serotipo de C. botulinum a través del estudio de sus toxinas en muestras alimentarias, heces o en suero. • En el estudio de muestras alimentarias se debe utilizar protección especial por parte del analista, así como material estéril y desinfectantes como alcohol yodado para la limpieza de la lata. Como paso previo a la apertura del envase se observará si existe abombamiento, volviendo a realizar un análisis visual una vez abierto (presencia de burbujas, color, etc.). Se extrae una alícuota y se mezcla a partes iguales con tampón fosfato, homogeneizando con la ayuda de un Stomacher. Finalmente se centrifuga a 3500rpm durante 30 minutos a 4ºC, separando sobrenadante (donde se detecta la toxina) del sedimento (contiene las células vegetativas o esporas). En el análisis del sedimento se extraen alícuotas e inoculan en caldo de carne cocida, poniéndolas en anaerobiosis a diferentes condiciones de incubación (una batería a temperatura ambiente, otra calentando a baño maría a 60ºC, la última calentando a 80ºC). Las diferentes condiciones de temperatura sirven para seleccionar las esporas por su termo resistencia. Finalmente se incuban en anaerobiosis durante 7 días a 30ºC. El caldo contiene sustancias reductoras que favorecen el crecimiento de microorganismos anaerobios estrictos. Transcurrido ese tiempo se siembran en placa en anaerobiosis a 30ºC 3 días. Las colonias de C. botulinum crecen en agar sangre mostrando un patrón hemolítico característico, o agar yema de huevo donde, debido a su actividad lipolítica, presentan un precipitado amarillento. Finamente se realizan pruebas específicas sobre las colonias sospechosas (tinción Gram, análisis metabólico frente a glucosa (+), maltosa (+) y lactosa (-), capacidad sulfitoreductora, pruebas inmunoenzimáticas, etc.), aunque raramente se aísla el microorganismo el cuadros clínicos de botulismo. En el sobrenadante se dividen tres alícuotas: la primera porción se calienta a 100ºC 5 minutos, con el fin de eliminar la toxina. La segunda se diluye 1:5 en tampón fosfato. La tercera se diluye a partes iguales con tripsina al 1% en tampón fosfato. La tripsina actúa activando las toxinas de los serovares no proteolíticos. Finalmente las 3 preparaciones se estudian mediante un bioensayo en ratones. • El diagnóstico diferencial de la toxina se realiza en ratones, utilizando antisueros específicos para cada tipo de toxina. Se trata de un ensayo específico y sensible donde se obtienen resultados antes de 72 horas (el cultivo específico por métodos clásicos en placa tarda alrededor de 7-10 días). El procedimiento consiste en inocular muestras de heces (principalmente) o suero infectado, así como los extractos del sobrenadante vistos en el apartado anterior en distintos lotes de ratones a los que se les suministra antitoxina y se observa la sintomatología y supervivencia. • Se están desarrollando pruebas alternativas al bioensayo sobre ratones, como el estudio sobre cultivos celulares o inmunoensayos específicos como ELISA, si bien su sensibilidad y fiabilidad todavía no es equiparable. Actualmente puede caracterizarse el serovar de C. botulinum a partir del estudio por amplificación genómica de los genes codificantes de las neurotoxinas. 15 2.8.-Tratamiento La incidencia de esta enfermedad es baja, pero es de gran impacto debido a su alta tasa de mortalidad en caso de no ser tratada apropiadamente y a tiempo. La recuperación de la intoxicación botulínica generalmente lleva de semanas a meses, dependiendo de la gravedad, pudiendo quedar secuelas de parálisis donde no se podrá recuperar la funcionalidad perdida. Si la ingestión es reciente podrá realizarse un lavado gástrico y forzar el vómito. Si no hay obstrucción intestinal se procederá a suministrar purgantes y enemas para eliminar la toxina del intestino. Deberá suministrarse ventilación mecánica en los casos más graves, pudiendo ser necesario administrar líquidos intravenosos si persiste la dificultad de deglución. La administración de antitoxina trivalente de caballo (Tornese et al. 2008) es recomendada para los serotipos A, B y E donde, suministrada a tiempo, puede detener la progresión de la enfermedad, neutralizando la toxina circulante. No es recomendable el uso de antibióticos, pues no está demostrada su eficacia en cuadros de botulismo. 16 BIBLIOGRAFÍA (1) Aenor, 2003. 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