Alteraciones del desarrollo cerebral en el alcoholismo materno-fetal: rol del sistema serotoninérgico y de la astroglía

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE MEDICINA
Tesis de Doctorado
Alteraciones del desarrollo cerebral
en el alcoholismo materno-fetal:
rol del sistema serotoninérgico y de la astroglía
SERGIO GUSTAVO EVRARD
Directora del Trabajo de Investigación y Plan de Tesis:
Prof. Dra. HERMINIA ALICIA BRUSCO
Año 2008
1ª UNIDAD ACADÉMICA del DEPARTAMENTO DE
BIOLOGÍA CELULAR, HISTOLOGÍA, EMBRIOLOGÍA Y GENÉTICA
INSTITUTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y NEUROCIENCIAS
“Prof. EDUARDO DE ROBERTIS”
A Florencia, la personita más tierna del universo, mi solcito en el cielo. Te amo.
A Graciela. Mi mujer. Mi compañera. Te amo.
A Neva y Carlos (in memoriam) que hicieron de mí todo lo que soy y que, desde mi
corazón, observan los frutos de su gigantesco esfuerzo y enorme amor. Los amo.
Mi eterno agradecimiento a:
Mis amigos de toda la vida (Luis, M arcelo, Nacho, César, Andrés, Fernando, Ezequiel) que me alegran
la vida mucho más de lo que ellos, probablemente, se imaginan. A lo largo de ya muchos años (¡34!) me han
ayudado y me ayudan a vivir. Y permiten que yo haga lo propio por ellos. Mis hermanos del alma.
Patricia Tagliaferro (Patri), excelente profesional e, infinitamente, mejor amiga. Fuente de toda tranquilidad
y paciencia para con este médico inexperto en las lides de la mesada. Amiga ahora a la distancia, baltimorense
y “newjerseyense” perdida para la Argentina y ganada para Nigeria, fuente subversiva de innúmera bibliografía
hurtada hábil y legalmente al Imperio. Siempre una voz mesurada, tranquilizadora, equilibrada.
Javier Ramos (Javi), excelente investigador y gran compañero; ¡pobre hombre! me ha enseñado con infinita
paciencia todo lo que se debe saber en un laboratorio (poco he aprendido, vano esfuerzo el tuyo); más
importante que todo, consejero y amigo, no sólo él, sino su propia tesis me ha servido de enorme ayuda en la
confección de esta, la mía; benavidense por adopción y colegial renegado (sabiamente). Flamante padre, la
vida tiene otras caras. ¡Sí, ya vamos a hacer la stand-up comedy!
M aite Duhalde Vega (M ai) y Alejandro Ferrari (Ale), con quienes tanto hemos trabajado y nos hemos
divertido, con quienes nos hemos hartado de tomar mate, reírnos, cortar cerebros y hacer “inmunos”. A Maite
le debo la toma de algunas de las muy buenas fotos de este trabajo.
Javier Lujilde, chubutense conspirador devenido esquelense aspira-cenizas, hacker, cracker, aprendiz de brujo
y anestesiólogo, excelente médico que conserva intacta su consciencia, comedor de paredes celulares,
excelente compañero y mejor amigo. ¡Zonzo...!
Laura Caltana, que, además de colaborar y ayudarme, es una lúcida mujer, que siempre está alerta a todo y
le pone un toque de frescor al laboratorio.
Paula Fontanet, estudiante de biología, inteligente mujer y mejor cocinera de tortas de chocolate, simpática
y divertida, disgráfica escritora de correos electrónicos, que me ha ayudado con infinitas mediciones (mientras
miraba videos de lo más aburridos); espero que no le hayan quedado daños cerebrales persistentes.
Paula Aronne, nuestra biológa marplatense, que ha realizado y realiza un intensivo curso de deformación
científica bajo mis certeros consejos (¡Dios se apiade de ti, hija mía!), y que tanto me ha ayudado con los
experimentos y mediciones, inmunos y cesáreas. Una gran amiga, lamentablemente iniciada en los misterios
dolorosos y fecundos de la vida.
Alicia Rossi, sufrida rosarina en la gran urbe, luchadora incansable contra vientos y mareas, el ejemplo vivo
de lo que es una buena persona. También ella vió videos hasta el cansancio (¡más aún!); espero que no le hayan
quedado daños cerebrales por los infinitos videos.
Trinidad Saez, nuestro misterio en forma de biológa. Sin embargo, yo te conozco, je...
Tamara Guadagnoli, el ejemplo vivo de la persona feliz si las hay, (ya) futura esposa, bióloga, sahumerista
y descontaminadora de los malos espíritus que se cuelan en nuestro laboratorio.
Emérita (jeje) Jorge Vilela de Banchieri, M eri, nuestra queridísima Meri (y ahora, ¡la nonna!), excelente
técnica de microscopía electrónica y, casi, casi, una mamá más. Gracias, Meri. ¡No te imaginás cuánto te debo!
¡Ojalá hubiera en el mundo más mujeres como vos!
Dorita Tello y Gladys M oreira, que han cuidado de todas mis ratas con esmero y profesionalismo y han
tolerado todos mis pedidos con buen humor y solicitud, y siempre me han ayudado, incluso más allá de lo que
les correspondía.
Pablo Corazza, quien con cuidado y habilidad ha revelado todos y cada uno de los negativos y los positivos
de las fotografías de microscopía electrónica.
Todo el personal técnico y no docente, presente y pasado, de la Cátedra y el Instituto (Antonia Aloisio,
Patricia Altieri, Carolina Barraza, Nilda Buscaglia, Alejandro Butti, M aría Ester Céceres, Rita
iii
Corvalán, Susana Cuneo, M argarita López, M ariana López Ravasio, Silvia M auro, Norma Olives†,
Daniel Otero, Pablo Oviedo, Ángel Pablo Henríquez, Carmen Ramos, Valentina Sorzoni, Christian
Tello, Silvia Trejo) sin quienes, simplemente, ninguno de nosotros podría trabajar y yo no hubiera podido
llegar a esto.
La Lic. M aría Teresa Di Vietro y todo el personal a su cargo en la Biblioteca Central “M ontes de Oca”
de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires (entre todos ellos, especialmente Patricia
Carrizo, M aría Rosa Saracino, Carina Zabala, Sebastián Aranega, Diego Palermo, Alejandro Delgado),
que han atendido con profesionalismo y excelente predisposición a todos mis pedidos (muchos de ellos,
extensos y/o extraños) en mis numerosas consultas y búsquedas bibliográficas; fieles guardianes del
invalorable y desconocido tesoro bibliográfico de nuestra querida Facultad.
Mis muchos y muy buenos compañeros del Hospital Neuropsiquiátrico de M ujeres “Dr. Braulio A.
M oyano” (el antiguo y más romántico Hospital Nacional de Alienadas) a quienes debo tanto, pero tanto, en
muchos sentidos (profesional y personal): Fabián M olina (¡papá!); Cristina Olivieri, Laura Belfiore, Elisa
Cortese, Luis M azzarella, Alberto Andrieu, Cecilia Gasque Justo, Adrián Fantini y Florencia Esteban.
Álvaro Beccio. Irene Romero, Viviana Pezoa, Norma Noto , y Hugo Alcalá. Carlos Paz, M ariano Outes,
Guillermo Núñez, Susana Vallejo, Cristina Jorrat, Patricia Presas, M artina Polach, Lucía Seré,
Carolina Singer y M atías M artínez. Rosalía Pereyra (¡mamá!), M aría Zapana, Luis Cubillas, Lorena
Albamonte, M ónica Rodríguez, M ónica Ibarra, Dionisio Barros y Gabriela Valentino. M irta Ricci.
Pablo Berretoni. A Dante, gracias por toda la compañía silenciosa pero eficaz; hasta el último momento.
Norberto M uzzoppappa, excelente psicólogo, colega y amigo gracias a quién, en parte, pude continuar con
esta tesis (y no sólo eso).
El Dr. Juan Carlos Goldar quien (no lo sabe, por supuesto) me ha servido (y sirve) de guía e inspiración
silenciosa en el arduo e ingrato camino por la diferencia entre CIENCIA y deporte tecnológico, entre
investigación científica y CIENCIA. Sin quererlo, contribuyó en gran medida a que me diera cuenta y
confirmara que la claridad mental, los conocimientos y la sabiduría no se alcanzan acumulando títulos y
honores, diplomas y distinciones, publicaciones y conferencias, o corriendo tras innúmeros cursos. Sino por
el simple expediente de sentarse tranquilo a leer, a observar, a registrar, a reflexionar y pensar.
Independientemente para con la opinión de los numerosos “iluminados” que pululan por doquier.
Fabián Loidl, por su amistad, simplemente. Aún quedan espíritus decimonónicos en nuestro mundo.
Juan José López, otro espíritu del XIX, que siempre ha estado ahí para brindarme un consejo.
M aría Jimena Ricatti, mi gran amiga (¡gracias por todo! y yo sé por qué), a quien me une no sólo el amor
sino también el espanto. Gracias.
*
*
*
Finalmente (last, but not least), a la Prof. Dra. Alicia Brusco, mi directora de tesis, que me dió la gigantezca
oportunidad de hacer lo que toda la vida quise: CIENCIA. Y que casi estoicamente soportó mi lentitud en el
trabajo, mis desvaríos y desvíos, mi minuciosidad y preciosismo permitiéndome, a la vez, innovar, crear y
experimentar con inusual libertad y confianza hacia mí (algo que es muy poco frecuente hoy en día). A ella,
mi enorme y eterna gratitud. Gracias, Alicia, por aguantarme. Espero que haya valido la pena tanta
“malasangre”.
iv
“Conviene que la gente sepa que nuestros placeres, gozos, risas y juegos no proceden de otro
lugar sino de ahí [del cerebro], y lo mismo las penas y amarguras, sinsabores y llantos. Y por
él precisamente, razonamos e intuimos, y vemos y oímos y distinguimos lo feo, lo bello, lo
bueno, lo malo, lo agradable y lo desagradable, distinguiendo unas cosas de acuerdo con la
norma acostumbrada, y percibiendo otras de acuerdo con la conveniencia; y por eso al
distinguir los placeres y los desagrados según los momentos oportunos no nos gusta (siempre)
las mismas cosas.
“También por su causa enloquecemos y deliramos, y se nos presentan espantos y terrores, unos
de noche y otros por el día, e insomnios e inoportunos desvaríos, preocupaciones inmotivadas y
estados de ignorancia de las circunstancias reales y extrañezas. Y todas esas cosas las
padecemos a partir del cerebro, cuando este no está sano,...”
Hipócrates (siglo V a.C.; Sobre la enfermedad sagrada, Corpus Hippocraticum)
“...el aprender no es realmente otra cosa sino recordar...”
Platón (siglo IV a.C.; Fedón, 72 e).
“...el que se plantea un problema o se admira, reconoce su ignorancia...”
Aristóteles (siglo IV a.C.; Metafísica, I, 2, 982b 15-20)
“In plicas cerebri, memoria et reminiscentia.”
Thomas W illis (1664; Cerebri Anatome) 1
“La Psicología, a pesar de numerosos esfuerzos e intentos, no ha podido ser llevada finalmente
al rango de una ciencia exacta porque sus conceptos básicos fueron edificados forzada e
independientemente de los conocimientos cerebrales. La ingenua presuposición de que sin
conocer un órgano como el cerebro puede desarrollarse su fisiología ha convertido a esta en un
campo de acción para las más extrañas ocurrencias de las cuales poco queda como valedero.
“También la Psiquiatría, por falta de claros conceptos sobre el órgano de la Psiquis, ha sufrido
sensiblemente y no ha podido remontarse al mismo plano que el resto de las disciplinas
médicas” [...] “Todavía en los últimos tiempos autores de difundidos textos psiquiátricos se
ufanan en el desprecio a la anatomía cerebral considerándola casi como un requisito para
entender la psicopatología y como prueba de una madura experiencia psiquiátrica. Yo espero
que este orgullo de los ignorantes próximamente llegue a su fin.”
Paul Emil Flechsig (1896; Gehirn und Seele) 2
1
Citado en Outes y Estevez, 1987.
2
Citado en Outes y González, 1988.
v
Los resultados del presente trabajo han sido parcial y previamente publicados en:
Experimental Neurology (2006); 200: 438-459.
Developmental Brain Research (2003); 147: 119-133.
Annals of the New York Academy of Sciences (2002); 965: 343-353.
Annals of the New York Academy of Sciences (2002); 965: 334-342.
vi
Índice
“Hasta el viaje más largo comienza por el primer paso.”
Proverbio chino.
Agradecimientos.
iii
Lista de abreviaturas.
xiii
Resumen.
1
I. Introducción:
6
1. Un caso clínico ilustrativo (a modo de prólogo).
7
2. El alcoholismo materno-fetal (AMF) (el morbo):
11
I.2.1. Los trastornos del espectro del alcoholismo fetal (FASD).
14
I.2.1.1. El síndrome alcohólico fetal (FAS).
19
I.2.1.2. Los efectos del alcoholismo fetal (FAE):
22
I.2.1.2.1. Los trastornos congénitos relacionados con el alcohol
(ARBD).
23
I.2.1.2.2. Los trastornos del neurodesarrollo relacionados con el
alcohol (ARND).
23
3. El etanol (el agente etiológico):
26
I.3.1. Farmacocinética.
27
I.3.2. Farmacocinética del etanol en la mujer. Características particulares.
32
I.3.3. Farmacocinética materno-fetal y en el recién nacido.
33
I.3.4. Farmacodinamia.
35
I.3.5. Correlación entre el nivel de alcoholemia y las manifestaciones
cognitivo-conductuales en la intoxicación aguda.
36
4. Desarrollo normal del sistema nervioso central (el período de acción de
la noxa).
38
I.4.1. La inducción de la placa neural y la neurulación.
40
I.4.2. Formación de las vesículas encefálicas.
41
I.4.3. Desarrollo de las vesículas telencefálicas y corticogénesis.
43
I.4.3.1. Formación del neuroepitelio.
43
I.4.3.2. Cinética proliferativa de las células neuroepiteliales.
44
I.4.3.3. Ritmo proliferativo de las zonas ventricular y subventricular del neuroepitelio.
46
I.4.3.4. La glía radial.
49
I.4.3.5. Evolución posterior del neuroepitelio en las vesículas telencefálicas.
52
5. Las relaciones neurogliales (el mecanismo etiopatogénico):
55
I.5.1. La serotonina:
55
I.5.1.1. Síntesis, almacenamiento, liberación y degradación.
56
I.5.1.2. El sistema serotoninérgico.
58
I.5.1.3. Los receptores 5-HT1A.
62
I.5.1.4. Funciones de la serotonina en el SNC adulto y en el desarrollo. 64
I.5.2. Los astrocitos:
67
I.5.2.1. Morfología y funciones.
68
I.5.2.2. La proteína S100B.
73
I.5.3. El citoesqueleto neuronal y astrocitario:
77
viii
I.5.3.1. Los filamentos intermedios (FI).
I.5.3.2. La proteína asociada a microtúbulos de tipo 2 (MAP-2).
I.5.4. El óxido nítrico y el sistema nitrérgico.
II. Hipótesis y Objetivos.
1. Consideraciones generales acerca del alcoholismo materno-fetal, el sistema serotoninérgico, los astrocitos y la proteína S100B y el sistema nitrérgico.
2. Hipótesis.
3. Objetivos:
II.3.1. Generales.
II.3.2. Específicos.
III. Materiales y Métodos:
1. Materiales.
2. Métodos:
III.2.1. Método utilizado de administración de etanol.
III.2.2. Metodología general del tratamiento de los animales:
III.2.2.1. Origen, alojamiento.
III.2.2.2. Apareamiento, diagnóstico de preñez y cría.
III.2.2.3. Alimentación apareada.
III.2.2.4. Bebida.
III.2.3. Protocolos experimentales:
III.2.3.1. Exposición prenatal al etanol, sin prevención del daño.
III.2.3.2. Exposición prenatal al etanol, con prevención del daño
por administración de buspirona.
III.2.3.3. Exposición al etanol durante la adolescencia con abstinencia
posterior.
III.2.3.4. Exposición al etanol durante la adultez.
III.2.4. Evaluación conductual de la intoxicación y la abstinencia.
III.2.5. Determinación de la alcoholemia.
III.2.6. Estudios de microscopía:
III.2.6.1. Fijación de los animales y procesamiento de los cerebros.
III.2.6.2. Selección de los cortes de tejido. Áreas cerebrales evaluadas.
III.2.6.3. Microscopía óptica:
III.2.6.3.1. Coloración de Nissl.
III.2.6.3.2. Inmunocitoquímica (ICQ).
III.2.6.3.3. Análisis de imágenes digitales asistido por computadora.
Morfometría.
III.2.6.4. Microscopía electrónica.
III.2.7. Estudios conductuales.
3. Análisis estadístico de los datos.
IV. Resultados:
1. Protocolo de exposición prenatal al etanol sin prevención del daño:
IV.1.1. Resultados generales del tratamiento:
IV.1.1.1. Consumo de alimento.
IV.1.1.2. Consumo de bebida.
IV.1.1.3. Consumo de etanol.
IV.1.1.4. Ingreso calórico total .
IV.1.1.5. Evolución ponderal de las hembras.
IV.1.1.6. Número de crías, relación machos/hembra, peso de las crías
77
81
83
87
88
91
93
93
95
97
98
99
99
101
101
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124
124
124
125
127
128
130
ix
al nacer y su evolución ponderal hasta P21.
IV.1.1.7. Alcoholemia en madres y crías.
IV.1.2. Observación de los cortes de los cerebros de crías P21 teñidos
con la coloración de Nissl.
IV.1.3. Experimentos de inmunocitoquímica en P21:
IV.1.3.1. Triptófano hidroxilasa (TPH).
IV.1.3.2. Serotonina (5-HT).
IV.1.3.3. Transportador de serotonina (5-HTT).
IV.1.3.4. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP).
IV.1.3.5. Proteína S100B (S100B).
IV.1.3.6. Neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200).
IV.1.3.7. Óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS).
IV.1.4. Microscopía electrónica del cerebro de las crías en P5 y P21.
2. Protocolo de exposición prenatal al etanol con prevención del daño por administración de buspirona:
IV.2.1. Resultados generales del tratamiento:
IV.2.1.1. Consumo de alimento.
IV.2.1.2. Consumo de bebida.
IV.2.1.3. Consumo de etanol.
IV.2.1.4. Ingreso calórico total.
IV.2.1.5. Evolución ponderal de las hembras.
IV.2.1.6. Número de crías, relación machos/hembra, peso de las crías
al nacer y su evolución ponderal hasta P88.
IV.2.1.7. Alcoholemia en madres y crías.
IV.2.2. Experimentos de inmunocitoquímica:
IV.2.2.1. Serotonina (5-HT).
IV.2.2.2. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP).
IV.2.2.3. Proteína S100B (S100B).
IV.2.2.4. Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2).
IV.2.3. Experimentos conductuales en P90.
3. Protocolo de exposición al etanol durante la adolescencia con abstinencia
posterior.
IV.3.1. Resultados generales del tratamiento (consumo de alimento y líquido, alcoholemias y peso de las ratas).
IV.3.2. Experimentos de inmunocitoquímica:
IV.3.2.1. Serotonina (5-HT).
IV.3.2.2. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP).
IV.3.2.3. Proteína S100B (S100B).
IV.3.2.4. Neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200).
IV.3.2.5. Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2).
IV.3.2.6. Óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS).
IV.3.2.7. Descripción de los cambios morfológicos observados en el
citoesqueleto neuronal.
4. Procolo de exposición al etanol durante la adultez:
IV.4.1. Resultados generales del tratamiento.
IV.4.2. Experimentos de inmunocitoquímica:
IV.4.2.1. Transportador de serotonina (5-HTT).
IV.4.2.2. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP).
IV.4.2.3. Proteína S100B (S100B).
133
134
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141
141
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161
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171
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189
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202
206
208
208
208
208
210
212
x
V.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
VI.
1.
2.
VII.
1.
2.
3.
4.
IV.4.2.4. Neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200).
IV.4.2.5. Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2).
Discusión:
Parámetros generales de los tratamientos en los distintos protocolos:
V.1.1. Consumo de alimento, bebida y calorías.
V.1.2. Consumo de etanol y alcoholemias.
V.1.3. Variaciones de peso.
V.1.4. Efectos generales de la exposición prenatal al etanol sobre la descendencia.
Las neuronas “oscuras” o la Zellschrumpfung:
V.2.1. Hallazgos en la corteza frontal con el Nissl.
V.2.2. Hallazgos en el cuerpo estriado y en la corteza frontal con la microscopía electrónica.
La exposición prenatal al etanol.
La prevención del daño con buspirona.
Los adolescentes:
V.5.1. El problema de definir y delimitar la adolescencia en humanos y
en ratas.
V.5.2. Cambios nerviosos y conductuales normales durante la adolescencia.
V.5.3. Cambios morfológicos prolongados tras la exposición durante
la adolescencia y la abstinencia.
Los adultos.
Comparación de los hallazgos entre las distintas edades.
Conclusiones y comentarios finales.
Conclusiones.
Comentarios finales.
Anexos:
Anexo I. Síndrome alcohólico fetal y trastornos asociados. Criterios diagnósticos:
VII.1.1. Elementos diagnósticos de Jaqueline Rouquette.
VII.1.2. Criterios diagnósticos del Institute of Medicine (IoM).
VII.1.3. Propuesta de revisión de los criterios diagnósticos del Institute of
Medicine (IoM) para los FASD.
VII.1.4. Criterios diagnósticos para el Centro para el Control de Enfermedades (CDC) para los FASD.
VII.1.5. Código diagnóstico de 4-Dígitos.
VII.1.6. Lineamientos canadienses para el diagnóstico del FAS, FAS parcial y los ARND.
Anexo II. Manifestaciones fenotípicas físicas en el síndrome alcohólico
fetal.
Anexo III. Receptores serotoninérgicos.
Anexo IV. Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo:
VII.4.1. Estructura de la proteína S100B.
VII.4.2. Estructura del receptor para los productos finales de la glucosilación avanzada (RAGE).
VII.4.3. Estructura de los filamentos intermedios (FI).
VII.4.4. Estrucutra de la proteína asociada a microtúbulos de tipo 2
(MAP-2).
214
216
220
221
221
226
231
233
236
236
252
256
265
271
271
272
273
284
286
289
290
292
296
297
297
297
299
302
303
304
307
308
310
310
312
313
315
xi
5. Anexo V. Métodos experimentales de exposición de animales al etanol.
Ventajas y desventajas de cada uno:
VII.5.1. Administración en el agua de bebida.
VII.5.2. Administración por inyección intraperitoneal.
VII.5.3. Administración intragástrica.
VII.5.4. Administración inhalatoria.
VII.5.5. Administración por dieta líquida.
6. Anexo VI.Tablas de datos de los parámetros nutricionales evaluados en los
protocolos de exposición prenatal al etanol (EPE).
7. Anexo VII. Tablas de datos de los parámetros morfométricos evaluados en
los experimentos de inmunocitoquímica.
VIII. Bibliografía.
318
320
321
322
324
324
327
329
334
xii
Lista de Abreviaturas:
5-HT
5-HT 1A
5-HTT
Ach
ADH
ALDH
AMF
AMPc
ARBD
ARND
BHE
CA1 Hipp
CC
CCGT-C
cC-R
cGR
cNEp
CxF
*
DA
DL 50
DOR
E
EEG
EMCE
eNOS
EEG
EGL
EPE
EtOH
FAE
FAS
FASD
FI
GABA
GFAP
GMPc
Hipp
hpm
ICQ
iNOS
ip
-ir
iv
kCal
kDa
:m
:m 2
serotonina
receptor serotoninérgico tipo 1A
transportador de serotonina
acetilcolina
alcohol deshidrogenasa
aldehído deshidrogenasa
alcoholismo materno-fetal
adenosín monofosfato cíclico
defectos congénitos relacionados
con el alcohol
trastornos del neurodesarrollo relacionados con el alcohol
barrera hematoencefálica
área CA1 del hipocampo
corteza cerebral
crisis convulsivas generalizadas tónico-clónicas
células de Cajal-Retzius
células de la glía radial
células neuroepiteliales
corteza frontal
densidad
dopamina
dosis letal 50
densidad óptica relativa
día embrionario o gestacional
electroencefalograma/fico
exposición materna crónica al etanol
óxido nítrico sintetasa, isoenzima
endotelial, o tipo III
electroencefalograma
eminencia gangliónica lateral
exposición prenatal al etanol
etanol
efectos del alcoholismo fetal
síndrome alcohólico fetal
trastornos del espectro del alcoholismo fetal
filamentos intermedios
ácido (-aminobutírico
proteína gliofibrilar ácida
guanilato monofosfato cíclico
hipocampo
haz prosencefálico medial
inmunocitoquímica
óxido nítrico sintetasa, isoenzima
inducible, o tipo II
intraperitoneal
inmunoreactivo/idad
intravenoso
kilocalorías
kilodaltons
micrometro
micrometro cuadrado
:M
MAP
MAP-2
MCP
MET
MF
MGP
MGS
MLE
MLI
mM
MT
nM
Nb
Nf-68
Nf-160
Nf-200
nm
nM
NDR
NMDA
NMR
nNOS
NO
NOS
NT
P
PC
PE
PM
pM
PP
p/v
RMN
S100B
sc
SNC
sP
Strt
TDAH
VRN
v/v
ZG
ZI
ZM
ZSV
ZV
micromolar
proteína asociada a microtúbulos
proteína asociada a microtúbulos
tipo 2
muerte celular programada
microscopía/io electrónica/o de
transmisión
microfilamentos
matriz germinativa primaria
matriz germinativa secundaria
membrana limitante externa
membrana limitante interna
milimolar
microtúbulos
nanomolar
neuroblastos postmitóticos migratorios
neurofilamentos de 68 kDa de PM
neurofilamentos de 160 kDa de PM
neurofilamentos de 200 kDa de PM
nanometro
nanomolar
núcleo dorsal del rafe
receptores glutamatérgicos de tipo
n-metil-d-aspartato
núcleo medial del rafe
óxido nítrico sintetasa, isoenzima
neuronal, o tipo I
óxido nítrico
óxido nítrico sintetasa
neurotúbulos
día postnatal
placa cortical
potenciales evocados
peso molecular
picomolar
preplaca
peso en volumen
resonancia magnética nuclear
proteína S100B
subcutáneo
sistema nervioso central
subplaca
cuerpo estriado
trastorno por déficit de atención con
o sin hiperactividad
núcleo ventral del rafe
volumen en volumen
zona germinativa
zona intermedia
zona marginal
zona subventricular
zona ventricular
xiii
Resumen
“Sé breve en tus razonamientos, que ninguno hay gustoso si es largo.”
M iguel de Cervantes Saavedra.
El desarrollo del sistema nervioso central (SNC) es un proceso muy complejo,
determinado por múltiples factores que entran en juego simultánea y/o secuencialmente.
Este desarrollo tiene, en el ser humano, un claro período crítico prenatal y otro postnatal
hasta los 20 a 25 años aproximadamente. No obstante, se prolonga, posiblemente, durante
toda la vida del individuo. Muchos son los factores que pueden alterar este complejo y
prolongado proceso de desarrollo.
El alcoholismo materno-fetal (AMF), en nuestro país, es una causa poco reconocida de
enfermedades neuropsiquiátricas de la niñez, la adolescencia y la adultez. El consumo de
etanol (EtOH) por parte de la embarazada puede provocar una amplia gama de trastornos
en su descendencia, denominados en conjunto Trastornos del Espectro del Alcoholismo
Fetal (FASD). No todas, pero sí algunas de las mujeres alcohólicas crónicas que se
embarazan paren niños que presentan al nacer el denominado Síndrome Alcohólico Fetal
(SAF), el grado máximo de afectación en el espectro de los FASD. Aquellos hijos de
madres alcohólicas que tienen la fortuna de verse menos afectados son fenotípica y
conductualmente normales, o caen en la categoría de lo que en un principio se denominó
Efectos del Alcoholismo Fetal (FAE) y que hoy comprende a los Trastornos del
Neurodesarrollo Relacionados con el Alcohol (ARND) y los Trastornos Congénitos
Relaiconados con el Alcohol (ARBD).
Las displasias corticales se cuentan entre los múltiples daños provocados al cerebro por
el AMF; estas sustentan especialmente, desde el punto de vista histopatológico, el
diagnóstico de ARND. Estas malformaciones cerebrales son, en última instancia,
responsables de muchas de las discapacidades neuropsiquiátricas que padecen lo hijos de
madres alcohólicas. En la concurrencia de factores para la producción de las displasias
corticales intervienen, entre muchos: las alteraciones del desarrollo del sistema
serotoninérgico (un sistema de neurotransmisores que se halla alterado en muchas
enfermedades neuropsiquiátricas y que, durante el desarrollo, tiene importantes funciones
en la diferenciación del SNC); la glía radial (un tipo especial de células de la glía por la que
migran los neuroblastos postmitóticos); los astrocitos (descendientes fenotípicos de la glía
2
Resumen
radial que poseen receptores para la serotonina -5-HT- y, ante cuyo estímulo, liberan a la
proteína S-100B, una proteína con actividad promotora de la estabilización del
citoesqueleto neuronal y astrocitario, la extensión de neuritas y el establecimiento de
circuitos sinápticos); y el sistema nitrérgico (un particular sistema neurotransmisor
relacionado con el serotoninérgico y los astrocitos).
La mayoría de los estudios experimentales que han lidiado con el AMF han intentado
reproducir los grados mayores de afectación por consumo prenatal de EtOH. En ese tipo
de estudios se han encontrado alteraciones fehacientes en muchos de los elementos
mencionados. Sin embargo, son escasos los trabajos que intentan reproducir in vivo grados
de afectación menores o mínimos (que son, probablemente, mucho más numerosos que los
casos de afectación catastrófica). Es lo que se ha intentado en este trabajo: realizar un
modelo animal de ARND, caracterizarlo y estudiarlo bajo diferentes aspectos con foco en
las relaciones neuro-gliales en las que el sistema serotoninérgico es el centro.
Así, en distintos períodos del desarrollo vital, en sendos protocolos experimentales en
animales de utilización habitual en el laboratorio (ratas Wistar), se expuso a estos al EtOH
6,6% v/v en el agua de bebida y se evaluó el daño provocado en distintos parámetros. Los
períodos vitales estudiados fueron los siguientes:
I) durante el desarrollo prenatal por medio de un modelo de AMF en el que se intoxicó
a las hembras 6 semanas antes de la preñez, y
A) durante la gestación y la lactancia, para exponer a las crías durante el desarrollo
intra- y extrauterino (por vía transplacentaria y por la leche materna; protocolo de
exposición prenatal al EtOH sin prevención del daño); y
B) solo durante la gestación para exponer a las crías durante el desarrollo intrauterino
al tiempo que se administró a las madres una droga (buspirona) durante la parte
final de la gestación, concomitantemente con el EtOH, con la finalidad de evaluar
la posibilidad de prevención del daño provocado por el EtOH (protocolo de
exposición prenatal al EtOH con prevención del daño);
II) durante la adolescencia, en el que a un subgrupo de animales se le permitió
recuperarse del daño por el simple expediente de una abstinencia prolongada
bebiendo agua (protocolo de expsoción al EtOH durante la adolescencia con
abstinencia posterior); y
3
Resumen
III) durante la adultez (protocolo de exposición al EtOH durante la adultez).
En los cuatro protocolos experimentales todos los animales recibieron alimento estándar
para roedores de laboratorio y su alimentación se realizó de modo apareado para minimizar
los efectos nutricionales debido al de consumo o no de EtOH.
En los cuatro protocolos de exposición al EtOH se han evaluado el sistema
serotoninérgico, la astroglía, las relaciones neurogliales y el sistema nitrérgico desde
distintos puntos de vista:
I) morfológicos, en dos núcleos mesencefálicos (núcleo dorsoal y medial del rafe -NDR
y NMR-) en los que asientan las neuronas serotoninérgicas que constituyen la
principal fuente de inervación distal al prosencéfalo y en tres áreas de este último (el
área CA1 del hipocampo, el cuerpo estriado y la corteza frontal): por medio de
A) microscopía óptica: con
1) tinciones histológicas de rutina (tinción de Nissl con azul de toluidina como
medio para evaluar la citoarquitectura del SNC en general y de la neocorteza
en especial); y
2) técnicas de inmunocitoquímica (ICQ) para:
a) la enzima triptofano hidroxilasa (TPH), la primer enzima (y limitante) de la
vía biosintética de la 5-HT;
b) la 5-HT;
c) el transportador de serotonina (5-HTT), presente en las prolongaciones de
las neuronas serotoninérgicas, esté o no presente la 5-HT en el interior de la
célula;
d) la proteína gliofibrilar ácida (GFAP), la principal proteína del citoesqueleto
astrocitario, un filamento intermedio de clase III;
e) la proteína S-100B (S-100B), presente en el citoplasma astrocitario,
secretada bajo estimulación por la 5-HT de los receptores 5-HT1A de los
astrocitos;
f) los neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200), un filamento intermedio de clase
IV, marcador del citoesquelto de dendritas y axones, cuyos niveles se ven
afectados por los de la S-100B;
g) la proteína asociada a los microtúbulos de tipo 2 (MAP-2), marcador
4
Resumen
neuronal de localización casi exclusivamente dendrítica y que, igual que el
anterior, se ve afectado por los niveles de S-100B;
h) la enzima óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS) una isoenzima presente
en una variedad de neuronas y que está asociada de diversos modos con el
sistema serotoninérgico.
B) microscopía electrónica de transmisión;
II) conductual: en el paradigma de la prueba de campo abierto, se evaluó ante la
exposición a un ambiente novedoso:
A) la actividad locomotora; y
B) la respuesta de ansiedad.
Los resultados, complejos y variados, permitieron observar globalmente que el daño del
provocado por el EtOH aún en bajas dosis es cierto y notorio en cualquier edad; que el tipo
de daño provocado sobre determinados marcadores de los sistemas en estudio no fue
paralelo en las distintas edades y regiones cerebrales estudiadas sino que varió (en cantidad
y calidad) en función de estos mismos factores (edad y región); que la simple abstinencia
permite cierta recuperación (incompleta y variable) del daño en la adultez tras el consumo
en la adolescencia pero no tras la exposición prenatal; y que la administración de buspirona
prenatalmente en forma concomitante con la intoxicación alcohólica previene la mayor
parte de los efectos producidos por el EtOH (incluso los conductuales) aunque su uso no
es inocuo completamente para los animales no expuestos. Se hallaron de manera constante
ciertas alteraciones cualitativas de la morfología del citoesqueleto neuronal y astrocitario
que han podido ponerse de manifiesto tanto por microscopía óptica cuanto por electrónica.
Finalmente, el EtOH, consumido a cualquier edad en forma crónica, aún a bajas dosis,
es capaz de provocar alteraciones notorias en el SNC. Por ello, sigue siendo válida la
máxima de que para prevenir el daño al cerebro, no hay como no exponerlo en lo absoluto.
La mejor prevención es la abstinencia. No obstante lo cual, se puede intervenir en el
sistema para modificarlo de manera beneficiosa para el individuo.
5
Introducción
“Hoy es el alcohol etílico la única sustancia sedativa ydependígena que, por hallarse
institucionalizada, nuestra sociedad maneja y absorbe con toda libertad. Es la droga del
establishment, la droga de nuestro sistema sociopolítico. Esta es precisamente su singularidad
psicofarmacológica. No ocurre nada parejo con ninguna otra sustancia psicotropa.”
Francisco Alonso-Fernández 1
I.1. Un caso clínico ilustrativo (a modo de prólogo):
Ángela J. S. M. 2, nacida en Salto (Uruguay) en 1966.
Es una persona apacible, de voz suave y bajo volumen; tranquila, tímida y algo retraída; respetuosa, de
tendencias depresivas y modos aniñados sin llegar a la puerilidad patológica; físicamente menuda. Inquieta
cuando niña, no podía estar sentada; dificultades escolares a pesar de no haber tenido trastornos específicos
del aprendizaje. Se mordía los dedos llegando a provocarse lesiones leves. Desde la infancia experimentó
frecuentes fenómenos de déjà vu y jamais vu. Ha padecido episodios de discontinuidad vivencial con lagunas
mnésicas (de pronto, se encontraba en su cama o en su cuarto sin saber cómo había llegado allí ni qué había
estado haciendo) (¿ausencias?; ¿crisis parciales complejas con automatismos?). A los 8 años,
aproximadamente, comenzó a padecer crisis convulsivas generalizadas tónico-clónicas (CCGT-C) que
aparentemente ante episodios febriles. A los 20 años, un episodio depresivo con hipobulia y desinterés por
el medio. A los 23 años, recostada en su cama, rumiando ideas de muerte, se levantó impulsivamente, fue a
la cocina, tomó un cuchillo e intentó clavárselo en el estómago para acabar con su vida. Durante el transcurso
de su segundo embarazo sufrió una CCGT-C. En 1995, conización de cuello de útero por metaplasia escamosa
sin signos de malignidad. En 1997, intentó suicidarse cortándose las venas de la muñeca con un cuchillo. En
otra ocasión, intentó electrocutarse metiendo un objeto de metal en un enchufe. Ambos intentos, realizados
en forma impulsiva.
Primera internación en el Hospital Moyano (08/04 al 19/05/97; 41 días); 30 años de edad; presentó a
lo largo de la internación: impulsividad; ideación suicida; se le imponía obsesivamente la idea de que debía
matarse; humor depresivo; ideas de ruina y desvalorización; hipobulia; anorexia; ideas de persecución;
angustia, a veces de carácter paranoide; contracturas musculares generalizadas; tenía la sensación de que su
cabeza se agrandaba pero, al tocarla, reconocía la irrealidad de la sensación; desde aproximadamente un año
antes escuchaba voces de tonos graves, de hombres, que desde fuera de su cabeza le decían claramente “te
voy a matar”; veía ojos grandes, brillantes, negros y amenazantes que la observaban y se le venían encima o
que, ubicados en la pared, la miraban fijamente o se transformaban en figuras que salían de la pared y la
amenazaban: “te vamos a matar”; también veía manos que sostenían cuchillos en forma amenazante; macro
1
Alonso-Fernández, 1992; pág. 44.
2
Historia clínica Nº 81.595 del Hospital Neuropsiquiátrico “Braulio A. Moyano” de la Ciudad Autónoma de
Buenos Aires. Atendí a Ángela (no solo yo) durante mi residencia en psiquiatría (1996-2000), realizada en
“el Moyano”.
7
Introducción
y microzoopsias; episodios de recuerdos escénicos; sentía que le tocaban el brazo y que se lo movían;
también, que la apretaban del cuello o una mano en el estómago que se abría y se cerraba, le clavaban algo
en el pecho; desrealización; intenso miedo a morirse; aspecto pueril. El cuadro fue controlado con el uso de
antipsicóticos y antiepilépticos. Diagnóstico presuntivo: HEBEFRENIA DEPRESIVA.
Segunda internación en el Hospital Moyano (19/08/97 al 05/09/97; 17 días de estadía): en esta ocasión
se presentó inhibida; rígida; signos de la rueda dentada y de la almohada psíquica; mirada perpleja;
hipomímica; piel seborreica; flexibilidad cérea y catalepsia; tensión arterial: 110/80 mm Hg; frecuencia
cardíaca: 134/min.; temperatura axilar: 37,5ºC. Sin negativismo ni alucinaciones; estaba triste pero no sabía
por qué; tenía ideas de matarse que reconocía como no impuestas, sino como propias, pero en las que no podía
dejar de pensar, al tiempo que no se explicaba el por qué y sin tener un plan para llevarlo a cabo; las voces
le decían “tenés que matarte” o “matáte”. Se diagnostica: SÍNDROM E CATATÓNICO, presuntivamente
SÍNDROM E NEUROLÉPTICO M ALIGNO. Se realizaron dos sesiones de tratamiento electroconvulsivo
(TEC; días 29/08 y 01/09); luego del primero, desaparecieron totalmente las voces ; con el segundo,
recuperación del cuadro. Diagnóstico de base: PSICOSIS EPILÉPTICA.
Luego del alta, realizó controles mensuales. Excelente evolución: comenzó a trabajar como recepcionista
en una academia de peluquería en la que luego aprendió el oficio. Cuidaba a sus hijos y tenía una buena
relación con su marido. Presentó en la cara un cloasma como efecto secundario a las fenotiazinas que recibía.
En 1999 se mudó a Uruguay pero continuó realizando controles en Buenos Aires. Internada en un hospital
general, en su país natal, entre el 14/06 y el 14/07/99; en el baño de su casa, había sufrido una CCGT-C que,
por broncoaspiración, produjo como complicación una neumonía aspirativa colapsante, insuficiencia
respiratoria aguda y shock; ingresó a terapia intensiva con una severa insuficiencia respiratoria por edema
pulmonar; sufrió un paro cardiorrespiratorio en bradiasístole por hipoxemia extrema, revertido con medidas
farmacológicas.
Tercera internación en el Hospital Moyano (08/11 al 23/11/99; 11 días); 32 años de edad; viajó sola
desde Uruguay para un control de rutina, se constataron ideas obsesivas de matar a sus hijos con un cuchillo
sumado a gran angustia; nueva internación y, luego, alta con mejoría.
Antecedentes heredofamiliares: su padre es alcohólico, la maltrataba de niña y con un cuchillo en la mano,
la amenazaba con matarla; la madre, también alcohólica, bebió alcohol durante la gestación de Ángela, varios
intentos de suicidio, ejercía la prostitución frente a ella y permitía que sus clientes abusaran de su hija
obligándola a prostituírse; una sobrina padece epilepsia y debilidad mental a causa de una hipoxia cerebral
perinatal; un tío materno padece epilepsia desde la infancia. Tabaquista moderada; niega en todo momento
el consumo de alcohol o cualquier otra droga de abuso (dato confirmado por el esposo). El cuadro de
presentación inicial en la primera internación recordaba al del delirium tremens, motivo por el cual se indagó
con especial énfasis en los antecedentes de consumo de alcohol por parte de la paciente.
Exámenes complementarios de diagnóstico: un EEG (02/05/97) reveló una “discreta desorganización
cortical difusa moderada y generalizada”. Una RM N de cerebro (26/05/97) informó “acortamiento con
reducción moderada de volumen de ambos hipocampos a predominio derecho, sin alteraciones de la señal
8
Introducción
hipocámpica, resto normal”; sin embargo, aunque no se lo informa, es visible, en la cara medial del cerebro,
en posición posterior a la cisura perpendicular interna, comprometiendo todo el lóbulo occipital derecho, una
polimicrogiria focal; se observa también una hipoplasia de la zona posterior del tronco del cuerpo calloso
inmediatamente por delante de su rodete (Fig. 1). Un segundo EEG y mapeo cerebral (10/11/99) informaron
“normalidad eléctrica cortical”. Una segunda RM N (12/11/99), de baja calidad técnica, que impedía apreciar
la polimicrogiria, informaba “normalidad estructural en el cerebro”.
Figura 1. R esonancia m agnétic a nuclear d e cerebro de la paciente Á ngela J.S .M . en la que se observa, en un corte sagita l (A ) la
dism inución localizada del grosor del cuerpo calloso en la región posterior de su cuerpo, inm ediatam ente por delante del rodete,
en la zona correspondiente al cruce de fibras interhem isféricas que conectan a las áreas auditivas (A en a’) y tém poroparietales
(T/P en a’; otras referencias: F: fibras frontales; M : fibras m otoras; S s: fibras som atosensitivas; V : fibras visuales). E n A tam bién
se o bse rva la polim icrogiria del lóbulo occipital en posición p osterior a la cisura p erp end icular interna y q ue im p id e d isting uir con
c la ridad a la cisura calcarina (m ag nificado en a). En un corte coronal (B ) se ob serva la dism inución d el volum en d e am b os
hipoca m pos a pred om inio del derech o (*) pero sin inten sifica ción de la señ al. E n A ’ y B ’, im á g e n e s c o m p a ra bles de u n su jeto
norm al a m odo de c ontrol co m parativo . R eferencias en a’ (m odifica do de P au l et al, 20 07 ): fibras interh em isférica s frontales (F ),
m otoras (M ), so m ato senso riales (S s), au ditivas (A ), tém poroparietales (T/P ) y visuales (V ).
Analicemos el caso clínico. ¿El morbo?. Neuropsiquiátrico (¿qué duda cabe?). ¿El agente etiológico
determinante? El alcohol. ¿El período de acción de la noxa? La gestación de Ángela. ¿El mecanismo
etiopatogénico? Un trastorno del normal desarrollo cerebral. ¿Agentes etiológicos concurrentes? Las
especiales condiciones socio-ambientales en las que Ángela creció, maduró y se desarrolló.
9
Introducción
En el trabajo que sigue, por medios experimentales, intentaré aportar algo al
conocimiento de los mecanismos etiopatogénicos que son responsables de la aparición de
enfermedades como la que afectó a Ángela. Para ello, en la Introducción, reseñaré lo hasta
hoy conocido acerca de las enfermedades originadas en la descendencia por el consumo
materno gestacional de alcohol; revisaré los datos relevantes de la farmacocinética y la
farmacodinamia de esta droga, principalmente en relación a la madre y al feto; luego
repasaré los hitos fundamentales del desarrollo normal en general, y de la corteza cerebral
en particular, que permitirán interpretar los hallazgos experimentales en animales adultos
que fueran gestados bajo la influencia del alcohol, cuando ya no es posible observar
directamente los procesos del desarrollo que fueran alterados por la droga sino solo sus
consecuencias. Para finalizar la Introducción, se verá de qué modo se interrelaciona el
sistema serotoninérgico (un sistema neurotransmisor que se altera en muchas enfermedades
neuropsiquiátricas) con los astrocitos en lo que ha dado en llamarse relaciones neurogliales
y cómo ambos, por medio de una proteína astrocitaria secretada bajo estímulo de la
serotonina (la S100B), se relacionan con el citoesqueleto de neuronas y glía y el
establecimiento de circuitos neuronales por medio de la extensión de neuritas. En la sección
de Hipótesis y Objetivos, tras considerar lo conocido hasta hoy sobre los efectos del
alcohol en estos sistemas a lo largo del desarrollo (desde el prenatal hasta la adultez),
expondré las hipótesis que originaron este trabajo y los objetivos que me propuse cumplir
con él. En la sección de Materiales y Métodos detallaré qué, cómo y con qué realicé los
experimentos para poner a prueba las hipótesis por medio de cuatro protocolos
experimentales distintos (en un anexo detallo las consideraciones que me llevaron a elegir
la administración en el agua de bebida como método de alcoholización de las ratas usadas
10
Introducción
en los experimentos). En la sección de Resultados, se enumeran acríticamente los
hallazgos que obtuve por métodos morfológicos con la microscopía óptica y electrónica,
con tinciones de rutina y, principalmente, por marcaciones inmunocitoquímicas y la
posterior medición de distintos parámetros morfométricos; una breve subsección detalla
hallazgos conductuales adicionales. En la Discusión, analizo críticamente los hallazgos
experimentales en particular en relación al alcoholismo materno-fetal y con respecto a otras
consideraciones más generales y mediatas, para finalizar en las Conclusiones con lo que
de enseñanzas o reflexiones se pueda obtener de todo esto. Para finalizar la presente tesis
doctoral, antes de enumerar la Bibliografía consultada, en una serie de Anexos (además
del ya mencionado), reseño sistemas diagnósticos al uso, la estructura de varias proteínas
cuya descripción en el cuerpo principal del texto haría muy engorrosa su lectura (pero que
considero necesario tener en cuenta si se pretende comprender cabalmente lo hallado en los
experimentos), como así también todos los datos numéricos de las mediciones que
sustentan los resultados, la discusión y las conclusiones.
I.2. El alcoholismo materno-fetal (AMF) (el morbo):
Hoy en día resulta una obviedad decir que al alcoholismo, al abuso y la dependencia del
EtOH se los considera como uno delos trastornos más comunes relacionados con
sustancias. Y el que mayor cantidad de muertes produce.3 Pero no por ser un tema remanido
deja esto de ser verdad.
3
A pesar de que otras drogas tengan mayor “prensa” a este respecto, incluso entre los médicos.
11
Introducción
El etanol (EtOH) es una sustancia de aparición espontánea en la naturaleza. Por ello, el
uso de bebidas alcohólicas se remonta, seguramente, a tiempos prehistóricos. Es la droga
más vastamente empleada a lo largo de la historia de la humanidad con la finalidad de
“alterar la consciencia”. Sin embargo, según las épocas y los pueblos que se consideren, su
utilización se ha asociado a muy diversas finalidades. El uso ritual mágico-religioso es (y
ha sido) compartido con muchas otras drogas como purificante espiritual. Pero su
utilización no se agota con esto ya que también es la droga más versátil en cuanto a
variedad de usos se refiere; según el contexto histórico y socio-cultural, se lo ha utilizado
como anestésico, afrodisíaco, energético, alimento, narcótico, o como medicamento de
amplio espectro (por ejemplo, durante la Edad Media). Pero, en cuanto a alterar la
consciencia es, probablemente, la droga más antigua usada a tal fin y, geográficamente, la
de más amplia distribución (Heath, 1974).
El consumo de bebidas alcohólicas por parte de las mujeres ha de haber comenzado,
evidentemente, en la misma época en que comenzó a hacerlo el hombre. Sin embargo, a lo
largo de la historia, los estudios científicos dedicados específicamente al alcoholismo
femenino son muchísimo menos numerosos que los estudios referidos al masculino.
Posiblemente esto se deba a que también es mucho menor la frecuencia con que beben las
mujeres. Más aún, los estudios dedicados al consumo de EtOH por parte de las
embarazadas también son menos frecuentes.
Pero sucede que las mujeres beben alcohol. E incluso, lamentablemente, cuando se
embarazan.
Parecería que desde la antigüedad distintos pueblos han tenido algún tipo de sospecha
vaga, imprecisa, acerca de lo que le sucedía a los hijos de las mujeres alcohólicas y que no
12
Introducción
era bueno que estas bebieran durante el embarazo (Abel, 1997, 1999, 2001a, 2001b). Pero
los primeros estudios científicos serios que informaron acerca de los efectos deletéreos del
consumo de EtOH por parte de las embarazadas sobre sus hijos se remontan a la Europa de
los siglos XVIII y XIX. En un principio se confundían (o no se diferenciaban) los efectos
debidos al consumo de EtOH por parte del padre o de la madre y los médicos se referían
a estos hijos como a los “hijos de alcohólicos”, indiscriminadamente. Hacia mediados del
siglo XIX, en Francia, dos famosos neuropsiquiatras (Bénédict Augustin Morel y Jacques
Joseph Valentin Magnan) comenzaron a hablar con creciente fuerza de la “degeneración”
producida en la especie por el alcoholismo de los padres. Magnan fue quien inició estudios
experimentales al respecto.4 Sin embargo, el primer estudio epidemiológico realizado en
humanos y del que se tenga noticia, en el que se relacionó específicamente el consumo de
EtOH por la embarazada con los daños en sus hijos, lo realizó William C. Sullivan, un
teniente oficial médico de la prisión de convictos “Parkhurst” de Su Real Majestad
Británica, en Liverpool (Reino Unido), en 1899 (Sullivan, 1899).5
El cuadro completo, con todas las características de lo que hoy se conoce en el ámbito
médico como Síndrome Alcohólico Fetal (FAS, por las siglas en inglés de Fetal Alcohol
Syndrome) fue descripto por primera vez por una pediatra francesa, Jacqueline Rouquette,
en 1957 en su tesis doctoral (Rouquette, 1957). Las observaciones que dieron lugar a su
trabajo las realizó mientras trabajaba en París para el Centro de Higiene Infantil de la
4
Cfr. el Anexo III (Métodos experimentales de exposición de animales al etanol. Ventajas y desventajas de
cada uno).
5
El artículo de Sullivan es realmente brillante y digno de ser leído, incluso hoy, como un excelente ejemplo
de epidemiología retrospectiva.
13
Introducción
Fundación Paul Parquet.6 No obstante ello, la mayoría de los investigadores que trabajan
sobre el alcoholismo materno-fetal (AMF), sean clínicos o básicos, cuando citan en sus
trabajos alguna referencia histórica a la “primera descripción del FAS” se empecina en citar
como los primeros descriptores o descubridores, casi invariablemente, a Jones y Smith
(1973). Algunos pocos citan a Clarren y Smith (1978) y los menos, aunque en número cada
vez mayor, a Lemoine et al. (1968).7
Andando el tiempo, los investigadores estadounidenses han agrupado ahora a todas las
alteraciones observables en los hijos habidos de madres alcohólicas, y relacionadas al
consumo gestacional de EtOH, en un grupo de trastornos a los que denomina Trastornos
del Espectro del Alcoholismo Fetal (FASD, por las siglas en inglés de Fetal Alcohol
Spectrum Disorders).8
I.2.1.
Los Trastornos del Espectro del Alcoholismo Fetal (FASD):
En principio, habrá de tenerse en cuenta algo que no por básico deja de ser importante.
Hay muchos factores que inciden en la manifestación final (en el feto o en el recién nacido)
de las alteraciones originadas por el AMF. Algunos de estos factores, que pueden
6
La Fundación Paul Parquet es una fundación privada cuyo Centro de Higiene Infantil, aún hoy, trabaja como
anexo de los servicios pediátricos de la Asistencia Pública de París (la Ayuda Social a la Infancia). Los datos
históricos y administrativos de la Fundación se pueden consultar en Internet en la página web de la misma
Fundación (http://www.fondation-paul-parquet.com/article.php3?id_article=27).
7
Paul Lemoine, otro pediatra francés, era Jefe del Servicio de Pediatría en el Centro Hospitalario
Universitario de Nantes. Como jefe de servicio era el responsable de la sala de lactantes depositaria de la
Asistencia Pública (Lemoine, 2003), la misma organización gubernamental con la que estaba relacionada la
Fundación de París en la que trabajaba Jacqueline Rouquette una década antes.
8
Afortunadamente, las trágicas épocas en que la humanidad padecía enfermedades ya finalizaron; ahora los
humanos sólo presentamos trastornos.
14
Introducción
considerarse verdaderos factores de riesgo, dado que muchos de ellos se relacionan con el
alcoholismo materno, son los que se enumeran a continuación (Jacobson y Jacobson, 1999;
May y Gossage, 2001; Thomas y Riley, 1998):9
I) factores de la salud materna perigestacional:
i ) la edad materna (es mayor la incidencia del FAS en hijos de madres mayores de 25
años y a mayor edad materna, mayor frencuencia de manifestación del FAS);
ii) la parición previa de 3 ó más niños afectados por el FAS;
iii) el uso concomitante de otras drogas de abuso (como marihuana, cocaína, tabaco);
iv) morbi-mortalidad prematura en gestas previas por causas relacionadas con el EtOH;
v) el estado metabólico y nutricional de la madre antes y durante la gestación;
vi) el período de la gestación durante el cual se produjo la exposición (primero, segundo
o tercer trimestre o toda la gestación;
vii) la presencia o ausencia de episodios de abstinencia aguda durante la gestación;
II) factores del nivel socio-económico:
i) bajo nivel socioeconómico y cultural (pobreza; baja y/o incompleta escolaridad;
desempleo, subempleo o empleo marginal);
ii) bajo acceso a los servicios de salud y control de la salud materna;
III) patrón de ingesta alcohólica:
i) edad temprana de inicio en el consumo de EtOH (a menor edad, mayor riesgo de
FAS);
ii) el patrón de ingesta de EtOH que presentó la embarazada durante la gestación (agudo
tipo parranda -binge-like de los angloparlantes, que consiste en beber 5 o más tragos
por ocasión, 2 ó más días en una semana- o crónico);10
9
No los consideraré con detalle en este lugar.
10
La palabra “trago estándar” en la literatura anglosajona sobre el FAS se define como: 12 onzas fluídas de
cerveza, ó 5 de vino ó 1,5 de bebidas destiladas de una graduación alcohólica de 80º (Maier y W est, 2001).
En el sistema métrico decimal, una onza fluida equivale, a 29,57 ml; por lo tanto, un trago de cerveza son (12
× 29,57 =) 354,84 ml (aproximadamente el contenido de una lata común); un trago de vino equivale a 147,87
ml (algo así como medio vaso); y uno de bebida destilada a 44,35 ml.
En consecuencia, 5 tragos (cuyo consumo en una sola ocasión definen al patrón de ingesta aguda (“en
parranda” o “binge-like”) equivalen a 60 onzas fluidas (= 60 × 29,57 = 1.774,2 ml) de cerveza o 25 onzas
15
Introducción
iii) la consecución de alcoholemias altas y/o sostenidas;
iv) ausencia de la reducción de la ingesta alcohólica durante la gestación;
IV) perfil psicológico materno:
i) baja autoestima;
ii) depresión;
iii) enfermedades psiquiátricas comórbidas;
iv) trastornos de la personalidad preexistentes;
v) disfunciones sexuales;
V) factores socio-familiares:
i) abuso de alcohol en la familia;
ii) abuso de alcohol por parte de la pareja de la mujer;
iii) relativa tolerancia al gran consumo de alcohol en el grupo social de pertenencia;
iv) inestabilidad vincular/marital;
v) pérdida previa de la tenencia de otros hijos dados en adopción o en guardas
transitorias.
En virtud de la actuación consecutiva o simultánea de muchos o todos estos factores, los
trastornos ocasionados por el AMF se presentan a lo largo de un continuum que configura
todo un espectro: desde la normalidad fenotípica casi total hasta el más severo conjunto de
las manisfestaciones del AMF que amenazan (o se cobran) la vida y la salud de los hijos.
Sin embargo, con fines prácticos, los distintos grados de afectación se agrupan, por fuerza
artificialmente, en distintas “categorías diagnósticas”. Todas estas categorías se ordenan,
en definitiva, a partir de la definición del grado máximo de afectación provocado por el
AMF; es decir, lo que se denomina FAS completo.
fluidas de vino (es decir, 25 × 29,57 ml = 739,25 ml, casi una botella común de vino de ¾ litro) o 7,5 onzas
de destiladas (7,5 × 29,57 = 221,77 ml). M ás abajo se verá, sin embargo, que no todas las cervezas (ni los
vinos, ni las bebidas destiladas) tienen el mismo contenido alcohólico, por lo que las “onzas fluidas” varían
en contenido alcohólico según el tipo de bebida que se considere. Por lo tanto, el cálculo del EtOH consumido
en determinada ocasión en función de las onzas fluidas no es de lo más seguro ni, mucho menos, exacto.
16
Introducción
De las mujeres que consumen alcohol en grandes cantidades durante la gestación, se
estima que sólo el 4-15% de los niños habidos de ellas estarán afectados por el FAS
completo (George et al., 2007; Gray y Henderson, 2006). Para comprender en alguna
categoría al resto de ellos, que caen en algún lugar del actual espectro, se había adoptado
en un principio la designación de Efectos del Alcoholismo Fetal (FAE, por sus siglas en
inglés -Fetal Alcohol Effects-). Esta denominación se tomó de los estudios realizados en
animales expuestos prenatalmente al EtOH (AAP, 2006). Más tarde se cayó en la cuenta
de que estos FAE también se presentaban en los hijos habidos de madres que habían bebido
alcohol en forma moderada a leve. Así fue como surgió el concepto de lo que hoy se
denomina FASD (Chudley et al, 2005; Gray y Henderson, 2006).
La incidencia y la prevalencia11 del FAS completo se estima en valores muy variables
según los distintos países del mundo. Dentro de un mismo país, estas cifras pueden variar
mucho de una región a otra y, dentro incluso de una misma región, también puede variar
muchísimo según el grupo humano étnico o socio-cultural particularmente considerado.
Así, por ejemplo, en los Estados Unidos de América (EUA) la incidencia general se ha
estimado en 0,5-3 por cada 1000 nacidos vivos (Chudley et al, 2005; Gray y Henderson,
2006; May y Gossage, 2001). En distintas comunidades y momentos, en Canadá, se la ha
estimado entre 0,515-190 (¡!) por cada 1000 nacidos vivos (Chudley et al., 2005). En el
Reino Unido, ha sido estimada en 0,21 (BMA, 2007). La prevalencia mundial del FAS
se ha estimado en alrededor de 0,5-2,0 cada 1000 nacidos vivos, si bien que para el cálculo
de estos valores, los de EUA han contribuido en gran medida por lo que es probable que
11
Se considera aquí como incidencia a la cantidad de casos nuevos en una determinada población o grupo
etario en un año. La prevalencia, por otro lado, es la cantidad de los casos totales (nuevos y ya existentes)
en un momento determinado, en una población determinada.
17
Introducción
el valor de la incidencia mundial esté significativamente sesgado (Bertrand et al., 2005;
BMA, 2007; May y Gossage, 2001; Mitten, 2004).
Independientemente del FAS completo, los otros elementos agrupados en los FASD
constituyen mayoría, son mucho más frecuentes que el FAS y pueden ser relativamente
comunes. Así, la prevalencia mundial de los FASD se ha estimado en 9-10 por cada
1000 nacidos vivos (es decir, alrededor del 1%) (Basford et al., 2004; Gray y Henderson,
2006; May y Gossage, 2001). Téngase en cuenta, a modo de comparación (por nombrar
sólo una de todas las enfermedades neuropsiquiátricas), que la prevalencia de las
esquizofrenias también se calcula en alrededor del 1% de la población.
Excluidos los casos de FAS puro, completo, el resto de los trastornos agrupados en los
FASD está parcialmente constituido por hijos de madres alcohólicas que presentan
malformaciones congénitas en distintos órganos de la economía.12 Sin embargo, el 50-80%
de los niños afectados por los FASD presentan solamente daños o disfunciones debidas a
alteraciones del desarrollo cerebral, es decir, alguno de todos aquellos efectos del AMF
agrupados bajo la categoría de Trastornos del Neurodesarrollo Relacionados con el
Alcohol (ARND, por las siglas en inglés de Alcohol-Related Neurodevelopmental
Disorders) (BMA, 2007; Gray y Henderson, 2006).
Actualmente, existe mucho debate acerca de la prevalencia real y de la verdadera
importancia del FAS y de los FASD como “enormes problemas” de salud pública.13
Sin embargo, los ARND, por su alta prevalencia y por el hecho de que pueden ser
12
Cfr. Anexo II: M anifestaciones fenotípicas físicas en el Síndrome Alcohólico Fetal.
13
Téngase presente, sin embargo, que en estos fuertes debates no dejan de estar implicados variados intereses
económicos y académicos que en más de una ocasión ponen en riesgo y condicionan la imparcialidad y
rigurosidad científica de los datos que se publican.
18
Introducción
debidos a grados leves a moderados de AMF, son (potencialmente) los de mayor
importancia desde el punto de vista de la salud pública dentro del conjunto de todos los
trastornos agrupados en los FASD.
En resumen: el cuadro configurado en su totalidad comprende, como manifestación
global del AMF, a los llamados FASD. Estos FASD engloban, por un lado, a los casos
puros de FAS y por el otro a lo que antes se denominaba FAE y que hoy se desglosa en
ARBD y ARND.
Pasemos entonces ahora a considerar con algún detalle cómo se realiza el diagnóstico
de cada una de estas condiciones.
I.2.1.1. El síndrome alcohólico fetal (FAS):
Desde Jacqueline Rouquette (Rouquette, 1957) en adelante el diagnóstico clínico del
FAS reposa en una tríada de elementos semiológicos que constituyen el conjunto nuclear
de las manifestaciones del síndrome. Estas manifestaciones son:
a) el retraso del crecimiento intra y extrauterino;
b) un dismorfismo facial característico; y
c) anomalías morfofuncionales del neurodesarrollo en el SNC.
Todo ello, y como condicio sine qua non, en el contexto de una madre fuertemente
bebedora de EtOH durante la gestación.
El retraso del crecimiento se puede constatar ya intrauterinamente, durante la gestación.
19
Introducción
Los niños nacen con bajo peso si lo hacen a término o con bajo peso para la edad
gestacional si son prematuros (cosa que, por otro lado, es frecuente). La talla también suele
ser baja. Postnatalmente, el progreso pondoestatural no se recupera como suele suceder en
niños afectados de otras causas de bajo peso al nacer. Siempre continúan siendo pequeños,
incluso si se controla la evolución de su peso hasta el final de la adolescencia y a pesar de
que reciban la mejor de las alimentaciones posibles. Son, desde el principio, simplemente
hipotróficos y/o hipoplásicos globales. Hay quien los ha llamado “niños miniatura”.
La cara de los niños afectados tiene características particulares durante la primera
infancia: frente pequeña asociada a (y consecuencia de) la microcefalia; la raíz nasal es
aplanada o incluso presenta el aspecto en silla de montar similar al de la sífilis congénita;
las alas de la naríz son pequeñas; los ojos son pequeños (microftalmia) y están muy cerca
entre sí, las hendiduras palpebrales son más cortas que lo normal y el párpado superior
frecuentemente está en ptosis; a veces puede haber un pligue epicanto o epicanto invertido
o blefarofimosis; la región media de la cara es pequeña; el labio superior es
característicamente fino, delgado, recto y está como “arremangado” hacia dentro mostrando
muy poco el bermellón (a veces puede haber labio leporino con o sin paladar hendido); el
philtrum supralabial está notablemente aplanado o es, incluso, inexistente por lo que la
zona facial superior a la boca toma un aspecto un aspecto como de planchado; los dientes
pueden ser pequeños, hipoplásicos y de esmalte defectuoso; las orejas pueden tener una
implantación baja y sus conchas estar malformadas; suelen tener un notable hirsutismo al
nacer, más marcado en la piel perifacial. Sin embargo, todas estas características faciales,
que hablan a las claras de defectos en el desarrollo del mesodermo facial, van suavizándose
a medida que el afectado crece y pueden desaparecer, y ya no es posible distinguir a los
20
Introducción
nacidos con FAS, cuando son adultos, sólo por el aspecto facial. El retraso madurativo del
macizo facial, lentamente, se va completando.
Con respecto a las alteraciones del neurodesarrollo, más abajo los trato en detalle.
Sin embargo, a pesar de que el diagnóstico clínico es relativamente sencillo para el ojo
avezado y para el que tiene un razonable grado de sospecha, entre las alambicadas proezas
diagnósticas de los tiempos que corren, para complicar las cosas, han proliferado los
sistemas diagnósticos para los FASD. En EUA y Canadá, los de uso más extendido son:14
i) los Criterios Diagnósticos del Instituto de Medicina, de la Academia Nacional de
Ciencias de EUA (Stratton et al., 1996), que ya han sido convenientemente revisados
(Hoyme et al., 2005),
ii) los Criterios Diagnósticos del Centro para el Control de Enfermedades del
mismo país (Bertrand et al., 2004),
iii) el Código Diagnóstico de 4-Dígitos (Astley y Clarren, 2000), y
iv) los Lineamientos Canadienses para el Diagnóstico de los FASD (Chudley et al.,
2005).
Entre los diagnósticos diferenciales que por fuerza se han de descartar, se encuentran los siguientes
síndromes y enfermedades, por su aspecto similar en algunas de las características fenotípicas faciales
(Bertrand et al., 2004; Stratton et al, 1996):
i) síndrome de Cornelia de Lange,
viii) displasia camptomélica,
ii) síndrome de Floating-Harbor,
ix) secuencia de DiGeorge,
iii) displasia geleofísica,
x) síndrome de Dubowitz,
iv) síndrome de Smith-Lemli-Opitz,
xi) secuencia 10q duplicada,
v) embriopatía por tolueno,
xii) secuencia 15q duplicada,
vi) síndrome lisencefálico de Miller-Diecker,
xiii) síndrome GF,
vii) síndrome del valproato fetal,
xiv) efectos fetales de la fenilcetonuria materna,
14
Cfr. en el Anexo I (Síndrome Alcohólico Fetal [FAS] y trastornos asociados. Criterios diagnósticos) el
detalle de estos sistemas diagnósticos.
21
Introducción
xv) síndrome óculo-dento-digital,
xviii) síndrome velocardiofacial.
xvi) trisomía del par 18,
xvii) síndrome de W illiams, y
Los siguientes síndromes, por otro lado, deben ser globalmente diferenciados del FAS (Bertrand et al.,
2004; Stratton et al, 1996):
i) síndrome de Aarskog,
vi) embriopatía por tolueno,
ii) síndrome de W illiams,
vii) síndrome de la difenilhidantoína fetal,
iii) síndrome de Noonan,
viii) síndrome del valproato fetal,
iv) síndrome de Dubowitz,
ix) efectos fetales de la fenilcetonuria materna.
v) síndrome de Brachmann-DeLange,
Finalmente, otras enfermedades pueden confundirse no por su fenotipo (en el que no se parecen realmente)
sino por el aspecto cognitivo y conductual semejantes (Stratton et al, 1996):
i) síndrome del X frágil,
iii) síndrome de Turner, y
ii) síndrome velocardiofacial,
iv) síndrome de Opitz .
I.2.1.2. Los efectos del alcoholismo fetal (FAE):
La categoría, en algún momento, diagnóstica de los FAE surgió a modo de “cajón de
sastre” como una manera de engloblar , en los trabajos de investigación básica sobre el
AMF realizados en animales de laboratorio, todo aquello que no constituyera el FAS
completamente desarrollado. Es decir, conceptualmente, los FAE engloban todos los
efectos provocados en la descendencia por el EtOH consumido por la madre, sean estos
efectos físicos o cognitivos-conductuales, y que no alcanzan a conformar el FAS completo.
En cierto modo, la presencia de algún tipo de FAE implica un tipo de daño menor al
máximo que es capaz de provocar el AMF. Los FAE engloban, entonces, a los ARBD y a
los ARND.
22
Introducción
I.2.1.2.1.
Los trastornos congénitos relacionados con el alcohol (ARBD).
En esta categoría se agrupan los efectos “puramente” físicos inducidos por el EtOH, las
malformaciones congénitas orgánicas.15 En el Anexo II (Manifestaciones fenotípicas físicas
en el Síndrome Alcohólico Fetal) se listan todas las malformaciones orgánicas (según su
frecuencia y sistema orgánico) que pueden estar presentes y que, en sí solas (excluyendo
las pre- y postnatales y las craneofaciales de la tabla y las del neurodesarrollo), dan lugar
a, y definen, los ARBD. No abundaré en esta categoría; no vienen al caso en este trabajo,
pero téngase en cuenta que puede determinar gran parte de la morbimortalidad que afecta
a estos desgraciados que pueden nacer mono- o polimalformados.
I.2.1.2.2.
Los trastornos del neurodesarrollo relacionados con el alcohol (ARND).
En contraste con la categoría anterior, en esta se incluye a todos aquellos signos y
síntomas cuyo origen depende o representa, si se quiere, un daño morfológico y/o funcional
del SNC.
En este amplio agrupamiento signo-sintomatológico se pueden observar desde las
groseras malformaciones anatómicas que amenazan la vida (o determinan la muerte) del
afectado, pasando por las más groseras y las más sutiles manifestaciones conductuales y
cognitivas observables por simple inspección o por delicados tests, hasta alteraciones sólo
puestas en evidencia por métodos de microscopía o bioquímicos, en el laboratorio clínico
15
Como se ve, el dualismo cartesiano aún tiene efectos ciertos en la ciencia del siglo XXI.
23
Introducción
o de investigación básica. Desde la simple microcefalia, se pueden observar defectos del
cierre del tubo neural (disrafias); holoprosencefalia y esquizencefalia; alteraciones del
desarrollo del cuerpo calloso desde las hipoplasias localizadas hasta la agenesia total;
hipoplasias del vermis y alteraciones en la foliación del cerebelo; distintos tipos de
displasias corticales, desde las que pueden ponerse en evidencia con estudios de imágenes
como las lisencefalias y macrogirias, las polimicrogias, o las heterotopías nodulares y en
banda hasta las que sólo pueden observarse por medio del uso del microscopio.
Sin embargo, más o menos afectado anatómicamente el cerebro, siempre será posible
observar alteraciones cognitivas o conductuales en los afectados por el FAS y por los
ARND. Así, por ejemplo, se ha dicho que el AMF es la principal causa teratogénica de
retraso mental (RM) (Bregman et al., 1995). El RM puede ser desde leve a profundo. Aún
más, el AMF puede provocar distintos tipos de trastornos cognitivos que no llegan a
conformar un diagnóstico de RM pero que comprometen la óptima actuación del individuo
en el mundo. Se pueden observar trastornos en el desarrollo del lenguaje y la memoria o de
las habilidades matemáticas y lingüísticas, trastornos práxicos y en las funciones ejecutivas,
alteraciones en el normal desarrollo psicomotor y de la socialización, inestabilidades en la
conducta, auto- y heteroagresividad y comportamientos socialmente desadaptativos (Conry,
1990; Famy et al., 1998; Jacobson, 1997; Jacobson y Jacobson, 1999; Kelly et al., 2000;
Mattson et al., 1996, 2001).
Entrando ya decididamente en el terreno de las enfermedades neuropsiquiátricas, se ha
implicado fuertemente al AMF como causa potencial de autismo y trastorno generalizado
del desarrollo; del trastorno por déficit de atención con o sin hiperactividad (TDAH);
de determinados trastornos de la personalidad (disocial, limítrofe, dependiente y
24
Introducción
evitativo) que por sí sólos son causa suficiente de un significativo sufrimiento para el
individuo que la padece y de la sociedad que lo aloja pero a la vez, además, causa
importante de otros trastornos neuropsiquiátricos; trastornos por abuso y/o dependencia
de sustancias (incluído el mismo alcohol además de, obviamente, otras drogas de uso ilegal
– cocaína, marihuana, anfetaminas, alucinógenos, etc. –); trastornos de la conducta
sexual; trastornos psicóticos y/o afectivos mayores (Baer et al., 2003; Famy et al., 1998;
Spear y Molina, 2005).
Párrafo aparte merecería la consideración in extenso acerca de que la EPE es una causa
importante de epilepsias de distinto tipo.16 Por sí solas, aún si se prescindiera del resto de
las alteraciones del SNC, las epilepsias son también generadoras de gran morbi-mortalidad
para quienes las padecen. Por otro lado, y sin llegar a las epilepsias, se han documentado
alteraciones eléctricas corticales en los hijos de madres alcohólicas que se ponen fácilmente
en evidencia con un simple electroencefalograma (EEG) (por ejemplo, disminución del
voltaje de las ondas ", lentificación eléctrica generalizada o localizada del trazado EEG)
o con un estudio de potenciales evocados (PE) (por ejemplo, aumento de la latencia en la
onda P300, etc.) (Mattson et al., 2001).
Vistos ya los efectos, consideremos ahora la causa eficiente de los FASD: el etanol.
16
Este punto en particular es bien conocido por los neuropsiquiatras ya desde los siglos XVIII y XIX. Cfr.
Magnan, 1871; Morel, 1857, 1860; Sullivan, 1899.
25
Introducción
I.3. El etanol (el agente etiológico):17
El alcohol etílico o etanol (EtOH; C2H6O;
Fig. 2) es un líquido incoloro, translúcido, de
olor característico, excelente solvente, menos
denso que el agua (* = 0,789 g/ml), con un
peso molecular (PM) de 46,0634 daltons.
Fig ura 2. El etanol en representación trid im ensional con sus
nu bles electrón icas.
El EtOH se forma por la fermentación
anaerobia de algunos glúcidos (como
Tabla 1. Concentración de etanol en distintos tipos de
bebidas alcohólicas.
la glucosa, fructosa y manosa) que
llevan a cabo ciertas bacterias y
hongos
espontáneamente,
sin
intervención humana. Por tal motivo,
el EtOH se produce en forma
Graduación alcohólica
Bebida
(rango en %)
FERMENTADAS
Sidra
Cerveza
Vinos de mesa
Vinos generosos o de licor
Vermuth
2-5
3-10
8-13
14-24
14-24
relativamente simple y a bajo costo
DESTILADAS o AGUARDIENTES
(Heath, 1974). Se lo encuentra en
una gran cantidad de productos
formando
parte
de
perfumes,
solventes,
bebidas,
productos
medicinales y cosméticos.
Las bebidas que lo contienen,
Pisco
Brandy o Cognac
Ginebra
Ron de Jamaica
Whisky
Vodka
Ron
Ron de Martinica
35-50
36-42
40-50
40-75
45-53
45-60
45-70
65
ARTIFICIALES o LICORES
Licores
20-50
17
Excepto en los lugares en los que se indica, la mayor parte de la información de esta sección se basa en
datos tomados de las siguientes fuentes bibliográficas: Alonso-Fernández, 1992; Bruch Igartúa, 1993; Curci,
1993; Hobbs et al., 1996; Lehninger, 1986; Mayes, 1992; y Rall, 1991.
26
Introducción
según su forma de obtención, se clasifican en fermentadas, destiladas y artificiales. Son las
bebidas destiladas las que generalmente contienen la mayor concentración de EtOH (Tabla
1).
I.3.1.
Farmacocinética:
El EtOH se puede absorber por varias vías. La vía enteral es, por lejos, la de más
frecuente uso. Pero otras vías de absorción se observan con frecuencia e importancia
variables.18
Una vez ingerido, la absorción del EtOH se lleva a cabo en un 20% en el estómago y el
80% restante en el duodeno y el yeyuno-íleon. Sin embargo, la absorción varía ampliamente
en función de la cantidad y calidad del contenido gástrico y la concentración alcohólica de
la bebida ingerida. Así, por ejemplo, en promedio, la ingestión de 44 g de EtOH en forma
de whisky (esto es, aproximadamente, unos 77 ml de un whisky de 45º) produce una
alcoholemia máxima de alrededor de 67-92 mg/dl si se lo ingiere con el estómago vacío;
en cambio, tras la ingestión de una comida mixta la alcoholemia correspondiente será de
unos 30-53 mg/dl. Igual cantidad de EtOH consumida en forma de cerveza (esto es, unos
694 ml de una cerveza de 5º, unas dos latas comunes) produce alcoholemias de 41-49 y 23-
18
Por ejemplo, la vía inhalatoria (de importancia en las exposiciones profesionales), la vía transdérmica
(como en el caso de la tan difundida costumbre en ciertos ámbitos socioculturales, en los que “para que el
bebé esté más tranquilito y se pueda dormir”, las madres les ponen a sus hijos lactantes un algodón o un paño
embebido en alcohol entre el pañal y la piel del abdomen), la vía rectal (de interés médico-toxicológico) y
la vía parenteral intravenosa (utilizada en el tratamiento de las intoxicaciones por metanol y etilenglicol –
etilterapia –) o las vías de inflitración local (como en el tratamiento de ciertas neuralgias por medio de la
llamada neurólisis alcohólica).
27
Introducción
29 mg/dl, con el estómago vacío y tras una comida mixta, respectivamente.
La distribución es rápida y amplia por tratarse de una molécula de bajo PM y muy
hidrosoluble y liposoluble. En virtud de su liposolubillidad atraviesa fácilmente todas las
barreras (entre ellas la hematoencefálica – BHE – y la placentaria, la hematotesticular y la
hematoalveolar). Tras la ingestión, en 5 a 10 minutos se lo puede detectar en la sangre y el
tiempo hasta la concentración plasmática pico es de 30 a 90 minutos. Para el ser humano,
el volumen de distribución del EtOH es, aproximadamente, de 0,7 l/kg para los hombres
y de 0,6 l/kg para las mujeres (la diferencia se debe a los distintos porcentajes de grasa
corporal total).
El EtOH desaparece del plasma, con una cinética de orden cero, entre las 8 a 10 horas
posteriores a la finalización de la ingesta.
El 90-98% del EtOH ingerido se oxida completamente a una velocidad de 100-150
mg/kg/h.19 Los alcohólicos crónicos, en tanto tengan una función hepática conservada,
pueden presentar un aumento de la velocidad de oxidación; por otro lado, la alcoholemia
de una persona que tiene daño hepático puede permanecer elevada más allá de las 24 horas
de finalizada la última ingestión.
En el hígado se produce la metabolización del 85-90% del EtOH ingerido. En un 70%
se metaboliza por medio de la acción secuencial de las enzimas alcohol deshidrogenasa
(ADH; E.C.: 1.1.1.1) y aldehído deshidrogenasa (ALDH; E.C.: 1.2.1.8). La ADH20 oxida
19
La velocidad de oxidación en los ratones es de unos 550 mg/kg/h y en las ratas de 300 mg/kg/h (Livy et al.,
2003). Es decir, ambas especies de roedores metabolizan el EtOH de 3 a 5 veces más rápido de lo que lo
hacemos los humanos.
20
La ADH, además de en el hígado, se expresa también en la mucosa gástrica (Livy et al., 2003). Este hecho
explica algunas diferencias farmacocinéticas como, por ejemplo, las mayores alcoholemias en mujeres que
en hombres (aquellas expresan la enzima gástrica en menor cantidad que estos) o en algunas etnias orientales
como, por ejemplo, en los japoneses quienes, en conjunto, expresan menores niveles de ADH gástrica que
los occidentales y por ello son más propensos a presentar el cuadro clínico de la denominada embriaguez
28
Introducción
el EtOH a acetaldehído y la ALDH lo convierte en acetato. En ambos pasos se generan
equivalentes reductores al reducirse el NAD+ a NADH.21
CH3-CH2-OH (etanol) + NAD+
º
CH3-CHO (acetaldehído) + NADH + H+
Alcohol
deshidrogenasa
CH3-CHO (acetaldehído) + H2O + NAD+
º
CH3-COOH (acetato) + NADH + H+
Aldehído
deshidrogenasa
El acetato, posteriormente, y por acción de la acetil-CoA sintetasa, es “activado” por
su unión a la coenzima A para formar acetil-CoA. La acetil-CoA puede ser luego utilizada
en varias reacciones anabólicas implicadas, entre otras, en la síntesis de colesterol y ácidos
grasos (contribuyendo así con la aparición de la esteatosis hepática – hígado graso – en los
alcohólicos crónicos22) y de otros constituyentes tisulares.
CH3-COOH (acetato) + CoA-SH + ATP
º
CH3-CO-S-CoA (acetil-CoA) + AMP + PPi
Acetil-CoA
sintetasa
Aproximadamente el 10 al 30% del EtOH se oxida por medio del denominado sistema
patológica ante bajos consumos de EtOH.
21
En la generación de NADH se basa uno de los métodos de detección bioquímica usados en el laboratorio.
22
Por otro lado, el aumento de la proporción [NADH]/[NAD +] tiene el efecto neto de reducir la actividad del
ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs) y de inhibir la $-oxidación de los ácidos grasos, por lo que aumenta
la esterificación de estos para formar triacilglicéridos que se almacenan y contribuyen aún más al hígado
graso, lesión precursora primaria de la cirrosis alcohólica.
29
Introducción
microsomal de oxidación del etanol (MEOS)23 u oxidasas microsomales de función
mixta-citocromo P-450 2E1 (CYP2E1), asociado al retículo endoplasmático liso de los
hepatocitos. Este sistema enzimático es inducible por la acción crónica del mismo EtOH
y responsable del leve aumento en la velocidad de oxidación que se observa en los
bebedores crónicos. Esta inducción enzimática es también importante desde el punto de
vista médico-toxicológico en cuanto a las potenciales interacciones farmacocinéticas con
otras drogas y tóxicos.
CH3-CH2-OH (etanol) + NADPH + H+ + O2 º CH3-CHO (acetaldehído) + NADP+ + 2H2O
Oxidasas microsomales
de función mixta-citocromo CYP2E1
Existe un gran polimorfismo en los genes que codifican a las enzimas ADH, ALDH y
CYP2E1.24 Se postula que este polimorfismo podría ser responsable de las diferencias de
capacidad metabolizadora que se observan entre los sexos, diferentes individuos y grupos
étnicos. También serían responsables de las diferentes susceptibilidades o resistencias a
desarrollar dependencia y/o tolerancia al consumo de EtOH.25 Una consecuencia importante
del polimorfismo genético con respecto a las enzimas metabolizadoras es la que se
relaciona con la ADH gástrica, responsable de un efecto metabolizador de primer paso, más
o menos importante, llevado a cabo en el estómago, antes de que el EtOH se absorba y
pueda ejercer sus efectos sobre los órganos blanco (el hígado, incluido).
23
MEOS, por las siglas en inglés de microsomal ethanol oxydizing system, así denominado por sus
descubridores, Charles Lieber y Leonore DeCarli, en la década de 1960.
24
Para una revisión de los tipos de isoenzimas de la ADH y ALDH, cfr. Sanchis Fortea et al., 1999.
25
Es irrelevante analizar aquí los distintos tipos de isoenzimas de cada uno de los sistemas mencionados, pero
téngase presente que los mismos pueden estar involucrados en la producción de distintos tipos de daños en
los tejidos blanco.
30
Introducción
Un tercer sistema de metabolización es el de la catalasa (E.C.: 1.11.1.6), enzima
presente en los peroxisomas, que oxida al EtOH utilizando peróxido de hidrógeno. Este
sistema parecería ejercer su acción sólo ante concentraciones elevadas de la droga y ser de
escasa importancia en el metabolismo hepático, no así en el cerebro.
CH3-CH2-OH (etanol) + H2O2
º
CH3-CHO (acetaldehído) + 2H2O
Catalasa
El acetaldehído formado como metabolito intermedio en todos los sistemas
metabolizadores del EtOH, es una molécula muy reactiva, responsable de gran parte de los
efectos tóxicos atribuidos al propio EtOH.
El 2-10% del EtOH que escapa a la oxidación se elimina, sin modificar, por vía renal y
pulmonar (principalmente) si bien que, en virtud de su capacidad para atravesar
membranas, se lo puede encontrar en todas las secreciones corporales.26
Desde el punto de vista energético, el EtOH es una molécula con una capacidad de
liberación de energía de 7,07 kCal/g (es decir, 29,58 kJ). Estas calorías se derivan, como
se vió, de la producción de equivalentes reductores en la forma de moléculas de NADH
que, por un mecasnismo indirecto, entran a las mitocondrias, organelas en las que, por
medio de la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa, se almacena
químicamente la energía en forma de ATP (adenosintrifosfato). También se almacena
energía del EtOH a partir de las moléculas de acetil-CoA que ingresan al ciclo de los ácidos
tricarboxílicos en el que se generan más equivalentes reductores que siguen la misma vía.
26
Como máximo, la concentración en la orina puede alcanzar un 130 % de la plasmática. Por otro lado, en
el aire espirado se encuentra una concentración de EtOH que corresponde al 0,05 % de la plasmática.
31
Introducción
De todas maneras, suele decirse que las calorías aportadas por el EtOH son “calorías
vacías” en el sentido de que las bebidas que lo contienen no aportan cantidades
significativas de vitaminas, minerales, oligoelementos, proteínas, glúcidos o lípidos. Las
calorías generadas por la oxidación del EtOH carecen de acción termogénica.27 Más
importante aún, el EtOH carece de capacidades “bioplásticas”, en el sentido de que no pasa
a formar parte de moléculas estructurales de las células o los tejidos28, algo que, se verá, es
de primordial importancia en la consideración del AMF.
I.3.2.
Farmacocinética del etanol en la mujer. Características particulares:
El daño hepático se desarrolla más rápidamente en las mujeres que en los hombres
alcohólicos. Ante iguales niveles de consumo de EtOH, las mujeres (alcohólicas o no)
presentan mayores niveles de alcoholemia que los hombres.
Más arriba hemos visto que el volumen de distribución para el EtOH, en la mujer, es de
0,6 l/kg y que la diferencia es debida a los distintos porcentajes de grasa corporal total en
relación con el hombre (mayor porcentaje de grasa corporal – un tejido relativamente
exento de agua –) y además, en general, a un menor peso corporal que los hombres.
Una de las consecuencias muy importantes a tener en cuenta en el AMF (en relación al
27
De hecho, la sensación transitoria de calor que se experimenta tras beber una bebida alcohólica es debida
a una vasodilatación de los territorios vasculares periféricos por efecto del acetaldehído. Pero por este medio,
en realidad, se pierde calor por convección, radiación y conducción y el EtOH como tal es así, más bien, un
agente inductor de hipotermia.
28
Esto ha hecho que el gran fisiólogo francés y premio Nobel de Medicina en 1913, Charles Robert Richet
(1850-1935) dijera del EtOH que es en realidad un “antialimento” en su obra Les aliments et l’alimentation
normale de l’homme.
32
Introducción
polimorfismo de las enzimas metabolizadoras del EtOH que se mencionara ut supra) es que
la ADH gástrica (clase IV o F-ADH) tiene, normalmente, una actividad 70-80% menor en
la mujer no alcohólica que en el hombre no alcohólico. Más aún, en las mujeres, el abuso
crónico del EtOH reduce la actividad de la ADH gástrica entre un 11-20% por sobre el
basal ya de por sí menor con respecto al hombre.29 Así, las diferencias entre los sexos en
el efecto de primer paso hacen que, en las mujeres alcohólicas – a diferencia de los hombres
alcohólicos – sean iguales el área bajo la curva tras dosis iguales de EtOH/kg de peso
corporal administradas por vía oral o intravenosa; es decir que, para estas mujeres, beber
EtOH es prácticamente lo mismo que administrárselo por vía intravenosa (el alcoholismo
crónico prácticamente abole en ellas el efecto de primer paso). De este modo, la
biodisponibilidad del EtOH, en la mujer, es mucho mayor que en el hombre y los daños
potenciales, por lo tanto, también (Frezza et al., 1990).
I.3.3.
Farmacocinética materno-fetal y en el recién nacido:
Si una embarazada consume bebidas alcohólicas, el 100% del EtOH que cosuma puede
estar en contacto con y/o pasar al embrión o al feto que gesta.
Debido a su bajo PM y a sus propiedades físicoquímicas, el EtOH puede atravasar
fácilmente las membranas biológicas. Por ello, ambos individuos, madre y concepto, en el
estado de equilibrio, comparten el EtOH y se comportan ante él como si fueran,
29
En el hombre alcohólico crónico la reducción de la actividad de la ADH gástrica se verifica entre el 37-46%
(Frezza et al., 1990).
33
Introducción
prácticamente, un solo compartimiento farmacocinético. De hecho, el coeficiente
alcoholemia materna/alcoholemia fetal es de 1, algo que no sucede con otras drogas de
abuso para las cuales la concentración plasmática fetal suele ser menor que la materna. Es
muy importante tener en cuenta que, para el feto, la vía de eliminación de drogas más
importante es el transporte feto-materno transplacentario. Ello se debe, en parte, a la menor
(o aún no desarrollada) capacidad fetal de metabolización de drogas (Szeto, 1995). La
placenta también permite el paso libre del acetaldehído (con potencialidad tóxica) y puede,
además, generarlo a partir del EtOH (Lieber, 2000).
Si una mujer que amamanta consume bebidas alcohólicas, sólo el 2% del EtOH total que
ingiera pasará al lactante por medio de su leche. No obstante, en tanto la mujer tenga
alcoholemias sustancialmente altas, su leche también contendrá EtOH (Mennella, 2001).
Esto se debe a que, en virtud del libre pasaje del EtOH a través de las membranas, la
concentración de EtOH en la leche es similar a la concentración plasmática y su
eliminación de ambos líquidos es temporal y cuantitativamente paralela. La alcoholemia
que se encuentre en el lactante será muy baja por efecto de la dilución del EtOH ingerido
con la leche en el agua corporal total del lactante (Heil y Subramanian, 1998). Sin embargo,
esto no implica que los bajos niveles de EtOH ingeridos a través de la leche que mama
carezcan de efectos biológicos dado que, en los recién nacidos, la vida media de
eliminación del EtOH es mayor que en los fetos ya que carecen de la placenta, importante
compartimiento metabolizador de la unidad materno-fetal (Szeto, 1995). Por otro lado (y
esto tiene importantes consecuencias conductuales a corto y largo plazo) la leche materna
que contiene EtOH ve modificados sus caracteres organolépticos (olor y sabor) (Mennella,
2001; Mennella y Beauchamp, 1991). Y el lactante es, desafortunadamente, altamente
34
Introducción
capaz de detectar estos cambios, igual que lo es el feto bañado por un líquido amniótico con
EtOH en solución (Molina et al., 2007).
I.3.4.
Farmacodinamia:
El EtOH tiene varios mecanismos de acción farmacológica. Uno inespecífico en cuanto
que, por sus propiedades físicoquímicas, es capaz de atravesar membranas biológicas y de
insertarse, intercalarse entre sus lípidos. De esta manera altera las propiedades de las
membranas con las que entra en contacto (altera su grado de fluidez, principalmente) y, en
virtud de las alteraciones metabólicas que induce, altera la composición fosfolipídica de las
membranas.
Por otro lado, se postula que el EtOH tiene también un mecanismo de acción específico
uniéndose a receptores de neurotransmisores.
En el cerebro, por un lado, el EtOH actúa como un agonista de los receptores GABAA
incrementando su conductancia al Cl- y aumentando así la inhibición sináptica; de este
modo, actúa de manera similar a como lo hacen los barbitúricos y las benzodiazepinas,
drogas que comparten con el EtOH su capacidad sedativa y depresora del SNC y con las
que presenta tolerancia cruzada ante el consumo crónico.
Por otro lado, el EtOH actúa como un antagonista de los receptores glutamatérgicos
NMDA y, de este modo, disminuye la conductancia para los iones divalentes (el Ca2+ y el
Mg2+) a través de este canal iónico. Disminuye así la excitabilidad neuronal, pero induce,
a largo plazo, una regulación en más (o hacia arriba, up-regulation) de los receptores
35
Introducción
NMDA por aumento compensatorio de su expresión en la membrana neuronal. Este
fenómeno puede ser el origen de la hiperexcitabilidad observable ante las supresiones o
abstinencias agudas tras un consumo crónico. Se sospecha que, en los alcohólicos crónicos,
muchas de las manifestaciones de neurotoxicidad provocadas por el EtOH podrían deberse
a la excitoxicidad NMDA-dependiente provocada por las sucesivas abstinencias agudas en
aquellos que intentan abandonar su adicción, sin lograrlo finalmente. Esta misma
excitotoxicidad por abstinencia aguda es la que se supone que aumenta el daño en el
cerebro de los fetos de madres crónica y fuertemente alcohólicas que, a lo largo del
embarazo, presentan sucesivas y frecuentes abstinencias.30
I.3.5.
Correlación entre el nivel de alcoholemia y las manifestaciones cognitivoconductuales en la intoxicación aguda:
En los seres humanos, la intoxicación alcohólica aguda se manifiesta, desde el punto de
vista cognitivo y conductual, de manera diferente según sea el nivel de alcoholemia
alcanzado (Tabla 2).
La dosis letal 50 (DL50) del EtOH es de 5-8 g/kg para los humanos adultos y de 3 g/kg
para los niños. En las intoxicaciones agudas fatales, la alcoholemia promedio que se ha
detectado es de unos 400 mg/dl (4 g/l). Sin embargo, un alcohólico crónico puede tolerar
niveles de hasta 500 mg/dl sin manifestar grandes alteraciones conductuales. Esta mayor
30
Por ello, se ha especulado con que, para el cerebro fetal, el daño por el AM F sería incluso mayor en madres
que beben fuertmente y se abstienen en forma repetitiva que en aquellas que lo hacen en forma sostenida.
36
Introducción
tolerancia de los alcoholistas crónicos se debe a los lentos y progresivos cambios
metabólicos que van sucediéndose con el tiempo y que le permiten al bebedor modificar
la respuesta habitual al EtOH (tolerancias farmacocinética y farmacodinámica).
En las ratas, la DL50 también varía según la vía de administración y la edad. Así, en ratas
jóvenes (3-4 meses de edad) la DL50 es de 10,6 g/kg por vía oral y de 6,71 g/kg por vía
intraperitoneal, en tanto que para las ratas viejas (10-12 meses de edad) estos valores son
de 7,06 y 5,10 g/kg, respectivamente (Wiberg et al., 1970). En la rata adulta, la DL50 por
vía intravenosa es de 1,44 g/kg. Por otro lado, la DL50 por vía oral es de 3,45 y 6,3 g/kg para
el ratón y el conejo, respectivamente.
Tabla 2. Relación de los distintos niveles de alcoholemia con las manifestaciones cognitivo-conductuales
observables en el ser humano agudamente intoxicado:
Alcoholem ia
M anifestaciones cognitivo-conductuales
mg/dl*
g/l
mM *
10-50
0,1-0,5
2,17-10,85
Período subclínico, sin signosintomatología evidente; sin embargo, en
pruebas psicométricas se observa enlentecimiento de la respuesta ante
estímulos; comienza el deterioro del juicio crítico; alteración de la
motricidad fina.
50-150
0,5-1,5
10,85-32,56
Euforia, excitación psicomotriz, hiperactividad, logorrea, hipoprosexia,
signos de afectación cerebelosa (adiadococinesia, ataxia, disartria,
dismetría); visión borrosa o diplopía, visón en tunel; compromiso
judicativo franco.
150-250
1,5-2,5
32,56-54,27
Aumenta la excitación; confusión mental, heteroagresividad, labilidad
afectiva; alteraciones sensoperceptivas, ataxia, vértigo; juicio suspendido.
250-350
2,5-3,5
54,27-75,98
Apatía, marcada ataxia, nistagmus, falta de respuesta a los estímulos,
relajación esfinteriana; hipo o arreflexia, hipo/analgesia, hipotermia;
obnubilación, estupor, coma. En mujeres que amamantan, inhibición del
reflejo de eyección de la leche.
>350
>3,5
>75,98
Bradipnea; parálisis respiratoria, muerte.
* Para interconvertir valores de concentración de mg/dl a mM debe multiplicarse o dividirse por un factor de 0,21709.
Es claro, entonces, que distintas especies animales tienen diferente sensibilidad al EtOH
y que dentro de una misma especie, la sensibilidad varía de acuerdo con la edad del animal
37
Introducción
y la vía por la que se administra el tóxico.31
I.4. Desarrollo normal del sistema nervioso central (el período de acción de la noxa):
En el cerebro de cada ser humano se producen innumerables y muy complejos cambios
morfofuncionales durante el desarrollo. Estos cambios son tanto groseros como
extremadamente sutiles y cada uno de ellos puede ser el blanco potencial de alteraciones
causadas por factores físicos, químicos y/o biológicos. Estas alteraciones serán, a su vez,
el origen de diversas enfermedades que se manifestarán durante la niñez, adolescencia o
adultez de la persona afectada.
El desarrollo cerebral comienza en el neuroectodermo del embrión trilaminar y llega a
ser un complejo órgano de intrincadísima anatomía.
En el adulto, el cerebro está compuesto por unas 10 11 neuronas (cien mil millones) 32 (Hubel, 1981;
Kandel, 1991; Kandel et al., 1991). Sólo en la corteza cerebral, la región cerebral que suponemos
evolutivamente más avanzada, se estima que las neuronas suman alrededor de 9 × 10 9 (nueve mil millones)
(Angevine, 1995). Cada neurona, por su parte, es capaz de formar, en promedio, alrededor de 10.000 sinapsis
por lo que puede suponerse que el número total de sinapsis en el sistema nervioso central es de unos 10 14 (cien
billones) en promedio (Hubel, 1981; Kandel et al., 1991). Es comprensible entonces que se pueda producir
alguna alteración en la formación de tan descomunal estructura.33
El desarrollo cerebral prenatal es, así, un complejo y continuo proceso de eventos
31
Todas estas son consideraciones que han de tenerse en cuenta a la hora de diseñar experimentos que
mimeticen las condiciones ambientales observadas en la realidad de los humanos (Cfr Anexo IV: Métodos
experimentales de exposición animal al etanol. Ventajas y Desventajas de cada uno).
32
Más o menos un factor de 10 (10 10-10 12 = diez mil millones a un billón).
33
De hecho, parece casi realmente milagroso que, por lejos las más de las veces, este proceso se lleve a cabo
con una relativa normalidad en cada uno de los seres humanos que nacen todos los días y que no sean
muchísimo más frecuentes las malformaciones con un correlato funcional apreciable.
38
Introducción
genéticos y epigenéticos.
Los investigadores, tan afectos a esquematizar la realidad, afirman que, en el desarrollo
de cualquier región del SNC, se pueden identificar siete u ocho fases generales (Cowan,
1980; Monk y Webb, 2001); son estas:
1) Inducción de la placa neural, regionalización y establecimiento de valores
posicionales de las células neuroepiteliales;
2) Neurulación, proceso básico por el que la placa neural se transforma en el tubo
neural, cerrado, con una cavidad central;
3) Proliferación regionalmente diferenciada de las células neuroepiteliales y producción
de neuroblastos en los distintos territorios (neurogénesis);
4) Migración de los neuroblastos (Nb) postmitóticos desde su lugar de generación hasta
su lugar de residencia final, con la consiguiente agregación celular para formar
regiones diferentes del cerebro y desde las cuales los Nb comienzan la
5) Extensión axonal inicial para interconectar a los Nb, y las distintas regiones en que
residen, entre sí;
6) Sinaptogénesis, por el establecimiento de conexiones de los Nb postmigratorios
entre sí y comienzo, con ello, de la
7) Diferenciación de los Nb a neuronas maduras; con la posterior
8) Muerte celular programada selectiva de ciertas neuronas, la mayor parte de ellas
por apoptosis, que lleva, finalmente, a la eliminación de muchas de las sinapsis
inicialmente formadas y a la estabilización de las restantes (“sintonía fina”, o fine
tuning de los angloparlantes) en un proceso que insume, en realidad, toda la vida del
individuo.34
34
De más está aclarar que varios de los estadíos o fases enumerados no son estrictamente secuenciales sino
que, varios de ellos, se solapan entre sí. Así, por ejemplo, mientras los Nb migran, otras células proliferan y
aún otras sufren apoptosis.
39
Introducción
I.4.1.
La inducción de la placa neural y la neurulación:
Tras la gastrulación, el embrión está
conformado por un disco trilaminar en
el que se interpone un tejido celular
laxo (el mesodermo intraembrionario)
entre dos
láminas
(ectodermo
y
endodermo) de epitelio cúbico simple.
La inducción de la placa neural es
el proceso por el cual una región del
ectodermo comienza a transformarse en
un tejido comprometido hacia el
desarrollo del SNC: la placa neural
(también
epitelial,
cilíndrica
laminar,
simple). 35
pero
Durante
la
inducción de la placa neural se
establecen en el neuroectodermo los
ejes
principales
del
futuro
SNC
(céfalocaudal y dorsoventral). A la par
quedan
establecidos
también
los
territorios presuntivos que darán origen
Fig ura 3. La neurulación. En esta fig ura se resum en los cam b ios q ue
o c u rren du ran te la n eu ru lació n: la tran sfo rm ació n d e u na p lac a
epitelial lam inar (A ) en una estructura tubular cerrada (G ). D e A a D ,
los p asos sucesivos en vistas sup erior (colum na izq uierd a), en un
corte coro nal (m edio) y en vista s de cortes coro nales al m icro scopio
elec trónico de barrido (derecha). La lám ina epitelial de la placa
ne ural ya ind uc ida (E) ya está region alizad a en distintas zo na s,
llam adas placas; esta s son (d e m edial a late ral): p laca del piso, basal,
alar y del techo. A l m ism o tiem po se establecen los p rincipales ejes
d el futuro SN C (céfalocuad al y m ediolateral/d orsoventral). Lueg o d e
transform arse la placa en tub o, tras el cierre de los neurop oros
anterior y po ste rior (F), queda conform ada una estructura tubu lar
hueca, cerrada, que conserva los m ism os territorios (G ) pero en
distinta conform ación espacial. D e la p laca basal surgirán todas las
ne u ronas y estructuras m otoras del S N C y de la placa alar, las
intern eu ronas; la casi totalidad de las neuronas sensitivas surgen
com o derivados extratubu lares d e las crestas neurales. E n las
vesículas telencefálicas solo se conocen derivados de la p lac a alar
q ue d an orig en a la corteza cerebral. M od ificad o y com p uesto a
partir de: A lberts et a l., 1996; C ow an, 1980; H ib, 1986; y R ubinste in
et al., 1998.
35
En el proceso de inducción intervienen múltiples sustancias solubles y de superficie celular que
intercomunican a tejidos y estructuras adyacentes (que no viene al caso detallar aquí) y que son las
responsables de que tal inducción se lleve a cabo correctamente. Entre otras estructuras debe mencionarse,
ineludiblemente, a la notocorda y al mesodermo precordal.
40
Introducción
luego a cada una de las principales regiones del SNC (Fig. 3E,G). La corteza cerebral (CC),
por ejemplo, deriva íntegramente de un territorio delimitado en la región anterolateral de
la placa neural que dará origen a todo el telencéfalo (Rubenstein et al., 1998).
Las células del neuroectodermo que forman la placa, a diferencia de lo que sucede en
el ectodermo general (que dará origen a los derivados tegumentarios -piel y faneras-), se
multiplican a mayor velocidad, crecen en altura y terminan por transformar la placa
original, plana, en un estructura tubular, el tubo neural, en principio abierto pero que va
cerrándose progresivamente hasta conformar un tubo totalmente cerrado. El proceso
completo de transformación de una lámina epitelial bidimensional (la placa neural) en un
tubo epitelial cerrado (el tubo neural) es el proceso que recibe el nombre de neurulación
(Fig. 3) (Alberts et al., 1994; Jessell y Schacher, 1991; Martin y Jessell, 1991).
I.4.2.
Formación de las vesículas encefálicas:
Por crecimiento diferencial en la región
cefálica el tubo neural desarrolla tres
expansiones: la vesícula prosencefálica
(cerebro
anterior),
la
mesencefálica
(cerebro medio) y la rombencefálica
(cerebro
posterior).
La
vesícula
prosencefálica se dividirá posteriormente
en dos (telencéfalo y diencéfalo) y la
Figura 4. E l em brión y el S N C en sus estadíos d e 3 y 5 vesículas
y los derivados a qu e d arán o rige n p osteriorm en te. M od ificado de
A lberts et al., 1996.
41
Introducción
vesícula rombencefálica hará lo propio dando origen a otras dos vesículas (metencéfalo y
mielencéfalo) en tanto que la vesícula mesencefálica permanecerá indivisa (Fig.4). Así,
tempranamente en el desarrollo quedan conformadas las principales regiones del SNC que
perdudarán como tales hasta la adultez. En la Tabla 3 se esquematizan estas relaciones y
se puede apreciar qué regiones maduras derivan de cuáles vesículas embrionarias.
Tabla 3. Divisiones y subdivisiones anatómicas macroscópicas principales del Sistema Nervioso y su
relación con estructuras embrionarias:
SISTEM A N ERVIOSO CEN TRAL (SNC)
Divisiones macroscópicas mayores del
Sistema Nervioso adulto*
Componentes de los
estadíos embrionarios de
5 vesículas
HEMISFERIOS
CEREBRALES
Telencéfalo
Diencéfalo
Cerebro Anterior
o Prosencéfalo
Diencéfalo
ENCÉFALO
TRONCO
DEL
ENCÉFALO
3 vesículas
Corteza Cerebral
Ganglios Basales
Mesencéfalo
Mesencéfalo
Protuberancia
Cerebelo
Bulbo Raquídeo
Metencéfalo
Mielencéfalo
Cavidad
central
Ventrículos
laterales
III Ventrículo
Cerebro Medio
o Mesencéfalo
Acueducto de
Silvio
Cerebro Posterior
o Rombencéfalo
IV Ventrículo
Conducto del
epéndimo
MÉDULA ESPINAL
SISTEM A NERVIOS O PERIFÉRICO (SNP)
GANGLIOS CRANEALES
NERVIOS CRANEALES
GANGLIOS RAQUÍDEOS o de la RAÍZ DORSAL
NERVIOS ESPINALES
GANGLIOS AUTÓNOMOS
MÉDULA SUPRARRENAL
* Para la división del SNC humano adulto sigo la esquematización neuroanatómica tal como consta en Carpenter (1985).
42
Introducción
I.4.3.
Desarrollo de las vesículas telencefálicas y corticogénesis:
La historia histogenética de la CC es la historia de los sucesos ontogénicos que se
suceden en el neuroepitelio de las vesículas telencefálicas a partir de la formación del tubo
neural, hasta el final del embarazo y aún después del parto, probablemente durante toda la
vida postnatal.
Debido a que la mayor parte de las enfermedades neuropsiquiátricas son manifestaciones
de alteraciones morfofuncionales de la CC, en este trabajo me centraré en los aspectos del
desarrollo que están más directamente relacionados con esta estructura.
I.4.3.1. Formación del neuroepitelio:
El epitelio del tubo neural formado a partir de la neurulación se denomina neuroepitelio.
Las células pluripotenciales que lo forman, denominadas células neuroepiteliales (cNEp),
comienzan a dividirse por mitosis y dan inicio así al período de proliferación.
Como
en
todo
epitelio
pseudoestratificado las células tienen su
núcleo en la porción más abultada del
citoplasma
y
prolongaciones
citoplasmáticas que alcanzan tanto la
Fig ura 5. Etapas d el d esarrollo d el neuroep itelio en la reg ión
d orsal d e las vesículas telencefálicas. V er exp licación y
referencias en el texto. M odificado de S idm an y R akic, 1973.
membrana basal (o membrana limitante
externa – MLE –, como se la denomina en el tubo neural) como la superficie apical que
43
Introducción
reviste la cavidad (donde forman la membrana limitante interna – MLI –) (Fig. 5A). Sin
embargo, en el neuroepitelio la mayoría de las células comienzan a acomodar su núcleo
cerca de la MLI y las prolongaciones que se proyectan hacia la MLE determinan en
conjunto una zona relativamente libre de núcleos y abundante en prolongaciones, que se
denomina zona marginal (ZM) o preplaca (PP). Por otro lado, la zona interna del
neuroepitelio, cercana a la MLI, donde se acumulan los núcleos de las cNEp, se denomina
zona ventricular (ZV). Así, en un principio, el tubo neural está formado por un epitelio en
el que se distinguen dos zonas, la ZV (interna) y la ZM o PP (externa) (Fig. 5B). A medida
que los Nb postmitóticos de reciente formación comienzan a migrar (vide infra) comienza
a observarse una tercera zona, la zona intermedia (ZI), migratoria, que separa a las dos
anteriores (Fig. 5C); una vez que arriban a su lugar de residencia final por debajo de la PP
se acumulan en una zona progresivamente más gruesa, la placa cortical (PC), que
constituye el precursor de la CC (Fig. 5D,E). De este modo, en su pleno desarrollo el
neuroepitelio está compuesto por cinco zonas claramente diferenciables desde el punto de
vista histológico que, de dentro afuera, son: ZV, ZSV, ZI, PC, ZM o PP (Sidman y Rakic,
1973).
I.4.3.2. Cinética proliferativa de las células neuroepiteliales:
Al principio de la neurogénesis36 las cNEp se dividen de forma simétrica de modo tal
que generan, como células hijas, a dos nuevas cNEp que permanecen en el ciclo celular
36
Alrededor de los días E11-E12 para los roedores, y en la 5ª semana gestacional humana (E29-E35).
44
Introducción
(Guillemot, 2005; Supèr et
al., 1998). Estas divisiones
simétricas,
llamadas
también
proliferativas,
tienen por efecto expandir
la población de cNEp y, por
lo tanto, incrementar el
número de células madre.
Posteriormente, la mayoría
de las cNEp que entran en
Figura 6. N eurog énesis tem p rana en la vesícula telencefálica d orsal d e los m am íferos
(región de la futu ra corteza cerebral). La referencia tem poral corresponde al desarrollo
del cerebro d el ratón. V er d escrip c ión y referencias en el texto. M od ificad o d e
G uillem ot, 2005.
mitosis se dividen de manera asimétrica, es decir que, tras la citocinesis, una de la células
hija continúa siendo una cNEp y la otra se diferencia a uno de dos tipos celulares posibles:
a) un Nb postmitótico que sale del ciclo celular (se dice que entra en G0) y comienza a
migrar tangencialmente hacia la ZM/PP, o b) una célula progenitora basal. Estas divisiones
asimétricas se denominan también divisiones diferenciativas en virtud de que dan origen
a diferentes tipos de células hijas una de las cuales se diferencia a Nb (Fig. 6A) (Guillemot,
2005).
A medida que progresa la neurogénesis, se ponen en juego múltiples vías de señalización
intracelular que inducen la expresión de marcadores gliales en las cNEp por lo que estas
se transforman en células de la glía radial (cGR). Las cGR también se dividen
simétricamente para originar otras dos cGR y asimétricamente para originar una nueva cGR
y un neuroblasto postmitótico (que luego migra radialmente hacia la PC) o a una célula
progenitora basal que se interna algo en el espesor de la pared del tubo neural en dirección
45
Introducción
a la ZM, y se localiza en una zona de reciente formación, la ZSV (Fig. 6B) (Guillemot,
2005). En conjunto, entonces, la ZV y la ZSV forman lo que se llama globalmente zona de
germinación o germinativa (ZG) del neuroepitelio (Sidman y Rakic, 1973).
I.4.3.3. Ritmo proliferativo de las zonas ventricular y subventricular del
neuroepitelio:
La proliferación de las cNEp en el
tiempo es continua, pero no uniforme.
Existen picos u oleadas de proliferación
activa (picos proliferativos) que se
alternan con períodos de relativo reposo
(valles proliferativos).
La CC se forma a partir de dos
Figua 7. O rigen de las neuronas corticales de las oleadas
ne ur ogenéticas p rim aria y secund aria. M P, D P, LP y V P: cortez a
m edial, dorsal, late ral y ventral, respectivam ente . LG E : e m inencia
g an gliónica lateral. M G E : em inencia gangliónica m edial. A E P /P O A :
área entorrinoped uncu lar/preó ptica an terior. ZV : zo na ven tricu lar.
ZS V : zo na subventricu lar. H : h ipoca m po. N C x: neoco rteza. S tr:
cuerp o estriado. PC x: cor tez a p iriform e. M od ificad o d e M arin y
R ubenstein, 2001.
grandes ondas proliferativo-migratorias. La primer gran onda migratoria, compuesta por
varios picos sucesivos, es la llamada neurogénesis primaria. En esta se originan Nb que
migran con un patrón predominantemente radial. Finalizada la migración, estos Nb se
diferencian a macroneuronas, excitatorias, de proyección, que utilizan glutamato como
neurotransmisor (Dobyns et al., 1996; Guillemot, 2005; Marín y Rubenstein, 2001; Sidman
y Rakic, 1973). Esto es, se originan primero las neuronas que constituirán la principal
eferencia cortical (Flores et al., 1988). La neurogénesis primaria se lleva a cabo en la ZG
(ZV – principalmente – y ZSV) de la región dorsal de las vesículas telencefálicas
46
Introducción
(Guillemot, 2005) (Fig. 7). Luego de abandonar el ciclo celular, los Nb migran hacia la ZM,
según hemos visto. Así, se generan ondas de desplazamiento u ondas migratorias que
tienen un patrón de desplazamiento típico: los Nb comienzan a migrar en un momento
determinado y lo hacen a una velocidad propia y característica para alcanzar localizaciones
precisas (su residencia final). Las ondas de desplazamiento, originadas por los picos
proliferativos, son la base de la organización laminar característica de las regiones
dorsales del tubo neural37 en las que cada lámina en el adulto se corresponde con una
onda de desplazamiento en el embrión o el feto (Hatten, 1999).38 Las capas o láminas de
la CC se forman por la migración de sucesivas oleadas que conformarán las diferentes
láminas. Pero el modo de ordenación es tal que, tras una oleada de Nb, la próxima oleada
(y cada una de las sucesivas posteriores) se sitúa sobre (y no debajo de) los Nb de la oleada
anterior. Cada Nb de una oleada detiene su migración cuando hace contacto con las células
de Cajal-Retzius de la ZM/PP (vide infra) por lo que la primera capa en formarse en la CC
es la VI, luego la V, la IV, la III y, por último, la II en un patrón de formación que se
denomina de “dentro-afuera” (inside-out, originalmente en inglés) (Sidman y Rakic,
1973).39
Cuando la neurogénesis primaria aún no se ha agotado pero está ya en franca
disminución, comienza una segunda onda migratoria que involucra numéricamente a
muchos más Nb y que dura considerablemente más tiempo que la primera onda; es la
neurogénesis secundaria (Dobyns et al., 1996; Sidman y Rakic, 1973). En estos picos
37
Como la CC, tubérculos cuadrigéminos, cerebelo, astas grises dorsales de la médula espinal.
38
Esto difiere con lo que sucede en las regiones ventrales del tubo neural en las cuales se forman estructuras
no laminadas (a excepción del tálamo y del cuerpo geniculado externo) (Hatten, 1999). Esta es otra
consecuencia de la temprana especificación regional que se produce con el establecimiento del eje
dorsoventral en la placa neural.
39
La futura capa I de la CC es la ZM/PP.
47
Introducción
proliferativos más tardíos se produce la proliferación de cNEp indiferenciadas que han
dispuesto a sus células hijas en la ZSV luego de la citocinesis (las células progenitoras
basales, ya mencionadas) (Fig. 6B). Estas últimas, en la ZSV, proliferan aún más y generan
Nb que, luego de migrar mayormente en forma tangencial hasta su residencia final, darán
origen a las microneuronas que utilizan GABA como neurotransmisor; esto es, a aquellas
que constituirán las pequeñas interneuronas inhibitorias de circuito local (Cowan, 1980;
Hatten, 1999).40 Estas microneuronas se originan a partir de Nb que han migrado desde la
ZSV de regiones ventrales de las vesículas telencefálicas, especialmente de una estructura
transitoria llamada eminencia gangliónica lateral (EGL) (Fig. 7) (Guillemot, 2005; Hatten,
1999).41 Más tarde aún durante la neurogénesis secundaria, en forma generalmente más
abundante durante la segunda mitad de la gestación humana e incluso después del
nacimiento (esto último es especialmente cierto para los roedores), se producen los picos
proliferativos que originarán predominantemente a los glioblastos. Los glioblastos, por
diferenciación, darán origen a los distintos tipos de células de la macroglía central42 (Fig.
8).
Se puede apreciar que, en virtud de estos picos proliferativos y ondas migratorias, el
desarrollo del SNC no es homogéneo. Las neuronas no se producen todas a la vez o en
40
Con esto, se ve nuevamente confirmada la validez general del clásico postulado de la ley biogénetica
fundamental que acuñara en 1874 el zoólogo alemán Ernst Haeckel (1834-1919) y que reza “la ontogenia
recapitula la filogenia”. Filogenéticamente, han aparecido primero las macroneuronas (neuronas sensitivas
y motoras, principalmente excitatorias) y más tarde las microneuronas (interneuronas, principalmente
inhibitorias).
41
La EGL también es el origen de Nb que migran hacia áreas ventrales, hacia el adyacente núcleo caudado,
al putamen, al complejo nuclear amigdalino y al tálamo (en el diencéfalo) por vía de la cápsula interna
(Hatten, 1999).
42
Células de la macroglía central son todas aquellas que, exceptuando a los microgliocitos, residen en el SNC,
como, por ejemplo, los astrocitos protoplasmáticos subependimarios, velamentosos, candelabro subpiales,
plumosas de Fañanas; astrocitos fibrosos y ependimarios; células cometa, de Bergmann y de Müller;
oligodendrocitos perineuronales e interfasciculares, etcétera.
48
Introducción
forma
constante
indiscriminada,
patrones
o
sino
con
secuencias
proliferativas
específicas,
e
que
son
ordenadas
características
para
y
cada
región del SNC. Cada región
puede iniciar así, en momentos
distintos, un número variable
de picos de proliferación y
ondas
de
migración
de
velocidad también variable.
Las
consecuencias
acci ón
de
un
de la
agente
Figura 8. R esum en esq uem ático d e la neurog énesis a p artir d e la diferenciación
de las células neuroepiteliales. A bajo, línea tem p oral según sucede en el
desarrollo de la CC de la rata. M odificado de H ib, 1986 y S auvageot y Stiles, 2002.
teratogénico que interfiera con
estos procesos dependerá del momento en que éste actúe y pueden explicar muchas de las
malformaciones congénitas que aparecen en el hombre o en los animales de
experimentación (Flores et al., 1988).
I.4.3.4. Las células de la glía radial:
Hemos visto que las cGR se forman a partir de cNEp que, tras dividirse asimétricamente,
49
Introducción
comienzan a expresar marcadores gliales y conservan sus prolongaciones citoplasmáticas
apical y basal. Más tarde también son generadas a partir de glioblastos que emiten
prolongaciones radiales inducidos por la presencia de factores difusibles de origen neuronal
(Hatten, 1999; Supèr et al., 1998). La masa citoplasmática mayor de la cGR, en la que se
encuentra el núcleo, se localiza en la ZSV del neuroepitelio (Sidman y Rakic, 1973).
Las cGR le proveen a los Nb el andamiaje a través del cual migrar. Ese andamiaje es
inducido y mantenido por los mismos Nb y por ciertas neuronas de la corteza en desarrollo
(las de Cajal-Retizius de la ZM/PP). Además, al proveer un sistema ordenado y conservado
de migración radial, las cGR sirven para preservar externamente la representación del
protomapa ventricular que existe en el neuroepitelio desde los estadíos de placa neural y
de tubo neural (vide supra) (Fig. 3E y 9); es decir, mantienen tridimensionalmente
inalterada la representación bidimensional de los territorios presuntivos al permitir que los
Nb
partan
de
un
lugar
periventricular para llegar a
lugares equivalentes en la
pared externa del tubo neural
que se está engrosando (Rakic,
2003a; Supèr et al., 1998).
Las cGR son una guía
migratoria también para los
axones
que,
más
tarde,
comienzan
a
llegar
inervar
la
corteza
a
para
en
Figura 9. H ipótesis de la u nidad rad ial de R ak ic. A la iz q u ie rda, neu roblasto
postm itótico m ig ratorio (N b ), en p lena m ig ración , adherid o a la prolong ación
citoplasm ática externa de una cG R . A la derecha, m odo de form ación d e las
colum nas corticales, y especificación de las áreas corticales, según predice la
hipótesis d e R ak ic. G racias a la m ig ración p or m edio d e las cGR , se conservan,
expand id as, las áreas d efinid as p reviam ente en el p rotom apa ventricular. N b :
neuroblasto po stm itótico m igratorio. M odificado de R akic, 1988 y 2003a.
50
Introducción
desarrollo, desde regiones subcorticales y desde otras áreas corticales (aferencias
tálamocorticales y corticorticales) (Fig. 9).
Por otro lado, estas células también proveen la estructura que le permite a los Nb
corticales disponerse en una organización columnar (Sidman y Rakic, 1973; Supèr et al.,
1998) ya que los Nb migran uno tras otro, separados por cierta distancia, adheridas a las
prolongaciones externas de las cGR (Fig. 9) (Hatten, 1999; Sidman y Rakic, 1973).43
Las cGR también son neuroprogenitoras ya que se
dividen simétrica y asimétricamente. Por división
asimétrica pueden dar origen a Nb que posteriormente
migran hacia la PC por medio de otras cGR (Tamamaki et
al, 2001). De hecho, las cGR de regiones diferentes del
telencéfalo determinan también la formación de Nb
corticales
específicamente
comprometidos
hacia
determinados fenotipos en lo relativo a la utilización de
neurotransmisores (Fig. 7) (Kriegstein y Götz, 2003;
Marín y Rubenstein, 2001).
Una vez terminado el período migratorio, las cGR no
permanecen en el cerebro adulto con su fenotipo radial
sino que lo modifican radicalmente. Las células retraen
primero sus prolongaciones y los pies terminales de la
prolongación externa, pasando luego por formas
Figura 10. Transform ación fenotípica de las
cGR en d istintos tip os m orfológ icos d e
astr o c ito s u n a vez te rm in ad a la
ne urog én esis. a: cG R ; b-k: as tro citos.
M od ificad o d e R akic, 2003b .
43
Nótese que, con esto, hemos visto ya cuáles son los dos mecanismos del desarrollo que permiten la
estructuración básica de la citoarquictetura neocortical adulta normal. Esto es, la organización laminar en
virtud de las ondas proliferativas y migratorias de los Nb y la organización columnar en virtud de la migración
radiada que posibilitan las cGR.
51
Introducción
morfológicas intermedias, hasta convertirse finalmente en distintos tipos de astrocitos (Fig.
10) (Rakic, 2003b; Sidman y Rakic, 1973; Supèr et al., 1998). El cambio de fenotipo se
pone en evidencia por el cambio de expresión en el principal tipo de filamentos intermedios
de su citoesqueleto que es la vimentina. Al cambiar el fenotipo comienza a expresarse la
GFAP44, una proteína marcadora típica de la astroglía madura.
I.4.3.5. Evolución posterior del neuroepitelio en las vesículas telencefálicas:
A medida que los Nb de las sucesivas oleadas migran y engrosan progresivamente la PC,
comienzan a arribar a esta estructura axones de neuronas catecolaminérgicas cuyos somas
residen en vesículas más caudales (prosencéfalo basal, mesencéfalo, metencéfalo -futura
protuberancia-) (Zecevic y Verney, 1995). Estos axones catecolaminérgicos invaden la PC
en desarrollo, realizan sinapsis con las células de Cajal-Retzius (cC-R)45 ya residentes en
la ZM/PP y parecerían cumplir funciones como organizadores de la corticogénesis en
progreso (Marín-Padilla, 1998; Supèr et al., 1998). Posteriormente comienzan a
diferenciarse secuencialmente las allocortezas de 3 capas (arqui- y paleocorteza) y luego
la isocorteza de 6 capas (neocorteza), nuevamente recapitulando la filogenia.
Algo después comienzan a arribar axones desde los núcleos talámicos (las aferencias
44
Por las siglas en inglés de glial fibrilar acidic protein (proteína gliofibrilar ácida).
45
Las cC-R son un tipo especial de neuronas, quizás de las primeras en migrar a la ZM/PP y diferenciarse a
partir de los Nb generados en las primeras divisiones asimétricas de las cNEp. De maduración precoz, se
establecen tempranamente en la PP y , posteriormente, una vez que la PP sea escindida por la PC, residirán
por fuera de esta última, en la ZM (futura capa I o molecular de la neocorteza madura). Las cC-R tienen
capital importancia en el desarrollo y organización de la CC madura (tanto arqui, como palio y neocorteza).
Son, en la corticogénesis, las primeras en diferenciarse, madurar y recibir contactos sinápticos (Marín-Padilla,
1998; Supèr et al., 1998; Zecevic y Verney, 1995).
52
Introducción
tálamocorticales específicas). Estos axones, durante un tiempo, antes de penetrar en la PC,
establecen contactos sinápticos con neuronas situadas en una estructura transitoria de
localización inmediatamente subyacente a la PC y destinada a desaparecer hacia el
momento del nacimiento: la subplaca (SP) (Allendoerfer y Shatz, 1994; Zecevic y Verney,
1995). Cuando progresa el desarrollo de la PC y estas aferencias tálamocorticales
específicas envían colaterales definitivas hacia afuera (a la PC), establecen contactos
sinápticos sobre todo con las neuronas de la futura capa IV (granular interna) y empieza de
este modo a determinarse la regionalización en áreas corticales según qué áreas reciben
axones desde cuál núcleo talámico específico (O’Leary et al., 1994; Rakic, 1988). Poco
tiempo después comienzan a establecerse, desde cada área cortical, las conexiones
asociativas corticocorticales intrahemisféricas por medio de fascículos y haces
asociativos46 y las conexiones asociativas corticorticales interhemisféricas por medio del
cuerpo calloso (fibras comisurales).47
Con el progresivo desarrollo de las distintas áreas corticales, el manto va plegándose
cada vez más y comienzan a aparecer los surcos que separan a las incipientes
circunvoluciones (proceso de “girificación”). En el último tercio de la gestación (7º mes en
el ser humano; postnatalmente en la rata), cuando empiezan a diferenciarse los
oligodendrocitos a partir de los glioblastos, comienza la mielinización de las primeras áreas
corticales (los campos primordiales o de premaduración de Flechsig) (Flechsig, 1896;
46
Las eferencias intrahemisféricas hacia áreas corticales en los que el nivel de procesamiento de la
información es de nivel creciente salen principalmente desde las capas II-III (supragranulares), y desde las
capas V-VI (infragranulares) si se dirigen hacia áreas de menor nivel. Las aferencias intrahemisféricas
correspondientes llegan a la capa IV si provienen de áreas de menor nivel, y a las capas I y VI si provienen
desde áreas de mayor nivel (Amaral, 2000; Carpenter, 1985).
47
Las eferencias interhemisféricas salen desde las capas II-III (principalmente) y V-VI (en menor grado). Las
aferencias interhemisféricas llegan a las capas III profunda (principalmente), II, IV y VI (Amaral, 2000;
Carpenter, 1985; Zilles, 1990).
53
Introducción
Outes y Funes, 1992) que ya estarán mielinizados al momento del nacimiento.
* * *
En vista de que el desarrollo del cerebro es tan complejo y la mayoría de los sucesos que
en él ocurren son temporalmente simultáneos, en la Figura 11 se presenta un gráfico que
resume muchos de los procesos hasta aquí analizados y que hará más comprensible el
proceso global. Quizás pueda resultar arduo tener que repasar con cierto detalle el
desarrollo del SNC con la finalidad de comprender lo que sucede en el cerebro de un feto
sometido a AMF. Pero no hay otra forma de hacerlo si se quieren comprender cabalmente
los hallazgos que se observen en animales postnatales (infantes, adolescentes o adultos),
tal como intentaré hacerlo en este trabajo tras la fase experimental.
Figura 11. E volución tem poral de algun os p arám etros d el desarrollo cerebral hum ano qu e suceden sim ultanea y/o consecutivam ente. M odificado de R ice y B arone, 2000.
54
Introducción
I.5. Las relaciones neurogliales (el mecanismo etiopatogénico):
Las neuronas y las células de la glía se relacionan entre sí de múltiples maneras.
Coexisten en un mismo tejido, tienen un mismo origen embriológico y una temporalidad
evolutiva compartida, según hemos visto. A diferencia de lo que hasta hace unas décadas
se consideraba establecido acerca de la glía, hoy se comienza a ver que no son meras
“células de sostén”. Más aún, se está comenzando a considerar que con sus contrapartes,
las neuronas, forman una comunidad morfofuncional muy estrecha y dinámicamente
interrelacionada. Uno de los modos en que las neuronas y las células de la glía, los
astrocitos específicamente, se interrelacionan es por medio de un neurotransmisor: la
serotonina. Entiéndase bien que este es sólo uno de esos modos y no es, bajo ningún
concepto, el único ni el más importante.
I.5.1.
La serotonina:
El neurotransmisor básico del SNC, predominante por la cantidad de neuronas y las vías
asociativas que se sirven de él, es el glutamato. El sistema glutamatérgico es múltiple y muy
finamente regulado por un gran número de otros sistemas de neurotransmisores que,
muchas veces, actúan más como verdaderos sistemas de neuromodulación de aquél que
como verdaderos sistemas de neurotransmisión.
Una de las sustancias más importantes, y filogenéticamente más antiguas, utilizadas
55
Introducción
como neurotransmisor/neuromodulador es la serotonina.48
I.5.1.1. Síntesis, almacenamiento, liberación y degradación.:
La serotonina o 3-($-aminoetil)-5-hidroxiindol, en el SNC, es el miembro más
prominente de la familia de las sustancias
aminérgicas clasificadas como indolaminas.
Su biosíntesis se logra en dos pasos
enzimáticos a partir del aminoácido triptofano
(ácido
2S-amino-3-(1H -indol-3-il)-
propanoico),
un
aminoácido
aromático
esencial, que los mamíferos obtenemos sólo a
partir de la dieta. Este aminoácido compite
con otros de su tipo para ingresar al SNC a
través de la BHE. Su ingreso se cumple por
medio de un transportador específico. La
primer enzima biosintética de la vía (y
Fig ura 12. V ía b iosintética d e la serotonina. A la derecha d e
la flecha, en cada reacción, se ubica el nom bre de la enzim a
interviniente y, a la izqu ierda, los co factores y co sustratos.
La TP H es la p rim e ra en zim a d e la vía y lim itante de la tasa
de síntesis.
limitante de la tasa de producción de 5-HT) es
48
Ya las plantas utilizan y sintetizan serotonina y otros derivados del triptofano, como la auxina. El anillo
indólico, que comparte la serotonina con el triptofano y con la melatonina, tiene la capacidad de absorber luz.
Incluso todavía en los mamíferos, la serotonina y la melatonina están relacionadas con la regulación del ciclo
sueño-vigilia y los ritmos biológicos basados en la transducción de señales lumínicas (Azmitia, 2001; Parent,
1981).
56
Introducción
la triptofano hidroxilasa (L-triptofano-5-monoxigenasa, TPH ó TrpOH, EC: 1.14.16.2)
que hidroxila al triptofano en la posición del carbono 5 para producir 5-hidroxitriptofano
utilizando oxígeno molecular como cosustrato y la tetrahidrobiopterina como cofactor.49
El 5-hidroxitriptofano es descarboxilado luego por la enzima descarboxilasa de los laminoácidos aromáticos (ADCC, EC: 4.1.1.28) que utiliza piridoxal fosfato (la forma
activa de la vitamina B6) como coenzima. El producto: la 5-hidroxitriptamina o serotonina
(5-HT) (Fig. 12). Todos estos eventos biosintéticos ocurren en las terminales presinápticas,
lugar en el que la 5-HT es inmediatamente almacenada en vesículas tras ser sintetizada.
Dentro de la vesícula, la 5-HT se une a la proteína de unión a la serotonina (SBP;
disminuye la presión osmótica intravesicular que crearía la gran cantidad de moléculas de
5-HT almacenadas si estuvieran en solución libre)50 (Tamir et al., 1994). En muchas
sinapsis serotoninérgicas, la 5-HT es co-almacenada y co-liberada junta con otras sustancias
como la sustancia P y el VIP.51
Tras la liberación sináptica, y una vez ejercido su efecto transmisor sobre alguno de los
múltiples tipos de receptores que le son
propios, la acción de la 5-HT finaliza por uno
de tres mecanismos conocidos: la recaptación
presináptica, la degradación enzimática y/o la
captación glial . La recaptación presináptica
es un mecanismo económico de finalización
Fig ura 13. Estructura del transp ortador d e 5-H T (5-H T T ) con
sus 12 dom inios transm em b ran a y los bucles intra y
extracelulares. M odificado de R udn ick, 2006.
49
En virtud de su ubicación en neuronas serotoninérgicas, se utiliza a los anticuerpos dirigidos contra la TPH
como “marcadores” específicos de este tipo celular.
50
SBP, por las siglas en inglés de la serotonin binding protein. Existen de ella tres formas de distinto PM :
45, 56 y 68 kDa (Tamir et al, 1994).
51
Péptido intestinal vasoactivo, por sus siglas en inglés (vasoactive intestinal peptide).
57
Introducción
de la acción neurotransmisora ya que elimina a la 5-HT de la hendidura sináptica y la
reingresa en la presinapsis donde es reutilizada, previo realmacenamiento. El
transportador de 5-HT (5-HTT o SERT; Fig. 13) es una proteína con 12 dominios
transmembrana con actividad antiportadora 5-HT-Na+-Cl-/K+ que utiliza la energía del
gradiente electroquímico favorable para el ingreso del Na+ y el Cl- y la salida de K+
(generado, en última instancia, por la Na+/K+-ATPasa) para transportar al mismo tiempo
la 5-HT hacia el interior de la presinapsis (para una revisión, véase Rudnick, 2006).52 La
degradación enzimática se cumple en la misma hendidura sináptica por obra de la enzima
monoaminooxidasa A (MAO-A; E.C.: 1.4.3.4) que realiza una desaminación oxidativa y
transforma a la 5-HT en 5-hidroxiindolaldehído, el cual posteriormente es transformado en
ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) por acción de la enzima aldehído deshidrogenasa
(ALDH; la misma enzima que, hemos visto, cumple el segundo paso degradativo del
EtOH). El 5-HIAA es el principal metabolito de la 5-HT; se transporta fuera del SNC a
través de la BHE y se excreta por orina. Al mecanismo de captación glial lo mencionaré
al tratar los astrocitos.
I.5.1.2. El sistema serotoninérgico:
El sistema serotoninérgico está compuesto por el conjunto de las neuronas que sintetizan
y utilizan este neurotransmisor, los axones que estas proyectan a distancia y los receptores
52
Dado que el 5-HTT se encuentra en las presinapsis serotoninérgicas, los anticuerpos dirigidos contra esta
molécula se utilizan como “marcadores” específicos de tales neuronas, útiles aún en ausencia de la misma 5HT dentro de la presinapsis (como podría ocurrir en casos de depleción, parcial o total, aguda o crónica, del
neurotransmisor).
58
Introducción
para los que la 5-HT es el ligando específico.
El sistema serotoninérgico constituye, filogenéticamente, el sistema neurotransmisor más
antiguo y, anatómicamente, el más extendido de entre los sistemas de inervación difusa de
la CC (Frazer y Hensler, 1994; Parent, 1981).53
Tabla 4. Núcleos del tronco encefálico humano en los que se localizan neuronas
serotoninérgicas (listado en orden rostrocaudal; Törk y Hornung, 1990).
I) Núcleo CAUDAL LINEAL.
II) Núcleo DORSAL DEL RAFE: subnúcleos
A) Medial: subdivisiones
1) Medial (o ventral de Baker).
2) Interfascicular.
B) Ventrolateral.
C) Dorsal.
D) Caudal.
E) Lateral.
III) Núcleo MEDIAL (o SUPERIOR CENTRAL) del RAFE: subnúcleos
A) ROSTRAL.
B) LATERAL.
C) DORSAL.
D) VENTRAL.
IV) Núcleo PARAMEDIAL.
V) Núcleo PONTINO ORAL.
VI) Núcleo B9 homólogo.
VII) Núcleo PONTINO DEL RAFE.
VIII) Núcleo MAGNO DEL RAFE.
IX) Núcleo OSCURO DEL RAFE.
X) Núcleo PÁLIDO DEL RAFE.
XI) Núcleos de la FORMACIÓN RETICULAR BULBAR:
A) Núcleo RETICULAR GIGANTOCELULAR PARS ".
B) Núcleo RETICULAR PARAGIGANTOCELULAR LATERAL.
C) ZONA RETICULAR INTERMEDIA.
D) Bulbo Rostral Ventrolateral.
B6-B7
B8
B9
B9
B1
B3
B2
* En la colum na de la derecha se listan los n úcleos equivalentes para la rata; en este anim al, según
D ahlström y Fuxe (1964), los núcleos B1-B 3 son de localización bulbar; B 4-B 6 son protuberanciales y B7B 9, m esencefálicos. E n tanto, en el hom bre, los n úcleos listados I-IV son principalm ente m esencefálicos;
V -V II, protuberanciales y V III-XI, bulbares.
Las neuronas de este sistema se encuentran, todas, en el tronco del encéfalo. En el ser
53
Así como cada área de la CC recibe aferencias específicas desde determinado núcleo talámico
exclusivamente, cada una de ellas recibe también aferencias inespecíficas (inespecíficas, porque también otras
áreas las reciben). Entre estos sistemas neuronales de proyección cortical difusa se encuentran: los núcleos
talámicos intralaminares; las neuronas que conforman la formación reticular del tronco del encéfalo; y los
núcleos del prosencéfalo basal y del tronco encefálico que utilizan neurotransmisores específicos como: la
acetilcolina (núcleos basal de Meynert, septal medial y de la banda diagonal de Broca), la dopamina
(sustancia negra y área tegmental ventral), la noradrenalina (locus coeruleus y otros núcleos) y los núcleos
serotoninérgicos del rafe (vide infra) (Martin, 1998).
59
Introducción
humano, se hallan agrupadas en dos grandes conjuntos nucleares: uno rostral y otro caudal,
compuestos cada uno de ellos por varios nucleos neuronales, la mayoría de los cuales se
localizan en la región del rafe. Pero, valga la aclaración, así como no todos los núcleos
serotoninérgicos se localizan en el rafe, de la misma manera, no todos los núcleos del rafe
son serotoninérgicos (Törk y Hornung, 1990). En muchos de los núcleos considerados
habitualmente como serotoninérgicos hay neuronas que expresan otros neurotransmisores.
Por ello, hasta cierto punto, es una simplificación (simplificación útil, en todo caso) hablar
de núcleos serotoninérgicos del rafe como generalmente se ve en la literatura y como, de
todas formas, también lo haremos aquí. En la Tabla 4 se presenta un listado de estos
núcleos con su denominación equivalente en la rata, que es el animal en el que Dahlström
y Fuxe (1964) describieron y nominaron
originalmente a los componentes del sistema.
Pero, como es previsible, el sistema
serotoninérgico de la rata no se corresponde
exactamente con el del ser humano.
El grupo rostral está compuesto por los
núcleos mesencefálicos y protuberanciales
rostrales, en tanto que los protuberanciales
caudales y los bulbares conforman el grupo
caudal. Si nos atenemos a las denominaciones
de la Tabla 4, estas dos grandes agrupaciones
se corresponden con los núcleos I-VII (grupo
rostral) y VIII-XI (grupo caudal) en el ser
Figura 14. Localización d e los núcleos serotoninérg icos d e
los g rup os rostral y caud al en el tronco encefálico hum ano
(arriba) y de la rata (abajo), co n la d istribución pred om inan te
de sus fibras de inervación h acia áreas rostrales y caudales
del S N C . M odificado a partir de Frazer y H ensler, 1994.
60
Introducción
humano o con los núcleos B5-B9 (grupo rostral) y B1-B4 (grupo caudal) en la rata (Fig.
14).
Desde el grupo rostral salen axones que inervan, principalmente, el prosencéfalo. Estas
fibras ascienden por el gran haz prosencefálico medial (hpm o medial forebrain bundle –
mfb – de los angloparlantes), un haz de fibras filogenéticamente antiguo, en el que un
significativo número de las fibras serotoninérgicas (-25%) están fuertemente mielinizadas
(Jacobs y Fornal, 1995; Törk y Hornung, 1990). De igual modo, por el fascículo
longitudinal medial (flm, otro haz filogenéticamente antiguo) descienden las fibras desde
el grupo caudal hacia los distintos niveles de la médula espinal. Ambos grupos contribuyen
a inervar, conjuntamente, el cerebelo (Fig. 14).
Los núcleos dorsal y medial del rafe
(NDR y NMR) son los dos principales
núcleos componentes del grupo rostral.
Ambos contribuyen con fibras al hpm pero
tienen áreas de inervación distintas para cada
uno y a la vez funcionalmente relacionadas
entre sí. Así, el NDR inerva, entre otras áreas,
a la sustancia negra, el cuerpo estriado (Strt),
la amígdala y el núcleo accumbens. En tanto,
el NMR inerva, entre otras, a las cortezas del
Figura 15. D istribu ción de la ine rvación prosenc efálica de los
d o s p rin c ip a le s n ú cleo s se ro to n in é rg ic o s d e l ra fe
m esencefalico. N D R : núcleo d orsal del rafe; N M R : núcleo
m edial del rafe; S G P A : su sta ncia gris periacueducta l; TC I:
tu bérb ulos cuadrig ém inos inferio res; lm : lem nisco m edial.
M odificado a partir de Frazer y H ensler, 1994.
cíngulo y entorrinal, los núcleos del septum
y la formación del hipocampo (Hipp) (Fig. 15). Entre los dos contribuyen a inervar el
conjunto de la neocorteza y, en particular a la corteza frontal (CxF) (Frazer y Hensler, 1994;
61
Introducción
Jakobs y Fornal, 1995; Törk y Hornung, 1990).
Las fibras emanadas de estos núcleos rostrales se
diferencian también por su morfología (Fig. 16): las
provenientes del NDR, llamadas fibras de tipo D, se
caracterizan por ser delgadas y de aspecto varicoso,
poseen una distribución difusa y profusa arborización
y presentan botones sinápticos fusiformes o esféricos
Figura 16. M orfología de los tipos de fibras serotoninérgicas
prosence fá lic as. M odifica do a p artir de F razer y H en sler,
1994.
pequeños ( -1 :m de diámetro), pleomorfos; es dudoso
que estos botones formen contactos sinápticos clásicos; en todo caso, se sospecha que podrían realizar un tipo
de neurotransmisión volumétrica ya que la 5-HT, liberada al líquido extracelular, puede difundir por varios
cientos de micrómetros antes de encontrar un receptor específico al cual acoplarse. Este tipo de fibras podría
liberar la 5-HT en forma menos específica y ser más dinámicas y, por tanto, más a propósito para cumplir
funciones neuromoduladoras y/o tróficas. Por otro lado, las fibras de tipo M , provenientes del NMR, se
caracterizan por estar formadas por axones gruesos, con tractos fibrosos no varicosos, tienen arborizaciones
delgadas y cortas, y botones sinápticos esféricos grandes que forman muchas y repetidas sinapsis clásicas
(Frazer y Hensler, 1994; Törk y Hornung, 1990).
I.5.1.3. Los receptores 5-HT1A:
Una vez liberada de la presinapsis, la acción que ejerza la 5-HT sobre sus células blanco
dependerá de los receptores que éstas expresen. Al momento actual se postula la existencia
de 16 tipos distintos de receptores para la 5-HT.54
De todos los receptores serotoninérgicos descriptos hasta el momento, el receptor 5HT1A, en particular (Fig. 17, abajo), es especialmente interesante desde el punto de vista de
las relaciones neurogliales por varios motivos (Azmitia, 2001a, 2001b): i) se expresan
ampliamente en el mesencéfalo (dónde se localizan muchas de las neuronas
54
Cfr. Anexo III (Receptores serotoninérgicos).
62
Introducción
serotoninérgicas) y en el prosencéfalo (el
territorio rostral de inervación distal de esas
neuronas);
ii)
como
receptores
de
localización presináptica permiten inhibir la
descarga de 5-HT por parte de la neurona (y
por tanto, regularla), particularmente en los
NDR y NMR; iii) como receptores de
localización postsináptica, en los territorios
de inervación distal, cumplen distintas
funciones según el tipo de neurona que los
exprese; iv) en condiciones fisiológicas,
pueden ser regulados ampliamente por
distintos
mecanismos
i n t r a c e l u l ar es ;
v)
moleculares
se
F igura 17. A rriba: estructura genérica de los receptores
serotoninérgicos de las fam ilias 1, 2, 4-7 (acoplados a proteínas
G ). A bajo: el receptor 5-H T 1A y sus m ecanism os efectores al ser
estim ulado por u na dro ga agonista parcial com o la buspiro na.
M od ificad o d e http ://w w w .cnsforum .com /im agebank section/
/receptor_system s_S eroton ergic/de fau lt.aspx.
e x pr e san
tempranamente en el desarrollo en el neuroepitelio y en la PC por lo que, posiblemente,
cumplan un rol importante durante la neuro- y/o corticogénesis; vi) tienen una alta afinidad
(Kd = 1 × 10-9 M) por su ligando (5-HT) lo que los hace especialmente a propósito para ser
activos durante el desarrollo incluso en presencia de bajas concentraciones del
neurotransmisor; vii) los astrocitos también expresan este tipo de receptor, por lo que se
erigen como un importante y directo nexo entre la función de las neuronas y los astrocitos;
viii) se han desarrollado distintas drogas agonistas y antagonistas que se le acoplan
selectivamente (lo que provee herramientas moleculares para intervenir exógenamente en
el sistema); ix) en condiciones clínicas, algunas de esas drogas tienen una probada utilidad
63
Introducción
terapéutica como ansiolítico y actualmente están aprobadas para su uso en humanos
afectados por algunos tipos de enfermedades neuropsiquiátricas.
I.5.1.4. Funciones de la serotonina en el SNC adulto y en el desarrollo:
El sistema serotoninérgico, hemos visto, es un sistema neurotransmisor filogenéticamente
antiguo y anatómicamente muy ampliamente distribuido en el encéfalo humano que cuenta
con gran variedad de receptores para ejercer sus acciones.
Así, durante la adultez, a este sistema se lo ha implicado en multiplicidad de funciones
cerebrales. Tan es así que se ha dicho que “la serotonina es un enigma. Está implicada en
virtualmente todo, pero no es responsable de nada” (Jacobs y Fornal, 1995). A la 5-HT se
la ha implicado en procesos fisiológicos tan dispares como la regulación de procesos
cardiovasculares y de la actividad ventilatoria, en los ritmos circadianos entre ellos el ciclo
ueño-vigilia; en las conductas sexual, alimentaria y agresiva; en la regulación de las
secreciones neuroendócrinas y de la nocicepción y los mecanismos de analgesia; en la
generación de respuestas motoras, de los estados de ansiedad, y de los estados de ánimo
(Frazer y Hensler, 1994; Jacobs y Fornal, 1995). En el terreno de la clínica
neuropsiquiátrica, correspondientemente, se la ha implicado, entre otras, en los siguientes
trastornos y enfermedades: dolor crónico y cefaleas (las migrañas, particularmente); emesis;
mioclonías; endocrinopatías; síndrome carcinoide; trastornos neurodegenerativos y en el
envejecimiento (normal y patológico); abuso y dependencia de drogas; trastornos del control
de los impulsos y agresividad; trastornos sexuales, alimentarios y del sueño; trastornos por
64
Introducción
ansiedad y obsesivo-compulsivo; trastornos afectivos (enfermedad maníaco-depresiva,
manías y depresiones unipolares); los distintos tipos de esquizofrenias; y, por último, en una
variedad de trastornos del desarrollo del SNC (Frazer y Hensler, 1994).55
El sistema serotoninérgico aparece tempranamente durante el desarrollo. Hacia la 5ta
semana gestacional empiezan a diferenciarse las primeras de sus neuronas en el rafe del
mesencéfalo humano (Azmitia, 2001a; Sundstrom et al., 1993); en la rata, en los días E11E12 las neuronas de los grupos mesencefálicos B7-B9 y en E13-E14 las de los núcleos del
grupo caudal (Lauder, 1990). El grupo rostral (entre los que están el NDR y el NMR)
comienza a enviar fibras hacia el prosencéfalo por medio del hpm en cuanto las células se
diferencian en el mesencéfalo. Son las primeras fibras en arribar a la PC y, en la rata, lo
hacen en el día E17. Su llegada coincide con el período pico de proliferación, migración y
diferenciación de las ZG. Estos axones se localizan en principio en aquellas capas en las que
residen las neuronas corticales establecidas primariamente: la ZM/PP y la SP. En las
distintas capas corticales desarrollan luego un patrón de inervación que sigue una secuencia
de dentro-afuera (“inside-out”) aproximadamente paralela al gradiente cortical de
neurogénesis y diferenciación y, aparentemente, realizan conexiones con las neuronas una
vez que estas han finalizado su migración. Los axones serotoninérgicos que arriban a la PC
y van inervando las sucesivas capas parecerían interactuar y coincidir en el tiempo, a la vez,
con los axones de las aferencias específicas tálamocorticales que arriban a la PC desde la
SP. Durante el desarrollo cortical se han observado variaciones temporoespaciales en el
55
Prueba cabal de su amplia implicancia en tan dispares trastornos es la existencia de drogas en uso
terapéutico con acción sobre el sistema serotoninérgico, a su vez tan dispares como el naratriptán (un
antimigrañoso, agonista de los receptores 5-HT 1B/1D), la clozapina (un antipsicótico atípico, antagonista
combinado 5-HT 2A/1C y dopaminérgicos D 4/2), el ondansentrón (un antiemético, antagonista 5-HT 3) o la
buspirona (un ansiolítico no benzodiazepínico, agonista parcial de los receptores 5-HT 1A).
65
Introducción
patrón de inervación serotoninérgica que podrían tener relación con un importante rol de la
5-HT en el desarrollo de las sinapsis intracorticales (D’Amato et al., 1987; Dori et al.,
1996). El patrón adulto de inervación cortical, en la rata, se alcanza recién hacia el final de
la tercera semana postnatal (-P21) (Dori et al., 1996). De todas formas, la inervación
serotoninérigica prosencefálica varía notablemente según la región y el momento
considerados tanto en el patrón espacial de extensión de las fibras como en el tipo y lugar
de establecimiento de las sinapsis (botones terminales, botones en pasaje, sinapsis
axosomáticas o axodendríticas, etc.) (Dori et al., 1996, 1998).
Durante el desarrollo, el 5-HTT comienza a expresarse sincrónicamente con la síntesis
de 5-HT en el soma de las mismas neuronas pero también se expresa transitoriamente en las
cNEp del telencéfalo dorsal incluso antes de que lleguen las fibras serotoninérgicas desde
el mesencéfalo. El 5-HTT también se expresa en axones serotoninérgicos que no realizan
aún contactos sinápticos y, más aún, en los conos de crecimiento de los axones
serotoninérgicos. Los niveles de expresión del 5-HTT varían también a lo largo del
desarrollo pre- y postnatal tanto en los núcleos del rafe cuanto en las áreas de inervación
distal. Estos hechos han llevado a pensar que la 5-HT pueda actuar durante el desarrollo, en
muchos casos no como un neurotransmisor clásico sino más como un factor difusible, cuasihormonal, con un mecanismo de transmisión volumétrica (Galineau et al., 2004; Zhou et al.,
2000).
El receptor 5-HT1A, pasible de ser activado aún por bajos niveles de 5-HT en virtud de
su alta afinidad de unión (vide supra), se expresa en niveles máximos durante el desarrollo
y no durante la vida postnatal. En el ser humano, de hecho, su pico de expresión se sitúa
entre las semanas gestacionales 16ª-22ª en tanto que en la rata aparece en E12 en los núcleos
66
Introducción
del rafe, tiene un pico de expresión en E15 y disminuye posteriormente hacia el fin de la
gestación para alcanzar los niveles menores del adulto, solo postnatalmente (Azmitia,
2001a; Bar-Peled et al., 1991; Daval et al., 1987). Es muy interesante el hecho, además, de
que este receptor se expresa en altos niveles en zonas donde residen células madre
indiferenciadas, en las ZV y ZSV durante el desarrollo prenatal (Lidow y Rakic, 1995) e
incluso en la ZSV del hipocampo adulto (Banasr et al., 2004).
Como se puede apreciar, son varias las razones que han llevado ya desde hace tiempo a
enunciar la hipótesis de que la 5-HT sería una señal importante para guiar e influir en el
desarrollo de todo el SNC, tanto de neuronas corticales cuanto de neuronas que utilizan
otros neurotransmisores, como así también en el de las mismas neuronas serotoninérgicas
(Lauder y Krebs, 1978).
I.5.2.
Los astrocitos:56
“Las células de neuroglia ó aracniformes (por parecerse á una araña) llamadas también
corpúsculos de Deiters -en honor de su descubridor- forman el armazon y soporte de la trama
nerviosa de los centros. Este armazón separa por una parte las expansiones dendríticas y fibrillas
nerviosas que no deben mantener contactos funcionales, y por otra, protege y sostiene los
capilares sanguíneos.”
57
Los astrocitos son un tipo de células de la neuroglía (el otro componente celular del
tejido nervioso). Junto con los oligodendrocitos, las cGR y las células ependimarias,
56
Excepto donde se aclara puntualmente, los datos de esta sección se han tomado de la revisión de Magistretti
y Ransom (2002).
57
Esto decía el genial aragonés en 1899 acerca de la neuroglía (Ramón y Cajal, 1899; t. I, pág. 174.). En lo
esencial, poco más se puede agregar hoy en día acerca de estos tipos celulares del tejido nervioso.
67
Introducción
constituyen la llamada macroglía del SNC.
Los astrocitos sobrepasan ampliamente el número de las neuronas en una proporción
aproximada de 10 por cada neurona (hay autores que elevan la cifra hasta 50:1). Tan
numerosos son que constituyen, por sí solos, del 25 al 50% del volumen cerebral total. Por
su forma y ubicación se los clasifica en distintos tipos: los protoplasmáticos predominan en
la sustancia gris, los fibrosos en la sustancia blanca,
astrocitos velamentosos, astrocitos subependimarios,
en candelabro subpiales, plumosos de Fañanas, etc.
También existen en los mamíferos adultos dos tipos
celulares derivados de las cGR (las células de
Bergmann del cerebelo y las células de Müller en la
retina, considerados como tipos de astrocitos adultos
por muchos autores ). De hecho, la gran mayoría de
las cGR, una vez concluida su función durante el
desarrollo embriofetal, se transforman en variedades
fenotípicas de astrocitos (vide supra) (Fig.10).
I.5.2.1. Morfología y funciones:
La forma de los astrocitos varía mucho según el
lugar en el que se encuentren pero, básicamente, la
mayoría son células de soma estrellado del que
Figura 18. A sp ecto q ue adop tan los astrocitos con
d i st in t o s m é t o d o s h is t o ló g ic o s p a ra s u
visualización. A rriba, en tinción c o n la técnica del
sublim ado de cloruro aúrico m ercúrico de C ajal (se
aprecian los p ies chup ad ores d e varios astrocitos
qu e se d ispo ne n alred ed or de un ún ico y gran vaso
sang uíneo). En m edio, d os im ágenes a distintos
au m en tos de astroc itos inm unom arcados contra la
G FA P . A b ajo, asp ecto d e un típ ico astrocitos
p rotoplasm ático im pregnado con la técnica d e
G olg i.
68
Introducción
parten prolongaciones citoplasmáticas más o
menos numerosas (más cortas, abundantes y
ramificadas en los protoplasmáticos y más
largas, rectas y escasas y menos ramificadas en
los fibrosos) (Fig. 18). El soma en sí es escaso
y tiene poco desarrollo de la mayoría de las
organelas. El núcleo es generalmente oval,
siempre de cromatina laxa y sin nucléolos
visibles (Ham y Cormack, 1986; Jones y
Fig u ra 19. R epresentación esq uem ática d e los d om inios
territoriales ana tom ofuncionales de los astrocitos en
relación a los va so s sa nguíneo s. M odifica do de N ed erg aa rd
et al., 2003 (realizad o a pa rtir de un a reco nstruc ción en ba se
a tinciones de IC Q para la G FA P ).
Cowan, 1986).
Los astrocitos tienen numerosas funciones. Algunas de ellas son58: i) por medio de las
prologaciones citoplasmáticas, llenan todo el espacio que se halla entre las neuronas y sus
prolongaciones y que no es ocupado por otras células de la glía (tal como dijera Cajal); de
hecho, emiten lengüetas en todas direcciones y así envuelven o recubren virtualmente todas
las sinapsis, aislándolas del resto del tejido nervioso; ii) las prolongaciones de cada astrocito
individual ocupan un espacio tal que no se interdigitan (prácticamente) con las
prolongaciones de otros astrocitos y definen así dominios territoriales anatomofuncionales
(Fig. 19) (Nedergaard et al., 2003); iii) son células altamente polarizadas que se encuentran
en una situación especialmente a propósito para actuar de mediadores entre las neuronas
y los elementos no neuronales del SNC: el epéndimo, la piamadre y los vasos sanguíneos;
con estos últimos toman contacto por medio de unas expansiones terminales especiales (los
58
Sólo menciono las más importantes o las mejor establecidas por no prolongar la exposición
innecesariamente. Para una reciente revisión global, cfr. Verkhratsky y Butt (2007).
69
Introducción
pies chupadores o pies terminales59) que llegan a cubrir entre el 95 al 100% de la superficie
externa de los vasos y forman parte importante de la BHE; conforman así una compleja
trama o red gliovascular (Nedergaard et al., 2003); iv) en los pies chupadores expresan
distintos tipos de transportadores y canales moleculares que permiten a los astrocitos
regular el acceso de las sustancias al SNC (por ejemplo, el transportador de glucosa del tipo
GluT1); v) son el único tipo celular del tejido nervioso que almacena glucosa en forma de
glucógeno; vi) los astrocitos maduros (y solo ellos) poseen en el citoesqueleto un tipo
especial de filamentos intermedios: la proteína gliofibrilar ácida (GFAP), más abundante
en los astrocitos fibrosos que en los protoplasmáticos; vii) se unen y acoplan entre sí por
medio de uniones en hendidura (o nexus) a través de los que, se sabe, viajan señales
moleculares (como el Ca2+ y el inositol-1,4,5-trifosfato) que acoplan funcional y
metabólicamente a estas células (son conocidas las denominadas ondas de calcio); viii) en
la membrana celular expresan canales iónicos (K+, Na+, Ca2+) voltaje-dependientes de
significación fisiológica aún oscura, que no les permiten generar potenciales de acción u
otros tipos de respuestas eléctricas regenerativas (que sí se ven en las neuronas), aunque sí
despolarizarse y variar su potencial de membrana; ix) amortiguan las altas concentraciones
de K+ extracelular (un producto de la actividad neuronal intensa) incorporándolo a su
citoplasma por medio de canales específicos y, ante esta señal, degradan glucógeno para
proveer de glucosa a las neuronas vecinas; x) por los pies chupadores expulsan el exceso de
K+ hacia los vasos sanguíneos vecinos donde éste ión induce una vasodilatación que
aumenta secundariamente la provisión de oxígeno y otros nutrientes necesarios para la
actividad neuronal aumentada (Kandel, 1991); xi) por medio de otros mediadores (tanto
59
También llamados procesos pediculares, pies perivasculares o aparato chupador de Cajal.
70
Introducción
extra- como intracelulares, como el óxido nítrico, glutamato, factor natriurético atrial, Ca2+,
ácidos epoxieicosatrienoicos y prostaglandinas) también contribuyen a regular el flujo
sanguíneo regional en función de la actividad neuronal circumvecina (Anderson y
Nedergaard, 2003; Fellin y Carmignoto, 2004); xii) intervienen en el anabolismo y/o
catabolismo de varios neurotransmisores por medio de circuitos metabólicos que los
proveen a las neuronas (como en el caso del glutamato, por ejemplo) o contribuyendo a
recaptarlos una vez finalizada su acción sináptica (como en el caso de varios
neurotransmisores -como el glutamato, DA, noradrenalina, 5-HT, GABA) por medio de
sistemas de recaptación de baja afinidad pero de alta capacidad (es el sistema de captación
glial que mencionáramos ut supra a propósito de la finalización de la acción sináptica de
la 5-HT); xiii) expresan receptores de membrana funcionalmente activos para muchos de
esos (y otros) neurotransmisores como, por ejemplo, el receptor serotoninérgico 5-HT1A;
xiv) modifican su morfología en respuesta a los cambios producidos en las sinapsis de la
vecindad (es decir, presentan plasticidad astrocitaria ante la plasticidad sináptica o neural)
y pueden así intervenir en los fenómenos de aprendizaje y memoria por medio de la
regulación de (e interacción con) la neurotransmisión y la sinaptogénesis; xv) también
modifican su morfología y actividad metabólica ante estímulos nocivos físicos y/o químicos
e intervienen en las respuestas inflamatorias del SNC (sufren hipertrofia e hiperplasia en una
serie de cambios morfofuncionales que ha llevado a que se los designe como astrocitos
reactivos) (Ridet et al., 1997); de hecho, son células inmunocompetentes que expresan
moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo II y poseen capacidad de
presentación de antígenos a ciertas células del sistema inmune (Dong y Benveniste, 2001);
xvi) pueden regular la neurogénesis adulta en el hipocampo al especificar el destino
71
Introducción
neuronal de las células madre (Song et al., 2002) y pueden “desdiferenciarse”
morfofuncionalmente a sus tipos celulares precursores (las cGR) ante estímulos adecuados
(Leavitt et al., 1999) e, incluso, algunos subtipos de astrocitos adultos pueden actuar como
verdaderas células madre (Barres, 1999; Steindler y Laywell, 2003); xvii) durante la
neurogénesis que se observa en la ZSV del III ventrículo en los mamíferos adultos, los
astrocitos migran junto a los Nb hacia el bulbo olfatorio, formándoles una especie de
“cápsula” tubular migratoria que envuelve y guía a los Nb en su largo trayecto, en un tipo
adulto de migración que se denomina migración en cadena (García-Verdugo et al., 1998)60;
xviii) son una población celular topográficamente heterogénea: varían su morfología y
función según su lugar de residencia en el SNC adulto y en determinadas áreas cerebrales,
según que se trate de machos o hembras (dismorfismo sexual astrocitario) (McCarthy et al.,
2002); xix) filogenéticamente, aumentan su complejidad morfofuncional según aumenta
evolutivamente la complejidad cerebral (Oberheim et al., 2006).
Evidentemente, los astrocitos (y las células de la neuroglía en general) distan mucho de
ser el tipo de células “de pegamento”, “conectivas” o “de relleno” o “soporte” que
antiguamente eran consideradas. Muy por el contrario, son extremadamente versátiles e
intervienen muy activamente en (casi) todos los procesos que se observan en el SNC en
desarrollo y adulto.
60
Los otros dos mecanismos conocidos de migración de N b se dan durante el desarrollo prenatal (ya he
hablado de ellos): la migración radial (con eje en el andamiaje de las cGR) y la migración tangencial (con
eje principalmente en los axones en desarrollo que transitan por la ZI).
72
Introducción
I.5.2.2. La proteína S100B:61
Una función muy importante de los astrocitos, que no he mencionado hasta ahora, es la
síntesis y secreción al medio extracelular de distintas proteínas con acción neurotrófica.62
Entre ellas se encuentra la proteína S100B (S100B, en adelante).63
Los astrocitos secretan S100B al medio extracelular de manera constitutiva. Pero también
pueden ser estimulados a ello por distintas moléculas. Entre éstas se encuentran el
glutamato, la adenosina, el ácido lisofosfatídico y la 5-HT actuando sobre receptores 5HT1A localizados en su membrana citoplasmática. No se conocen aún los mecanismos
íntimos por los que los astrocitos secretan la S100B aunque se sospecha que es por un
mecanismo independiente de la vía clásica retículo endoplasmático-aparato de Golgi; al
menos en una línea celular de origen astrocitario, la secreción depende de una elevación de
la concentración intracelular de Ca2+, o de una disminución de la de Zn2+ (Davey et al.,
2001).
La S100B, como la mayoría de las proteínas S100, cumple funciones intra- y
extracelulares (Tabla 5). Dentro de las células regula la función de proteínas efectoras y,
dado que su función depende de la unión de átomos de Ca2+, la S100B funciona como una
proteína censora de Ca2+ aunque algunas de sus acciones son independientes del catión
(Tabla 6).
61
Cfr. las excelentes revisiones de Donato (1999, 2003) sobre la familia de proteínas S-100 (que he seguido
para escribir esta subsección, excepto donde específicamente lo aclaro).
62
Como el GDNF (por las siglas en inglés del glial cell line-derived neurotrophic factor), el BDNF (brain
derived neurotrophic factor), el CNTF (cilliary neurotrophic factor), las neurotrofinas 3 y 4 (NT-3y NT-4)
o el NGF (por las del factor de crecimiento nerviso en inglés, nerve growth factor).
63
Cfr. el Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo) en el que se detalla su
estructura molecular.
73
Introducción
Entre las muchas funciones que cumple la S100B se cuentan, como particularmente
relevantes a los fines de este trabajo, su participación como factor promotor de la extensión
de neuritas por parte de las neuronas en diferenciación; la estabilización del citoesqueleto
neuronal y glial (tanto por modificar el estado de fosforilación de diversas proteínas
citoesqueléticas como por interactuar directamente con ellas); la estimulación de la
diferenciación de distintos tipos de neuronas inmaduras de varios sistemas
neurotransmisores (colinérgico, noradrenérgico, glutamatérgico, dopaminérgico e, incluso,
del serotoninérgico mismo) hacia fenotipos maduros; su acción como factor promotor de
la sobrevida neuronal, antiapoptótico, y de la plasticidad sináptica cuando está presente en
bajas concentraciones (en el rango de las altas pM a bajas nM). Por el contrario, cuando se
encuentra en altas concentraciones (altas nM a bajas :M) puede promover un efecto
neurotóxico (Hu et al., 1996; Hu y van Eldik, 1999).
En los mismos astrocitos, por otro lado, la S100B interactúa con la GFAP e induce su
expresión y el incremento del grado de arborización de las prolongaciones citoplasmáticas
además de ser capaz de inducir la proliferación mitótica de estas células (por tanto, es
mitógena para los astrocitos).
La S100B juega así un papel especial, central, de interrelación entre las neuronas
serotoninérgicas, los astrocitos, las neuronas de otros sistemas neurotransmisores y el
citoesqueleto en todas ellas.
Pero más allá de las funciones que cumple por medio de la unión directa a diversas
proteínas blanco, una vez liberada al medio extracelular, también puede unirse, en la
superficie de otras células, al receptor para los productos finales de la glucosilación
avanzada (RAGE, por las siglas en inglés de receptor for advance glycosylation end-
74
Introducción
Tabla 5. Funciones intra- y extracelulares de la S100B, establecidas al momento actual:
FUN CION ES de la S100B
intracelulares
extracelulares
INHIBICIÓN DE LA FOSFORILACIÓN DE
PROTEÍNAS:
! inhibe la fosforilación de proteínas bloqueando el
acceso de las quinasas -como la PKC- a sus proteínas
sustrato pertinentes;
! inhibe la fosforilación de la proteína tau y MAP-2
(tipos de proteínas asociadas a los microtúbulos );
! inhibe la fosforilación de la proteína p53
! En neuronas, efecto prosobrevida y promotor de la
extensión de neuritas en concentraciones bajas (en el
rango nM) por interacción con receptores RAGE e
inducción de efectos neurotróficos (por la vía de la
activación Ras-MAPK-NF6B y de la vía cdc42/Rac);
! Efectos tóxicos (muerte neuronal apoptótica por
activación persistente de la vía Ras-MAPK) en
concentraciones altas (en el rango :M);
! Estimulación de la proliferación astrocitaria por un
mecanismo no conocido;
! Apoptosis astrocitaria, por inducción de la iNOS
astrocitaria via translocación nuclear del NF6B;
! Apoptosis neuronal, vía activación del RAGE, con
activación de caspasa 3 mediada por citocromo C;
aumento de la conductancia al calcio por canales de
tipo L y por regulación en más de genes proapoptóticos
(c-fos, c-jun, bax, bcl-x, p-15, p-21;
! Estimulación de la secreción de NO astrocitario por
inducción de iNOS astroglial vía translocación nuclear
del NF6B;
! Estimulación de la secreción de NO microglial por
inducción de la iNOS microglial por unión a RAGE en
sinergia con lípido A e IFN-(;
! Modulación de la plasticidad sináptica por depresión
de la potenciación a largo plazo (LTP) en CA1 Hipp.
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:
! estimula al Ndr (serin-/treonin-proteinquinasa nuclear
importante en la regulación de la división celular y de la
morfología celular);
! estimula la actividad de la guanilatociclasa de
membrana en los segmentos externos de los
fotorreceptores
REGULACIÓN DEL CRECIMIENTO Y LA
DIFERENCIACIÓN CELULAR:
! se une a las secuencias bHLH de los factores de
transcripción MyoD y E12;
! interacciona con la proteína de supresión tumoral p53
(cooperaría con la p53 para provocar detención del
crecimiento celular y apoptosis)
REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS DEL CALCIO:
! jugaría un papel como tampón de calcio citosólico
directamente o indirectamente por medio de la acción
sobre la fosfoproteína gigante AHNAK
REGULACIÓN DEL ESTADO DEL CITOESQUELETO,
MORFOLOGÍA Y MOTILIDAD CELULARES:
! inhibición del ensamblaje de los microtúbulos por
secuestro de tubulina y por la estimulación de la
sensibiliad al calcio de los microtúbulos armados;
! inhibición del ensamblaje y estimulación del
desensamblaje de los FI tipo III (como la GFAP) por
secuestro de subunidades no ensambladas de
proteínas de los FI;
! reversión de la inhibición caldesmona- y calponinadependiente de la actividad de ATPasa de la
actomiosina
* AHNAK: fosfoproteína gigante idéntica a la desmoyokina; CacyBP/SIP1: calcyclin-binding protein/Siah-1-interacting
protein; CapZ (TRTK-12): proteína de capping de la actina; GFAP: glial fibrillary acidic protein; IQGAP1: IQ motif GTPaseactivating protein (un itpo de proteína ligada a la actina); MAG: myelin-associated protein; NDR: nuclear Dbf2-related
protein kinase; RAGE: receptor for advanced glycation end-products.
products).64
La propiedad de la S100B de estimular al RAGE no es exclusiva de ella: la comparte con
otras proteínas de su familia (S100A1, S100A6, S100A12 y S100P) (Donato, 2003; Leclerc
64
Cfr. el Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo) en el que se detalla la
estructura íntima de esta receptor.
75
Introducción
et al., 2007) pero se une de manera diferencial y específica entre los dominios V y C1
(Dattilo et al., 2007; Leclerc et al., 2007).65 La estimulación de los RAGE se sigue de la
activación de complejas cascadas de señalización intracelular que llevan finalmente a la
extensión de neuritas, la proliferación y la sobrevida celular (u otras acciones dependiendo
de las condiciones microambientales predominantes como, por ejemplo, la concentración
local de S100B) (Huttunen et al., 1999; Santamaria-Kisiel et al., 2006).
Tabla 6. Funciones conocidas de la S100B en relación con su dependencia de la unión al calcio:*
Proteína blanco con
la que interactúa**
K d (nM )
Función promovida
FUNCIONES CALCIO-DEPENDIENTES
AHNAK
Aldolasa C
Anexina A6
CacyBP/SIP
Caldesmona
CapZ (TRTK-12)
Filamentos intermedios
Fosfoglucomutasa
GFAP, vimentina
Guanilato ciclasa
IQGAP1
MAG
Microtúbulos
NDR
Neuromodulina (GAP43)
p53
RAGE
Proteína tau
50
< 1000
500
150-1000
2000
7000
500
24-23500
regulación de la homeostasis del calcio
estimulación de la actividad de la aldolasa C
regulación del flujo de calcio y del ensamblaje de los FI
regulación de la ubiquitinación
disminución de la inhibición de la actomiosina por la caldesmona
regulación de la extensión de los filamentos de actina
regulación del ensamblaje y desensamblaje de los FI
estimulación de la actividad de la fosfoglucomutasa
ensamblaje de FI
activación de la guanilato ciclasa
rearreglo de membrana
regulación del citoesqueleto de la célula glial
regulación de la dinámica de los microtúbulos
modulación de la actividad de la NDR-quinasa
inhibición de la fosforilación de la neuromodulina por la PKC
inhibición de la función de la p53
promoción de la sobrevida celular
inhibición de la fosforilación de la proteína tau por la proteinkinasa II
FUNCIONES CALCIO-INDEPENDIENTES
Aldolasa A
Glucógeno fosforilasa
estimulación de la actividad
* Modificado de Santamaria-Kisiel et al., 2006.
** AHNAK: fosfoproteína gigante idéntica a la desmoyokina; CacyBP/SIP1: calcyclin-binding protein/Siah-1-interacting
protein; CapZ (TRTK-12): proteína de capping de la actina; GFAP: glial fibrillary acidic protein; IQGAP1: IQ motif GTPaseactivating protein (un itpo de proteína ligada a la actina); MAG: myelin-associated protein; NDR: nuclear Dbf2-related
protein kinase; GAP43: growth associated protein 43; RAGE: receptor for advanced glycation end-products.
65
La S100A6 y la S100A12, por ejemplo, se unen en los dominios C 1 y C 2 (Leclerc et al., 2007).
76
Introducción
Finalmente, desde el punto de vista ontogenético, la S100B comienza a expresarse
durante el desarrollo fetal en las cGR (Gómez et al., 1990; Brusco et al., 1995). Hemos visto
que muchas de estas células se transformarán más tarde, fenotípicamente, en astrocitos. La
S100B interviene de este modo, también, en el desarrollo del SNC.
A modo de resumen, puede decirse que la S100B actúa, durante el desarrollo y en la
adultez, como un factor promotor y de mantenimiento de la forma diferenciada y madura
del SNC.
I.5.3.
El citoesqueleto neuronal y astrocitario:
Hemos visto que la proteína S100B interactúa con varias proteínas del citoesqueleto y
modifica y/o regula sus características estructurales y funcionales.
El citoesqueleto en las células eucariotas está compuesto por tres elementos principales:
los microtúbulos (MT; formados por 13 protofilamentos de "- y $-tubulina que determinan
una estructura hueca de unos 15 nm de diámetro; también llamados neurotúbulos – NT –
en las neuronas), los filamentos intermedios y los microfilamentos (MF; de 7-9 nm de
diámetro y formados, fundamentalmente por actina).
I.5.3.1. Los filamentos intermedios (FI):66
66
Cfr. el Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo) en el que se detalla la
estructura de los filamentos intermedios.
77
Introducción
Los filamentos intermedios (FI) representan un componente particular del citoesqueleto,
presente exclusivamente en las células eucariotas (Karp, 2006). A diferencia de los MTs y
los MFs, que están filogenéticamente más conservados, los FI varían notablemente en su
secuencia aminoacídica (estructura primaria). Están compuestos por proteínas que, por su
alto grado de resistencia a las fuerzas tensionales, le confieren a la célula protección contra
las tensiones mecánicas asociadas con el estiramiento. De hecho, son los elementos más
resistentes y estables del citoesqueleto.
Las diferencias en la estructura primaria son la base de la existencia de los diferentes
tipos de FI, cada uno de ellos con perfiles particulares de expresión celular y tisular y
posibilidades de regulación e interacción molecular. En base a estas diferencias es que se
los clasifica (Tabla 7).
Además, de las proteínas que forman la estructura principal de los FI, existen distintos
tipos de proteínas accesorias que estabilizan su extructura, los refuerzan y unen a otros FI
por medio de uniones cruzadas entre haces de filamentos para formar así una red resistente.
En las neuronas, las principales proteínas de FI expresadas son las de los neurofilamentos
(Nf). Los Nf se ensamblan a partir de la reunión de tres proteínas que pertenecen a la clase
IV (son, por ello, heteropolímeros). Las proteínas de Nf se clasifican en base a su PM y son:
los livianos (Nf-L o Nf-68), los medianos (Nf-M o Nf-160) y los pesados (Nf-H o Nf-200)
El ensamblaje de los Nf comienza con la reunión primaria de subunidades de la proteína
Nf-68 sobre la que se depositan luego, en menor proporción, los Nf-160 y Nf-200. In vivo,
los Nf estructuralmente maduros están compuestos, mayoritariamente, por una relación
estequiométrica de 7:3:2 (para los Nf-68, -160 y -200, respectivamente). En cambio, en las
neuronas en desarrollo, en regeneración o afectas de alguna enfermedad se pueden observar
78
Introducción
otras proporciones estequiométricas. Así, generalmente se acepta que la expresión de los
Nf-68 predominan durante el desarrollo y en los fenómenos de regeneración (Hoffman et
al., 1987; Hoffman y Cleveland, 1988) en tanto que los Nf-200 son característicos de las
neuronas maduras (Nixon y Sihag, 1991).
Tabla 7. Clasificación de las proteínas de los filamentos intermedios:*
Ubicación
celular
Tipo
de FI
Proteína de FI
PM
I
Queratinas ácidas (> 25 tipos)
40-64
II
Queratinas neutras o básicas (> 25
tipos)
53-67
III
Citoplasma
IV
Núcleo
V
Citoplasma
VI
Distribución tisular
principal
Células epiteliales
Vimentina
54
Células de origen mesenquimático, células de la glía radial
Desmina
53
Miocitos
Proteína gliofibrilar ácida (GFAP)
50
Astrocitos
Periferina
57
Neuronas periféricas y centrales
Neurofilamentos:
- livianos (Nf-L o Nf-68)
- medianos (Nf-M o Nf-160)
- pesados (Nf-H o Nf-200)
68
160
200
"-Internexina
66
Proteínas de lámina nuclear:
- Lámina A
- Lámina B
- Lamina C
70
67
60
Nestina
240
Neuronas
Todas las células nucleadas
(formando parte de la envoltura
nuclear)
Células madre del SNC,
heterogénea
* Modificado a partir de Alberts et al., 2006; Cooper, 2002; Karp, 2006.
Las subunidades de Nf-160 y Nf-200 poseen brazos laterales que se proyectan hacia fuera
del Nf desde las colas globulares del extremo carboxi-terminal. En los axones, estos brazos
laterales están fosforilados y los niveles de fosforilación son particularmente altos en los de
los Nf-200 (Ackerley et al., 2003; Huh et al., 2002). Una de las funciones postuladas para
los brazos laterales es que mantendrían un espaciado apropiado entre los Nf paralelos del
79
Introducción
axón (Karp, 2006). La fosforilación de esta región de los Nf-160 y -200 juega también un
papel fundamental en el proceso de ensamblaje/desensamblaje e influye asimismo en la
fosforilación de los mismos sitios adecuados en el dominio de la cola carboxi-terminal.67
Se sospecha que la fosforilación también puede jugar un rol en la formación de puentes
cruzados entre los Nf y de estos con los NTs y, de esta manera, enlentecer el transporte
axonal promoviendo la integración de las proteínas de los Nf a la red del citoesqueleto
neuronal. Por medio de estos procesos se controlaría el diámetro del axón y se estabilizaría
el citoesqueleto neuronal (Sihag et al., 2007). Contrariamente, la desfosforilación de los Nf200 incrementa mucho la tasa y extensión de la proteólisis de los Nf (Huh et al., 2002).
Durante el desarrollo o el establecimiento de nuevos circuitos neuronales, una vez que
una neurona ha extendido una neurita y establecido un contacto y, por ello, ha dejado de
crecer el axón en longitud, se incorporan los Nf al axón, le brindan soporte mecánico y este
crece notablemente en diámetro (Karp, 2006). La densidad de los Nf axonales es constante
en axones de distinto diámetro y el número de los Nf presentes en un corte transversal de
un axón determinado se correlaciona bien con el área de dicho corte. La densidad
relativamente constante de los Nf está estrechamente relacionada con la presencia de los
puentes laterales que parecen determinar el espaciado entre los Nf adyacentes. Así, los Nf
son los principales determinantes del diámetro axonal. A su vez, el diámetro axonal es uno
de los principales determinantes de la velocidad de conducción en los axones mielinizados
(Hoffman et al., 1987).
La enorme importancia que poseen los Nf en la estructura neuronal está dada por el
67
Una enzima importante, con capacidad fosforilatoria de los brazos laterales de los Nf-160 y y Nf-200, es
la PKC. El acceso de la PKC a los FI para fosforilarlos se puede ver inhibido por la unión previa a estos de
la S100B (cfr. ut supra Tabla 5: Funciones intra- y extracelulares de la S100B, establecidas al momento
actual).
80
Introducción
hecho, entre otras cosas, de que las alteración de la estructura de los Nf puede alterar el
transporte axonal lento, puede afectar la velocidad de conducción de ese axon o llevar a la
neurodegeneración (Huh et al., 2002). Por ello, una buena forma de evaluar la “salud” de
una neurona es por medio de la evaluación cualicuantitativa de sus Nf.
Como se puede observar en la Tabla 7, el FI propio y característico de los astrocitos
(equivalente en todo a los Nf de las neuronas), es la GFAP, un FI de tipo III que ya he
mencionado al hablar del cambio de fenotipo de cGR al fenotipo astrocitario y al describir
los astrocitos mismos. Nótese también que la vimentina es la principal proteína de los FI de
las cGR y, al igual que la GFAP, es un FI de tipo III.
En los astrocitos es la GFAP el principal determinante de la forma celular y de la forma
y grado de extensión de las prolongaciones citoplasmáticas que los caracterizan.
I.5.3.2. La proteína asociada a microtúbulos de tipo 2 (MAP-2):68
Además de las proteínas que forman a los NTs, los FIs y los MFs existe todo un gran
grupo de proteínas que se unen, principalmente, a los MTs (son, por ello, proteínas unidas
a los MTs). Así, por ejemplo, existen proteínas asociadas a los centrosomas, proteínas
motoras (como las kinesinas y las dineínas) y proteínas estructurales unidas a los MTs.
Entre estas últimas se cuentan las proteínas de ruptura (por ejemplo, la catanina-p60 y la
espastina), los factores catástrofe (por ejemplo, la stathmina), la doblecortina, y todo un gran
grupo de proteínas promotoras del ensamblaje de los MTs o, como se las denomina más
68
La mayor parte de los datos de esta subsección los he tomado de la excelente revisión de Sánchez et al.
(2000).
81
Introducción
frecuentemente, proteínas asociadas a MTs (MAPs, por las siglas en inglés de microtubule
associated proteins). Todos los miembros de las MAPs se unen a los MTs y, al hacerlo,
promueven su ensamblaje y estabilizan su estructura. De los varios tipos existentes de
MAPs, la MAP-2 y la proteína tau (J), y principalmente la primera, son especialmente
importantes en relación al presente trabajo.69
La MAP-2 se expresa en gran cantidad en el SNC aunque también se la encuentra en
otros tejidos. Dentro del SNC, las MAP-2 de alto PM (HMWMAP-2) se expresan
específicamente en las neuronas, en somas y dendritas, asociadas principalmente a los MTs
y en co-localización con la actina en las espinas dendríticas y en las densidades
postsinápticas; pueden estar presentes en el axón pero sólo en pequeñas cantidades, a punto
tal que, en general, a la inmunomarcación específica para la MAP-2 se la utiliza
habitualmente como marcador de dendritas. Las MAP-2 de bajo PM (LMWMAP-2), en
cambio, tienen una distribución más generalizada dentro de los distintos compartimientos
celulares de las neuronas y se las puede encontrar también en las células de la glía (aunque
en menor proporción).
Las distintas variantes de la MAP-2 varían también en su momento de aparición durante
el desarrollo, por lo que se supone que cada variante puede tener funciones temporalmente
diferentes.70
Se postula que la MAP-2 cumple, entre otras, con las siguientes funciones: i) está
implicada (y puede ser esencial) en el brotado y crecimiento de las neuritas y en el
69
Cfr. Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo) donde se detalla la estructura
de la MAP-2.
70
Así, por ejemplo, la MAP-2A se expresa mayormente en el cerebro adulto; la M AP-2B está presente a lo
largo de todo el desarrollo del SNC pero sus niveles disminuyen en el período postnatal temprano en la rata;
la MAP-2C se expresa en estadíos tempranos del desarrollo y luego en el adulto pero selectivamente en las
dendritas y somas; la M AP-2D se expresa en el cerebro de la rata sólo a partir de P5 (si bien que su ARNm
está presente desde antes, durante todo el desarrollo).
82
Introducción
establecimiento de la polaridad celular en las neuronas inmaduras, y en su mantenimiento
en la maduras; ii) interactúa con los MTs y, al hacerlo, incrementa su rigidez, los estabiliza
y da origen a polímeros microtubulares más largos; iii) estimula la formación de haces
microtubulares (no se sabe bien aún por cuál mecanismo, si por la unión cruzada de los MTs
por medio de la dimerización de la MAP-2 y/o por la rigidez inducida en los MTs); iv)
puede intervenir en (y regular) el transporte microtubular de organelas mediado por
proteínas motoras de manera diferencial en axones y dendritas; v) se puede unir, y parece
interactuar con los MFs de actina-F, aparentemente por medio de los mismos dominios por
los que se une a los MTs (TBD), especialmente en las espinas dendríticas durante la
sinaptogénesis; vi) puede unirse a los Nf, quizás por medio de un dominio particular,
distinto del TBD; vii) los cambios en sus niveles acompañan a las modificaciones
sinápticas y, por lo tanto, a las modificaciones en los circuitos sinápticos; viii) sus ciclos
de fosforilación y desfosforilación acompañan la dinámica sináptica (el establecimiento, la
consolidación y la modificación de las sinapsis).71
I.5.4.
El óxido nítrico y el sistema nitrérgico:
El óxido nítrico (NO; monóxido de nitrógeno) es un gas, una molécula difusible que
actúa, en el SNC, como un neurotransmisor volumétrico (Dawson et al., 1992; Dawson y
Snyder, 1994). Su síntesis se lleva a cabo a partir del aminoácido L-arginina en presencia
71
Es precisamente este mecanismo, la fosforilación/desfosforilación, el principal medio de control molecular
de su dinámica. Cfr. Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo) en donde se
detallan los modos de transducción de las cambiantes señales extracelulares en cambios estructurales del
citoesqueleto.
83
Introducción
de oxígeno molecular (O2) y NADPH, tetrahidrobiopterina, FMN y FAD como cofactores
enzimáticos (Fig. 20). La enzima que realiza la reacción biosintética es la óxido nítrico
sintetasa (NOS; E.C.: 1.14.13.39), una metaloenzima que posee un grupo prostético hemo
en el sitio catalítico y es Ca2+-calmodulina-dependiente. En los mamíferos existen tres
isoformas conocidas de la enzima: i) la isoforma neuronal o tipo I (nNOS) expresada
constitutivamente por determinadas neuronas en el SNC, codificada en el cromosoma 12;
ii) la isoforma inducible o tipo II (iNOS) expresada por los macrófagos y los microgliocitos
tras la inducción de su transcripción del cromosoma 17; y iii) la isoforma endotelial o tipo
III (eNOS) expresada constitutivamente por las células endoteliales y codificada en el
cromosoma 7 (Wang y Marsden, 1995).
Al NO se lo ha implicado en funciones
tan amplias y dispares como el desarrollo
del SNC, neuromodulación, neurotoxicidad,
plasticidad sináptica, potenciación a largo
plazo, enfermedades neurodegenerativas,
etc. (Black et al., 1999; Cerruti et al., 1995;
Fig ura 20. R eacción catalizada por la óxid o nítrico sintetasa
(N O S ) y biosíntesis del óxido n ítrico (N O ). B H 4: tetrahidrobiopterina; FM N : flavinm ononucleótico; FA D : flavina adenina dinucleótid o.
Dawson y Dawson, 1996; Liberatore et al., 1999; Lu et al., 1999; Roskams et al., 1994).
Durante el desarrollo prenatal, por ejemplo, funciona como un factor extrínseco de
diferenciación neuronal y como inhibidor de la neurogénesis en la adultez (Moreno-López
et al., 2004; Packer et al., 2003).
Las neuronas nitrérgicas están relacionadas con las serotoninérgicas tanto desde un punto
de vista morfológico (Johnson y Ma, 1993; Ramos et al., 2002; Tagliaferro et al., 2001;
Wang et al., 1995; Wotherspoon et al., 1994; Xu y Hökfelt, 1997) como funcional (Kaehler
84
Introducción
et al., 1999; Karolewicz et al., 2000; Sugimoto et al., 1999; Wegener et al., 2000) y por este
motivo se las considerará también en este trabajo. Un número importante de las neuronas
serotoninérgicas del NDR coexpresan galanina y la enzima nNOS y se proyectan
mayoritariamente al cuerpo estriado (Xu y Hökfelt, 1997). Por otro lado, en el Strt, muchas
terminales serotoninérgicas hacen contacto con neuronas productoras de NO que expresan
a la nNOS (neuronas medianas, sin espinas, GABAérgicas que coexpresan somatostatina
y neuropéptido Y); el Strt es una de las regiones anatómicas en las que existe una mayor
interacción entre ambos sistemas neurotransmisores.
Entrando en el terreno de las enfermedades y de la toxicología, se sabe que la acción de
algunas drogas neurotóxicas para el sistema serotoninérgico (como la cocaína y ciertas
anfetaminas sustituidas) podría estar en parte mediada por el NO (Tagliaferro et al., 2003;
Torres y Rivier, 1994; Zheng y Laverty, 1998). El NO puede alterar la actividad de distintas
proteínas y enzimas, entre ellas la TPH, la primera enzima (y limitante) de la biosíntesis de
la 5-HT (Kuhn y Arthur, 1997; Kuhn y Geddes, 1999). Por otro lado, los niveles de
expresión de la nNOS y la iNOS pueden verse alterados tras la depleción de los niveles
cerebrales de 5-HT (Ramos et al., 2002; Tagliaferro et al., 2001, 2003). Tras la isquemia
cerebral focal se han observado alteraciones de las neuronas que expresan a la nNOS (Zhang
et al., 1994); se han observado también neuronas nitrérgicas citomegálicas en el Strt tras la
asfixia perinatal (Loidl et al., 1997) y alteraciones del sistema nitrérgico en las enfermedades
de Parkinson y de Alzheimer (Duncan y Heales, 2005). In vitro, la S-100B es capaz de
estimular la producción de NO, probablemente por medio de un efecto iNOS-dependiente
(Hu et al., 1996; Hu y Van Eldik, 1999). El NO, si está presente en el medio en altas
concentraciones por efecto de la S100B, puede inducir muerte celular apoptótica tanto en
85
Introducción
neuronas (Hu et al, 1997; Hu y Van Eldik, 1999) como en astrocitos (Hu y Van Eldik,
1996).
Como se ve, hay una relación de dos vías entre el sistema nitrérgico y el serotoninérgico
en el que cada uno puede verse alterado a consecuencias de la alteración concomitante del
otro.
* * *
Es evidente la interrelación que existe entre el sistema nitrérgico y el serotoninérgico por
un lado y, por otro lado, entre el sistema nitrérgico y los astrocitos y el serotoninérgico y los
astrocitos; más aún, el sistema serotoninérgico y los astrocitos se relacionan con el
citoesqueleto neuronal y glial por medio de la S100B. Estas interrelaciones neurogliales
comienzan tempranamente durante el desarrollo prenatal y continúan en el desarrollo
postnatal temprano y tardío, durante la infancia, adolescencia y durante la adultez también.
Por lo tanto, es probable que ante injurias de distintos tipos estos elementos
interrelacionados se vean afectados de un modo u otro. Es lo que nos proponemos estudiar
en este trabajo, en el caso de que se administre EtOH a un animal en distintas etapas del
desarrollo de su SNC.
86
Hipótesis
y Objetivos
“Las preguntas superficiales siempre encuentran una respuesta. Las preguntas profundas
generan nuevas preguntas.”
Refrán del Budismo Zen.
“Sabio no es aquel que da las respuestas correctas, es el que hace las preguntas correctas.”
Claude Lévi-Strauss (1908- )
II.1. Consideraciones generales acerca del alcoholismo materno-fetal, el sistema
serotoninérgico, los astrocitos y la proteína S100B y el sistema nitrérgico:
Hasta el momento previo a iniciarse los experimentos originales que se exponen en el
presente trabajo se sabía, a grandes rasgos, lo siguiente acerca del efecto del AMF sobre el
desarrollo pre- y postnatal del cerebro en general, y sobre los sistemas serotoninérgico y
nitrérgico y los astrocitos y la S100B en particular.
Durante el desarrollo prenatal, el EtOH es capaz de alterar los mecanismos
neurogenéticos y provocar así la aparición de displasias corticales por alteración de los
mecanismos corticogenéticos (Miller, 1986). También en la adultez puede alterar la
neurogénesis en el giro dentado de la formación del hipocampo (Herrera et al., 2003).
Existe mucha evidencia que indica que durante la EPE el sistema serotoninérgico es uno
de los principales sistemas de neurotransmisores que se ven afectados (Rathbun y Druse,
1985; Sari et al., 2001). Sobre el sistema serotoninérgico varios son los efectos que se han
demostrado de la EPE; entre muchos otros, los siguientes: i) la inducción de una notable
reducción de la 5-HT cerebral, especialmente en la corteza, el cerebelo y el tronco del
encéfalo (Rathbun y Druse, 1985); ii) el retardo en la migración y en el desarrollo de las
neuronas serotoninérgicas (Zhou et al., 2001); iii) la disminución del número de las
neuronas serotoninérgicas en los núcleos del rafe mesencefálico (NDR y NMR) en
desarrollo (Tajjudin y Druse, 1999); iv) la reducción de los niveles de los receptores 5-HT1A
88
Hipótesis y Objetivos
en el tronco del encéfalo y en distintas regiones de la CC, el Hipp y el septum lateral (Kim
et al., 1997); v) la disminución de los sitios transportadores de 5-HT (5-HTT) en distintas
regiones corticales (Druse y Paul, 1989; Druse et al., 1991); vi) la alteración de la expresión
de la proteína S-100B y de otros factores neurotróficos (Sari et al., 2001; Tajjudin y Druse,
1989, 1999). También se han registrado alteraciones en las cGR, en los astrocitos, y en el
cambio de fenotipo normal de unas a otros (Fletcher y Shain, 1993; Goodlett et al., 1993;
Miller y Robertson, 1993; Vallés et al., 1996, 1997).
El EtOH, según se ha demostrado en múltiples trabajos, puede ejercer efectos diversos
(y, lo que es muy importante, incluso contradictorios) sobre el desarrollo del cerebro
dependiendo del/los período/s durante el/los que actúe, dependiendo también del patrón del
exposición al EtOH (contínuo o intermitente), de la vía de administración del tóxico y de
los niveles de alcoholemia alcanzados (Ahluwalia et al., 2000; Bonthius y West, 1988).
En los seres humanos adultos el EtOH produce efectos deletéreos en el cerebro y la
mente que se conocen desde hace ya mucho tiempo.1 En animales adultos (humanos o no),
al igual que durante el desarrollo, el EtOH también puede provocar efectos neurotóxicos
en el sistema serotoninérgico; así, puede: i) dañar los principales núcleos serotoninérgicos
y provocar degeneración de sus axones y de las terminales axónicas distales (Halliday et
al., 1995); ii) provocar o no la pérdida de neuronas en los NDR y NMR (dependiendo de
la cantidad y de la duración de la ingesta alcohólica y de la presencia o no del síndrome de
Wernicke-Korsakoff) (Baker et al., 1996a, 1996b; Berggren et al., 2002; Halliday et al,
1993); iii) disminuir los niveles cerebrales de 5-HT (Lovinger, 1999); iv) alterar el patrón
de descarga eléctrica de las neuronas del NDR (Pistis et al., 1997); v) disminuir la
1
Cfr., por ejemplo, Korsakoff, 1890; Magnan, 1871; Marchiafava y Bignami, 1903; W ernicke, 1881.
89
Hipótesis y Objetivos
distribución y la densidad del 5-HTT en la corteza anterior del cíngulo (áreas 24, 25, 32 y
35 de Brodmann -áreas corticales límbicas-) (Mantere et al., 2002).
A pesar de la existencia de una gran cantidad de datos sobre los efectos que tiene el
EtOH sobre el sistema serotoninérgico en el feto y en el adulto, en los animales
adolescentes casi no existen datos concernientes a este respecto y no los hay desde el punto
de vista mofológico. Tampoco hay datos sobre el EtOH y el sistema nitrérgico y los
citoesqueletos neuronal y astroglial. Sin embargo, en los adolescentes, tanto sean seres
humanos o ratas, sí se sabe que el EtOH provoca respuestas conductuales diferentes en
relación con lo que se ve en los adultos. Los adolescentes se acomodan más fácil y
rápidamente a la presencia del EtOH en su medio interno (Doremus et al., 2003; Spear,
2000). Las ratas adolescentes muestran menos signos de ansiedad ante la abstinencia aguda
en la prueba del laberinto elevado en cruz (Doremus et al., 2003), en la prueba de campo
abierto (Slawecki y Roth, 2004) o en pruebas de interacción social (Varlinskaya y Spear,
2004). Además, tienen una resistencia relativa al compromiso motor y a los efectos
sedativos del EtOH (el inicio de la sedación suele ser más lento y de menor magnitud) pero
parecen ser más sensibles que los adultos a las alteraciones en el aprendizaje y en la
memoria espacial (funciones conductuales que dependen de la integridad del Hipp)
(Markwiese et al., 1998; Spear, 2000; White y Swartzwelder, 2004). La exposición crónica
de las ratas adolescentes al EtOH induce alteraciones a largo plazo en sus funciones
congnitivas (Osborne y Butler, 1983). La administración aguda de EtOH inhibe la
neurotransmisión glutamatérgica NMDA-dependiente en el Hipp, más fuertemente durante
la periadolescencia que en la adultez (White y Swartzwelder, 2004). Diferentes regiones
corticales (zonas olfatorias, la porción anterior de la corteza piriforme y entorrinal) son
90
Hipótesis y Objetivos
vulnerables a los efectos del EtOH solo en las ratas adolescentes y no en las adultas (Brown
y Tapert, 2004; Crews et al., 2000). También en las ratas, la exposición a niveles
intermitentes breves pero altos de EtOH durante la adolescencia (P35-P40), parecería
inducir cambios persistentes a largo plazo en los efectos de nuevas dosis agudas de EtOH
sobre la actividad eléctrica cortical registrada con el EEG; dado que estos cambios no se
ven en condiciones basales se ha especulado con que los cambios neuroadaptativos que
normalizaron la función neurofisiológica tras la exposición al EtOH, indujeron cambios
“latentes” en los mecanismos neurobiológicos que regulan la respuesta EEG al EtOH
(Slawecki, 2002).
II.2. Hipótesis:
El tejido nervioso en general, y el SNC en particular, son muy sensibles al daño
provocado por distintos tóxicos en todas las edades de la vida aunque con distinto grado de
sensibilidad según la edad particular que se considere. Es harto y de antiguo sabido que el
EtOH en altas dosis es capaz de provocar daños severos y evidentes en los animales adultos
y más aún en los adolescentes, infantes y, mucho más aún, en los que se encuentran en su
desarrollo prenatal. Sin embargo, considerados el SNC y el EtOH a la vez, en virtud de la
especial sensibilidad de uno y los múltiples mecanismos farmacocinéticos y
farmacodinámicos del otro, es lícito emitir la hipótesis de que la administración de la droga
por períodos prolongados (administración crónica), incluso a bajas dosis, será capaz de
provocar distintos tipos de daños. Es probable que esto sea así en los distintos momentos
91
Hipótesis y Objetivos
vitales del desarrollo (pre- y postnatal) y, lógico es suponer, que el daño (si existiere) sea
mayor cuanto más inmaduro sea el organismo pero que, al mismo tiempo, la capacidad de
recuperación espontánea o de prevención de tal daño sea (a la inversa) menor cuanto más
maduro o diferenciado esté el SNC del animal intoxicado.
Así pues, para el presente trabajo, y en relación con las relaciones neuro-gliales y el
sistema serotoninérgico y su relación con el desarrollo, en general del SNC y con la
corticogénesis en particular, hube de manejarme atento a las siguientes hipótesis referidas
a la experimentación con animales de laboratorio:
I)
el EtOH administrado por una vía fisiológica (la oral) a hembras preñadas induce
daños evidentes a las relaciones neurogliales que tienen como centro al sistema
serotoninérgico, incluso si el tóxico fuere administrado a bajas dosis incapaces de
por sí de inducir manifestaciones conductuales visibles en las madres y que
constituirían, parcialmente, un correlato experimental de los observado y descripto
en los seres humanos como Trastornos del Neurodesarrollo Relacionados con
Alcohol (ARND);
II)
el bajo grado de exposición prenatal al EtOH es incapaz de inducir alteraciones
estructurales groseras (displasias corticales, entre ellas) aunque sí, acaso,
ultraestructurales y más aún en la expresión de distintas moléculas marcadoras de
las relaciones neuro-gliales; sin embargo, en virtud del bajo grado de exposición
es esperable que el daño sea, también, leve;
III)
si se provocare un daño leve en las relaciones neuro-gliales por la exposición prenatal
de bajo grado al EtOH, es probable que, en virtud de la alta plasticidad de los
animales jóvenes, el daño sea reparado total o parcialmente durante el crecimiento
y desarrollo;
IV)
si se provocare un daño prenatal en las relaciones neuro-gliales que tienen como
centro al sistema serotoninérgico, tal que no se recuperaren espontáneamente, es
probable que se lo pueda prevenir por métodos farmacológicos por medio de, por
92
Hipótesis y Objetivos
ejemplo, la administración de una droga que actúe reforzando la acción de tal
sistema “dañado”;
V)
el daño provocado por la exposición de animales adolescentes a bajos niveles de
EtOH provocará daños presumiblemente leves pero ciertamente evidentes (si los
provocare) en las relaciones neuro-gliales que, en virtud de la aún presente
plasticidad del cerebro joven, es probable que se recuperen espontáneamente, total
o parcialmente, tras la abstinencia prolongada;
VI)
el daño provocado por la exposición de animales adultos a bajos niveles de EtOH (si
lo provocare), en virtud de lo ya diferenciado y maduro del tejido nervioso, será
de grado leve pero ciertamente evidente sobre las relaciones neuro-gliales que
tienen como centro al sistema serotoninérgico.
II.3. Objetivos:
Con la finalidad de confirmar o refutar las hipótesis anteriores se fijaron los siguientes
objetivos generales y específicos.
II.3.1.
Generales:
Los objetivos generales que nos fijamos para el presente trabajo experimental son los
que se detallan a continuación:
I)
Desarrollar un método experimental de administración del EtOH a ratas Wistar, que
cumpla con los siguientes requisitos:
93
Hipótesis y Objetivos
a. que sea de administración por vía oral, en el agua de bebida;
b. que sea compatible con su uso en animales de distintas edades y sexo;
c. que no modifique el estado nutricional de los animales durante y después de la
exposición;
d. que no modifique los parámetros gestacionales más importantes al implementarlo
en hembras preñadas (incremento de peso gestacional materno, número de crías
por camada, relación machos/hembra, peso de las crías al nacer);
e. que genere bajos niveles de alcoholemia en todos los animales, sean estos de la
edad y sexo que fueren.
II)
Desarrollar protocolos experimentales que permitan evaluar los efectos de la
alcoholización crónica de bajo nivel sobre las relaciones neuro-gliales en varios
períodos del desarrollo del SNC:
a. protocolo de exposición prenatal al EtOH;
b. protocolo de exposición al EtOH durante la adolescencia;
c. protocolo de exposición al EtOH durante la adultez.
III)
Generar en el protocolo de exposición prenatal al EtOH un modelo
experimentalmente válido en animales de laboratorio de los Trastornos del
Neurodesarrollo Relacionados con el Alcohol (ARND) que se observan en el ser
humano.
IV)
Evaluar el daño (si existiere) de las relaciones neuro-gliales que tienen como centro
al sistema serotoninérgico, en animales de cada uno de los protocolos de exposición
al EtOH, por medio de métodos de microscopía óptica (observación cualitativa,
morfometría en experimentos de ICQ con marcadores neuronales —TPH, 5-HT, 5HTT, Nf-200, MAP-2 y nNOS— y gliales —GFAP y S-100B —), de microscopía
electrónica y/o conductuales, según correspondiere o se evaluare pertinente en cada
caso.
V)
Evaluar el daño (si existiere), por los métodos morfométricos del punto anterior, en
los núcleos mesencefálicos fuente de la inervación serotoninérgica distal (es decir,
el NDR y el NMR) y en las correspondientes áreas prosencefálicas por ellos
inervadas (es decir, CA1 Hipp, Strt y CxF).
VI)
Comparar los tipos y/o patrones de daño (si existire) en las relaciones neuro-gliales,
94
Hipótesis y Objetivos
en los distintos grupos etarios provocados por la exposición crónica leve al EtOH.
II.3.2.
Específicos:
Los objetivos específicos fijados para el presente trabajo experimental son los que se
detallan a continuación:
I)
En el protocolo de exposición prenatal al EtOH:
a. lograr el desarrollo de crías de ratas Wistar bajo condiciones tales que sean
expuestas al EtOH durante todo el período de desarrollo de su SNC (pre- y
postnatal, teniendo en cuenta que en las ratas el período de desarrollo prenatal
corresponde a los dos primeros trimestres del desarrollo gestacional humano y que
los primeros 14 días su de vida postnatal equivalen, aproximadamente, al tercer
trimestre gestacional humano);
b. evaluar minuciosamente los parámetros de salud gestacional en las hembras
preñadas y de los fetos al nacer y durante su desarrollo postnatal, durante la niñez
y adolescencia, hasta la adultez;
c. evaluar cualitativamente, por medio de la observación con microscopía óptica, la
citoarquitectura del SNC en general, y la neocortical en especial, en las crías
sometidas a EPE;
d. evaluar cuali- y cuantitativamente, por medio de la observación con microscopía
óptica y la morfometría, en experimentos de ICQ, la presencia o ausencia de
cambios en la expresión de distintos marcadores neuronales y gliales en las área
especificadas ut supra en los objetivos generales;
e. evaluar, en crías postnatales tempranas y tardías, la presencia o ausencia de
alteraciones ultraestructurales en las neuronas de áreas prosencefálicas por medio
de la utilización de la microscopía electrónica de transmisión;
f. administrar buspirona (una droga agonista parcial de los receptores 5-HT1A) a las
hembras gestantes concomitantemente con el EtOH, en un subprotocolo ad hoc
95
Hipótesis y Objetivos
(denominado protocolo de exposición prenatal al EtOH con prevención del daño
por la administración de buspirona), con la finalidad de evaluar, por microscopía
óptica en experimentos de ICQ, la posibilidad de prevenir el daño provocado por
el EtOH;
g. evaluar, en crías ya adultas sometidas a EPE, dos parámetros conductuales
(motilidad y ansiedad ante la exposición a un ambiente novedoso) en caso de que
la evaluación de la estructura cerebral en los experimentos del punto anterior
hubieran arrojado diferencias significativas;
II)
En el protocolo de exposición al EtOH durante la adolescencia:
a. exponer crónicamente al EtOH a ratas Wistar en su adolescencia tardía;
b. evaluar el daño (si existiere) de las relaciones neuro-gliales, por métodos
morfométricos de microscopía óptica en experimentos de ICQ, en áreas
mesencefálicas y prosencefálicas, en las ratas adolescentes inmediatamente
después de la exposición;
c. evaluar (si se verificare daño en la evaluación del punto anterior) la presencia o
ausencia de capacidad de recuperación espontánea por medio de la simple
abstinencia tras exposición crónica al EtOH.
III)
En el protocolo de exposición al EtOH durante la adultez:
a. evaluar el daño (si existiere) de las relaciones neuro-gliales, por métodos
morfométricos de microscopía óptica en experimentos de ICQ, en áreas
mesencefálicas y prosencefálicas, en las ratas adultas expuestas crónicamente a
bajos niveles de EtOH.
96
Materiales
y Métodos
“Quien trabaja sin método, trabaja en vano.”
Proverbio monástico .
III.1.
Materiales:
El EtOH que se administró a los animales era de grado analítico (Merck KgaA;
Darmstadt, Germany).
La buspirona utilizada (clorhidrato de N-[4-[4-(2-pirimidinil)-1-piperazinil]butil]-8azaspiro[4.5]decano-7,9-diona; PM: 421,96 Da; lote 101H0402) se adquirió a Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, EUA.
Para los experimentos de inmunocitoquímica (ICQ) se utilizaron los siguientes
anticuerpos primarios:
i)
anti-TPH (anti-triptófano hidroxilasa; anticuerpo monoclonal de ratón; Sigma;
clon WH-3, lote 105H4831);
ii)
anti-5-HT (anti-serotonina; anticuerpo policlonal de conejo; desarrollado
previamente, por la Prof. Dra. Alicia Brusco; ver Brusco et al., 1983);
iii)
anti-5-HTT (anti-transportador de serotonina; anticuerpo monoclonal de ratón;
adquirido a Chemicon International; Temecula, CA, EUA; clon VBS1; lote
18111727);
iv)
anti-GFAP (anti-proteína gliofibrilar ácida; anticuerpo policlonal de conejo antivaca; adquirido a Dako Corp.; Glostrup, Denmark; lote 096, edición 05.07.00);
v)
anti-S100B (anti-proteína S100B; anticuerpo monoclonal de ratón; Sigma; clon
SH-B1, lote 099H4812);
vi)
anti-Nf-200 (anti-neurofilamentos de 200 kDa; anticuerpo monoclonal de ratón;
Sigma; clon N52, lote 90K4843);
98
Materiales y Métodos
vii) anti-MAP-2 (anti-proteína asociada a microtúbulos tipo 2; anticuerpo monoclonal
de ratón dirigido contra los tres tipos de MAP-2 de alto PM [es decir, MAP-2A,
MAP-2B y MAP-2C]; Sigma; clon HM-2, lote 053K4838);
viii) anti-nNOS (anti-óxido nítrico sintetasa; anticuerpo monoclonal de ratón; Sigma;
clon NOS-B1, lote 60K4885);
Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios:
i) anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con biotina (Sigma; lote 078H9161) para
los casos en los que se utilizaron anticuerpos primarios policlonales de conejo;
ii) anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con biotina (Sigma; lote 078H9060) para
los casos en los que se utilizaron anticuerpos primarios monoclonales de ratón.
Finalmente, en el último paso de la técnica ICQ se utilizó un complejo de avidinaperoxidasa (Extravidin®-Peroxidase; Sigma; lote 103K4840). En el paso de revelado de la
reacción enzimática se usó tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobenzidina (Sigma; lote
65H0170), sulfato amónico de níquel (Carlo Erba Reagenti; Milano, Italia) y peróxido de
hidrógeno (H2O2; Merck KgaA).
Para realizar los cortes ultrafinos para microscopía electrónica, el tejido fue incluído en
el medio de inclusión Durcupan (Fluka AG, Chemische Fabrik, Buchs SG, Switzerland).
Todas las otras sustancias químicas utilizadas eran de grado analítico.
III.2.
Métodos:
III.2.1. Método utilizado de administración de etanol:
99
Materiales y Métodos
En todos los protocolos que se detallan más abajo se utilizó el método de administración
de EtOH en el agua de bebida a una concentración de 6,6% (v/v).1
En la elección de este modelo se tuvieron en cuenta, como factores decisivos, las
siguientes ventajas y hechos:
i)
la vía de administración oral, que es fisiológicamente semejante al consumo
humano;
ii)
la ausencia de generación de estrés con la utilización de esta vía de administración
(a diferencia de lo que sucede, por ejemplo, en la administración intrabucal o
intragástrica por sonda orogástrica o por gastrostomía, o en la inyección
intraperitoneal);
iii)
la facilidad de preparación de la solución de EtOH;
iv)
la economía del método en estudios a largo plazo;
v)
la posibilidad cierta y conocida de inducir bajas alcoholemias concomitantemente
a una baja capacidad para provocar signos conductuales de intoxicación aguda o
crónica durante el período de administración y de signos conductuales de
abstinencia aguda ante la retirada brusca;
vi)
para los estudios que se habrían de llevar a cabo no era necesario bajo ningún
aspecto asegurarse la producción de lesiones hepáticas por lo que se podía
prescindir de la utilización de dietas líquidas, mucho más onerosas;
vii) la existencia de antecedentes ciertos y conocidos acerca de que con este método
de administración, a concentraciones levemente mayores (10% v/v) se obtienen
concentraciones de EtOH clínicamente relevantes en el líquido extracelular del
SNC (Nurmi et al., 1999); y que
viii) en estudios previos similares, con administración del EtOH en dieta líquida y con
la utilización de igual concentración que la aquí elegida, se obtuvieron importantes
alteraciones en la corticogénesis (Miller, 1986).
1
Cfr. Anexo III (M étodos experimentales de exposición de animales al etanol. Ventajas y desventajas de
cada uno).
100
Materiales y Métodos
III.2.2. Metodología general del tratamiento de los animales:
III.2.2.1.
Origen, alojamiento:2
Según el protocolo experimental de que se tratara, se utilizaron animales machos y/o
hembras de ratas noruegas de la cepa albina Wistar (Rattus norvegicus; Hsd: WI) de
distintas edades postnatales.
Los animales se adquirieron en el bioterio central de la Facultad de Farmacia y
Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires o se obtuvieron por cría directa en el
bioterio del Instituto de Biología Celular y Neurociencias de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Buenos Aires.
Durante los períodos experimentales, todos los animales utilizados fueron mantenidos
en el mismo ambiente: ciclo luz-oscuridad de 12:12 hs (las luces se apagaban a las 18:00
hs), en una habitación bien ventilada, con temperatura y humedad controladas (20 ± 2ºC y
50-70%, respectivamente).
Los machos y las hembras no preñadas o en apareo fueron alojados, en grupos de 4 a 5,
en jaulas de acero inoxidable (44 cm de longitud × 31 cm de ancho × 20 cm de alto) con
camas de viruta de madera.
Cada día, entre las 09:00 y las 11:00 hs (según se detalla más abajo), se calculó el
consumo de alimento y bebida, se repuso lo consumido y se pesó a cada animal utilizado,
fueran machos o hembras (preñadas o no), crías o adultos.
2
El tratamiento de los animales se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el Uso y Cuidado de los Animales
de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de EUA y con los principios presentados en la Guía para
el Uso de Animales en Investigación en Neurociencias de la Society for Neuroscience (SfN).
101
Materiales y Métodos
III.2.2.2.
Apareamiento, diagnóstico de preñez y cría:
En los protocolos experimentales en los que se requiría el apareo de animales para el
estudio postnatal de las crías se alojó, en cada jaula, a un macho adulto cada 2 a 4 hembras.
El diagnóstico de preñez se realizó por el estudio de una muestra de extendido vaginal
tomado cada mañana entre las 07:00 y las 09:00 hs. La toma de la muestra se realizó
instilando y aspirando dos o tres veces, con una pipeta Pasteur, 0,5-1,0 ml de solución
fisiológica tibia en el introito vaginal de cada hembra. Recogido el material en un
portaobjetos gelatinado, se lo examinaba inmediatamente, en fresco, con un microscopio
Zeiss Axiolab en busca de determinar la presencia de espermatozoides. El día en que se los
hallaba era considerado como el inicio de la gestación y se lo designaba día gestacional o
embrionario cero (E0).
Las hembras preñadas eran inmediatamente alojadas en forma individual en jaulas más
pequeñas, de acero inoxidable (30 cm de longitud × 18 cm de ancho × 18 cm de alto), con
camas de viruta de madera, para permitirles la construcción del nido y evitar fuentes de
estrés por la convivencia con el macho u otras hembras. El día del parto (E21 o E22) se
determinó el sexo de cada cría nacida viva o muerta (proceso de sexado) y se registró su
peso al nacer para controlar su crecimiento y desarrollo. Las camadas se redujeron siempre
a un tamaño de 10-12 animales para asegurar la adecuada alimentación de las crías lactantes
por parte de la madre. La reducción de las camadas se hizo a expensas de las hembras. La
reducción se llevaba a cabo por decapitación previa anestesia inhalatoria con éter o con
dióxido de carbono.
El día del nacimiento se consideró como día postnatal cero (P0). Hasta el momento del
102
Materiales y Métodos
destete, en P21, se mantuvo juntas a las crías con su madre en la misma jaula,
permitiéndoles que mamaran e interactuaran libremente. A las crías que se estudiaron más
allá de la edad P21 se las separaba por sexo ese día y se las alojaba en jaulas grandes, en
grupos de 3 a 5.
III.2.2.3.
Alimentación apareada:
A los animales se les ofreció alimento estándar para roedores de laboratorio (Alimentos
Pilar; SENASA Nº 02-014/A; Pilar, Buenos Aires, Argentina). Cada gramo de este
alimento provee 2,5 kCal de energía digestible.
En todos los protocolos experimentales que se detallan más abajo se llevó a cabo un
modo de alimentación tal que asegurara que las diferencias experimentales observadas no
se debieran a diferencias nutricionales sino a los efectos del EtOH exclusivamente. Este
modo de alimentación se denomina alimentación apareada. Es decir, es apareada ya que
a los animales del/los grupo/s control se les ofreció cada día, durante todo el período
experimental, una cantidad de alimento (en gramos) equivalente a las calorías que
incorporaron los animales del/los grupo/s tratado el día anterior. Por lo tanto, los animales
tratados iniciaron, siempre, el período experimental un día antes que los animales control.
Para calcular las calorías consumidas por los animales tratados se tuvieron en cuenta las
calorías aportadas por el alimento (2,5 kCal/g) y las calorías derivadas de la solución de
EtOH (7,07 kCal/g de EtOH; * = 0,789 g/ml). Así, cada día se calculó por diferencia el
peso del alimento consumido por los animales tratados durante el día anterior y se
103
Materiales y Métodos
calcularon las calorías incorporadas a partir de este. También por diferencia se calculó el
volumen de solución de EtOH consumida, la cantidad de EtOH consumida en mililitros y
en gramos y las calorías que aportaron. Sumadas las calorías del alimento y del EtOH se
ofrecían, entonces, estas mismas calorías (convertidas previamente a gramos) en forma de
alimento sólido a los animales control. Todos los cálculos se hicieron en base a la unidad
de peso corporal (el gramo, pero en beneficio de la claridad, en los resultados se informa
por kg de peso corporal).
III.2.2.4.
Bebida:
En todos los protocolos experimentales, para beber, a los animales del/los grupo/s
control se les ofreció agua. A los animales del/los grupo/s tratado se les ofreció siempre una
solución de EtOH 6,6% (v/v) en agua. A ambos grupos de animales se les permitió beber,
en todos los casos, ad libitum.
La solución de EtOH se preparaba cada día inmediatamente antes de ofrecer una ración
fresca. A fin de asegurar el consumo obligado del EtOH, a los animales que lo recibieron,
no se les permitió la posibilidad de elegir entre tomar agua o la solución de EtOH ya que
esta fue la única fuente de líquido con la que contaron. A los fines de asegurar la adaptación
gradual de los animales a la ingesta de EtOH, este fue incorporado al agua de bebida en
forma paulatina (en concentración de 1% el primer día, a 3,3% el segundo y tercer días y
recién a partir del cuarto día se incorporaba la concentración máxima de 6,6% (v/v) a usar
durante los períodos de intoxicación).
104
Materiales y Métodos
III.2.3. Protocolos experimentales:
Se llevaron a cabo cuatro protocolos experimentales distintos a los fines de estudiar los
efectos que tienen las bajas alcoholemias sobre el sistema serotoninérgico y la astroglía en
distintos momentos evolutivos del desarrollo cerebral: durante el desarrollo prenatal y,
durante la vida postnatal, en la adolescencia y la adultez.
III.2.3.1.
Exposición prenatal al etanol, sin prevención del daño:
En este primer protocolo experimental se utilizaron ratas hembra nulíparas que pesaban
221,9 ± 18,9 g (rango: 202,0-251,0 g; n = 10). A estas hembras se las dividió en dos grupos
cuyos pesos eran de 225,63 ± 16,2 g (rango: 202,0-238,5 g) para el grupo Control (n = 4)
y de 219,33 ± 21,5 g (202,5-251,0 g) para el grupo tratado (en adelante denominado grupo
EtOH; n = 6). Las medias de los pesos iniciales no diferían estadísticamente entre sí (P =
0,6342).
Las hembras EtOH fueron expuestas a la solución de EtOH durante las 6 semanas
previas al apareo3, durante las tres semanas de la gestación y en el período postparto hasta
el destete de sus crías 21 días más tarde. En total, el período de exposición materna crónica
al EtOH (EMCE) se prolongó durante 12 semanas (Cuadro 1), en tanto que sus crías
estuvieron expuestas transplacentariamente durante la gestación y por la leche de sus
3
Para permitir que se produjeran los cambios metabólicos propios del alcoholismo crónico. Cfr. sección I.3.1.
(Farmacocinética) en la Introducción y Anexo V (Métodos experimentales de exposición de animales al
etanol. Ventajas y desventajas).
105
Materiales y Métodos
madres durante todo el período de la lactancia.
Para
los
estudios
de
Período de exposición materna crónica al etanol (EMCE)
microscopía óptica (tinción con
azul de toluidina e ICQ con
distintos marcadores) se utilizó
el cerebro de las crías macho de
6 sem anas
Pregestacional
21 días
21 días
Gestacional
Lactancia
edad P21 y para los de
Inicio del
tratam iento
microscopía
electrónica
se
P reñez
(E 0)
P arto
(P 0)
Fijación
(P 21)
C uadro 1. C ronogram a de tratam iento del protocolo de exposición p renatal al
eta nol sin p revención d el d año.
utilizaron cerebros de crías
macho de edades P5 y P21.
III.2.3.2.
Exposición prenatal al etanol, con prevención del daño por administración
de buspirona:
En este protocolo experimental también se utilizaron ratas hembra nulíparas que pasaron
por un período de exposición al EtOH de 6 semanas previas al apareo. Los dos grupos
iniciales (Control y EtOH), a medida que las hembras eran preñadas, fueron subdivididos
en cuatro subgrupos experimentales. Dos subgrupos continuaron bebiendo agua
(denominados C) y dos EtOH (denominados E). A un subgrupo C y a un subgrupo E habría
de administrárseles la droga buspirona y a los otros, solución salina. De este modo,
quedaron conformados cuatro subgrupos: CS (control-salina, es decir, bebieron agua y se
les admnistraría solución salina), CB (control-buspirona), ES (EtOH-salina) y EB (EtOH-
106
Materiales y Métodos
buspirona). Al inicio del período gestacional las hembras de los cuatro grupos de este
protocolo presentaban pesos estadísticamente equivalentes (CS: 279,0 ± 8,485 g, n = 2; CB:
268,8 ± 26,52 g, n = 2; ES: 260,2 ± 32,27 g, n = 3; EB: 231,0 ± 3,54 g, n = 3).
Se preparó una solución de buspirona a una concentración 7,11 mM (3,0 mg/ml p/v) en
solución salina. Esta solución fue esterilizada por filtrado a través de filtros de nylon
descartables, con poros de 0,45 :m de diámetro (Advantec MFS, Inc.; modelo DISMIC
25NSO45AS; Dublin, CA, EUA). Desde el día E13 hasta el día E20, diariamente entre las
11:00 y las 12:00 hs, a las hembras CB y EB se les administró la buspirona en una dosis de
4,5 mg/kg/d (10,66 mmol/kg/d), por vía subcutánea. A los restantes subgrupos (CS y ES)
se les administró volúmenes equivalentes de solución salina, también por vía subcutánea.
El volumen inyectado en cada ocasión estuvo en el orden de los 0,4-0,6 ml, dependiendo
del peso gestacional, variable, de la hembra. La inyección se realizaba por inmovilización
suave de la hembra, con deprivación visual para minimizar el grado de stress, y
administración de la solución correspondiente en un pliegue de la piel laxa interescapular.
A diferencia del anterior protocolo, en éste, al momento del parto se discontinuó la
administración de EtOH en el agua de bebida. Así, las hembras fueron expuestas durante
9 semanas a la acción del tóxico y sus crías sólo durante el período gestacional,
transplacentariamente.
Para los estudios de microscopía óptica (ICQ con distintos marcadores) se utilizaron
crías macho de edades P5, P21, P35, P60 y P90. Para los estudios conductuales se
utilizaron crías macho y hembra de edad P90 de una segunda tanda experimental ad hoc
(Cuadro 2).
107
Materiales y Métodos
Período de EMCE
Período de administración de
BUSPIRONA 4,5 mg/kg/d via sc (E13-E20)
6 sem anas
Pregestacional
21 días
90 días
Gestacional
Postnatal
P5
Inicio del
tratam iento
P reñez
(E 0)
P arto
(P 0)
P 21
P 35
P 60
Fijaciones
P 90
E studios
conductuales
C uadro 2. C rono gram a del tratam iento del protocolo de E P E con prevención d el daño p or la adm inistración d e buspirona.
III.2.3.3.
Exposición al etanol durante la adolescencia con abstinencia posterior:
Se utilizaron 20 ratas macho de edades comprendidas entre P45 y P50 (adolescencia
tardía) que pesaban 194,1 ± 28,11 g (201,3 ± 23,4 g las asignadas al grupo Control, n = 10,
con un rango de 167,0-235,0 g y 186,9 ± 32,05 g las asignadas al grupo EtOH, n = 10, con
un rango de 146,0-230,0 g). Las diferencias de peso no eran estadísticamente significativas
(P = 0,2662).
Durante 6 semanas (42 días) los machos bebieron agua o la solución de EtOH.
Inmediatamente tras la finalización del período de exposición al EtOH, 5 machos del grupo
Control y otros 5 del grupo EtOH fueron fijados y sus cerebros procesados para realizar
los estudios de microscopía óptica (ICQ con distintos marcadores) en tanto que a los otros
5 machos de ambos grupos se los forzó a pasar por un período de recuperación de 10
semanas (70 días; Cuadro 3). Durante este período de recuperación los machos de ambos
grupos (Control/R y EtOH/R) continuaron bebiendo solamente agua con la finalidad de
108
Materiales y Métodos
estudiar si la abstinencia prolongada al EtOH, tras un consumo también prolongado,
permite la recuperación o no del daño provocado por la intoxicación leve y crónica. Una
vez finalizada la recuperación, los cerebros de los machos recuperados (ya adultos) de
ambos grupos fueron procesados de igual manera que sus homólogos a los que no se les
permitió pasar por la abstinencia tras la intoxicación.
6 sem anas con agua
Control
Fijación
6 sem anas con EtO H 6,6%
EtOH
6 sem anas con agua
10 sem anas con agua
Control/R
6 sem anas con EtO H 6,6%
10 sem anas con agua
EtOH/R
Período de exposición
Período de recuperación
C uad ro 3. C ronogram a de tratam ien to del p rotoco lo de e xp osición al etanol duran te la adolesce ncia con ab stinen cia p osterior.
III.2.3.4.
Exposición al etanol durante la adultez:
Para este protocolo experimental se utilizaron 10 ratas macho adultas con pesos
comprendidos entre 250-300 g. Al grupo Control se asignaron 5 animales y otros tantos
al grupo EtOH. Como es habitual, el grupo Control bebió agua y el grupo EtOH bebió la
solución de EtOH durante 6 semanas, al cabo de las cuales sus cerebros fueron procesados
para realizar los estudios de microscopía óptica correspondientes (ICQ con distintos
marcadores).
109
Materiales y Métodos
III.2.4. Evaluación conductual de la intoxicación y la abstinencia:
En los cuatro protocolos experimentales llevados a cabo, diariamente se evaluó el grado
de intoxicación de las ratas expuestas, macho y hembra (preñadas o no), adultas o crías, por
medio de dos escalas conductuales (Nixon y Crews, 2004; Slawecki, 2002). Las
puntuaciones obtenidas se correlacionaron con los niveles de alcoholemia medidos en
machos, hembras y crías de los distintos protocolos.
La escala de Slawecki (modificada a partir de Freund, 1969) consta de los siguientes parámetros
conductuales y su correspondiente puntuación:
- sin efectos conductuales visibles:
0
- notablemente calmo, con hipotonía durante la manipulación:
1
- ataxia leve con marcha rápida:
2
- compromiso de la marcha, el animal cae hacia un lado:
3
- gran hipotonía, inmóvil en el suelo:
4
La escala de Nixon y Crews (tomada a su vez de Penland et al., 2001) que permite evaluar grados mayores
de intoxicación, consta de los siguientes parámetros conductuales y su correspondiente puntuación:
- normal:
0
- hipoactivo:
1
- ataxia:
2
- ataxia + arrastre del abdomen por el piso y/o lentificación del reflejo de enderezamiento:
3
- pérdida del reflejo de enderezamiento:
4
- pérdida del reflejo corneal:
5
En los protocolos en los que se suprimió bruscamente la administración de EtOH se
evaluaron los signos de abstinencia aguda por medio de una escala de abstinencia tomada
de Penland et al. (2001) quienes a su vez la modificaron a partir de Majchrowicz (1975).
Esta escala consta de los siguientes signos conductuales y su correspondiente puntuación:
- neutralidad:
- hiperactividad general:
- temblor de la cola:
- espasticidad de la cola:
- temblor de la región caudal:
- miembros abiertos y extendidos hacia fuera:
- temblor generalizado:
- temblor cefálico:
0
1,0
1,4
1,6
2,0
2,4
2,6
3,0
110
Materiales y Métodos
-
episodios de carrera inducida:
sacudidas de secado (wet shakes):
castañeteo de dientes:
convulsiones espontáneas:
muerte:
3,2
3,4
3,6
3,8
4,0
III.2.5. Determinación de la alcoholemia:
En cada uno de los cuatro protocolos experimentales se midieron los niveles de
alcoholemia alcanzados por los animales durante la exposición al EtOH. Se realizaron
mediciones:
i)
en las hembras expuestas durante la gestación (sangre tomada de la vena de la cola
o del tronco, obtenida por decapitación previa anestesia con dióxido de carbono),
ii)
en las crías al momento de nacer (sangre del tronco, obtenida por decapitación
previa anestesia con dióxido de carbono), y
iii)
en los machos adolescentes y adultos expuestos al momento de la fijación (sangre
obtenida de la cavidad ventricular izquierda del corazón al momento de la
fijación).
A modo de control, también se tomaron muestras de sangre (aleatoriamente) de algunos
animales pertenecientes a los grupos Control.
Las muestras se tomaron en tubos heparinizados, tipo Eppendorf de 0,5 o de 2,0 ml. La
sangre se centrifugó a temperatura ambiente durante 10 minutos a 3000 rpm en una
microcentrífuga ECYS; se separó el plasma y se envió para la determinación bioquímica
a la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de
la Universidad de Buenos Aires.
111
Materiales y Métodos
La determinación de la alcoholemia se llevó a cabo por el método enzimático de la
NAD/NADH, cuya sensibilidad es $ 0,1 mg/dl (= 21,7 :M).
III.2.6. Estudios de microscopía:
III.2.6.1.
Fijación de los animales y procesamiento de los cerebros:
En las edades correspondientes a lo ya detallado en cada protocolo experimental, se
anestesió profundamente a los animales con una inyección intraperitoneal de hidrato de
cloral en dosis de 300 mg/kg. Como parámetro de profundidad de la anestesia se tomó el
reflejo corneal.
Tras realizar una toracotomía, a cada animal se lo perfundió a través del ventrículo
izquierdo del corazón, inicialmente con 30-60 ml de una solución salina fría conteniendo
0,05% (p/v) de NaNO2 (nitrito de sodio; como vasodilatador) más 1% (v/v) de heparina
5000 UI/ml (como anticoagulante) y posteriormente con 300 ml de una solución fijadora
fría de 4% (p/v) de paraformaldehído y 0,25% (v/v) de glutaraldehído en solución
amortiguadora de fosfato 0,1 M, pH 7,4. De cada animal se abrió el cráneo, se extrajó el
cerebro y se lo mantuvo sumergido en la misma solución fijadora fría durante otras 4 hs
(período de postfijación). Luego, se lavó cada cerebro tres veces en solución amortiguadora
de fosfato 0,1 M, pH 7,4 con sacarosa 5% (p/v) y se lo dejó en esta solución lavadora
durante 18 hs a 4ºC.
Los cortes de los cerebros (espesor de 40–50 :m) se realizaron con un vibrátomo Oxford
112
Materiales y Métodos
Vibratome Series 1000. Se realizaron cortes coronales del mesencéfalo y sagitales del
prosencéfalo. Hasta su utilización en los experimentos de ICQ, los cortes se almacenaron,
en crioviales de 2,0 ml, a –20ºC, crioprotegidos en una solución de sacarosa 25% (p/v)
disuelta en solución amortiguadora de fosfato 0,1 M, pH 7,4.
III.2.6.2.
Selección de los cortes de tejido. Áreas cerebrales evaluadas:
Los cortes a utilizar en los experimentos de ICQ se seleccionaron en placas de Petri, en
flotación libre en solución amortiguadora de fosfato 0,1 M, pH 7,4 con sacarosa 5% (p/v),
bajo control visual con una lupa estereoscópica Wild Heerbrugg M5.
Para seleccionar los cortes se tuvieron en cuenta
estructuras anatómicas correspondientes a las
planchas 91-101 (para los cortes coronales
mesencefálicos)4 y a las planchas 169-174 (para los
cortes sagitales prosencefálicos)5 del atlas del
cerebro de la rata, de Paxinos y Watson (2007).
En
los
cortes
transversales
de
niveles
mesencefálicos se evaluaron los dos principales
núcleos serotoninérgico del rafe del grupo cefálico,
Figura 21. N úcleos serotoninérgicos del rafe en el
m esencéfalo d e la rata (fotocom p osición d e
im á g e n e s; in m u n o m a rcación para TP H ). S e
observan los núcleo s dorsal (N D R ), m ed ial (N M R ) y
ventral (N V R ). S e evaluaron los dos prim eros. A S : el
acueducto de S ilvio.
es decir, aquellos que inervan el prosencéfalo. Estos
4
Bregma: -6,96 a -8,16 mm; interaural: 2,04-0,84 mm.
5
Lateral: 1,90-3,20 mm.
113
Materiales y Métodos
núcleos son (Fig.21):6
i) el núcleo dorsal del rafe (NDR) y
ii) el núcleo medial del rafe (NMR).
En los cortes parasagitales prosencefálicos se evaluaron (Fig. 22):
i) el stratum radiatum del área CA1 de la formación del hipocampo (CA1 Hipp),
b) el cuerpo estriado o caudado-putamen (Strt), y
c) la corteza frontal (CxF).
F igu ra 22. Á reas estudiadas en los cortes p arasagitales d el p rosencéfalo. C xF: corteza frontal; Strt: cuerp o
estriado; C A 1 H ipp: stratum radiatum del á rea C A 1 d el hip ocam p o.
III.2.6.3.
Microscopía óptica:
6
La razón de estudiar estos núcleos se basa en las estructuras prosencefálicas inervadas por cada uno de ellos.
Cfr. ut supra, la sección I.5.1.2. (El sistema serotoninérgico) de la Introducción.
114
Materiales y Métodos
III.2.6.3.1. Coloración de Nissl:
Se seleccionaron cortes sagitales de cerebro para evaluar la citoarquitectura general de
las áreas prosencefálicas que habrían de ser estudiadas en los experimentos de ICQ, y
principalmente la de la CxF.
A los cortes seleccionados y montados sobre portaobjetos gelatinados se los coloreó con
una gota de una solución de azul de toluidina 0,1%, durante 20 a 30 segundos para obtener
una tinción suave. Inmediatamente se los lavó suavemente con agua destilada y, en caso de
que la coloración fuera demasiado oscura, se lo aclaró con alcohol 96º. Se los dejó desecar
al aire y se los cubrió con medio de montaje Permount y un cubreobjeto.
III.2.6.3.2. Inmunocitoquímica (ICQ):
En cada uno de los experimentos de ICQ realizados en cada protocolo experimental con
los cortes de cerebro de las ratas macho de distintas edades postnatales, el procedimiento
técnico fue el mismo que se detalla a continuación.
Los cortes de cerebro de cada uno de los grupos experimentales se procesaron en
flotación
libre,
simultáneamente,
en condiciones
estandarizadas
(para
cada
inmunomarcador, al mismo momento, el mismo día).
Para inhibir la actividad de peroxidasa endógena, los cortes se deshidrataron
previamente pasándolos por concentraciones crecientes de soluciones de EtOH (50-100%),
se los trató con H2O2 al 0,5% (v/v) en metanol durante 30 minutos y se los rehidrató
115
Materiales y Métodos
pasándolos por soluciones de EtOH en concentraciones decrecientes. Luego se los lavó en
agua destilada y en una solución amortiguadora de fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 (PBS). Se
incubaron los cortes durante 1 hora en una solución “bloqueadora” de suero normal de
cabra 3% (v/v) más Triton X-100 0,5% (v/v) en PBS para bloquear los sitios inmunógenos
de unión inespecíficos y para permeabilizar los tejidos. Tras dos lavados con PBS más
Triton X-100 0,025% (v/v) (PBS-X), se los incubó durante 48 hs a 4ºC con anticuerpos
primarios dirigidos contra los distinos marcadores a explorar en cada caso particular,
diluídos en las siguientes proporciones:
- TPH
- 5-HT
- 5-HTT
- GFAP
1:1000
1:4000
1:1000
1:3000
- S100B
- Nf-200
- MAP-2
- nNOS
1:500
1:3000
1:700
1:1000
Luego de la incubación por 48 hs con los anticuerpos primarios y tras 5 lavados en PBSX, los cortes se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente con los
correspondientes anticuerpos secundarios biotinilados (diluidos 1:100). Es decir, se utilizó
un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con biotina en los casos en los que el
marcador de interés era la 5-HT o la GFAP, y en los restantes casos (TPH, 5-HTT, S100B,
Nf-200, MAP-2 y nNOS) se utilizó un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado
con biotina.
Tras nuevos lavados en PBS-X, los cortes se incubaron otros 90 minutos con el
complejo de avidina-peroxidasa (1:200) y se lavaron nuevamente, 5 veces en PBS-X y 2
veces en una solución amortiguadora de acetato 0,1 M, pH 6,0. Tras ello, los cortes se
incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente en tetraclorhidrato de 3,3’-
116
Materiales y Métodos
diaminobenzidina 0,035% (p/v) más sulfato amónico de níquel 2,5% (p/v) en solución
amortiguadora de acetato. Se llevó a cabo el revelado de la actividad de peroxidasa
agregando a la solución H2O2 0,1% (v/v). Siguiendo al paso de la reacción enzimática, los
cortes se lavaron 3 veces en la solución amortiguadora de acetato y una vez en agua
destilada.
Finalmente, se montaron los cortes en portaobjetos gelatinados, se los deshidrató por
desecación al aire7 y se los cubrió con cubreobjetos utilizando medio de montaje Permount
para su observación por microscopía de luz.
Todos los anticuerpos primarios y secundarios, al igual que el complejo de avidinaperoxidasa, se disolvieron en PBS conteniendo suero normal de cabra 1% (v/v) y Triton X100 0.3% (v/v).
En cada experimento de ICQ, un grupo de cortes de cerebro se utilizó como control
positivo y negativo apropiado para el procedimiento de ICQ per se; por ejemplo, se
omitieron intencionalmente los anticuerpos primarios para descartar la existencia de
reacciones positivas falsas.
III.2.6.3.3. Análisis de imágenes digitales asistido por computadora. Morfometría:
Para maximizar las condiciones de objetividad, para cada grupo de experimentos de
ICQ, en los cuatro protocolos experimentales, todas las mediciones se realizaron en
portaobjetos codificados, en condiciones ciegas. Las mediciones de los cortes de los
7
Raramente se observó retracción de los tejidos por la desecación al aire y cuando así sucedió, los cortes en
cuestión se descartaron.
117
Materiales y Métodos
distintos grupos experimentales se llevaron a cabo en condiciones estandarizadas (en la
misma sesión de medición, en el mismo día). En cada corte de tejido, se seleccionó el
campo microscópico a analizar morfométricamente dentro los límites de cada área
anatómica de interés.
Las imágenes del tejido se obtuvieron por medio de un microscopio óptico Zeiss
Axiophot equipado con una cámara de video conectada en línea con un analizador de
imágenes Zeiss-Kontron VIDAS. Las imágenes de video se transfirieron al analizador de
imágenes y se digitalizaron con un patrón de 512 × 512 píxeles (correspondientes a un área
de tejido de aproximadamente 140 × 140 :m para una magnificación primaria de 40×). A
cada píxel se le asignó una resolución de 256 niveles distintos de gris (8 bits). Tras una
normalización automática de la escala de grises se realizó una delineación interactiva de
las estructuras inmunomarcadas de interés y se procedió luego a la eliminación de las
imágenes inespecíficas. Las imágenes resultantes se midieron utilizando distintos
parámetros morfométricos, dependiendo en cada caso del marcador evaluado.
Así, la intensidad de la inmunorreactividad (-ir) citoplasmática a la TPH, a la 5-HT, a
la S100B y a la nNOS se evaluó por medio de un valor de densidad óptica relativa
(DOR). Según lo descripto en trabajos previos del laboratorio de la Dra. Brusco
(Tagliaferro et al., 1997; Ramos et al., 2000), los valores de DOR se obtuvieron tras la
transformación de cada valor medio de gris usando la siguiente fórmula: DOR = log
(256/gris medio). Para evaluar la DOR del citoplasma de cada célula individual,
independientemente del fondo local del tejido en que tal célula se hallaba, se obtuvo un
parámetro del fondo del tejido de cada corte (fuera de las estructuras inmunomarcadas) y
se lo sustrajo de cada valor de DOR celular antes de procesar estadísticamente los valores
118
Materiales y Métodos
obtenidos. Los valores de DOR se informan como unidades de DOR.
Para los astrocitos GFAP-ir, se evaluó el área celular. A este parámetro se lo midió
determinando en forma interactiva los límites de cada célula particular y teniendo en cuenta
que toda la imagen de cada célula estuviera dentro de los límites del campo que se
evaluaba.
Para evaluar las fibras 5-HTT-ir, Nf-200-ir y MAP-2-ir se relacionó el área total de las
fibras inmunomarcadas en cada campo con el área total del campo microscópico
correspondiente (19.332,35 :m2; 40× de magnificación primaria), lo que se tradujo en un
parámetro de área relativa de tejido (Ramos et al., 2000).
III.2.6.4.
Microscopía electrónica:
Para realizar observaciones por microscopía electrónica se seleccionaron algunos cortes
sagitales de los cerebros de las crías P5 y P21 del protocolo de exposición prenatal al EtOH
sin prevención del daño. A los cortes seleccionados se los transfirió a una solución
amortiguadora de fosfato 0,1 M pH 7,4. Luego se los postfijó durante 30 minutos con
tetróxido de osmio 1% en la misma solución amortiguadora de fosfato; se los deshidrató
por pasajes en soluciones de etanol de concentraciones crecientes; se contrastó el tejido con
acetato de uranilo 5% y se los incluyó en Durcupan. De los tacos con el tejido incluído se
ralizaron cortes ultrafinos con un ultramicrótomo Reichert-Jung Ultracut E. A tales cortes
se los tiñó con citrato de plomo según el método estándar de Reynolds (Reynolds, 1967).
Finalmente, los cortes, una vez montados en grillas de cobre, se observaron en un
119
Materiales y Métodos
microscopio electrónico Zeiss 109 perteneciente al Laboratorio Nacional de Análisis y
Servicios (LANAIS-MIE) dependiente del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas
y Técnicas (CONICET) y ubicado en dependencias del Instituto de Biología Celular y
Neurociencias “Prof. Eduardo De Robertis”.8
III.2.7. Estudios conductuales:
Para los estudios conductuales se utilizaron animales de una segunda tanda de animales
críados ad hoc del protocolo de EPE con prevención del daño por administración de
buspirona. A la edad de P90 se expuso a las crías macho a un ambiente novedoso
constituido por un campo abierto, de forma cuadrada, de 50 cm de lado y cerrado por
paredes de 39 cm de alto. Tanto las paredes como el piso eran de madera enchapada negra,
y el piso estaba dividido en 9 cuadrados
por líneas blancas (Fig. 23). Las sesiones
se realizaron en un ambiente bien y
homogéneamente iluminado y silencioso.
Sin sesiones de entrenamiento previas,
para evitar la habituación, a cada uno de
los animales se lo situó suavemente en uno
de los cuadrados de los vértices del campo
Fig ura 23. D isp ositivo d e la prueb a cond uctual d e cam p o ab ierto.
8
En toda esta tarea de postfijación, inclusión, corte, montaje y observación conté con la muy experta e
inestimable colaboración de la Sra. Emérita Jorge Vilela de Banchieri (nuestra muy querida Meri) técnica del
CONICET experta en microscopía electrónica. ¡Gracias, Meri!
120
Materiales y Métodos
abierto, con la cabeza mirando inicialmente hacia el ángulo formado por la convergencia
de las dos paredes adyacentes. A partir del momento mismo en que se los dejó libres en el
campo, y por 5 minutos, se contabilizó el número de veces que cada animal cruzaba el
límite de un cuadro a otro (parámetro: número de cruces) como medida de actividad
locomotora) y el tiempo total que se detenía y permanecía en el cuadro central (parámetro:
tiempo en el cuadro central) como medida del estado de ansiedad. Así, se evaluó y comparó
el comportamiento de todas las crías macho de los cuatro gupos experimentales (CS, CB,
ES y EB) con la finalidad de estudiar si el tipo de tratamiento prenatal producía efectos
duraderos en dos importantes parámetros conductuales.
III.3.
Análisis estadístico de los datos:
En cada protocolo experimental, por cada inmunomarcador utilizado en los estudios de
microscopía óptica, se realizaron 4-6 experimentos de ICQ. Los experimentos individuales
estuvieron compuestos por 6-10 cortes de tejido cerebral de cada animal de cada grupo
experimental. Se midieron 5-10 campos de cada área cerebral en cada corte de cada animal.
Las diferencias entre los animales, en cada uno de los grupos experimentales, tanto
como las diferencias entre los experimentos, no fueron estadísticamente significativas.
Tanto para los experimentos de ICQ (estudios de morfometría) como para los estudios
conductuales, los valores que se informan corresponden a la media ± DS (desvío estándar).
Las diferencias entre las medias de los grupos experimentales en cada protocolo se
analizaron estadísticamente por medio de las siguientes pruebas estadísticas, según
121
Materiales y Métodos
correspondiera en cada caso particular: i) test t de Student de dos colas, ii) análisis de la
varianza de una vía (ANOVA) seguido por un test de comparaciones múltiples de StudentNewman-Keuls o de un test de Dunnett (comparación de los grupos experimentales contra
el grupo control), según correspondiera.
El nivel de significancia estadística se estableció, en todos los casos, para un valor de
P < 0,05.
Para el análisis estadístico de los datos se utilizaron los progamas de computadora
GraphPad Instat v2.05a y GraphPad Prism v3.00 (GraphPad Software Inc.).
A los fines de simplificar la presentación gráfica y el poder de comparación, los valores
de los grupos experimentales se presentan como procentajes de sus respectivos grupos
Control (valor control = 100%) en la mayoría de los casos. En todos los gráficos de barras,
las barras representan el valor de la media ± ES (error estándar de la media).
122
Resultados
“Miserables son aquéllos a quienes mueve a obrar el resultado de sus actos.”
Krishna, 8 vo avatar de Vishnú (en el “Bhagavad-Gita”)
IV.1.
Protocolo de exposición prenatal al etanol sin prevención del daño:
IV.1.1. Resultados generales del tratamiento:
IV.1.1.1.
Consumo de alimento:
Durante los períodos pregestacional y gestacional de exposición al EtOH, las hembras
de ambos grupos recibieron, cada día, una cantidad distinta de alimento. Las hembras del
grupo Control consumieron, cada día, una cantidad de alimento calóricamente equivalente
al consumido en alimento y EtOH, el día previo, por las hembras del grupo EtOH.
Como es lógico suponer, las hembras del grupo Control comieron cada día, durante el
período pregestacional, significativamente más alimento (por kg de peso corporal) que las
hembras del grupo EtOH (73,71 ±17,26 versus 60,56 ±12,39 g/kg/d; P < 0,0001; Fig. 24;
Anexo VI, Tabla 1). Lo mismo sucedió considerado desde el punto de vista de cada hembra
individual: las del grupo Control comieron significativamente más alimento cada día que
las del grupo EtOH (18,14 ± 4,18 versus 13,92 ± 2,63 g/animal/d; P < 0,0001). Durante este
período del tratamiento, el consumo de alimento de las hembras EtOH representó (en
promedio) un 82,15% del consumo de las hembras Control. Es decir, recibieron 17,85%
menos alimento.
Durante el período de tratamiento gestacional, las hembras del grupo Control comieron
124
Resultados
64,28 ± 6,0 g/kg/d ó 19,59 ± 2,36 g/animal/d, en tanto que las hembras EtOH consumieron
59,9 ± 6,31 g/kg/d ó 16,48 ± 2,08 g/animal/d. En ambos casos, las diferencias son
estadísticamente significativas (P = 0,023 y < 0,0001, respectivamente; Fig. 24; Anexo VI,
Tabla 1). En términos de consumo de calorías derivadas del alimento por unidad de peso,
durante la gestación, las hembras EtOH ingirieron sólo 6,82% menos que las Control, ya
que ingieron un 93,15% de las calorías ingeridas por las hembras Control.
Figura 24. C onsum o de alim ento por parte de las hem bras durante los período s de tratam iento pregestacional y gestacional del
pro to co lo de EP Esin prevención del daño (en g/k g/d y k C al/k g/d ). Los núm eros en la p arte sup erior d entro d e las b arras d el g rup o
E tO H indica n el porcentaje de lo co nsu m ido en relación al grupo C ontrol (ba se 10 0). * P < 0,05. *** P < 0,0001 . Test t d e Stud ent
de do s co las.
IV.1.1.2.
Consumo de bebida:
Las hembras del grupo EtOH bebieron
significativamente menos líquido que las
del grupo Control durante el período
pregestacional tanto si se lo considera
desde el punto de vista de los animales
Figura 25. C onsu m o de beb ida por parte de las hem bras d uran te
los períodos pregestacional y gestacional del protocolo de E P E
sin p reve n c ió n del dañ o (en m l/kg/d). Los n úm ero s en la p arte
superior dentro d e las barras del grupo E tO H corresponden al
po rcen taje d e lo c o n su m ido en relación al grup o C on trol (ba se
10 0). N S : no sign ifica tivo . *** P < 0,0001 . Test t d e Stud ent d e d os
co las.
125
Resultados
individuales como si se lo hace desde el consumo por unidad de peso corporal (35,99 ±
9,21 versus 24,51 ± 4,77 ml/animal/d, ó 146,9 ± 42,08 versus 106,3 ± 21,56 ml/kg/d; P <
0,0001 en ambos casos; Fig. 25; Anexo VI, Tabla 1). Así, las hembras EtOH bebieron
aproximadamente un 27,64% menos de líquido (por unidad de peso corporal) que las
hembras del grupo Control. A pesar de ello, no se observaron signos físicos ni conductuales
de deshidratación.
Durante el período gestacional, en cambio, las hembras EtOH bebieron
comparativamente más líquido que durante el período anterior, tanto si se lo considera por
animal individual como por unidad de peso corporal. De este modo su nivel de consumo
de líquido se acercó al de las hembras Control (38,55 ± 8,02 versus 32,7 ± 4,77
ml/animal/d, P = 0,0053; ó 126,3 ± 22,67 versus 118,3 ± 10,37 ml/kg/d, P = 0,1398).
Durante la gestación, las hembras EtOH bebieron así sólo 6,34% menos líquido que las
Control. Entre ambos grupos, el consumo de líquido por unidad de peso (ml/kg/d) no fue
estadísticamente diferente durante toda la preñez (Fig. 25 y 26; Anexo VI, Tabla 1).
Figura 26. E vo lución del co nsu m o de b eb ida p or las hem bras d e los grupos C ontrol y E tO H duran te los p eríod os d e tratam ien to
pregestacional y gestacional en el protocolo de E P E sin prevención del daño. Los m om entos im portantes del tratam iento están
señ alad os p or flech as.
126
Resultados
IV.1.1.3.
Consumo de etanol:
En los estudios de alcoholización experimental como el presente es muy importante
establecer la cantidad de EtOH que se le ofrece, consumen y/o administra a los animales
de laboratorio.
Durante el período de tratamiento pregestacional las hembras del grupo EtOH
consumieron, en el agua de bebida, una media de 5,474 ± 1,11 g/kg/d (rango: 3,805-8,065).
El EtOH consumido les aportó unas 39,3 ± 7,96 kCal/kg/d (rango: 27,32-57,90) (Fig. 27).
Durante la preñez, paralelamente al incremento del consumo de líquido, aumentó el
consumo de EtOH. Así, las hembras preñadas del grupo EtOH consumieron 6,092 ± 0,534
g/kg/d de EtOH (rango: 5,323-7,126). La amplitud del consumo, como se aprecia, fue
menor pero con un promedio sostenidamente mayor al correspondiente de la etapa
pregestacional (Fig. 27; Anexo VI, Tabla 1). Para las hembras EtOH el consumo de bebida,
y con ella de EtOH, fue 11,29% mayor durante la gestación que en el período previo. En
cambio, las hembras Control bebieron 14,02% menos de agua durante la gestación que
durante el período previo.
Figura 27. C onsum o de etanol de las hem bras del grupo E tO H durante los período s de tratam iento pregestacional y gestacional
d el protocolo de E P E sin prevención d el daño (en g/kg/d y kCal/kg/d). Los valores en la parte superior dentro de las barras
co rresp ondien tes al períod o de tratam ien to gestacional indican el porcenta je d e variación co n resp ec to al tratam ien to
preg estacional (ba se 10 0). N S : no sign ifica tivo . * P < 0,05. Test t de S tuden t de d os colas.
127
Resultados
Por último, hemos de recordar que el agua de bebida consumida por las hembras EtOH
también les aportó calorías que serán tenidas en cuenta en el apartado siguiente al momento
de hacer el cálculo del ingreso calórico total.
IV.1.1.4.
Ingreso calórico total:
En la etapa experimental pregestacional
las hembras Control y las EtOH recibieron
una media de 184,3 ± 43,14 versus 151,4 ±
30,98 kCal/kg/d (P < 0,0001; Fig. 28 y 29;
Anexo VI, Tabla 1) derivadas del alimento.
A estas calorías se le sumaron, en el grupo
EtOH, las derivadas del EtOH consumido
con el agua de bebida. Dado que estas
Fig ura 28. C onsum o calórico total d e las hem b ras d e los g rup os
C ontrol y E tO H duran te lo s p e río d o s de tratam ien to
pregestacional y gestacion al de l protoc olo de E P E sin p reven ción
del daño (en kC al/kg/d). E n las barras del grupo E tO H se indica
en la zona grisada el porcentaje propo rcion al de calorías
derivadas del etanol. N S . no sign ifica tivo . *** P < 0,0001 . Test t d e
Studen t de d os colas.
fueron 39,3 ± 7,967 kCal/kg/d, sumadas a
las derivadas del alimento, el ingreso calórico total para las hembras EtOH fue, en este
período experimental, de 190,7 ± 35,74 kCal/kg/d. Esta diferencia no fue estadísticamente
significativa con respecto a las calorías ingresadas por las Control (P = 0,4559). Es decir,
la alimentación de ambos grupos fue definitivamente apareada desde el punto de vista
calórico. El EtOH ingerido representó para las hembras que lo recibieron el 20,61% del
valor calórico total diario.
Si consideramos a cada una de las hembras individualmente, hemos visto que las 4
128
Resultados
hembras Control recibieron un total de 45,33 ± 10,45 kCal/d cada una, todas derivadas del
alimento consumido, en tanto que las 6 hembras del grupo EtOH consumieron 34,8 ± 6,59
kCal/d cada una. Estas calorías, sumadas a las 9,058 ± 1,764 kCal/d derivadas del EtOH
de la bebida, totalizaron 43,86 ± 7,56 kCal/d. Nuevamente, la diferencia de calorías
ingeridas por las hembras de ambos grupos no fue estadísticamente significativa (P =
0,4569; Anexo IV, Tabla 1).
Durante la gestación las hembras Control y EtOH ingirieron una cantidad de calorías
derivadas del alimento que fue significativamente diferente (160,7 ± 15,01 versus 149,7 ±
15,79 kCal/kg/d; P = 0,0226; Fig. 28; Anexo VI, Tabla 1). Cuando, para el grupo EtOH,
se consideran también las calorías derivadas del EtOH del agua de bebida (43,74 ± 3,83
kCal/kg/d) se aprecia que, sumadas a las calorías ingeridas a partir del alimento, finalmente,
las hembras EtOH ingirieron significativamente más calorías que las hembras Control
(160,7 ± 15,01 versus 193,5 ± 18,74 kCal/kg/d; P < 0,0001; Fig. 28; Anexo VI, Tabla 1).
El EtOH ingerido durante la gestación representó para las hembras que lo recibieron el
F igu ra 29 . E v olución del consum o de calorías totales (d erivadas d el alim ento y d el etanol) p ara las hem b ras d e los g rup os C ontrol
y E tO H du ra nte los períodos de tratam iento pregestacional y g estacional d el p rotocolo d e EP E sin p revención d el d año.
129
Resultados
22,6% del VCT diario. Así, las hembras EtOH ingirieron 20,41% más de calorías por kg
de peso corporal, por día, que las del grupo Control. Esas calorías extra ingeridas por las
hembras EtOH provinieron casi enteramente del EtOH consumido, ya que las derivadas del
alimento fueron prácticamente iguales (Fig. 26).
IV.1.1.5.
Evolución ponderal de las hembras:
La ganancia de peso de las madres durante los períodos de tratamiento pregestacional,
gestacional y postnatal fue equivalente para los dos grupos de tratamiento.
Al finalizar el período pregestacional de exposición al EtOH 6,6% en el agua de bebida
(es decir, tras 43 días de “aclimatación metabólica” al consumo de EtOH) el peso de las
hembras Control era 276,5 ± 18,8 g (rango: 249,5-289,0 g) y el de las hembras EtOH,
245,67 ± 25,5 (rango: 225,5-285,5 g). Las diferencias de peso fueron, estadísticamente, no
significativas (P = 0,0742). Sin embargo, la ganancia de peso de las hembras expuestas al
EtOH mostró una leve tendencia a ser menor que la de las Control (Fig.30 y 31 -curva-;
Anexo VI, Tabla 1). Así, la ganancia de peso entre el inicio y la finalización de esas 6
semanas fue significativa para las hembras Control (P = 0,0064), que aumentaron un 22,5%
sobre el peso inicial, pero no lo fue para las del grupo EtOH (P = 0,0824; Fig. 30), que
aumentaron sólo un 12% por sobre el peso inicial.
Transcurrido el período de apareamiento, el día E0 (inicio de la gestación), las hembras
de ambos grupos, Control y EtOH, pesaron una media de 273,9 ± 17,1 y 245,7 ± 26,2 g,
respectivamente. Durante la gestación el aumento de peso fue armónico y comparable para
130
Resultados
ambos grupos (Fig. 31). Al finalizar la gestación (E21) pesaban 376,8 ± 25,1 y 351,4 ±39,4
g, respectivamente, una diferencia estadísticamente no significativa (P = 0,2906). Durante
la preñez, entonces, las hembras de los grupos Control y EtOH aumentaron 37,5% y 43,0%
de su peso corporal inicial, respectivamente (Fig. 30 y 31; Anexo VI, Tabla 1).
Tras el parto, durante el período de lactancia, mientras las madres Control mantuvieron
su peso aproximadamente invariante, las del grupo EtOH fueron incrementandolo
lentamente hasta reducir la diferencia de pesos a 9 g hacia el final de la lactancia cuando
sus crías tenían 18 días de vida postnatal (Control: 290,4 ± 30,8 g; EtOH: 281,4 ± 24,4 g;
P = 0,6191; Fig. 30 y 31).
F igu ra 30 . P eso de las hem bras en los distintos m om entos d el tratam iento, en el p rotocolo d e EP E sin p revención d el d año. Los
núm e ro s p o r so b re las líneas de punto s horizonta les en las barras correspondiente s a los m om ento s pregesta cional final y
gesta cio n al final indican el porcentaje de aum ento d e p eso d esd e el m om ento anterior, tom and o a este com o b ase 100. N S: no
significativo. **: P < 0,01. Test t de S tuden t de d os colas.
131
F igu ra 31 . E volución del peso de las hem bras durante los p eríod os d e tratam iento p regestacional, g estacional y p ostp arto en el p ro to co lo d e E P E s in p re ve nc ió n d el d añ o .
Resultados
IV.1.1.6.
Número de crías, relación machos/hembra, peso de las crías al nacer y su
evolución ponderal hasta P21:
Como fuera dicho en el apartado III.2.2. de los Materiales y Métodos (Metodología
general del tratamiento de los animales), inmediatamente después de finalizado el período
de exposición al EtOH todas las hembras fueron alojadas en grupos de 3- 4 por jaula, con
un macho, para el apareo. En un plazo de 1-10 días todas las hembras fueron preñadas.1
La duración de la gestación no varió entre las hembras del grupo Control y las del grupo
EtOH. Esa duración fue de 22 días para todas las hembras de ambos grupos de
tratamiento.
El tamaño de las camadas que parieron las hembras Control y EtOH y la relación
machos/hembra fue estadísticamente equivalente para ambos grupos y también lo fueron
los pesos de las crías al nacer y su ganancia de peso hasta el día P21.
El peso al nacer de las crías Control (n = 46) fue de 5,9 ± 0,37 g y el de las crías EtOH
(n = 79) fue de 5,8 ± 0,5 g (P = 0,312; Fig. 32).
El tamaño de las camadas fue de 11,5 ± 4,43 crías para las hembras Control y 13,17 ±
2,92 crías para las hembras EtOH (P = 0,4884; Fig. 32). No se obsevaron diferencias
significativas.
La relación machos/hembra fue de 1,15/1,0 para las crías Control y de 1,02/1,0 para las
del grupo EtOH.
Cualitativamente, no se observó ningún caso de malformación congénita (microcefalias
1
Excepto una del grupo EtOH que demoró 27 días (esta última hembra no se diferenció en nada,
posteriormente, de las restantes en cuanto a ganancia de peso, número de crías paridas, relación
machos/hembra o peso al nacer de las mismas).
133
Resultados
incluídas).
La evolución del peso de estas crías fue en todo paralela para ambos grupos de
tratamiento y el proceso de crecimiento y desarrollo en todo normal (aparición del pelo
corporal, apertura del conducto auditivo externo, apertura palpebral, comienzo de la
reptación y de la marcha, etc.). El peso de las crías a la edad de P21 fue de 39,48 ± 4,31 g
para las crías Control y de 40,96 ± 6,64 g para las EtOH (P = 0,3411), una diferencia
estadísticamente no significativa (Fig. 32 y 33).
Figura 32. P eso de las crías al nacer, cantidad de crías por cam ada y peso de las crías en edad P 21 nacidas de las hem bras del
protoco lo d e E P E sin p reve nción d el dañ o. N S : n o significa tivo . Test t de S tuden t de d os colas.
IV.1.1.7.
Alcoholemias en madres y crías:
Evaluadas por medio de dos escalas conductuales de intoxicación2, las hembras EtOH
no mostraron signos de intoxicación (ni sus crías cuando, por su edad, pudieron ser
evaluadas) en ningún momento de los períodos de tratamiento pregestacional, gestacional
y postparto. En todos los casos puntuaron con valor cero en ambas escalas. Tampoco
mostraron signos de abstinencia aguda las hembras al día P21 (momento del destete y de
2
La escala de Slawecki (2002) (modificada a partir de Freund [1969]) y la de Nixon y Crews (2004). Véase
el punto III.4. (Evaluación conductual de la intoxicación y la abstinencia) en Materiales y Métodos, ut supra.
134
Resultados
la fijación de las crías) cuando se las evaluó con una escala conductual ad hoc.3 Las crías
no pudieron ser evaluadas para abstinencia porque al día del destete inmediateamente se
las anestesió y fijó para extraer sus cerebros.
Tanto en las madres a lo largo de la gestación como en las crías al momento del parto,
la alcoholemia medida para el grupo EtOH fue de 19,0 ± 4,87 mg/dl (rango: 15-25 mg/dl
= 3,25-5,42 mM). Como era previsible, en los animales Control no se hallaron niveles de
alcoholemia detectables.
Figura 33. E volución postn ata l del peso de las crías m acho, nacidas de m adres C ontrol y E tO H , desde P 0 a P 21, en el pro to colo
de E P E sin p reven ción de l da ño . N ótese el pa ralelism o e n e l ascen so d el pe so d e am bo s grup os.
3
La escala de Penland et al. (2001) modificada a partir de Majchrowicz (1975). Véase el punto III.4.
(Evaluación conductual de la intoxicación y la abstinencia) en Materiales y Métodos, ut supra.
135
Resultados
IV.1.2. Observación de los cortes de los cerebros de crías P21 teñidos con la
coloración de Nissl:
Se observaron sistemáticamente los cortes de cerebro de los animales de edad P21 del
grupo Control y EtOH teñidos con azul de toluidina. No pudieron constatarse variaciones
del tamaño o grosor de las distintas áreas prosencefálicas estudiadas ni, en general,
alteraciones citoarquitectónicas. Tampoco se observaron neuronas de localización
aberrante, ni alteraciones de la laminación ni del grosor cortical.
No obstante ello, en algunos animales (pero no en todos) de distintas camadas (es decir,
no hermanos entre sí), sí se observaron alteraciones estructurales en ciertas neuronas
piramidales, específica y únicamente, en la CxF. Más aún, estas alteraciones sólo se
observaron en la corteza frontal orbitaria lateral (LO -lateral orbital- correspondiente a la
plancha 170 del atlas de Paxinos [Paxinos y Watson, 2007]; Fig. 34A,B), histológicamente
correspondiente al área 10 de Brodmann, según la clásica caracterización citoarquitectónica
que hiciera Wendell Krieg de la CC de la rata (Krieg, 1946a, 1946b).
En esta área cortical, las neuronas piramidales anormales se ubicaban unas debajo de las
otras respetando estrictamente la organización columnar neocortical típica. En sentido
paralelo a la superficie pial, en cada corte observado, la región de células anormales
abarcaba una extensión máxima de unas 15-20 columnas y mínima de 3-5, afectando toda
la región la forma bidimensional de un trapezoide angosto y elongado, de base mayor
orientada hacia la pía y base menor orientada hacia la sustancia blanca subyacente. En
sentido perpendicular a la pía, estas pirámides anormales se disponían entre las capas II
(granular externa) y V (piramidal interna), respetando la capas I (molecular) y la mayor
136
Figura 34. C oloración de N issl. La figura m u estra el aspecto de la citoarquitectura de la C xF de las crías P 21 del protocolo de E P E
sin pre ve nc ión del daño, según se la observó con la coloración d e N issl. La p lancha 170 (A ) d el atlas d el cerebro d e la rata de
P axinos y W atson (2007) correspondiente a la zona de la C xF en la que se observaron las m a yores alteraciones m o rfológicas. E n
B se o bserva el po lo fron tal y la zo na trap ezo ida l recu ad rad a en rojo co rres p o n d e a la fo to m ostrad a en C . E n e sta últim a se
m u estra n, som breadas en rojo, las zonas m ostrada s a m ayor aum ento en C 1-5 y F. D escrip ciones adicionales véanse en el texto.
B arras de escala = 675 :m en B ; 250 :m en C ; 50 :m en C 1 (válida para C 1-5,D -I).
137
Resultados
parte de la VI (capa de células fusiformes) (Fig. 34B,C). Cuando se la hallaba, esta región
anormal estaba presente en 3-5 cortes contiguos (150-250 :m, aproximadamente) y a
medida que se pasaba de un corte al otro de la serie, la extensión lateral de la zona afectada
se iba reduciendo en cantidad de columnas afectadas. De ello es posible inferir que la
región afectada ha de haber presentado in vivo la forma tridimensional aproximada de un
cono truncado de base orientada superficialmente y vértice dirigido hacia la profundidad
de la sustancia gris cortical. Es decir, lo más llamativo de estas células, desde el punto de
vista espacial, era su confinamiento a una zona determinada que podría describirse como
un compartimiento o agrupamiento de neuronas anormales, individualmente orientadas
correctamente dentro de la columna (salvo muy escasas excepciones en las que alguna
célula parece haber estado “desorientada” en su eje con respecto a las vecinas normalmente
situadas; véase la neurona marcada por la doble flecha negra en la Fig. 34C4).
Observadas a mayor aumento, lo que resaltaba en estas neuronas era el incremento
llamativo de la tinción citoplasmática. Neuronas piramidales claramente hipercromáticas
en las que se hubo perdido la separación habitual entre los grumos de la sustancia de Nissl.
La hipercromasia era siempre llamativa si bien que la forma del citoplasma podía variar
a lo largo de un espectro en el que las neuronas presentaban desde una forma casi normal
(Fig. 34E) hasta aquellas en las que el citoplasma estaba tan retraído que no representaba
más que la escasa y oscura envoltura de un núcleo también anormal (Fig. 34H,I). Entre
estos dos tipos polares se hallaban los estadíos intermedios (Fig. 34F-H). En muchas de
estas pirámides podían observarse ondulaciones de la superficie citoplasmática (Fig.
34G,H). A causa de la retracción del citoplasma muchas de estas células adquirían un
aspecto “espiculado” (Fig. 34C1,C2,C4) en el que las espículas se correspondían con la
138
Resultados
emergencia de axón y dendritas. Globalmente considerado, el citoplasma tendía a adquirir
un aspecto adelgazado, avejentado, o rugoso, haciendo recordar a veces (para ser gráficos)
al perfil de las pasas de uva.
En cuanto a las prolongaciones de estas neuronas piramidales, era característica (aunque
no constante) la presencia de dendritas apicales de inicio y trayecto tortuoso o zigzagueante
(flechas negras en la Fig. 34C1-4,D) como así también, en ocasiones, de la porción inicial
del axón (flechas blancas en la Fig. 34C1-3).Estas ondulaciones mostraban, al cambiar de
dirección, un ángulo habitualmente obtuso pero, rara vez, lo eran de ángulo muy agudo (ver
la dendrita señalada por la flecha negra del medio en la Fig. 34C1).
En cuanto al núcleo de estas neuronas (contrastando con la forma circular normal,
cromatina laxa y nucléolo evidente) su forma acompañaba en general al grado de afectación
de la forma y tinción del citoplasma. Así, se encontraron núcleos con forma desde casi
normal (pero siempre al menos algo angostado; Fig. 34E) hasta aquellos muy estrechados
en sentido laterolateral y de formas netamente anormales, con indentaciones superficiales
que seguían el perfil también ondulado del citoplasma que los rodeaba (Fig. 34C1-3,E-I).
Estas alteraciones de la morfología nuclear fueron visibles ya con el poder de resolución
del microscopio óptico. Sin embargo, y a pesar de estar los núcleos y los citoplasmas tan
alterados, fue llamativo constatar que la cromatina nuclear era siempre laxa y sin signos de
picnosis. Aún más llamativo: el núcleolo se encontró presente en forma casi constante,
incluso en las células más anormales (Fig. 34H,I).
Otro hallazgo, por cierto muy llamativo para cerebros de ratas de edad P21, fue el de una
célula bipolar (marcada con un asterisco amarillo en la Fig. 34C5) de citoplasma
hipercromático y núcleo central de cromatina laxa, nucléolo evidente y una clara
139
Resultados
escotadura, que se hallaba orientada perpendicularmente con respecto a la piamadre. El
citoplasma presentaba una prolongación apical y otra basal de menor longitud
perfectamente alineadas (marcadas con sendas flechas amarillas en la Fig. 34C5) como si
se hallaran adheridas (prolongaciones y citoplasma) a alguna fibra. Este aspecto
morfológico, en conjunto, recuerda al de un Nb postmitótico migratorio aún en proceso de
migración a lo largo de la fibra apical de una cGR.
Por último, que las neuronas anormales se dispusieran en columnas dentro de un área
circunscripta, no significa que todas las columnas de esa región estuvieran integradas por
neuronas anormales. De hecho, sólo algunas de las 15-20 columnas de la región anormal
mostraban pirámides afectadas y así, al lado de una columna de neuronas anormales se
encontraban una o más columnas con neuronas en todo normales. Tampoco es cierto que
todas las neuronas dispuestas en una misma columna afectada fueran anormales. De este
modo, en una misma columna podían hallarse una, dos y hasta tres o más neuronas
anormales contiguas seguidas más arriba o abajo por células completamente normales. Sin
embargo, cuando se observaba a las columnas a bajo aumento (Fig. 34C) eran fácilmente
identificables las anormales y las normales. A este respecto, han de tenerse presentes las
limitaciones de la microscopía óptica, de la inespecificidad de la tinción utilizada y del
grosor (50 :m) de los cortes utilizados (que no permite decidir con certeza si dos neuronas
visualmente alineadas corresponden a la misma columna o a columnas contiguas ubicadas
a distinta profundidad dentro del corte).
140
Resultados
IV.1.3. Experimentos de inmunocitoquímica en P21:
IV.1.3.1.
Triptófano hidroxilasa (TPH):
La enzima TPH, primera enzima (y limitante) de la vía biosintética de la 5-HT, se evaluó
por ICQ en las neuronas del NDR y del NMR en cortes transversales de niveles
mesencefálicos por medio de los valores de DOR. En ambos núcleos se observaron
neuronas de soma típicamente estrellado, multipolares, con imágenes negativas del núcleo
celular (en donde no se halla marcación para esta enzima).
En el NDR de las crías de edad P21 sometidas a EPE, los valores de DOR de las
neuronas TPH-ir fueron casi 5 veces mayores que las de las crías Control (Figs. 35A,B; Fig.
36; Anexo VII, Tabla 1).
En las neuronas del NMR el valor de la DOR fue 4 veces mayor que en el de las Control
(Figs. 35C,D; Fig. 36; Anexo VII, Tabla 1).
En ambos núcleos, el citoplasma de las neuronas se observó mucho más intensamente
teñido en los animales del grupo EtOH y el trayecto de las principales prolongaciones
citoplasmáticas se pudo observar por mayor longitud y con mayor claridad que en las
neuronas de los animales del grupo Control (Figs. 35B y D). En muchas neuronas de las
crías EtOH, en el NMR, algunas prolongaciones citoplasmáticas tenían un trayecto sinuoso,
zigzagueante (Fig. 35D) y se observaron incluso, contra el fondo del tejido, perfiles aislados
de prolongaciones que se podrían describir como “segmentos en sacacorcho”.
No se detectaron diferencias en el número de neuronas TPH-ir en los NDR y NMR de
las crías EtOH con respecto a los de las crías Control.
141
Figura 35. N eu ron as TP H -ir en el N D R (A ,B ) y en el N M R (C ,D ) de las crías P 21 del protocolo de E P E sin prevención del daño. E n
la fila superior, anim ales Co ntrol. E n la fila inferior, anim ales E tO H . V éase la descripción en el texto. Las flechas en B y D señalan
prolong aciones celulares en sacacorcho. B arra de escala en A = 50 :m (válida p ara A -D ).
Figura 36. D en sida d ó ptica relativa de las neu ron as TP H -ir de
los núcleo s do rsal y m edial del rafe m esencefálico en las
crías de edad P 21 d el p ro tocolo de E P E sin prevención d el
dañ o. ** P < 0,01. *** P < 0 ,00 01 . Test t d e Stud ent d e d os
co las.
142
Resultados
IV.1.3.2.
Serotonina (5-HT):
No se observó ningún cambio significativo en los valores de la DOR en las neuronas del
NDR (Figs. 37A,B; Fig. 38; Anexo VII, Tabla 1). El aspecto de estas neuronas estrelladas
multipolares era similar en los cortes de las crías pertenecientes a ambos grupos. En este
Figura 37. N eu ron as 5-H T-ir en el N D R (A ,B ) y en el N M R (C ,D ) de las crías P 21 del protocolo de E P E sin prevención del daño. E n
la fila superior, anim ales Co ntrol. E n la fila inferior, anim ales E tO H . V éase la d escripción en el texto. B arra d e escala en A = 20 :m
(válida p ara A -D ).
143
Resultados
núcleo, a pesar de no haberse detectado variaciones en la DOR del citoplasma, se
observaron algunas neuronas aisladas con prolongaciones sinuosas (no mostradas).
En las neuronas 5-HT-ir del NMR de las crías EtOH, el valor de la DOR aumentó casi
1,3 veces con respecto al valor de los
Controles ( Figs. 37C,D; Fig. 38; Anexo
VII, Tabla 1).
Nuevamente,
no
se
detectaron
diferencias estadísticamente significativas
en el número de neuronas 5-HT-ir en los
NDR y NMR de las crías EtOH con
Fig ura 38. D ensid ad óp tica relativa d e las neuronas 5-H T -ir d e los
núcleos dorsal y m e dial del rafe m e sencefálico en las crías d e
edad P 21 del protoco lo de E P E sin p reve nción del dañ o. *** P <
0,00 01 . Test t de S tuden t de d os colas.
respecto a los de las crías Control.
IV.1.3.3.
Transportador de serotonina (5-HTT):
En las tres áreas prosencefálicas estudiadas, la expresión del 5-HTT-ir se observó como
delgadas fibras arrosariadas con una ramificación densa y muy intrincada. La medición
semicuantitativa permitió evaluar la densidad de las fibras por unidad de área de tejido
cerebral y se expresa como área relativa de fibras 5-HTT-ir.
En el stratum radiatum del CA1 Hipp de las crías EtOH se observó un incremento
significativo del área relativa ocupada por estas fibras que fue 1,5 veces mayor que en las
crías Control (Figs. 39A,B; Fig. 40; Anexo VII, Tabla 1).4
Figura 39 (en la próxim a página). Fibras 5-H TT-ir en el H ipp (A ,B ), el S trt (C ,D ) y la C xF (E ,F) de las crías P 21 del protocolo de E P E
sin prevención del daño. La fila superior corresponde a los anim ales C ontrol y la fila inferio r a los anim ales E tO H . V éase la
descripción en el texto. B arras de escala = 20 :m en A (válida para A ,B ) y 50 :m en C (válida p ara C -F).
144
145
Resultados
En el Strt, las fibras 5-HTT-ir se
observaron
en
la
matriz
estriatal,
respetando los estriosomas. El análisis de
las imágenes se focalizó en la matriz
estriatal en la que se
ncuentra
normalmente
una
densa
inervación serotoninérgica. En el Strt de
las crías EtOH hubo un aumento
Figura 40. Á rea relativa de tejido cerebral cubierto po r las fibras
5-H TT-ir en áreas prosencefálicas de las crías de edad P 21 en el
pro toco lo de E P E sin p reve nción del dañ o. * P < 0,05. *** P <
0,00 01 . Test t de S tuden t de d os colas.
significativo del área relativa de las fibras que alcanzó a ser 1,3 veces mayor que en el Strt
de las Control (Figs. 39C,D; Fig. 40; Anexo VII, Tabla 1).
En la CxF de los animales EtOH también se observó un aumento significativo del área
relativa ocupada por las fibras 5-HTT-ir que alcanzó un valor 1,5 veces mayor que el de los
Controles (Figs. 39E,F; Fig. 40; Anexo VII, Tabla 1).
No se observaron variaciones morfológicas en las fibras 5-HTT-ir, en ninguna de las tres
áreas prosencefálicas, de las crías EtOH con respecto a las de las crías Control.
IV.1.3.4.
Proteína gliofibrilar ácida (GFAP):5
En el CA1 Hipp de las crías P21 sometidas a EPE los astrocitos presentaron un cuerpo
celular agrandado, con prolongaciones citoplasmáticas más alargadas y de trayecto más
tortuoso en comparación con los de los animales Control. En estos últimos animales las
Figura 41 (en la p róxim a p ág ina ). A stroc itos G FA P -ir en el H ip p (A ,B ), el Strt (C ,D ) y la C xF (E,F) d e las crías P21 del p rotocolo d e
E P E sin prevención del daño. La fila superio r corresponde a los anim ales C ontrol y la fila inferio r a los anim ales E tO H . V éase la
descripción en el texto. B arras de escala = 100 :m en A (válida para A ,B ) y 50 :m en C (válida p ara C -F).
146
147
Resultados
prolongaciones
observaron
de estas
siguiendo
células
un
se
trayecto
aproximadamente paralelo al de las
dendritas de las células del estrato
piramidal que transcurren por este estrato.
En cambio, en los animales EtOH las
prolongaciones de los astrocitos mostraron
F ig ura 42. Á rea celu lar d e lo s astro cito s G F A P -ir en áre a s
prosencefálicas de las crías de edad P 21 en el protocolo de E P E
sin p reve nción del dañ o. *** P < 0,0001 . Test t d e Stud ent d e d os
co las.
un perfil mucho más aracnoideo, no tan
organizado y cubriendo una mayor superficie de tejido. El análisis morfométrico mostró
que el área celular astrocitaria aumentó significativamente en los animales EtOH, aumento
que alcanzó 2,5 veces el valor de los Controles (Figs. 41A,B; Fig. 42; Anexo VII, Tabla 1).
En el Strt de las crías EtOH se observó un pequeño aumento, no significativo, del área
celular de los astrocitos (Figs. 41C,D; Fig. 42; Anexo VII, Tabla 1). No se observaron
variaciones morfológicas.
En la CxF, como en el CA1 Hipp, los astrocitos de los animales sometidos a EPE se
observaron hipertróficos, con un aumento significativo de su área celular cuando se los
comparó con los de los Control. El área celular fue 1,7 veces mayor en los animales EtOH
(Figs. 41E,F; Fig. 42; Anexo VII, Tabla 1).
IV.1.3.5.
Proteína S100B (S100B):
Tanto en los animales Control como en los EtOH se observó la S100B-ir de ubicación
148
Resultados
intracitoplasmática en los astrocitos de cada área prosencefálica analizada. La
inmunotinción para la S100B marcó el cuerpo celular y algunas de las principales
prolongaciones y, como era de esperar para un marcador citoplasmático, mostró imágenes
negativas del núcleo celular.
En el stratum radiatum del CA1 Hipp de los animales sometidos a EPE hubo un
aumento significativo del valor de la DOR del citoplasma astrocitario que alcanzó 1,2 veces
el valor del de los animales Control (Figs. 43A,B; Fig. 44; Anexo VII, Tabla 1).
En el Strt de las crías EtOH también se observó un aumento significativo de la DOR, de
1,4 veces con respecto al valor de los Control (Figs. 43C,D; Fig. 44; Anexo VII, Tabla 1).
También se observó un aumento significativo, nuevamente de 1,2 veces sobre el valor
Control, en la CxF de los animales EtOH ( Figs. 43E,F; Fig. 44; Anexo VII, Tabla 1).
Con la utilización de este marcador citoplasmático astrocitario no se observaron mayores
variaciones morfológicas en los animales EtOH con respecto a los Control en ninguna de
las áreas. Solamente, se pudo observar un aumento de la longitud durante el cual se pudo
seguir visualmente el trayecto de las principales prolongaciones citoplasmáticas (véase, por
ejemplo, la Fig. 43B y F).6
Figura 43 (en la próxim a p ág ina). A stroc itos S -100B -ir en el H ipp (A ,B ), el S trt (C ,D ) y la C xF (E ,F) d e las crías P 21 del pro to colo
de E P E sin p reven ción de l da ño . La fila supe rior correspon de a los an im ales C on trol y la fila inferior a los an im ales E tO H . E n B se
o bse rva un vaso sanguíneo (v) al que llega una prolong ación d e un astrocito q ue term ina en p ie chup ad or. V éase la descrip ción
am pliada en el texto. B arras de escala = 20 :m en A (válida para A -D ) y 50 :m en E (válida p ara E ,F).
149
150
Resultados
Figura 44. D ensidad óp tica relativa de los astrocitos S 10 0B -ir en
áreas prosencefálicas d e las crías d e edad P21 en el p rotoc ol o d e
E P E sin p reve nción del dañ o. ** P < 0,01. *** P < 0,0001 . Test t d e
S tuden t de d os colas.
IV.1.3.6.
Neurofilamentos de 200kDa (Nf-200):
En el CA1 Hipp se observó una importante alteración del patrón de expresión de los Nf200 dado que el área relativa de tejido cubierta por estos aumentó 1,27 veces su valor en
los animales sometidos a EPE con respecto al valor de los animales Control (Figs. 45A,B;
Fig. 46; Anexo VII, Tabla 1). En unos y otros animales se observó la inmunomarcación
predominante de las dendritas de las neuronas piramidales del Hipp que discurren por el
stratum radiatum, como así también la de algunos somas aislados en el stratum piramydale.
En el Strt de los animales EtOH también aumentó significativamente el área relativa de
los Nf-200-ir. Este aumento nuevamente alcanzó un valor 1,27 veces mayor que el de los
animales Control (Figs. 45C,D; Fig. 46; Anexo VII, Tabla 1).7
En la CxF, semicuantitativamente, no se observó ningún cambio en la expresión de los
Figura 45 (en la p róxim a p ág ina). Fibras N f-200-ir en el H ipp (A ,B ), el S trt (C ,D ) y la C xF (E ,F) de las crías P 21 del protocolo de E P E
sin pre ve nc ión del daño. La fila superior corresp on d e a los anim ales C ontrol y la fila inferior a los anim ales EtO H . En F
(fotocom posición d e dos cam pos distintos), en la m itad izquierda se observa un vaso sanguíneo (vs) alrededor del cual se dispone,
c on to rn eá nd olo parcialm ente, la dendrita apical de una neurona p iram id al. V éase la descrip ción am p liada en el texto. B arras d e
escala = 100 :m en A (válida para A ,B ) y 50 :m en C (válida p ara C -F).
151
152
Resultados
Nf-200-ir de las ratas sometidas a EPE. Hubo un cambio muy pequeño, no significativo,
del área relativa en los animales EtOH que alcanzó sólo a 1,05 veces el valor de los
animales Control (Figs. 45E,F; Fig. 46; Anexo VII, Tabla 1).
En las tres áreas estudiadas (incluída la CxF en la que no se detectaron cambios
semicuantitativos), muchas fibras Nf-200-ir mostraron importantes alteraciones
morfológicas consistentes, principalmente, en ondulaciones, zigzagueos de su trayecto que,
teniendo en cuenta que el grosor de los cortes fue de 50 :m y que probablemente incluyera
el grosor total de las prolongaciones, podría ser descripto como una estructura (símilsacacorcho(, nombre con el que otros autores han descripto previamente esta imagen
(“corkscrew-like”; cf. Onizuka et al., 1996 y Muramatsu et al., 1997). Esta alteración
morfológica cualitativa se observó tanto en las dendritas de las células piramidales del Hipp
(no mostrado), como en los axones que transcurren por los estriosomas en el Strt y en las
dendritas apicales de la neuronas piramidales de la CxF (Fig. 45D y 45F). No todos los
animales ni todas las neuronas o fibras presentaron esta alteración y, cuando estaba
presente, la ondulación no era siempre, ni en todas las fibras, igualmente cerrada o angulada
en su zigzagueo. En el Strt, el zigzagueo se
pudo observar tanto en los axones que
discurren por los estriosomas como, con
mayor dificultad y por menor longitud, en
las prolongaciones presentes en la matriz
estriatal (correspondían en este caso tanto
a axones como a dendritas de las células
propias del Strt). En la CxF, por ejemplo,
Figura 46. Á rea relativa de tejido cerebral cubierto po r las fibras
N f-20 0-ir en áreas prosencefálicas de crías de edad P 21 en el
protoco lo de E P E sin p reve nción del dañ o. * P < 0,05. *** P <
0,00 01 . Test t de S tuden t de d os colas.
153
Resultados
esta alteración morfológica tampoco estuvo presente en toda su extensión sino que pareció
estar presente en “parches” o en “islotes”; es decir, había zonas que la presentaban y otras
que no, de igual modo que otras regiones corticales no evaluadas en este estudio (como la
Cx parietal y la occipital). Las neuronas estrelladas de la CxF parecen haber estado, en
general, menos afectadas que las piramidales, pero lo estuvieron. Cuando estaban afectadas,
las neuronas estrelladas mostraban un zigzagueo corto pero notorio, de escasa longitud de
sus prolongaciones (predominantemente dendritas). De las neuronas piramidales, parecen
haber sido más afectadas las de más largas dendritas apicales y grandes somas de la capa
V (piramidal interna).
IV.1.3.7.
Óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS):
Lamentablemente, en el CA1 Hipp no se pudo observar una cantidad adecuada de
neuronas nNOS-ir que pudiera ser confiablemente evaluada, por lo que no se muestran
datos ni imágenes acerca de esta región.
En el Strt de las crías EtOH se observó un aumento significativo de la DOR del
citoplasma de las neuronas nNOS-ir que fue 2,77 veces mayor con respecto al valor de la
DOR de los animales Control (Figs. 47A,B; Fig. 48; Anexo VII, Tabla 1).
De manera similar, en la CxF de los animales sometidos a EPE hubo un incremento
significativo en el valor de la DOR que alcanzó 2,47 veces el de los animales Control (Figs.
47C,D; Fig. 48; Anexo VII, Tabla 1).
En ambas áreas de los animales EtOH, las neuronas nNOS-ir presentaron largas
154
Resultados
Fig. 47. N eu ron as nN O S -ir en el S trt (A ,B ) y en la C xF (C ,D ) de las crías P 21 del pro to colo de E P E sin prevención del daño. La fila
su perio r c orresponde a los anim ales C ontrol y la fila inferior a los a ni m ales EtO H . B es una fotocom p osición d e d os cam p os
distintos. B arra de escala en A = 20 :m (válida p ara A -D ).
prolongaciones citoplasmáticas. Más aún, las prolongaciones que se observaron en el fondo
del tejido pudieron haber pertenecido a otras neuronas cuyos somas estaban en otros cortes
de tejido, distintos al de aquellos en los que se evaluó morfométricamente su DOR
citoplasmática. Los núcleos celulares mostraron una tinción negativa en los animales
Control (la nNOS una enzima de localización citoplasmática), pero en los animales EtOH
el aumento de la DOR fue tal que, en algunos casos, el núcleo quedó total o parcialmente
155
Resultados
oscurecido
por
la
inmunotinción
(recuérdese que el grosor de los cortes de
tejido fue de 50 :m, en los que fácilmente
se puede incluir la totalidad o la mayor
parte del volumen del soma de una
neurona).
Para un resúmen de los resultados
Figura 48. D ensidad óptic a relativa de las neuro nas nN O S -ir
en áreas prose n cefálicas de las crías de edad P 21 en el
protoco lo de E P E sin preve nción del dañ o. *** P < 0,0001.
Test t de S tuden t de d os colas.
obtenidos en las crías de edad P21
sometidas a EPE, véase el la Tabla 8, y la Tabla 1, Anexo VII.
Tabla 8. Resumen de los resultados morfométricos de los experimentos de ICQ
realizados en cortes de cerebros de ratas de edad P21 sometidos a EPE sin prevención
del daño.
M arcador
M ESENCÉFALO
NDR
NM R
TPH
8
8
5-HT
z
8
PROS ENCÉFALO
CA1 H ipp
Strt
CxF
5-HTT
8
8
8
GFAP
8
z
8
S100B
8
8
8
Nf-200
8
8
z
nNOS
n/d *
8
8
* n/d: no detectado.
156
Resultados
IV.1.4. Microscopía electrónica de transmisión del cerebro de las crías en P5 y P21:
Por microscopía electrónica de transmisión (MET) se estudiaron el Strt y la CxF de
crías recién nacidas (P5) y a la edad de P21, la misma edad en que se realizaron los estudios
de ICQ en este protocolo experimental.
En el Strt (Fig. 49)8de las crías EtOH se encontraron algunas alteraciones
ultraestructurales. No se observaron alteraciones en los astrocitos, oligodendrocitos ni en
la mayoría de los vasos sanguíneos, aunque en ocasiones sí se observó escaso edema
perivascular. Los axones mielinizados de los estriosomas, tanto en cortes longitudinales
como transversales, mostraban aspecto normal en algunas zonas, pero en otras se eran
claramente anormales. Así, se vieron, por ejemplo, axones seccionados longitudinalmente
que seguían una trayecto claramente sinuoso en el plano de corte, tanto como en planos
transversales, (según se puede deducir de la variación de la sección transversal en el plano
de corte); ello indicando que el axón se desplazaba ligeramente hacia arriba o abajo del
plano observado, curvándose. Se observaron axones curvados repetidamente en uno y otro
sentido lo que, muy plausiblemente, se corresponda con las imágenes “en sacacorcho”
observadas en los axones de los estriosomas vistos en los experimentos de ICQ con
inmunomarcación para Nf-200 (Cfr. Fig. 49 de MET y Fig. 45D de ICQ). El neuropilo en
Figura 49 (en la p róxim a p ág ina). Fotom icrografías de m icroscop ía electrónica d e transm isión en el S trt de las crías P5 y P21 del
pro to co lo de EP E sin prevención del daño.
S e o bse rva n m itocond rias m orfológicam ente anorm ales en A -C (m itocond ria acod ad a en A ; una larg a m itocond ria, en el interior
de una dend rita, con form a groseram ente sem ejante a un signo de interrogación –?– en cuya cavidad parecen disponerse otras
dos pequeñas m itocond rias; m itocond ria co n una expansión bulbosa en C ; en D , en el interior de una dend rita, se observan tres
larg as m itoco ndrias, una d e las cu ales – la de la izquierd a – parec e b ifurcarse junto co n la d en drita q ue la contien e).
E n E se observa un axón de trayecto sinuoso – cam b ia de dirección, alternad am ente, al m enos 4 veces en un corto tram o – q ue
en tres o ca sion es – en am bos extrem os y e n la zona m ed ia d e la im ag en – d ism inuye su secc ión de co rte, indica ndo claram en te
que se aleja del plano del corte que se m uestra. Las m itocond rias tienden a ubicarse en la perifieria. E n F-H se m uestran im ágenes
de un axón norm al (F ) y dos segm ento s contig uos del axón m ostrado en E (la orienta ción no se ha respeta do en H sino que se lo
dispuso de m odo tal que su puediera apreciar aproxim adam ente en paralelo los filam entos del citoesqueleto en las tres im ágenes
qu e se m u e stra n in ve rtida s, en ne ga tivo p ara perm itir ob servarlo c on m ás clarida d). E l citoesq ue leto en el axó n n orm al (F) se
a pre cia m á s ordenado que en G y H en los que, por ejem p lo en G , se ob servan zonas en p arches en las q ue falta el citoesq ueleto.
S e o bse rva ron neuronas con núcleos de conto rn os claram ente irregulares, con pro fundas escota duras (I), lobulados (J ) y m ultiindenta dos (K ) e n los que, sin em barg o, se aprecian los nucléolos (K ) rodeados por u na cro m atin a laxa de aspecto norm al.
M ag nifica ciones prim arias: 4400 × (I); 50 00 × (E ); 70 00 × (B ,D ,J,K ); 20 00 0× (A ,C ); 31 50 0× (F,G ,H ).
157
158
Resultados
general, y las sinapsis en particular, no mostraron alteraciones ultraestructuralmente
apreciables.
En la CxF (Fig. 50)9de las crías EtOH tampoco se encontraron alteraciones en los
astrocitos, en los oligodendrocitos. El compartimiento vascular estaba mayormente
inalterado (Fig. 50K) si bien que, en ocasiones se observó (igual que en el Strt) esacaso
edema perivascular. Sin embargo, al lado de neuronas piramidales de aspecto en todo
normal (Fig. 50K) se encontraron, a pocos micrómetros de distancia, otras neuronas,
también piramidales, de aspecto “adelgazado”, de citoplasma poco abundante retraído sobre
el núcleo, y con escaso edema perineuronal (Fig. 50L) que se corresponderían con las
imágenes de las neuronas piramidales anormales previamente observadas y descriptas en
la CxF, en los cortes de vibrátomo teñidos con azul de toluidina (cfr. ut supra Fig. 34). Se
observaron también alteraciones ultraestructurales en algunas prolongaciones neuronales
(no en todas), principalmente en las largas dendritas de las neuronas piramidales. En estas
se observó, por ejemplo, sinuosidad del recorrido dendrítico en el plano de corte,
compatible con un trayecto “en sacacorcho” que se corresponde con el hallado en los
Figura 50 (en la p róxim a p ág ina). Fotom icrografías de m icroscop ía electrónica d e transm isión en la C xF de las crías P5 y P21 del
pro to co lo de EP E sin prevención del daño.
S e o bse rva n m itocond rias de gran long itud (m egam itcondrias) y ubicación preferentem ente periférica dentro de las dendritas
ap ica les de n eu ronas piram idales (flec has neg ras, en A ), algunas d e las cu ales se ac odan y cam bian de dirección den tro y fuera
de l plano de co rte (flech a inferior en A ; C ). E n B se observan do s gruesas de nd ritas (d); la de la d erecha recibe un a sina psis (s)
so bre un a e spina dendrítica (*); en la dendrita de la izq uierd a se ob serva una m egam itocond ria d e ub icación p eriférica. En D , un
gru po de , a l m enos, 8 m itocondrias ubicadas en el c itop lasm a q ue ocup a una g ran ind entación nuclear en una neurona; d os d e
e sa s m ito co ndrias, una de ellas en form a de clava o m aza (m ) p arecen estar d ivid iénd ose p or fisión b inaria. En E, d entro d e una
den drita, se o bservan dos m itoco ndrias, una de ellas de dirección ca m bian te (prese nta 3 ac odad uras de an gulo obtuso ) y la o tra
c la ra m e nte bifurcada en Y; m ás arriba, otra m itocon d ria en form a de U ab ierta. En F, una m itocond ria larg a y sinuosa, acod ad a
en 3 oportunidades (u na de ellas saliendo del plano de corte). E n G se observa una larg a dendrita (d ) a p ic a l sinuosa, cuyo eje
c am bia de dirección en dos oportunidades; en su interior, una m itoco nd ria (m ) b ifurcad a en Y d e b razos cerrados, uno de los
c ua le s (e l izquierdo) parece salir del plano del corte ap enas orig inad o d el tronco com ún.
Lo s n ú cle os de m uchas d e las neuronas presentaron (igual que en el S trt) indentaciones m últiples (H ) o ún icas y profund as (J)
m ie ntra s o tras neuronas m ostraron núcleos con escotaduras d ob les enfrentadas q ue p rácticam ente lo b ilob ulaban d ejand o un
puente de nucleoplasm a relativam ente delgado entre las dos m asas nucleares m ayores. E n H : g, aparato de G olgi; reg: retíc ulo
en doplasm ático gran ular.
E n K y L s e observan dos neuronas piram idales. La neurona d e la izq uierd a (K ) es una célula de ap ariencia en tod o norm al, con
abund ante citoplasm a en el que se observa toda la variedad norm al de organelas, la em ergencia d e d endritas apical (da) y basal
(db), e l n ú cle o central, elipsoidal, con la crom atina laxa y d os nucléolos visib les (nu). A su lado, un capilar norm al (vs). La neurona
de la d erecha (L) se ub icab a en cercan ías de la preced en te, en la m ism a g rilla estud iad a, y se observa ad elga zad a, co n e scaso
citoplasm a retraído sobre el núcleo, a u n q u e d e a p a riencia norm al en su interior, retraído del resto del tejido por edem a
perineuronal (pu ntas de flec ha blan ca ); el núcleo an gostado y con la cro m atina levelm en te m ás co nden sada que lo norm al pero
co n un nucléo lo claram en te prese nte (nu). Inm ed iatam en te a la izq uierd a de la neu rona afectad a se observa u na larga d en drita
en cu yo interior hay una m eg am itoco ndria (m ).
M ag nifica ciones prim arias: 3150 × (A ,K ,L); 44 00 × (H ,I,J); 50 00× (G ); 20 00 0× (B -F).
159
160
Resultados
experimentos de ICQ realizados con anticuerpos anti-Nf-200 (Cfr. Fig. 50 de MET y Fig.
45D,F de ICQ). Estas dendritas sinuosas muchas veces contenían largas mitocondrias en
su interior, de aspecto también sinuoso, acompañando su recorrido; más aún, muchas de
esas mitocondrias sinuosas (contenidas en dendritas sinuosas) presentaban, además,
aberraciones morfológicas. En otras ocasiones se encontraron, en el interior de largas
dendritas apicales, mitocondrias de gran longitud y ubicación inusualmente periférica. Se
han observado mitocondrias bifurcadas en Y, ampliamente acodadas; bifurcadas en Y y,
a la vez, de ramas de trayecto sinuoso; mitocondrias dismórficas en forma de clava o maza
contenidas en el citoplasma que llenaba las indentaciones nucleares, etc. (Fig. 50). Igual
que en el Strt, en la CxF el neuropilo y las sinapsis no mostraron alteraciones
ultraestructurales.
IV.2.
Protocolo de exposición prenatal al etanol con prevención del daño por
administración de buspirona:
IV.2.1. Resultados generales del tratamiento:
IV.2.1.1.
Consumo de alimento:
Las hembras de los cuatro grupos experimentales del presente protocolo: control-salina
(CS), control-buspirona (CB), etanol-salina (ES) y etanol-buspirona (EB), fueron sometidas
a un período de “aclimatación metabólica” de 6 semanas de duración durante el cual su
161
Resultados
aumento de peso, consumo de alimento y bebida e ingreso calórico fue en todo similar.
Dado que en esta serie de experimentos las hembras se diferenciaron entre sí por su
pertenencia a distintos grupos recién a partir del ingreso al período gestacional, se presentan
los datos relevantes solamente para este período experimental.
Durante la gestación las hembras de los distintos grupos consumieron diariamente
cantidades equivalentes de alimento, medido en g/kg/d (Anexo VI, Tabla 2). Sólo el grupo
de hembras EB difirió significativamente de lo consumido por el grupo CS durante la
gestación (Fig. 51), pero estas hembras pesaron, desde el inicio, siempre menos que las
hembras de los otros grupos.
Figura 51. C onsum o de alim ento (en g/kg/d y kC al/kg/d) durante el período de tratam iento gestacional
de las hem bras de los cuatro grupos e xp erim entales d el p rotocolo d e EP E con p revención d el d año p or
ad m inistración de b usp irona. ** P < 0,01. A N O V A de dos vías + post-test de D unnett.
IV.2.1.2.
Consumo de bebida:
El consumo diario de líquido durante toda la gestación fue equivalente en todos los
grupos experimentales (considerado en ml/kg). Ningún grupo difirió significativamente de
lo bebido por las hembras CS cuando a cada uno de ellos se lo comparó con este grupo
162
Resultados
(ANOVA seguido de posttest de Dunnett). Sin embargo, si se comparan todos los grupos
entre sí (ANOVA seguido por post-test de Student-Newman-Keuls), se observa que la
única diferencia significativa es la existente entre los grupos CB y ES (Fig. 52).
Considerado desde el punto de vista de la cantidad de líquido bebido diariamente por
cada animal individual (ver valores en la Tabla 2, Anexo VI), las únicas diferencias
significativas se hallaron entre lo consumido por las hembras CB con respecto a las que
recibieron EtOH, es decir, las de los grupos ES y EB, cuando se realizaron comparaciones
múltiples (ANOVA seguido por el test de Student-Newman-Keuls; Fig. 52). Sin embargo,
si a la cantidad media consumida por los individuos de cada grupo experimental se la
compara únicamente con la bebida por el grupo control (CS; es decir, ANOVA seguido por
el test de Dunnett) no se hallan diferencias significativas (gráficos no mostrados).
Figura 52. C onsum o de bebida (en m l/k g/d y m l/anim al/d ) p or p arte de las hem b ras d e cad a uno de los
cuatro grupos experim entales durante el p eríod o de tratam iento g estacional en el p rotocolo d e EP E con
preve nción del dañ o por la a dm inistración de b uspirona. * P < 0,05. A N O V A d e d os vías + p ost-test d e
S tuden t-N ew m an -K eu ls de co m pa racion es m últiples.
IV.2.1.3.
Consumo de etanol:
El consumo de EtOH fue paralelo al del líquido. Durante la gestación las hembras del
163
Resultados
grupo ES consumieron una media de 5,85 ± 0,69 g/kg/d de EtOH, con un rango de 4,537,11 g/kg/d. Las del grupo EB consumieron una media algo superior de 6,51 ± 0,71g/kg/d
(P = 0,0031) con un rango de 5,63-8,49 g/kg/d (Figs. 53 y 54; Anexo VI, Tabla 2). Las
hembras del grupo EB ingirieron 11,3% más de EtOH diariamente que las hembras ES.
Figura 53. C antidad de E tO H consum ido (en g/kg/d y kC al/kg/d) por las hem b ras de los grupos E S y E B
durante el período de tratam ien to gestacional en el p rotocolo d e EP E con p revención d el d año p or
ad m inistra c ió n d e b usp irona. Los n úm ero s en blan co por sobre la línea punteada e n la b arra
co rresp ondien te al grupo E B indica el porcentaje d e consum o co n resp ec to al del grupo E S (base 1 00 ).
** P < 0,01. Test t de S tuden t de d os colas.
Figura 54. E vo lución del co nsu m o de E tO H (en g/kg/d) de las hem bras de los grupos E S y E B duran te el período de tratam ien to
gestacional en el protocolo de E P E con prevención d el daño p or adm inistración d e buspirona.
164
Resultados
IV.2.1.4.
Ingreso calórico total:
Si se consideran solamente las calorías
aportadas por el alimento, el grupo de
hembras EB es el único que difirió
significativamente del grupo CS en cuanto
a ingreso calórico diario durante la
gestación (Fig. 53 derecha; Anexo VI,
Tabla 2). Pero, el EtOH consumido les
aportó a los grupos que lo recibieron 41,36
± 4,86 y 46,03 ± 5,01 kCal/kg/d para los
grupos ES y EB, respectivamente. Así, las
calorías
aportadas
por
el
Fig ura 55.C onsum o calórico total d iario d e las hem b ras d e los
grupos C S , C B , E S y E B duran te el períod o de tratam ien to
g estacional d e l p rotocolo d e EP E con p revención d el d año p or
adm inistración d e buspirona. E n la parte superior de las barras
cor resp ondientes a los g rup os ES y EB , la zona g risada
corresp onde a l porcentaje d el V C T ap ortado por el E tO H . *** P <
0,0 0 01. A N O V A de do s vías + po st-test de S tuden t-N ew m an sK eu ls de co m pa racion es m últiples.
EtOH
representaron 20,16% y 24,55%, respectivamente, del valor calórico total diario ingerido
por cada uno de los grupos crónicamente intoxicados.
Si se tiene en cuenta ahora la totalidad de las calorías ingresadas diariamente por las
hembras gestantes (provenientes del alimento y del EtOH) se observa que, comparadas con
el grupo CS, sólo las hembras de los grupos ES y EB ingresaron cantidades
significativamente mayores de calorías (ANOVA seguido por el testde Dunnett; gráfico no
mostrado). Si se comparan todos los grupos experimentales entre sí (Fig 57; ANOVA
seguido por el test de Student-Newman-Keuls), se observa que los subgrupos de animales
dentro de un mismo grupo (CS y CB por un lado, y ES y EB por otro) no difirieron entre
sí en su consumo calórico. Pero, al mismo tiempo, cada uno de los dos grupos que
165
Resultados
recibieron EtOH (ES y EB) ingirieron significativamente más calorías que cada uno de los
grupos que bebieron agua (CS y CB) independientemente de que hubieran o no recibido
buspirona entre los días E13-E20 (Figs. 55 y 56; Anexo VI, Tabla 2).
F igu ra 56 . Evolución del consum o calórico total (alim ento + b eb id a) d urante el tratam iento g estacional d e las hem b ras d e cad a
grupo experim etal en el protocolo de E P E con prevención d el daño por adm inistración d e buspirona.
IV.2.1.5.
Evolución ponderal de las hembras:
A semejanza de lo ocurrido en el anterior protocolo experimental, la ganancia de peso
de las madres durante los períodos de tratamiento pregestacional y gestacional fue
equivalente para los cuatro grupos de tratamiento.
Como puede verse en las Figs. 57 y 58 y en el Anexo VI, Tabla 2 la evolución del peso
de las hembras de los cuatro grupos fue paralela y en todo comparable a lo largo de la
gestación, independientemente de que hubieran recibido o no EtOH y/o buspirona. Más
166
Resultados
aún, durante el período de administración de esta última droga (E13-E20), no se alteró en
nada la evolución del peso de las hembras que la recibieron (Fig. 52). Las hembras del
grupo EB, con respecto a las del grupo CS eran las de menor peso hacia el final de la
gestación, pero la diferencia de peso fue exactamente la misma que existía al inicio de la
misma (48 g). Las hembras de cada grupo aumentaron porcentajes similares de su peso
corporal durante la gestación (134-144% sobre el valor inicial) (Fig. 54).
A pesar de que las hembras de los grupos expuestos dejaron de recibir EtOH al momento
del parto (P0), se siguió su evolución ponderal durante toda la lactancia y, hacia el
momento del destete de sus crías (P21) tampoco se observaron diferencias significativas
en sus pesos, independientemente de que hubieran pertenecido a uno u otro grupo
experimental (Fig. 52).
Figura 57. Peso de las hem bras en distintos m om entos d el tratam iento, en el p rotocolo d e EP E con
preve nción del dañ o por ad m inistra c ió n de b usp irona. Los n úm ero s so bre las b arras al m om en to
gestacional final indican los porcentaje s d e aum ento d e p eso p or sob re aq uellos al inicio d e la gestación
(base 100). Independientem ente del g rup o de tratam iento a q ue p ertenecieran las hem b ras, los
porcentajes d e a um en to de p eso so n de la m ism a m ag nitud. Test t de S tuden t de d os colas.
167
Figura 58. E volución del peso de las hem b ras durante el período de tratam iento gestacional y durante el postparto, discrim inado por grupo de tratam iento (C S , C B , E S y E B ) en el protocolo de E P E
c on pre vención del daño por la adm inistración de b usp irona. Las flechas neg ras en la parte inferior d el g ráfico, en el p eríod o ge sta cio n al, in d ic an lo s d ía s (E 1 3 -E 2 0 ) e n lo s q u e se in ye ctó la bu sp iro n a
a dosis 4,5 m g/kg/d a las hem bras de los gru pos C B y E B o un volum en equivalente de solución salina a las de los gru pos C S y E S . La adm inistración de buspirona no m odificó la evolución de la ganancia
gesta cio nal de peso.
Resultados
IV.2.1.6.
Número de crías, relación machos/hembra, peso de las crías al nacer y su
evolución ponderal hasta P88:
Igual que en el protocolo experimental anterior, la duración de la gestación de todas las
hembras fue de 22 días en los cuatro grupos experimentales.
El tamaño de las camadas que parieron las hembras y la relación machos/hembra fue
estadísticamente equivalente para los cuatro grupos y también lo fue el peso de las crías al
nacer y la ganancia de peso de esas crías hasta el día P88 (Figs. 59 y 60; Anexo VI, Tabla
2).
El peso de las crías al nacer fue estadísticamente equivalente para los cuatro grupos de
tratamiento tanto se lo considere en forma global (machos y hembras en conjunto) como
si se lo discrimina por sexo (Fig. 59; Anexo VI, Tabla 2). La relación de peso entre los
machos y las hembras dentro de una misma camada también fue equivalente para los cuatro
grupos (Anexo VI, Tabla 2).
F igu ra 59 . G ráficos relativos a las crías de las hem b ras d el p rotocolo d e EP E con p revención d el d año p or adm inistración d e
buspiro na. A N O V A + post-test d e D unnett. E n ninguno de los gráficos se observaro n diferencias significativas.
169
Resultados
El tamaño de las camadas tampoco difirió estadísticamente para los cuatro grupos y
estuvo dentro de los parámetros considerados como normales (Fig. 59; Anexo VI, Tabla
2).
La relación machos/hembra estuvo dentro de lo esperado como normal (ligeramente más
machos que hembras en cada camada) excepto para las crías de las hembras pertenecientes
al grupo ES en las que la relación se invirtió (Fig. 59; Anexo VI, Tabla 2).
No se observó ningún caso de malformación congénita (microcefalias incluídas). Su
crecimiento y desarrollo fue normal.
La evolución del peso de las crías de los cuatro grupos fue paralela desde el nacimiento
y hasta la edad de P88, último momento en que fueron evaluadas antes de la realización de
los estudios conductuales (Figs. 59 y 60). No se observaron diferencias estadísticas en el
peso de estas crías.
Figura 60. E volución d el peso postnatal de las crías m acho, discrim inadas por grupo de tratam iento, desde P0 hasta P 88,
en el protocolo de E P E con prevenvión d el daño p or adm inistración d e buspirona.
170
Resultados
IV.2.1.7.
Alcoholemia en madres y crías:
Al igual que en el protocolo anterior, las hembras fueron evaluadas por medio de escalas
conductuales de intoxicación a lo largo de los períodos de tratamiento pregestacional y
gestacional. En ningún caso mostraron signos de intoxicación por EtOH.
A pesar de que, al momento del parto, se hubo realizado una suspensión brusca de la
administración de EtOH, en ninguna de las hembras que lo recibiera se pudieron observar
signos de abstinencia cuando fueron evaluadas por medio de las escala de abstinencia para
ratas de Penland et al. (2001) y para ratones de Ikeda et al. (1999).
Las alcoholemias medidas en hembras y crías fueron comparables a las obtenidas en el
protocolo experimental previo, es decir, bajas y en el orden de los 15-25 mg/dl (3,25-5,42
mM).
IV.2.2. Experimentos de inmunocitoquímica:
IV.2.2.1.
Serotonina (5-HT):
A lo largo del desarrollo postnatal de las crías CS se observó que la DOR del citoplasma
de las neuronas 5-HT-ir en los NDR y NMR siguió un patrón similar de variación desde P5
y P21 hasta P90, con un claro pico de expresión hacia P35, de mayor magnitud y pendiente
de ascenso y descenso para el correspondiente al NMR. Luego del pico de P35 se observó,
en ambos núcleos, una disminución hacia P60 y un posterior nuevo aumento hacia P90
171
Resultados
(Fig. 61; Anexo VII, Tabla 2).
El perfil de la DOR en los animales
ES mostró un perfil similar al de los
animales CS entre P5 y P21 para el
NMR y entre P60 y P90 para ambos
núcleos; sin embargo, tanto en el NDR
como en el NMR, fue evidente la
ausencia del pico de expresión en P35
en los animales ES. Es decir, hacia P35
en ambos núcleos de los animales ES se
vió una curva aplanada de la DOR de
las neuronas 5-HT-ir con respecto a la
de los animales CS (Fig. 61). La adición
de buspirona al tratamiento de las
hembras que recibían EtOH (grupo EB)
hizo que la curva de la DOR de las
neuronas 5-HT-ir se modificara en sus
crías con respecto a la del grupo ES.
Así, para el NDR, en P35 y P60 los
Figura 61. D ensidad óp tica relativa del citoplasm a de las neuronas 5H T-ir, a distin ta s edades, en los núcleos dorsal y m edial d e l rafe
m e sencefálico (N D R y N M R ) en las crías postnatales som e tidas a E P E
con prevenció n d e l daño por adm inistración de buspirona. C S :
control-salina; C B : control-buspiro na; E S : eta nol-salina; E B : eta nolbuspirona. E dad es evaluad as: para el N D R : P 21 , P 35 , P 60 y P 90 ; para
el N M R : P 5, P 21, P 35, P 60 y P 90. S e grafican los valores absolutos en
unida des de D O R . * P < 0,05. ** P < 0,01. A N O V A de dos vías + posttest d e D unnett, p ara cada ed ad .
niveles de DOR en los animales EB no
se diferenciaron de los niveles del grupo CS, en tanto que hacia P90 cayeron por debajo del
nivel de CS y ES. En el NMR, por otro lado, la adición de buspirona al tratamiento de la
hembras EtOH (grupo EB) indujo que el perfil de la curva entre P5 y P90 fuera en todo
172
Resultados
similar a la de CS, incluyendo el pico de expresión en P35 (Fig. 61). Es llamativo que en
los animales EB, las curvas de la DOR, aunque se acercaron al perfil mostrado por las crías
CS y se alejaron a la vez de las del grupo ES, mostraron algunas desviaciones llamativas
de las curvas de los animales CS: por ejemplo, en el NDR, en P21 y en P90 los niveles
fueron mayor y menor, respectivamente, a los de los grupos CS y ES que, salvo por el pico
de P35, mostraron un perfil similar. En el NMR el nivel de la DOR en P5, si bien no fue
estadísticamente diferente a los de CS y ES, mostró una clara tendencia a ser mayor.
Por último, en los animales cuyas madres recibieron buspirona durante el embarazo a
la vez que bebían agua (grupo CB) se observaron varios hechos llamativos: i) en el NDR,
a la edad P21 y P60, los niveles de DOR no fueron diferentes a los de los animales CS, pero
en P35 fueron mucho mayores que en CS y mostraron un pico exacerbado (Figs. 61 y 62)
en tanto que hacia P90 su nivel, si bien no significativamente diferente al de los animales
CS, sí mostró una tendencia a la disminución, acercándose al nivel que mostraron las crías
EB, en vez de aumentar nuevamente desde P60 como lo hicieron las del grupo CS; ii) en
el NMR, los niveles de la DOR en las crías P5 fueron significativamente mayores que en
el grupo CS (a semejanza de los de las crías EB, aunque en estas no hubo diferencias
estadísticamente significativas), en tanto que en las otras edades (P21, P35, P60 y P90) sus
niveles fueron en todos iguales a los de los animales CS.
Figura 62. N eu ron as 5-H T-ir del N D R a la edad P 35 del protocolo de E P E con prevención d el daño p or adm inistración d e buspirona.
L o s gru po s d e tratam iento son CS (A ), C B (B ), ES (C ), y EB (D ). V éase la exp licación d etallada en el texto. B arra de escala en A
= 20 :m (válida p ara A -D ).
173
Resultados
IV.2.2.2.
Proteína gliofibrilar ácida (GFAP):
En el CA1 Hipp de las crías de edades P5, P21, P35 y P60 se observó un aumento
consistente y sostenido del área celular de los astrocitos GFAP-ir incluso en la edad adulta
(P60). La curva del área celular de los astrocitos en esta área de los animales CS mostró un
pequeño pico coincidente con la edad P21 y una posterior disminución paulatina en P60
y P90 (Figs. 63 y 65; Anexo VII, Tabla 2). En los animales ES, el área celular estuvo
significativamente aumentada, con respecto a CS, en todas las edades y el pico se localizó
en P35. Para los animales EB, es decir, aquellos a cuyas madres se les administró buspirona
juntamente con el EtOH en el agua de bebida, se observó que el área celular astrocitaria
disminuyó en todas las edades evaluadas y no difirió estadísticamente de los valores de los
animales CS en P5 y P21, aunque sí en P60 y P90. Por otro lado, el pico del área celular
astrocitaria, igual que en CS, volvió a observarse en P21 aunque posteriormente, en vez de
bajar, volvió a subir en P60 a partir de P35 (Figs. 63 y 65; Anexo VII, Tabla 2). Por último,
en los animales CB, los niveles del área celular de los astrocitos en el CA1 Hipp no
variaron estadísticamente con respecto a los niveles observados en los animales CS pero
el perfil temporal fue diferente en tanto que el pico de aumento se observó en P35 con una
leve disminución posterior hacia P60 (Figs. 63 y 65; Anexo VII, Tabla 2).
En la CxF, se evaluó el área celular de los astrocitos en tres edades postnatales: P21, P35
y P60. La curva de los animales CS mostró un pequeño valle a la edad P35 con un fuerte
aumento posterior hacia P60 coincidente con el inicio de la adultez. En los animales ES los
174
Figura 63. A stroc itos G FA P-ir en el H ipp de las crías de ed ad es P 5, P 21 , P 35 y P 60 de los g rupos d e tratam ien to
C S , C B , E S y E B del pro to colo de E P E con prevención del daño por adm inistración de buspiro n a . V é ase la
explicación d etallada en el texto. E l recuadro en P 60 E B m uestra un astrocito con el citoesqueleto alterado de tal
m odo que una de sus prolong aciones exhibe un p erfil en sacacorcho. B arra de escala en P 5 C S = 50 :m (válida p ara
todas las edades y tratam ientos) y 20 :m en el recuadro.
175
Figura 64. A stroc itos G FA P -ir en la C xF de las crías de edades P 21, P 35 y P 60 d e los g rupo s de tratam iento C S , C B , E S y EB del
pro to co lo de EP E con prevención del daño por adm inistración d e b usp irona. V éase la exp licación d etallada en el texto. B arra de
escala en P 21 C S = 50 :m (válida p ara todas las ed ad es y tratam ien tos).
176
Resultados
niveles del área celular de
los astrocitos estuvieron
aumentados
fuerte
y
significativamente
en P21 y en P35 y
disminuidos (con respecto a
CS)
en
P60,
con
la
particularidad de que el
perfil de la curva fue
inverso al observado en los
animales CS, es decir, en
P35 se observó un pico en
lugar de un valle (Figs. 64 y
65; Anexo VII, Tabla 2).
Figura 65. Á rea celular de los astrocito s G FA P -ir en el stratum radiatum del área C A 1
de l hipoc am po (C A 1 H ipp) y en la co rteza fron tal (C xF), a d istintas ed ad es postna tales,
en las crías som etid as a EPE con p revención d e l d año p or adm inistración d e
buspiro n a . C S : control-salina; C B : control-buspiro na; E S : eta nol-salina; E B : eta nolbuspirona. Ed ad es evaluad as: P5, P21, P35 y P60 en C A 1 H ip p y P21, P35 y P60 en C xF.
Se grafic an los valores absolutos d el área celular en :m 2. ** P < 0,01. A N O V A d e d os
vías + po st-test D unnett, p ara cada ed ad .
En los animales EB se restituyó por completo el perfil normal del área astrocitaria
observado en las crías CS si bien que el nivel en P21 fue significativamente menor para este
grupo de tratamiento. Por último, en los animales del grupo CB se observó una curva de
perfil idéntico al observado en los animales del grupo CS aunque con una disminución
estadísticamente no significativa (Figs. 64 y 65; Anexo VII, Tabla 2).
Se observaron alteraciones morfológicas cualitativas similares a las vista en el protocolo
anterior, en las prolongaciones de algunos de los astrocitos GFAP-ir en los animales
sometidos a EPE independientemente de que hubieran o no recibido buspirona (ver, por
ejemplo, en la Fig. 63 el recuadro en el grupo EB edad P60).
177
Resultados
En el Strt no se evaluó el área celular de los astrocitos.
IV.2.2.3.
Proteína S100B (S100B):
La expresión de la S-100B fue evaluada en el CA1 Hipp de las crías postnatales
sometidas a EPE con prevención del daño por administración de buspirona a las madres
gestantes concomitantemente con el consumo de EtOH en el agua de bebida.
Las curvas de los valores obtenidos de la DOR del citoplasma de los astrocitos S-100Bir mostraron un perfil en U amplia, a concavidad superior, similar para todos los grupos de
tratamiento y con valores mínimos en P35 para el grupo CS. Los valores del grupo ES
fueron superiores a los del CS en todas las edades; la administración concomitante de
buspirona al grupo de madres que bebieron EtOH (grupo EB) hizo que los valores de la
curva correspondiente se acercaran a los del grupo CS y no difirieran estadísticamente
excepto para la edad P60 en la que los niveles fueron mayores en EB que en CS, pero sin
llegar a ser tan altos como los de ES. Los valores correspondientes a las distintas edades
del grupo CB no difirieron de aquellos del grupo CS; en P60 se noto un aumento no
significativo por sobre los valores de CS que tendieron a acercarse a los valores del grupo
EB (Figs. 66 y 67; Anexo VII, Tabla 2). Se observaron nuevamente, a semejanza de lo
ocurrido en el protocolo experimental anterior, alteraciones morfológicas de los astrocitos
en virtud de las cuales las prolongaciones de algunos de ellos, en los grupos sometidos a
la administración de EtOH, es decir, ES y EB, se mostraron zigzagueantes, onduladas, en
tirabuzón (Cfr. Fig. 66, grupo ES en P35, y EB en P35 y P60).
178
Figura 66. A stroc itos S-100B-ir en el H ipp de las crías de e dad es P 5, P 21 , P 35 y P 60 de los gru pos de tratam ien to
C S , C B , E S y EB del protocolo de E P E con prevención del daño por adm inistración de buspirona. Las flechas en
P 3 5 ES, P35 EB y P60 EB señalan prolongaciones citop lasm áticas en sacacorcho. V éase la exp licación d etallada
en el texto. B arra de escala en P 5 C S = 20 :m (válida p ara todas las ed ad es y tratam ien tos).
179
Resultados
Figura 67. D ensidad óp tica relativa de los astrocitos S 10 0B -ir, a distintas edades postnatales, en el
stratum radiatum del área C A 1 del hipocam p o (C A 1 H ip p ) d e las crías p ostnatales som etid as a EPE con
prevención del daño por adm inistración de buspirona. C S : control-salina; C B : control-buspiro n a; E S :
etanol-salina; E B : etanol-buspirona. E dades evaluadas: P 5, P 21 , P 35 y P 60. S e grafican los valores
ab so lutos en unidad es de D O R . * P < 0,05; ** P < 0,01. A N O V A de d os vías + post-test de D unnett p ara
cad a u na de las ed ad es.
IV.2.2.4.
Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2):
En este protocolo experimental la expresión de la MAP-2-ir se evaluó en dos áreas
prosencefálicas: el CA1 Hipp y la CxF. En ambas regiones, su inmunomarcación mostró
un perfil filamentoso o fibroso orientado predominantemente según la orientación de las
dendritas apicales de las neuronas piramidales de ambas áreas.
En el CA1 Hipp los niveles del área relativa de tejido cerebral ocupado por las fibras
MAP-2-ir aumentó con una pendiente suave desde P5 hasta P90, con un leve incremento
de la pendiente entre P21 y P35, coincidiendo con el final de la infancia y el inicio de la
adolescencia. Hacia P90 el aumento final del área relativa fue de 129,32% con respecto a
P5 (Figs 68 y 70; Anexo VII, Tabla 2). En los animales del grupo ES la curva de valores
del área relativa de las fibras MAP-2-ir en relación con la edad evaluada se ubicó en valores
sostenidamente menores que los del grupo CS, con una leve pero perceptible disminución
180
Resultados
entre P5 y P21, un cambio relativamente abrupto de la pendiente (con aumento) entre P21
y P35 y un nuevo estancamiento entre esta última edad y la siguiente, P60, en la que el
valor, incluso, disminuyó con respecto a la anterior; entre P60 y P90, nuevamente, un
incremento leve de la pendiente. Entre P5 y P90, sin embargo, no se observó el aumento
total que se observara en CS sino que, por el contrario, el aumento entre estas dos edades
fue de solamente 117,9% (Anexo VII, Tabla 2). Es decir, en los animales ES los valores del
área relativa de las fibras MAP-2-ir partieron de niveles más bajos en P5 y no llegaron,
siquiera, a tener un nivel de aumento comparable con el del grupo CS. En aquellos animales
sometidos a EPE a cuyas madres se les administró buspirona concomitantemente (grupo
EB), los valores se acercaron a los del grupo CS en todas las edades, con dos excepciones:
en P5, los valores en EB fueron significativamente mayores que en los de CS y
significativamente mayores en P60, con valores estadísticamente comparables en P21, P35
y P90, por lo que el perfil de la curva presentó un valle en P21 que alteró la armonía del
cambio de los valores que se observara en el grupo CS entre las sucesivas edades. Por
último, en los animales del grupo CB (cuyas madres bebieron agua en todo momento y
recibieron buspirona) la curva de aumento del área relativa de las fibras MAP-2-ir, si bien
en todas las edades fue estadísticamente similar en valores a la del grupo CS, no presentó
el aumento armónico que mostró esta última aunque, globalmente, entre P5 y P90
aumentara un 139,42%.
En la CxF, se observó que el área relativa de tejido nervioso ocupado por las fibras
MAP-2-ir, en el cerebro de las crías del grupo CS, presentó una disminución transitoria en
la edad P35 a partir de los valores previos de P21 para volver a aumentar hacia P90,
quedando este fenómeno, en la curva temporal, representado por un valle. Igual perfil
181
Figura 68. Fibras M A P-2-ir en el H ipp de las crías de edades P 5, P 21, P 35 y P 60 de los grupos de tratam iento C S ,
C B , ES y EB del protocolo de EP E con prevención d el d año p or adm inistración d e b usp irona. V éase la exp licación
detallada en el texto. B arra de escala P 5 C S = 50 :m en (válida p ara todas las ed ad es y tratam ien tos).
182
Resultados
Figura 69. Fibras M A P -2-ir en la C xF de las crías de edades P21, P 35 y P 60 de los grupo s de tratam iento C S , C B , E S y EB del
pro to co lo de EP E con prevención del daño por adm inistración d e b usp irona. V éase la exp licación d etallada en el texto. B arra de
escala P 21 C S = 50 :m en (válida p ara todas las ed ad es y tratam ien tos).
183
Resultados
presentó la curva correspondiente a la CxF de las crías del grupo ES, pero a niveles mucho
más bajos (aproximadamente la mitad). Las crías sometidas a EPE y cuyas madres
recibieran buspirona entre los días E13 a E20 de la gestación (grupo EB) mostraron un
perfil similar al de las crías CS en niveles estadísticamente equivalentes.
Por último, lo mismo sucedió para las crías de madres del grupo CB (Figs. 69 y 70;
Anexo VII, Tabla 2).
Figura 70. Á rea relativa de te jido cerebral ocupado por las fibras M A P -2-ir en el stratum
radiatum del área C A 1 d el hipoca m po (C A 1 H ipp ) y en la c orteza frontal (C xF ) a
distintas edades de las crías postnatales som etid as a EPE con p revención d el d año p or
la adm inistración de buspiro na. C S : control-salina; C B : control-buspiro na; E S : eta nolsalina; E B : etanol-buspirona. E dades evaluadas: P 5, P 21, P 35, P 60 y P 90 para el C A 1
H ipp y P21, P35 y P60 para la C x F. Se p resentan los valores absolutos en unid ad es d e
área relativa. * P < 0,05. ** P < 0,01. A N O VA de d os vías + post-test de D unnett, para
cada edad.
184
Resultados
IV.2.3. Experimentos conductuales en P90:
En un grupo de ratas macho de una segunda tanda experimental de animales, criados ad
hoc, del protocolo de EPE con prevención del daño por administración de buspirona, se
realizaron estudios conductuales cuando estas alcanzaron la edad P90. Estos estudios se
llevaron a cabo con la finalidad preliminar de evaluar si las alteraciones morfológicas que
se habían observado en los cerebros de los animales tratados de igual manera presentaban
o no un correlato funcional en dos aspectos importantes de la conducta animal: el
comportamiento motor y el grado de ansiedad
provocados por la exposición a un ambiente
novedoso. El estudio se realizó con el
dispositivo del campo abierto según lo
descripto en el apartado III.2.7. (Estudios
conductuales) de la sección de Materiales y
Métodos. En una misma sesión experimental
se evaluaron ambos parámetros conductuales.
En cuanto a la respuesta motora frente a la
exposición a un ambiente novedoso, los
animales del grupo CS realizaron, en los 5
minutos que duró la evaluación, 53,22 ± 15,68
(n = 10) cruces de cuadros; los del grupo CB
realizaron 42,33 ± 11,04 (n = 15); los del
grupo ES 63,0 ± 18,86 (n = 10) y los del
Fig u ra 71. Evaluaciones cond uctuales en ratas m acho d e
edad P90 som etid as a EPE con p revención d el d año p or
adm inistración de buspiro na. A rriba, resulta dos de la
evaluación de la conducta m oto ra y abajo, resulta dos de la
evalua c ión de la conducta de ansiedad, am bos, ante la
exp osición a un am b iente novedoso (p rueb a d el cam p o
abierto). T iem po de evaluación: 5 m inuto s. C S : controlsalina; C B : control-buspiro na; E S : eta nol-salina; E B : eta nolbu spiron a. S e rep resen tan los valores ab solutos ( 0 ± E S ). *
P < 0,05. ** P < 0,01. A N O V A de dos vías + post-test d e
S tuden t-N ew m an -K eu ls de co m pa racion es m últiples.
185
Resultados
grupo EB 59,0 ± 15,37 (n = 15) cruces de cuadros. La evaluación de los resultados por
medio del ANOVA de dos vías seguido del post-test de Dunnett mostró que, desde el punto
de vista estadístico, ninguno de los grupos experimentales se diferenció significativamente
del grupo control (CS), pero sí se encontraron diferencias significativas entre los grupos CB
y ES, y CB y EB cuando tras el ANOVA se realizó el post-test de Student-Newman-Keuls
de comparaciones múltiples (Fig. 71).
Con respecto al tiempo de permanencia en el cuadro central como medida del grado de
ansiedad, los resultados de las mediciones para cada grupo experimental fueron: grupo CS:
11,62 ± 5,407 segundos (n = 10); CB: 6,145 ± 4,54 segundos (n = 15); ES: 17,38 ± 18,19
segundos (n = 15); y EB: 11,82 ± 9,12 segundos (n = 15). Realizado el ANOVA de dos vías
seguido por el post-test de Dunnett, se encontró, también aquí, que ninguno de los grupos
experimentales difirió significativamente (desde el punto de vista estadístico) del grupo
control (CS). Cuando, en cambio, se realizaron múltiples comparaciones entre todos los
grupos de tratamiento entre sí por medio del post-test de Student-Newman-Keuls, se pudo
apreciar que el único resultado significativamente diferente era el que comprendía al par
de grupos integrado por CB y ES (Fig. 71).
IV.3.
Protocolo de exposición durante la adolescencia con abstinencia posterior:
IV.3.1. Resultados generales del tratamiento (consumo de alimento y líquido,
alcoholemias y peso de las ratas):
186
Resultados
No hubo diferencias de peso entre los cuatro grupos experimentales antes y después de
los períodos de exposicíon y abstinencia al EtOH.
Durante el período de exposición las ratas del grupo EtOH, cada día, comieron alimento
en una cantidad equivalente a 143,5 ± 13,9 kCal/kg/d (rango: 124,1-170,0). Por otro lado,
bebieron una media de 134,4 ± 32,33 ml/kg/d (rango: 86,81-178,0) de la solución de EtOH
6,6% v/v. Este consumo significó la ingestión de 6,997 ± 1,68 g/kg/d (rango: 4,52-9,27) de
EtOH. De este EtOH, las ratas macho adolescentes obtuvieron 49,47 ± 11,9 kCal/kg/día
(rango: 31,96-65,53). Este ingreso calórico constituyó a su vez un 25,42 ± 4,637% (rango:
18,46-33,12%) para un del VCT diario de 192,9 ± 19,78 kCakl/kg/d (rango: 157,4-230,9).
Al igual que en los protocolos experimentales anteriores, las ratas macho del grupo ido
que las ratas Control, pero a pesar de ello no desarrollaron un estado de deshidratación
detectable.
Las alcoholemias, determinadas en los animales del grupo EtOH, según lo esperado,
fueron bajas y comprendidas en los valores previamente hallados: 19,0 ± 5,2 mg/dl (rango:
16-25 mg/dl = 3,47-5,42 mM). En los animales Control, también según lo esperado, las
alcoholemias fueron indetectables a pesar de haberse realizado para mantener las mismas
condiciones de tratamiento en ambos grupos.
Al comienzo del período de 42 días de exposición al EtOH, todas las ratas tenían una
edad comprendida entre P45 y P50 (adolescencia tardía) y pesaban 194,1 ± 28,11 g (201,3
± 23,4 g las asignadas al grupo control, n = 10, con un rango de 167,0-235,0 g y 186,9 ±
32,05 g las asignadas al grupo expuesto, n = 10, con un rango de 146,0-230,0 g; P =
0,2662). Para el final de este período los animales tenían una edad de P87 a P92 (adultas),
casi habían duplicado su peso inicial (con aumentos de 182,02% y 188,23%,
187
Resultados
respectivamente) y pesaban 366,4 ± 18,15 g y 351,8 ± 29,55. No hubo diferencias
estadísticamente significativas entre los pesos de estos dos grupos (P = 0,6787) (Fig. 72).
Hacia la finalización del período de recuperación de 70 días los machos tenían una edad
de P157 a P162 y pesaban 403,3 ± 16,93 g (Control/R; n = 5) y 395,1 ± 18,72 g (EtOH/R;
n = 5). Nuevamente, no hubo diferencias significativas entre los valores de ambos grupos
(P = 0,7536). Así, durante este período aumentaron 110,07% y 112,3%, respectivamente,
a partir de su peso inicial. Y, con respecto al peso al inicio de todo el período experimental
(exposición más recuperación) los machos Control y EtOH aumentaron 200,44% y 211,4%,
respectivamente.
Figura 72. Peso de los m achos adolesc entes d e los g rup os C ontrol y EtO H al inicio y al final d el p eríod o
de exposición al EtO H y de los m achos ya adultos d e los g rup os C ontrol/R y EtO H /R , tras el p eríod o de
abstinencia. Lo s nú m eros den tro d e las barras en el m om en to de p ost-exp osición y de po st-recuperación
corresponden a los porcentajes de aum ento de peso con respecto al p eríod o anterior, es decir, al
m om ento inicial y al m om ento de po st-ex p o sición, respectivam ente. Los núm eros situados sobre las
barras de los grupo s C o n trol/R y EtO H /R , en el m om ento de po st-recuperación, corresponden al
au m en to de p eso total en relación al m om en to inicial del tratam ien to. Test t de S tuden t de d os colas.
El patrón de exposición crónica al EtOH que utilizamos en este protocolo experimental
no provocó ningún signo conductual de intoxicación aguda o crónica durante el período de
administración ni de abstinencia aguda o crónica al EtOH, en ninguno de los animales,
luego de que la administración del EtOH fuera finalizada abruptamente. Nuevamente, los
188
Resultados
signos de intoxicación, tanto como los de abstinencia, se evaluaron por medio de las escalas
conductuales para roedores de laboratorio previamente utilizadas (Nixon y Crews, 2004;
Penland et al., 2001; Slawecki, 2002).
IV.3.2. Experimentos de inmunocitoquímica:
IV.3.2.1.
Serotonina (5-HT):
La 5-HT-ir se evaluó, por medio del valor de la DOR, en las neuronas del NDR y del
NMR en cortes de niveles mesencefálicos. Para ambos núcleos, no se observaron cambios
significativos en el número de neuronas inmunomarcadas. Las neuronas de estos dos
núcleos presentaron su característico perfil estrellado; la inmunotinción marcó el soma,
oscureció el núcleo de cada una de las neuronas en la mayoría de los casos, y también
marcó las principales prolongaciones citoplasmáticas o el inicio de estas.
En el NDR de los animales del grupo EtOH se observó una disminución significativa
de la 5-HT-ir; el valor de la DOR llegó solo a 0,71 veces del valor de los animales Control
(P < 0,0001; Figs. 73A,B y 74; Anexo VII, Tabla 3). En el mismo núcleo de los animales
del grupo EtOH/R se observó una recuperación del valor de la DOR; este fue 0,97 veces
el valor de los animales Control/R y esta diferencia no fue estadísticamente significativa
(P = 0,7609; Figs. 73A,C y 74; Anexo VII, Tabla 3). En las neuronas de los animales del
grupo EtOH el perfil nuclear siempre fue evidente dado que la inmunotinción, al estar
disminuida, no lo oscureció como sí fue el caso en los animales de los grupos EtOH/R,
189
Resultados
Control y Control/R (Fig. 73B).
F ig u ra 73. N eu ron as 5-H T-ir en el N D R (A -C ) y en el N M R (D -F) d e los m achos del pro to colo de exposición al E tO H durante la
adolescencia con abstinencia posterior. La colum na de la izquierda (A ,D ) c orresponde a los anim ales Co ntrol; la colum na del
m ed io (B ,E ) a los an im ales E tO H ; y la co lum na de la derech a (C -F) a los anim ales E tO H /R .V éa se la d escripción en el texto . B arra
de escala en F = 50 :m (válida p ara A -F).
En el NMR no hubo cambios en los valores medidos de la DOR en el par de grupos de
190
Resultados
animales Control-EtOH ( P = 0,324; Figs. 73D,E y 74; Anexo VII, Tabla 3) ni en el par de
grupos Control/R-EtOH/R (P = 0,9136; Figs. 73D,F y 74; Anexo VII, Tabla 3).
Figura 74. D ensidad óp tica relativa de las neuronas 5-H T -ir d e lo s núcleos dorsal y m edial del rafe m esencefálico en ratas
adolescente s tras el perío do de into xicación y de recuperación en el pro to colo de exposición al eta nol durante la adolescencia
co n ab stinen cia p osterior. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de do s colas.
IV.3.2.2.
Proteína gliofibrilar ácida (GFAP):
En los animales del grupo EtOH, en las tres áreas prosencefálicas evaluadas, los
astrocitos mostraron un cuerpo celular agrandado, con procesos citoplasmáticos más
tortuosos y ramificados y una inmunotinción más intensa comparada con la de los animales
del grupo Control. El análisis morfométrico reveló que el área celular aumentó
significativamente en los animales del grupo EtOH, en todas las áreas.
En el CA1 Hipp el incremento fue de 1,62 veces con respecto al de los animales Control
(P < 0,0001; Figs. 75A,B y 76; Anexo VII, Tabla 3). En el Strt el aumento alcanzó 1,68
191
Fig. 75. A stroc itos G FA P -ir en el H ipp (A -C ), el Strt (D -F), y la C xF (G -I) d e los m achos d el p rotocolo d e exp osición
al E tO H durante la adolescencia con abstinencia posterior. La colum na de la izquierda (A ,C ,D ) corresponde a
los anim ales C ontrol; la colum na del m edio (B ,E,H ) a los anim ales EtO H ; y la colum na d e la derecha (C ,F,I) a los
anim ales E tO H /R . V éase la descripción en el texto. B arra de escala = 100 :m en A y G (válida para A -C y G -I) y
50 :m en D (válida p ara D -F).
192
Resultados
veces el valor del grupo Control (P < 0,0001; Figs. 75D,E y 76; Anexo VII, Tabla 3). En
la CxF el incremento del área celular alcanzó 1,73 veces el valor del Control (P < 0,0001;
Figs. 75G,H y 76; Anexo VII, Tabla 3).
Tras 70 días de abstinencia, los astrocitos del cerebro de los animales del grupo EtOH/R
tendieron a recuperar su morfología normal en las tres áreas a pesar de que el valor medio
de sus áreas celulares aún persistió aumentado con respecto a sus controles (pero disminuyó
con respecto al que tenían los del grupo EtOH).
Así, los astrocitos del CA1 Hipp mostraron un incremento del área celular que alcanzó
un valor 1,24 veces el de sus respectivos controles (P < 0,0001; Figs. 75A,C y 76; Anexo
VII, Tabla 3) pero, al mismo tiempo, este valor representó 0,77 veces el valor del grupo
EtOH.
En el Strt, el valor del área celular alcanzó 1,11 veces el de los Control/R (P < 0,0001;
Figs. 75D,F y 76; Anexo VII, Tabla 3) pero fue 0,66 veces el valor del grupo EtOH.
Finalmente, en la CxF, el valor del área celular fue 1,26 veces mayor que en el
respectivo control (P < 0,0001; Figs. 75G,I y 76; Anexo VII, Tabla 3) y 0,73 veces el valor
del grupo EtOH.
Figura 76. Á rea celular de los astrocitos G FA P -ir en áreas prosencefálicas de las ratas adolescentes
tras el perío do de into xic a c ión y de recuperación en el pro to colo de exposición al eta nol durante la
ad olesce ncia con ab stinen cia p osterior. * P < 0,01. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de d os colas.
193
Resultados
IV.3.2.3.
Proteína S100B (S100B):
La S100B-ir intracelular se observó en los astrocitos de cada una de las áreas
prosencefálicas que se analizaron. La inmunotinción marcó el cuerpo celular y algunas de
las proyecciones citoplasmáticas primarias (Fig. 77). En los animales adolescentes del
grupo EtOH, en las tres áreas, los astrocitos mostraron una disminución de la S100B-ir.
Esta disminución fue visualmente evidente en el hecho de que los astrocitos dejaban ver
su perfil nuclear, un fenómeno que no se observó en los animales no expuestos (Control,
Control/R) ni en los abstinentes (EtOH/R) (Fig. 77).
En el CA1 Hipp de los animales del grupo EtOH hubo una disminución del valor de la
DOR que alcanzó 0,51 veces el valor del grupo Control (P < 0,0001; Figs 77A,B y 78;
Anexo VII, Tabla 3).
En el Strt, estos animales mostraron una disminución que llegó a 0,41 veces el valor del
grupo Control (P < 0,0001; Figs 77D,E y 78; Anexo VII, Tabla 3).
En la CxF, la DOR llegó a valores que representaron 0,64 veces el valor del grupo
Control (P < 0,0001; Figs 77G,H y 78; Anexo VII, Tabla 3).
Tras el período de abstinencia, la DOR en los animales EtOH/R se recuperó a los valores
medidos en los animales del grupo Control/R. Así, en el CA1 Hipp, los astrocitos de los
animales del grupo EtOH/R mostraron valores de DOR que alcanzaron 1,13 veces el de los
animales del grupo Control/R (P = 0,1333; Figs 77A,C y 78; Anexo VII, Tabla 3); al
mismo tiempo, este valor fue 2,2 veces mayor que el del grupo EtOH.
En el Strt, los valores de la DOR llegaron a 0,86 veces el valor de los animales del grupo
Control/R (P = 0,0428; Figs. 77D,F y 78; Anexo VII, Tabla 3). De este modo, el valor de
194
Fig. 77. A strocitos S -1 0 0 B -ir en el H ipp (A -C ), el Strt (D -F), y la C x F (G -I) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H d urante la adolescencia con abstinencia posterior. La colum n a de la izquierda (A ,C ,D )
corresponde a los anim ales C ontrol; la colum na de l m edio (B ,E ,H ) a los anim ales E tO H ; y la colum na de la
derecha (C ,F,I) a los anim ales E tO H /R . V éase la descripción en el texto. B arra de escala en I = 20 :m (válida p ara
A -I).
195
Resultados
la DOR del grupo EtOH/R representó un cambio en más de 2,1 veces con respecto al del
grupo EtOH.
En la CxF, el valor de la DOR de los astrocitos alcanzó 1,22 veces del valor de los
animales del grupo Control/R (P = 0,0908; Figs. 77G,H y 78; Anexo VII, Tabla 3), lo que
representó un cambio en más de 1,9 veces con respecto al valor del grupo EtOH.
F igu ra 78 . D e nsidad óptica relativa de los astrocitos S100B -ir en áreas p rosencefálicas d e las ratas adolescentes tras el p eríod o
de into xicación cró nica y tras la recuperación en el pro to colo de into xicación con eta nol durante la adolescencia y abstin encia
posterior. N S : no sign ifica tivo . *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de do s colas.
IV.3.2.4.
Neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200):
Los Nf-200-ir mostraron una inmunomarcación de tipo filamentosa o fibrosa
correspondiente al cuerpo celular de las neuronas, al axón y a los procesos dendríticos, dado
que esta proteína se expresa en toda la neurona.
El análisis morfométrico de los cortes de cerebro de los animales del grupo EtOH mostró
196
Resultados
alteraciones en el patrón de expresión de estos filamentos intermedios ya que el área
relativa de tejido cubierta por estas fibras disminuyó en el CA1 Hipp, en el Strt y la CxF.
En el CA1 Hipp la disminución alcanzó un valor que fue 0,18 veces el valor de los
animales Control (P < 0,0001; Figs. 79A,B y 80; Anexo VII, Tabla 3). En el Strt el área
relativa alcanzó 0,50 veces el valor del Control (P < 0,0001; Figs. 79D,E y 80; Anexo VII,
Tabla 3). En la CxF el área relativa en los animales EtOH llegó a ser 0,36 veces con
respecto al valor de los animales Control (P < 0,0001; Figs. 79G,H y 80; Anexo VII, Tabla
3).
Tras 70 días de abstinencia, bebiendo solamente agua, los machos del grupo EtOH/R
mostraron un patrón regional diferencial de respuesta en la expresión de los Nf-200. En el
CA1 Hipp, hubo una tendencia a la recuperación ya que el valor del área relativa llegó a ser
0,66 veces el valor de sus respectivos animales Control/R (P = 0,0004; Figs. 79A,C y 80x;
Anexo VII, Tabla 3). A pesar de que este valor aún estuvo por debajo del de los animales
Control/R, fue 3,67 veces mayor que el de los animales del grupo EtOH. En el Strt, tras la
abstinencia, hubo un incremento leve pero no significativo del área relativa ocupada por los
Nf-200-ir que llegó a ser de 1,19 veces con respecto al de los animales Control/R (P =
0,1709; Figs. 79D,F y 80; Anexo VII, Tabla 3). Este cambio, con respecto al valor de los
animales del grupo EtOH, representó un incremento de 2,38 veces. En la CxF, por último,
el valor en los animales del grupo EtOH/R alcanzó a ser 1,33 veces el de los animales
Control/R (P = 0,0024; Figs. 79G,I y 80; Anexo VII, Tabla 3). El valor alcanzado por los
animales del grupo EtOH/R representó así un cambio en más de 3,65 veces con respecto
al de los animales EtOH.
Algunos de los animales expuestos al EtOH (pero no todos) mostraron un perfil
197
Fig. 79. Fibras N f-2 0 0 -ir en el H ipp (A -C ), el Strt (D -F), y la C x F (G -I) d e los m achos d el p rotocolo d e
e xp osición al E tO H d urante la adolescencia con abstinencia posterior. La colum n a de la izquierd a
(A ,D ,G ) corresponde a los anim ales C ontrol; la colum na del m e d io (B ,E ,H ) a los anim ales E tO H ; y la
colum na de la derecha (C ,F,I) a los anim ales E tO H /R. V éase la descrip ción en el te xto . B arra de escala
= 100 :m en B y H (válida para A -C y G -I) y 50 :m en E (válida p ara D -F).
198
Resultados
ondulante, “en sacacorcho”, en las fibras Nf-200-ir en algunas de las áreas estudiadas (Fig.
79H). Esta característica morfológica anormal se encontró en algunos de los animales que
pasaron el período de abstinencia, a pesar de que se hubieran recuperado desde un punto
de vista semicuantitativo (Fig. 79C,F) (ver más abajo una descripción ampliada).
Figura 80. Á rea relativa de tejido cerebral cubierto po r las fibras Nf-200-ir en áreas prosencefálicas de las ratas adolescentes tras
el períod o de intoxicación y de recuperación, en el protoco lod de into xicación duran te la adolesce ncia con ab stinen cia p osterior.
N S : no sign ifica tivo . ** P < 0,01. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de do s colas.
IV.3.2.5.
Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2):
La inmunomarcación para la MAP-2 también puso en evidencia unas estructuras de tipo
filamentoso o fibroso que corresponden, en este caso, a las dendritas, dado que la
localización de esta proteína citoesquelética es casi exclusivamente dendrítica (algo de ella
199
Resultados
puede verse, sin embargo, en el soma neuronal).
El análisis morfometrico reveló que, en el CA1 Hipp de las ratas del grupo EtOH, hubo
una disminución del área relativa cubierta por los procesos MAP-2-ir que llegó a ser 0,51
veces el de los animales Control (P < 0,0001; Figs 81,C y 82; Anexo VII, Tabla 3). En el
Strt hubo una importante disminución; el valor llegó a ser 0,31 veces el valor de los
animales Control (P < 0,0001; Figs 81D,F y 82; Anexo VII, Tabla 3). En la CxF, la
disminución representó un valor de 0,41 veces el valor de los animales Control (P <
0,0001; Figs 81G,I y 82; Anexo VII, Tabla 3).
En aquellos animales expuestos al EtOH y sometidos a un período de abstinencia de 10
semanas (EtOH/R) hubo una reversión de la disminución de los valores de área relativa
ocupada por las fibras MAP-2-ir en el CA1 Hipp. Así, estas fibras ocuparon un área relativa
que llegó a 0,92 veces el valor de sus respectivos animales control (Control/R). Esta
diferencia no fue estadísticamente significativa (P = 0,2414; Figs 81A,C y 82; Anexo VII,
Tabla 3) pero, con respecto al valor de los animales del grupo EtOH representó un cambio
en más de 1,8 veces. Algo similar fue lo que se observó en el Strt; el área relativa llegó a
ser 1,23 veces del valor de los animales del grupo Control/R; la diferencia entre ellos
tampoco fue estadísticamente significativa (P = 0,2291; Figs 81D,F y 82; Anexo VII, Tabla
3) pero el cambio con respecto a los animales del grupo EtOH fue mucho mayor que el del
Hipp: 3,96 veces. Finalmente, en la CxF no se observó tal recuperación de este parámetro
morfométrico. En los animales EtOH/R este valor alcanzó a ser sólo 0,58 veces el valor de
los animales del grupo Control/R, y la diferencia fue extremadamente significativa desde
un punto de vista estadístico (P = 0,0001; Figs 81G,I y 82; Anexo VII, Tabla 3). Este valor
fue solamente 1,42 veces mayor que el de los animales del grupo expuesto y sin recuperar
200
Fig. 81. Fibras M A P -2-ir en el H ipp (A -C ), el Strt (D -F), y la C x F (G -I) d e los m achos d el p rotocolo d e exp osición
al E tO H durante la ad olescencia co n abstinencia p osterior. La colum na de la izquierda (A ,D ,G ) corresponde a
lo s anim ales C ontrol; la colum na del m edio (B ,E,H ) a los anim ales EtO H ; y la colum na d e la derecha (C ,F,I) a los
anim ales EtO H /R . V éase la d escripción en el texto. B arra de escala = 100 :m en B e I (válida p ara A -C y G -I) y
50 :m en E (válida p ara D -F).
201
Resultados
(EtOH), una diferencia estadísticamente no significativa (P = 0,2391).
Figura 82. Á rea relativa de tejido cerebral cubierta por las fibras M A P -2-ir en áreas prosencefálicas de las
ra tas adolescentes tras la intoxicación crónica y la recup eración p osterior en el p rotocolo d e intoxicación
co n etanol duran te la adolesce ncia y co n recuperación posterior. N S : no sign ifica tivo. ** P < 0,01. *** P <
0,0001 . Test t de S tuden t de d os colas.
Desde un punto de vista descriptivo puramente morfológico, las fibras MAP-2-ir, si bien
se recuperaron semicuantitativamente en el CA1 Hipp y en el Strt de los animales del grupo
EtOH/R, no lo hicieron desde un aspecto cualitativo. Las dendritas apicales de las neuronas
piramidales mostraron un claro perfil ondulado (Fig. 81I; ver más abajo una descripción
ampliada).
IV.3.2.6.
Óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS):
En el Strt y en la CxF de los animales Control, EtOH y Control/R se pudieron observar
claramente neuronas de soma estrellado y algunas fusiformes, más o menos agrupadas, con
una inmunotinción fuerte y uniforme que oscureció el núcleo de manera consistente.
202
Resultados
También se observaron algunas de sus principales prolongaciones citoplasmáticas por
trayectos de longitudes variables (Fig. 83A,B,D,E). Contrariamente, en ambas áreas de los
animales del grupo EtOH/R se observó una marcación mucho menos intensa, de modo tal
que el perfil nuclear fue evidente en cada neurona. Las prolongaciones citoplasmáticas
también estaban teñidas pero más tenuemente y por mucha menos longitud (Fig. 83C,F).
En el grupo de animales EtOH, la medición de los valores de la DOR de las neuronas
situadas en el Strt no mostró cambios con respecto a las de los animales Control (P =
0,2852; Figs 83A,B y 84; Anexo VII, Tabla 3). En la CxF, tampoco se observaron cambios
significativos en los valores de la DOR (P = 0,4878; Figs 83D,E y 84; Anexo VII, Tabla
3).
En los animales del grupo EtOH/R, las neuronas nNOS-ir del Strt mostraron una
disminución significativa en sus valores de DOR que llegó a ser 0,53 veces el valor de los
animales Control/R (P = 0,0339; Figs 83A,C y 84; Anexo VII, Tabla 3). En la CxF, la
disminución, también estadísticamente significativa, alcanzó valores que fueron 0,63 veces
el valor de los animales del grupo Control/R (P = 0,0024; Figs 83D,F y 84; Anexo VII,
Tabla 3).
Finalmente, en el CA1 Hipp no se observó un número de neuronas nNOS-ir suficiente
desde el punto de vista estadístico, tal que pudiera ser evaluado en forma confiable. Por lo
tanto, no se muestran datos acerca de esta región.
Para un resúmen de los resultados obtenidos en los animales adolescentes expuestos al
EtOH y tras la abstinencia, véase la Tabla 9.
203
Resultados
F ig . 8 3 . N e u ron as n N O S -ir en el S trt (A -C ), y la C xF (D -F) d e los m achos del pro to colo de exposición al E tO H durante la
adolescencia con abstinencia posterior. La colum na de la izquierda (A ,D ) c orresponde a los anim ales Co ntrol; la colum na del
m ed io (B ,E ) a los anim ales E tO H ; y la colum na d e la d erech a (C ,F) a los anim ales E tO H /R . V éa se la d escripción en el texto . B arra
de escala en F = 50 :m (válida p ara A -F).
204
Resultados
Figura 84. D ensidad óptic a relativa de las neuro nas nN O S -ir d el S trt y la C xF de las rata s adolescente s tras la into xicación y la
re cu p eración posterior en el protocolo de adm inistración de etanol durante la adolescencia con abstinencia posterior. N S : n o
sign ifica tivo . ** P < 0,01. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de d os co las.
Tabla 9. Resumen de los resultados morfométricos de los experimentos de ICQ realizados en cortes de
cerebros de ratas adolescentes expuestas al EtOH y tras la abstinencia (con respecto a sus respectivos
controles).
M arcador
M ESENCÉFALO
NDR
NM R
EtOH
EtOH/R
EtOH
EtOH/R
9
z
z
z
5-HT
PROS ENCÉFALO
CA1 H ipp
Strt
CxF
EtOH
EtOH/R
EtOH
EtOH/R
EtOH
EtOH/R
GFAP
88
8
88
8
88
8
S100B
9
z
9
z
9
z
Nf-200
99
9
9
z
9
8
MAP-2
9
z
9
z
9
9
nNOS
n/d*
n/d*
z
9
z
9
* n/d: no detectado.
205
Resultados
IV.3.2.7.
Descripción de los cambios morfológicos observados en el citoesqueleto
neuronal:
Los animales del grupo EtOH, en los cortes prosencefálicos inmunomarcados tanto para
Nf-200 como para MAP-2 (marcadores del citoesqueleto neuronal), mostraron fibras
(correspondientes tanto a axones como a dendritas) con un perfil claramente ondulado en
el CA1 Hipp, el Strt y la CxF, zigzagueando como si ellas mismas hubieran estado ebrias
al momento de ser fijadas (Figs. 79 y 81). Este cambio morfológico no se observó
constantemente en todas las áreas de todos los animales pero sí se lo observó en forma
general, a veces en algunos animales o en algunas áreas, en las tres áreas evaluadas del
prosencéfalo. Lo mismo es válido para los animales del grupo EtOH/R. Por ejemplo, en la
CxF, comparadas con las neuronas piramidales normales (Fig. 85A), las de los animales del
grupo EtOH presentaron dendritas de perfil ondulado que podría ser descripto como una
estructura (símil-sacacorcho(. El tronco primario de las dendritas apicales parece haber sido
la porción dendrítica más afectada en las neuronas piramidales de los animales
pertenecientes a los grupos tanto EtOH como EtOH/R (Fig. 85B,C,E). Sin embargo, esta
dismorfología también se observó en las dendritas basales y, con menor frecuencia, en las
ramas secundarias de las dendritas apicales (Fig. 85C). También se observó esta alteración
estructural del citoesqueleto en las neuronas estrelladas corticales pero con mucha menor
frecuencia, incluso cuando las dendritas apicales de las neuronas corticales inmediatamente
vecinas estaban claramente afectadas (Fig. 85D).
206
F ig. 85. A lte raciones cualita tivas del cito esqueleto neuro nal. Las foto m icro grafías m uestran neuro nas corticales N F-200-ir
ilu stra tiva s de la C xF de los m achos del protocolo d e exp osición al EtO H d urante la ad olescencia con ab stinencia p osterior, d e
a nim a le s C o ntrol (A ), EtO H (B ), y EtO H /R (C -E). En e l H ip p y en el Strt d e los anim ales tanto EtO H com o EtO H /R se han ob servado
im ágenes com parables con la M A P -2-ir (véase, por ejem plo, las Figs. 79C ,F y 8 1C ). E n las neuronas corticales de los anim ales
C ontrol (A ) se pudieron observar las dendritas apicales (da) y basales (db) com o así tam bién el inicio del axón con su cono axónico
(ax) y las dendritas secundarias (ds), todo s ellos con un perfil liso y regular. E n los anim ales E tO H (B ), tanto las dendritas apicales
(da) com o las basales (db) exhibieron u na apariencia estructural sem ejante a un sacacorcho o a un tirabuzón, m ás evidente en
las dendritas apicales y m enos en las basales; en la m ayoría de las dendritas secundarias (ds) esta alteración n o se hizo evidente.
E n los anim ales E tO H /R (C -E ), se pudiero n ob servar d endritas apicales (d a), b asales (d b) y apicales secundarias (d s) c on la
a pa rie nc ia en sacacorcho en las neuronas corticales p ero no en la m ayoría de las neuronas estrelladas q ue, en cam b io, m ostraron
una silueta lisa y reg ular (nE en D ) a p esar de que las den dritas apica les de n eu ronas piram idales vecinas estab an claram en te
afectadas (flechas en D ). B arras de escala = 50 µ m en A -E .
207
Resultados
IV.4.
Protocolo de exposición al etanol durante la adultez:
IV.4.1. Resultados generales del tratamiento:
Los registros referentes al consumo de alimento, de líquido y de EtOH y a la evolución
ponderal, fueron, en este protocolo experimental, en todo similar a lo ya visto en los
protocolos anteriores. Valga aclarar que los machos del grupo EtOH consumieron menos
líquido (en general) que los del grupo Control; que la evolución del peso de ambos grupos
fue similar y no significativamente diferente; que la ingesta diaria de EtOH en el agua de
bebida fue similar a la de los machos adolescentes del protocolo anterior como así también
lo fue el porcentaje del VCT que constituyeron las calorías derivadas del mismo; y, por
último, que las alcoholemias halladas también estuvieron dentro del rango de las halladas
en los anteriores protocolos experimentales.
IV.4.2. Experimentos de inmunocitoquímica:
IV.4.2.1.
Transportador de serotonina (5-HTT):
El 5-HTT,10recordemos, se expresa no solamente en las terminales presinápticas, sino
también a lo largo de las fibras que interconectan los botones en pasaje por lo que la
morfología observable se asemeja a imágenes de fibras arrosariadas.
Figura 86 (en la próxim a págin a). Fibras 5 -H T T -ir en el H ip p (A,B ), el Strt (C ,D ) y la C x F (E,F) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H d urante la adultez. La fila superior corresponde a los anim a les C ontrol y la fila inferior a los anim a les E tO H .
V éa se la d escripción detallad a e n el texto . B arra d e e scala = 50 µ m en A (válida p ara A -F).
208
209
Resultados
Las fibras 5-HTT-ir se observaron claramente en cada corte analizado de los animales
Control y EtOH, pero en estos últimos se observó una importante reducción del área
relativa por unidad de tejido en las tres áreas prosencefálicas estudiadas (Fig. 86A-F).
Estas observaciones cualitativas se confirmaron por medio de la morfometría y el
análisis estadístico. Así, la disminución del área ocupada por las fibras 5-HTT-ir en el CA1
Hipp de los animales EtOH fue significativa y de una magnitud equivalente a 0,74 veces
el valor de los animales Control, no expuestos (Figs 86A,B y 87; Anexo VII, Tabla 4). En
el Strt el mismo valor fue 0,72 veces el de
los Control (Figs 86C,D y 87; Anexo VII,
Tabla 4). Finalmente, en la CxF el área
relativa también disminuyó y fue de 0,83
veces el valor respectivo de los animales
Control (Figs 86E,F y 87; Anexo VII,
Tabla 4). La morfología de las fibras en sí
mismas no se vió alterada.
IV.4.2.2.
Figura 87. Á rea relativa de tejido cerebral cubierta por las fibras
5-H TT-ir en áreas prosencefálicas de las ratas adultas expuestas
crónica m en te al etanol. *** P < 0,0001 . Test t d e Stud ent d e d os
colas.
Proteína gliofibrilar ácida (GFAP):
En los animales Control, los astrocitos GFAP-ir mostraron su clásica apariencia con
procesos citoplasmáticos largos y delgados (Fig. 88A,C,E).11
En las ratas adultas expuestas al EtOH 6,6% en el agua de bebida durante 6 semanas, se
Figura 88 (en la p róxim a p ág ina). A stroc itos G FA P -ir en el H ip p (A ,B ), el Strt (C ,D ) y la C xF (E,F) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H d urante la adultez. La fila superior corresponde a los anim a les C ontrol y la fila inferior a los anim a les E tO H .
V éa se la d escripción detallad a e n el texto . B arra d e e scala = 50 µ m en A (válida p ara A -F).
210
211
Resultados
observó una importante reacción astroglial puesta en evidencia como un aumento
tremadamente
significativo
del
área
celular, nuevamente, en las tres áreas
evaluadas. En el CA1 Hipp, el área de los
astrocitos de los animales EtOH fue 1,92
veces mayor que en los animales Control
(Figs 88A,B y 89; Anexo VII, Tabla 4). En
el Strt, el área celular de los astrocitos fue
F ig ura 89. Á rea celu lar d e lo s astro cito s G F A P -ir en áre a s
prosence fálicas de ratas adultas expuestas crónicam ente al
etanol. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de d os colas.
1,36 veces mayor que en los Control (Figs
88C,D y 89; Anexo VII, Tabla 4). Por último, en la CxF, el área celular astrocitaria fue 1,46
veces mayor en los animales EtOH que en los Control (Figs 88E,F y 89; Anexo VII, Tabla
4). Estos astrocitos hipertróficos presentaron no solamente cuerpos celulares agrandados
sino también prolongaciones celulares más largas y tortuosas, muchas de ellas
zigzagueantes (Fig. 88B).
IV.4.2.3.
Proteína S100B (S100B):
En los astrocitos normales la S100B-ir presenta una distribución citosólica limitada al
cuerpo celular, en tanto que los procesos citoplasmáticos aparecen escasamente
inmunomarcados y por trayectos cortos (Fig. 90A,C,E).12
En las ratas macho adultas expuestas crónicamente al EtOH, el patrón morfológico de
Figura 90 (en la próxim a p ág ina). A stroc itos S -100B -ir en el H ip p (A ,B ), el Strt (C ,D ) y la C xF (E,F) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H d urante la adultez. La fila superior corresponde a los anim a les C ontrol y la fila inferior a los anim a les E tO H .
V éa se la d escripción detallad a en el texto . La im ag en en C es una fotoco m posición. B arra de esca la = 50 µ m en B (válida p ara A -F).
212
213
Resultados
distribución intracelular de la S100B fue cualitativamente normal pero la intensidad de la
inmunotinción estuvo significativamente aumentada en las tres áreas prosencefálicas que
se estudiaron. En el CA1 Hipp el aumento de la DOR alcanzó valores que fueron 1,56
veces mayores que en los animales Control (Figs 90A,B y 91; Anexo VII, Tabla 4). En el
Strt, la DOR fue 1,21 veces mayor (Figs
90C,D y 91; Anexo VII, Tabla 4) y en la
CxF, finalmente, el valor medio de la
DOR del citoplasma de los astrocitos
S100B-ir fue 1,1 veces mayor en los
animales EtOH que en los Control (Figs
90E,F y 91; Anexo VII, Tabla 4).
IV.4.2.4.
Figura 91. D ensidad óptica relativa de los astrocitos S 100B -ir en
área s p rosence fálica s d e ratas ad ultas expuestas cró nica m en te
al etan ol. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de d os colas.
Neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200):
Los Nf-200 son filamentos intermedios que expresan las neuronas tanto en el soma como
en las prolongaciones (axónicas y dendríticas). Su inmunomarcación permite observar, en
general, estructuras fibrosas. En las tres áreas estudiadas se observaron disminuciones
significativas del área relativa de tejido nervioso ocupado por estas fibras Nf-200-ir.13
En el stratum radiatum del CA1 Hipp se observaron imágenes correspondientes a las
dendritas apicales de las neuronas piramidales ubicadas en el estrato inmediatamente
Figura 92 (en la p róxim a p ág ina). Fibr as N f-200-ir e n el H ip p (A,B ), el Strt (C ,D ) y la C x F (E,F) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H durante la adultez. La fila superior corresponde a los anim a les C ontrol y la fila inferior a los anim a les E tO H .
V éa se la d escripción detallad a e n el texto . La im ag en en F es una fotoco m posición. B arra de e scala en A = 10 0 µ m (válida p ara
A ,B ), 50 µ m (válida p ara C ,D , E ), 20 µ m (valida p ara F).
214
215
Resultados
suprayacente. En esta área, el valor del área relativa en los animales EtOH fue 0,50 veces
el valor medido en los Control (Figs 92A,B
y 93; Anexo VII, Tabla 4). En el Strt de los
animales EtOH tal valor fue 0,84 veces el
valor de los Control (Figs 92C,D y 93;
Anexo VII, Tabla 4). En la CxF, por fin, el
valor medio del área relativa de las fibras
Nf-200-ir fue 0,85 veces el valor medio
medido en los animales Control (Figs
Figura 93. Á rea relativa de te jido cerebral cubierto por fib ras N f20 0 -ir en áreas prosence fálica s d e ratas ad ultas cró nica m en te
exp uestas al etanol. * P < 0,05. ** P < 0,01. *** P < 0,0001 . Test t
de S tuden t de d os colas.
92E,F y 93; Anexo VII, Tabla 4). En esta última área, si bien la disminución fue
significativa, visualmente, fue más llamativa la alteración cualitativa consistente en el
aspecto símil-sacacorcho, zigzagueante que adquirieron las fibras Nf-200-ir y que ya se
observara en los anteriores protocolos experimentales (Fig. 92F).
IV.4.2.5.
Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2):
En los cortes de cerebro de los machos adultos sometidos a alcoholización crónica con
una solución de EtOH 6,6% v/v en el agua de bebida que se estudiaron en este protocolo,
no se pudo medir confiablemente el área relativa de las fibras MAP-2-ir en el Strt (Fig.
94C,D).14 Esto se debe a que la organización estructural de las dendritas de las neuronas
Figura 94 (en la p róxim a p ág ina). Fibras M A P -2 -ir en el H ip p (A,B ), el Strt (C ,D ) y la C x F (E,F) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H durante la adultez. La fila superior corresponde a los anim a les C ontrol y la fila inferior a los anim a les E tO H .
Vé a se la de scripción detallada en el texto. En el Strt (C ,D ) p rácticam ente no se ob serva m arca q ue hub iera pod id o ser m edid a
por m orfom etría. B arra de escala e n A = 50 µ m (válida para A -F).
216
217
Resultados
que se localizan en esta área no se disponen tan ordenadamente como en las otras dos áreas
evaluadas.
En estas últimas áreas, CA1 Hipp y CxF, donde sí se la pudo medir confiablemente, la
inmunomarcación para la MAP-2 se vió notoriamente reducida. El stratum radiatum del
CA1 Hipp contiene a las dendritas apicales de las neuronas piramidales del
stratumpiramydale. Siendo la MAP-2 una proteína citoesquelética de expresión
predominantemente
dendrítica,
lainmunomarcación para esta proteína
permitió observar fibras de trayecto
aproximadamente paralelo que cruzan todo
el espesor de aquel estrato hipocámpico. El
análisis de imágenes y el estadístico de los
datos numéricos obtenidos demostró que el
Figura 95. Á rea relativa de tejido cerebral cubierta por fibras
M A P -2-ir en áreas prosencefálicas de ratas adultas expuestas
crónica m en te al etanol. *** P < 0,0001 . n/d: no detectado. Test t
de S tuden t de d os colas.
valor medio medido en los animales EtOH fue 0,64 veces el valor medido en los animales
Control (Figs 94A,B y 95; Anexo VII, Tabla 4). En la CxF el valor medio del área relativa
fue, también, 0,64 veces el valor de los machos Control (Figs 94E,F y 95; Anexo VII, Tabla
4). Además de la disminución semicuantitativa objetivada, los procesos dendríticos
mostraron una estructura irregular y fragmentada, también en sacacorcho.
En la Tabla
10 se puede observar un resumen de los datos morfométricos obtenidos en las tres áreas
prosencefálicas, evaluadas con los distintos marcadores astrogliales y neuronales, de los
machos adultos alcoholizados crónicamente.
218
Resultados
Tabla 10. Resum en de los resultados morfométricos de los
experimentos de ICQ realizados en cortes de cerebros de ratas
expuestas al EtOH durante la adultez.
M arcador
CA1 H ipp
Strt
CxF
5-HTT
9
9
9
GFAP
8
8
8
S100B
8
8
8
Nf-200
9
9
9
MAP-2
9
n/d*
9
* n/d: no detectado.
219
Discusión
“Il apparaît donc clairement que la responsabilité de la mère alcoolique sur l’ avenir de ses
enfants est écrasante, tant au point de vue physique que psycho-affectif.”1
Jacqueline Rouquette
“En realidad, la disposición de una neurona adulta representa el término de una serie de
movimientos, de impulsos interiores y exteriores, que obraron durante la época embrionaria y
juvenil (...) La razón de la forma está, pues, por entero en la función actual ó pasada.”2
Santiago Ramón Cajal
V.1. Parámetros generales de los tratamientos en los distintos protocolos:
V.1.1.
Consumo de alimento, bebida y calorías:
La alimentación es un factor extremadamente importante a tener en cuenta en cualquier
estudio experimental en el que se administre EtOH. En los seres humanos algunos de los
efectos patológicos atribuidos al tóxico se deben en gran parte al menor consumo de
alimento (en calidad y cantidad) y menos a los efectos de la ingesta del EtOH per se. Por
ello, para deslindar los efectos propios del EtOH de los debidos a la alimentación, es
menester asegurarse de que los animales en experimentación, a la vez que intoxicados por
el EtOH, estén adecuadamente alimentados. Sólo así podrá asegurarse que los efectos
observados han sido debidos exclusivamente al EtOH. En los estudios experimentales de
AMF este deslinde es crítico ya que simples alteraciones nutricionales pueden provocar
importantes trastornos del desarrollo en los fetos.
En los dos protocolos de EPE (sin y con prevención del daño), durante el período de
intoxicación pregestacional, las hembras de los grupos que recibieron EtOH en el agua de
bebida (EtOH y ES y EB, respectivamente) consumieron menos alimento y recibieron
1
“Por consiguiente, parece claro que la responsabilidad de la madre alcohólica sobre el porvenir de sus niños
es abrumadora, tanto desde el punto de vista físico como psico-afectivo.” Rouquette, 1957; pág. 54.
2
Ramón Cajal S, 1899; pág. viii.
221
Discusión
menos calorías de él derivadas que las de los grupos control (Control y CS y CB) (Fig. 24;
Anexo VI, Tabla 1). Esto era de esperarse dado que el método de alimentación al que
fueron sometidas fue apareado en cuanto al VCT diario que recibían. Pero el VCT por
ambos grupos fue el mismo (Figs. 28 y 29; Anexo VI, Tabla1). También era esperable que
los animales que bebían la solución de EtOH, por su natural aversión al tóxico, bebieran
menos líquido que los animales control (Fig. 25; Anexo VI, Tabla 1) y eso fue lo que
sucedió. A pesar de que las hembras de los grupos EtOH, ES y EB bebieron diariamente
un 27,64% menos de líquido que las hembras de los grupos Control, CS y CB, no se
observaron consecuencias por deshidratación dado que su consumo diario de líquido en
ambos protocolos estuvo dentro de los límites del consumo considerado normal (20-50
ml/animal/d ú 80-120 ml/kg/d). Como se puede apreciar en la Fig. 28 y en el Anexo VI,
Tabla 1, el VCT diario recibido por ambos grupos de animales (controles y tratados) fue
estadísticamente equivalente.
Durante el período de exposición gestacional, la situación varió. El apareamiento de la
alimentación no fue igual desde el punto de vista del VCT diario recibido por ambos grupos
de animales sino desde el punto de vista de las kCal recibidas a partir de los componentes
plásticos de la dieta, es decir, del alimento. Estas kCal plásticas fueron las que aseguraron
la igualdad de nutrición de las hembras, hecho de la máxima importancia para los fetos en
gestación. Así, las hembras gestantes de ambos grupos consumieron prácticamente la
misma cantidad de alimento (en g y kCal/kg/d) a lo largo de toda la preñez (Fig. 24 y
Anexo VI, Tabla 1). Si se analiza en detalle la Tabla 1 del Anexo VI se observa que lo
sucedido es que, considerada la alimentación por unidad de peso corporal (g o kCal/kg/d),
los animales del grupo EtOH no variaron prácticamente su consumo entre el período de
222
Discusión
exposición pregestacional y el gestacional (151,4 ± 30,98 versus 149,7 ± 15,79 kCal/kg/d,
ó 60,56 ± 12,39 versus 59,9 ± 6,31 g/kg/d; una variación en menos de alrededor de 1,1%).
Por otro lado, los animales del grupo Control lo disminuyeron (espontáneamente) en forma
más notoria (184,3 ± 43,14 versus 160,7 ± 15,01 kCal/kg/d ó 73,71 ±17,26 versus 64,28
± 6,0 g/kg/d; una variación en menos de alrededor de 12,8%). Esta disminución en el
consumo de alimento al entrar en la gestación es paradójico si se piensa que, normalmente,
las hembras gestantes de todos los animales aumentan su ingesta de alimento. Sin embargo,
esta paradoja es sólo aparente si se considera a cada grupo de tratamiento, no ya como
grupo sino desde el punto de vista del consumo de cada animal individual dentro de cada
grupo. Así, en realidad, los animales de ambos grupos aumentaron su ingesta de alimento
(en g y en kCal/animal/d). Este aumento en el consumo de alimentos fue notoriamente
mayor en los animales individuales del grupo EtOH que en los del Control. Parecería que
las hembras gestantes del grupo EtOH hubieran percibido de alguna manera sus mayores
necesidades calórico-plásticas de alimento en función de su nuevo estado de preñez y que
aumentaron en consecuencia su consumo de alimento (quizás previamente diminuido por
el efecto anorexígeno propio del EtOH) en mayor medida de lo que lo hicieron las hembras
del grupo Control. Así, individualmente consideradas, las hembras del grupo Control
aumentaron su consumo de alimento, de un período al otro, casi un 8% (18,14 ± 4,178
versus 19,59 ± 2,361 g/animal/d ó 45,33 ± 10,45 versus 48,97 ± 5,9 kCal/animal/d) en tanto
que las del grupo EtOH lo hicieron en casi un 18,4% (13,92 ± 2,635 versus 16,48 ± 2,08
g/animal/d ó 34,8 ± 6,59 versus 41,2 ± 5,2 kCal/animal/d). En esta explicación de las
variaciones de los niveles de consumo de alimento entre un período y otro del tratamiento,
de uno y otro grupos de animales, debe también tenerse presente el efecto debido a la
223
Discusión
diferente cantidad de animales en uno y otro grupo (n = 4 y 6 para los grupos Control y
EtOH). Esto hace que, consideradas por unidad de peso corporal, las hembras de ambos
grupos parecieran haber disminuido su consumo de alimento al preñarse (según se
desprende de lo que se observa en la Fig. 24) cuando lo que realmente sucedió es que,
consideradas individualmente, lo incrementaron.
Algo en todo similar es lo que se puede decir con respecto al consumo líquido, para
ambos grupos de tratamiento (cfr. Figs. 25 y 26 y Anexo VI, Tabla 1); parecería que las
hembras Control hubieran bebido menos líquido durante la gestación que antes de ella si
se considera el consumo por unidad de peso corporal, cuando lo que en realidad sucedió (lo
mismos es válido para las hembras EtOH) es que aumentaron el consumo de líquido (como
sería lógico esperar) si se las considera, ahora, desde el punto de vista individual de cada
hembra.
Nuevamente, considérese la Tabla 1 del Anexo VI. Se aprecia que durante la gestación,
si bien el VCT fue significativamente mayor en los animales EtOH que en los Control
cuando lo relacionamos a la unidad de peso corporal, ese aumento no lo fue tanto cuando
se tiene en cuenta a cada hembra individualmente.3
En el protocolo de EPE con prevención del daño por la administración de buspirona:
¿provocó la administración de buspirona a las hembras gestantes algún efecto sobre la
alimentación, la bebida o las calorías ingresadas diariamente? Aparentemente no, sobre el
consumo de alimento según surge de considerar las Figs. 51 y 56. El hecho de que las
hembras del grupo EB consumieran significativamente menos alimento que las del grupo
CS puede ser atribuido con mayor seguridad a sus diferencias de peso al inicio de la
3
Y son las hembras individuales las que, finalmente, paren a las crías y no su unidad de peso corporal.
224
Discusión
gestación que a un efecto de la buspirona per se. Los mismo puede decirse acerca de los
efectos de la buspirona sobre el consumo de bebida. Si al consumo de bebida de cada grupo
se lo refiere al grupo control (CS; ANOVA + post-test de Dunnett; figura no mostrada), las
diferencias no son significativas. Si se observa la Fig. 52 y se comparan todos los grupos
entre sí (ANOVA + post-test de Student-Newman-Keuls) se aprecia que las hembras del
grupo CB han bebido algo más que las de los grupos ES y EB pero, sabemos, los animales
que recibieron EtOH bebieron espontáneamente menos que las que no y, por otro lado, no
hubo diferencias entre el consumo de CB con respecto a CS. Más aún, no hubo diferencias
significativas entre el consumo de líquido de los animales que, habiendo tomado EtOH,
recibieron o no buspirona (ES y EB). De todo ello es legítimo suponer que en este
protocolo experimental la buspirona no ha causado efectos sobre el consumo de bebida en
general, o de EtOH en particular, y ello a pesar de que existen trabajos que relacionan la
administración de buspirona con una merma en el consumo de EtOH por parte tanto de
humanos alcohólicos (Fawcett et al., 2000; Lovinger, 1999) como de ratas expuestas al
EtOH (Hedlund y Wahlström, 1996; Kostowski y Dyr, 1992).
Por último, sobre el ingreso de calorías diariamente durante la gestación (Figs. 55 y 56;
Anexo VI, Tabla 2), de los resultados obtenidos y ya expuestos, tampoco se puede decir que
la buspirona haya tenido algún efecto apreciable.
En los protocolos de exposición al EtOH durante la adolescencia y durante la adultez no
hay nada llamativo que se pueda agregar a lo expuesto en las respectivas secciones de los
resultados más allá de que todos los parámetros que aquí se consideran no se alteraron con
respecto a los de los respectivos animales Control (o Control/R, según el caso).
225
Discusión
V.1.2.
Consumo de etanol y alcoholemias:
Hemos considerado ya lo que sucedió en los distintos protocolos de exposición al EtOH
con el alimento, la bebida y las calorías de ellos derivados. Ahora bien, ¿qué sucedió con
el consumo de EtOH –considerado en sí mismo– entre uno y otro períodos de exposición
pregestacional y gestacional en los protocolos de EPE (sin y con prevención del daño)?
Aumentó 11,3% si se toma en cuenta el consumo por unidad de peso corporal, y un
importante 33,25% si se considera a las hembras individualmente. Sin embargo, el
porcentaje del VCT diario que representó exclusivamente el EtOH entre uno y otro
períodos de exposición aumentó sólo 9,65% (20,61% a 22,60%, respectivamente).
La administración de buspirona en el segundo de los protocolos de EPE, ¿indujo algún
efectos sobre el consumo de EtOH puro? A semejanza de lo dicho acerca de la acción de
la buspirona sobre el consumo de bebida, nada se puede decir al respecto. La buspirona
parece no haber tenido efectos estadísticamente significativos (Figs. 52-54) y la diferencia
de consumo de EtOH que se aprecia en la Fig. 53 entre los grupos ES y EB no se debe a la
buspirona en sí sino, simplemente a la distinta manera de considerar el consumo (por
unidad de peso corporal o individualmente de cada animal; cfr. la Fig. 53 con la 52).
Independientemente de estos hechos, veamos cuál fue el nivel de consumo diario de
EtOH de los animales (hembras gestantes o no, y machos) (Tabla 11).
Tal como era de esperar, los animales que más EtOH consumieron diariamente fueron
los machos adultos y adolescentes. Estos animales exhibieron no sólo el mayor consumo
sino también el rango de consumo más amplio y el mayor nivel máximo. En comparación,
las hembras bebieron menos EtOH que los machos, estuvieran preñadas o no. Las hembras,
226
Discusión
consumieron más EtOH durante la gestación en concordancia con el mayor consumo de
bebida. Por último, a pesar de lo que se observa en el cuadro (véanse más arriba las
aclaraciones pertinentes) las hembras de los grupos ES y EB del protocolo de EPE con
prevención del daño no difirieron entre sí en el consumo de EtOH gestacional.
Tabla 11. Consumo de EtOH por parte de los animales de experimentación en
cada uno de los protocolos de este trabajo (valores en g/kg/d):
Protocolo
Sexo
EPE sin prevención
- exposición pregestacional
- exposición gestacional
M edia
DE
Rango
5,47
6,09
1,11
0,53
3,805 - 8,065
5,323 - 7,126
5,85
6,51
0,69
0,71
4,53 - 7,11
5,63 - 8,49
6,997
1,68
4,52 - 9,27
Hembras
EPE con prevención (gest.)
- ES
- EB
Adolescentes y adultos
Machos
Los consumos observados en nuestros protocolos están en relación con los niveles de
consumo que han observado otros investigadores utilizando igual método de exposición al
EtOH.4 A modo de comparación, digamos que si un hombre adulto de 1,70 m de estatura
y 70 kg de peso bebiera en un sólo día 3,805-9,27 g/kg de EtOH, estaría bebiendo el
equivalente a 3820-9303 ml de cerveza (de 5,5º), ó a 1750-4264 ml de vino (de 12º) ó a
525-1279 ml de whisky (de 40º). Ahora bien, este trabajo ha versado, principalmente, sobre
los efectos del AMF, por lo que, extrapolados ahora estos niveles al consumo que
correspondería a una mujer de 1,60 m de estatura y 55 kg de peso corporal, estos valores
4
Cfr. el Anexo V (Métodos experimentales de exposición de animales al etanol. Ventajas y desventajas de
cada uno) y especialmente lo dicho en los puntos VII.5.1. (Administración en el agua de bebida) y VII.5.5
(Administración por dieta líquida).
227
Discusión
equivaldrían a 3002-7309 ml de cerveza, ó 1375-3350 ml de vino, ó 412-1005 ml de
whisky. Siempre diariamente durante todo el embarazo. Nadie diría, en presencia de una
tal hipotética mujer, que estos niveles de consumo sean bajos. Y posiblemente no
determinarían alcoholemias bajas en las mujeres. Sin embargo, en nuestras ratas, las
alcoholemias a las que dan lugar estos niveles de consumo sí son bajas. Recuérdese
entonces aquí que las ratas tienen una velocidad de metabolización del EtOH que es de 2-3
veces mayor que la que poseemos los humanos (300 versus 100-150 mg/kg/h).5
Especulemos un poco más y supongamos que, para compensar las velocidades de
metabolización, le administramos a nuestra hipotética mujer 2-3 veces menos EtOH en cada
uno de los tipos de bebidas. Las cifras anteriores se convertirían en alrededor de 1000-3654
ml de cerveza, ó 458-1675 ml de vino, ó 137-501 ml de whisky. Bebidas estas cantidades
a lo largo de todo un día, quizás sí podría decir ahora, más de una mujer alcohólica, que
estos son niveles de consumo bajo. Más adelante analizaremos lo que, en las ratas crías de
madres alcohólicas producen estos bajos niveles de alcoholemia. Un daño desde ningún
punto de vista despreciable.
Hablemos ahora entonces de las alcoholemias medidas en las ratas de los distintos
protocolos. ¿Por qué decimos que son bajos niveles de alcoholemia? Porque las
alcoholemias en el rango de 15-25mg/dl (o, lo que es lo mismo, 3,25-5,42 mM o, en
unidades más frecuentemente usadas en el ámbito legal, 0,15-0,25 g/l) caen dentro de lo
que, en las alcoholizaciones agudas, se denomina período subclínico.6 Es decir, no es, en
la práctica, notable para un observador externo y, muy posiblemente, tampoco por el mismo
5
Cfr. sección I.3.1 (Farmacocinética) en la Introducción.
6
Cfr. la Tabla 2 (Relación de los distintos niveles de alcoholemia con las manifestaciones cognitivoconductuales observables en el ser humano agudamente intoxicado) en la subsección I.3.5. de la
Introducción.
228
Discusión
sujeto alcoholizado. Seamos aún más gráficos: en los términos de la hoy vigente Ley de
Tránsito Nº 24.449/94 de la Nación Argentina, nuestras ratas, en cualquier momento,
podrían haber conducido automóviles (de haber podido, sabido y querido) ya que la
alcoholemia máxima permitida para ello es de 500 mg/l (= 50 mg/dl). En más de una
ocasión podrían, incluso, haber conducido motocicletas (límite máximo: 200 mg/l). Más
aún, hemos visto que nuestras ratas hembras o machos; adultas, adolescentes o infantes;
preñadas o no, en ningún momento mostraron signos conductuales de intoxicación aguda
cuando fueron evaluadas con las escalas de Nixon y Crews (2004) y Slawecki (2002). En
ambas escalas, siempre puntuaron nivel 0 (cero).7 Igual sucedió al retirar bruscamente el
EtOH cuando se las evaluó en busca de signos de abstinencia con la escala de Penland et
al. (2001).
Todos los motivos anteriores de consuno son los que permiten afirmar taxativamente que
las alcoholemias fueron bajas más allá aún de las propias mediciones realizadas en el
plasma de los animales.
Ahora bien, otros investigadores han establecido previamente, por medios
experimentales, que la concentración plasmática pico (alcoholemia pico) alcanzada tras
la ingesta materna de EtOH es un factor crítico en la determinación del daño cerebral
producido en el feto. Al mismo tiempo es su principal predictor, es decir, a mayores
alcoholemias, y mantenidas por mayor tiempo, mayor daño cerebral (Pierce y West, 1986).
Del mismo modo, el nivel de alcoholemia que se alcance, en comparación con la dosis total
de EtOH consumida (o administrada a los animales de experimentación), es un indicador
más preciso del daño tisular inducido. Estos factores se deben, nuevamente, a las
7
Cfr. subsección III.2.4. (Evaluación conductual de la intoxicación y la abstinencia) en la sección de
Materiales y Métodos.
229
Discusión
diferencias farmacocinéticas interindividuales e interespecies (Bonthius et al., 1988; Livy
et al., 2003).
En cuanto a las alcoholemias necesarias para inducir displasias corticales por
neurodegeneración apoptótica, ha de ser necesario que los niveles de alcoholemia se
mantengan por sobre los 200 mg/dl durante más de 8 horas al día en ratas de edad P7
(Ikonomidou et al., 2000). Prenatalmente, por otro lado, con alcoholemias de niveles algo
menores (171 mg/dl; pero siempre altas en comparación con las obtenidas en nuestro
trabajo) se han observado alteraciones importantes en la cantidad de los Nb generados en
las regiones corticales, un retraso y a la vez extensión del período de generación de los Nb
en la CC al tiempo que se redujo (al medirlas en la CC adulta) la cantidad total de neuronas
con el mismo momento de origen; quizás más importante aún, se alteró la distribución
intracortical de las neuronas generadas en un día particular, esto es, su localización resultó
alterada (Miller, 1986). Más abajo se verá que algo similar se encontró en nuestros
experimentos.
En ratones adultos se ha visto que bajos niveles de alcoholemia (15-21 mg/dl) son ya
capaces de inducir disminuciones de la neurogénesis en el giro dentado de la formación del
hipocampo, alteraciones que son reversibles por el simple ejercicio físico (Crews et al.,
2004). Prenatalmente, también en ratones, las alcoholemias bajas a moderadas (11,3-65
mg/dl y 44,3-142,7 mg/dl) son capaces de provocar disrafias del tubo neural (alteraciones
del cierre) tanto en la placa del piso como en la placa del techo (Zhou et al., 2003).
Por lo tanto, se ve claramente que las alcoholemias bajas si bien no inducen en los
animales de experimentación los catastróficos cuadros neuropatológicos que se observan
en lo niños con el FAS completo (esquizencefalia, holoprosencefalia) sí son capaces de
230
Discusión
provocar las alteraciones morfológicas macro y microscópicas del desarrollo del SNC
propias de los ARND. Luego veremos que, de hecho, en nuestros experimentos se
produjeron displasias corticales sutiles.
V.1.3.
Variaciones de peso:
La medición seriada del peso corporal de los animales sometidos, a cualquier edad, a la
exposición crónica al EtOH es uno de los principales parámetros que permiten evaluar el
impacto global de la intoxicación sobre la salud del animal. Si un animal expuesto
crónicamente al EtOH no ve modificado su peso (o, mejor, lo incrementa) es esto un signo
de buena salud global. Es fácil imaginar que este parámetro general de salud será de más
frecuente alteración en aquellos animales que ven fácilmente alterada su evolución ponderal
ante muchas noxas. Es lo que, día a día, hacen los pediatras al evaluar el peso de los recién
nacidos y de los niños mientras crecen.
Por otro lado, hemos visto que, ya con Rouquette (1957), uno de los tres elementos
semiológicos del FAS en cualquier sistema diagnóstico de los FASD es la evolución del
peso pre- y postnatalmente.8 Por ello es que en este trabajo se dedico especial cuidado a su
medición evolutiva, día a día desde antes de la gestación hasta 90 días luego del parto (154
días, o más).
En los protocolos de EPE la evolución del peso materno durante el período de
exposición pregestacional fue paralelo para ambos grupos de tratamiento (Figs. 30 y 31;
8
Cfr. Anexo I (Síndrome Alcohólico Fetal (FAS) y trastornos asociados. Criterios diagnósticos).
231
Discusión
Anexo VI, Tabla 1). Sin embargo, el aumento de peso fue mayor, y significativo, para las
hembras Control; para las hembras expuestas al EtOH, en tanto, si bien al finalizar este
período no difirieron estadísticamente del peso de las Control, mostraron un aumento que,
a diferencia del de las Control, no fue significativo con respecto al peso de inicio (Fig. 30;
Anexo VI, Tabla 1). Este hecho está indicando que, por efecto del consumo obligado de
EtOH, las hembras de este grupo mostraron un leve efecto anorexígeno. Sin embargo,
durante la gestación las hembras de ambos grupos mostraron un aumento de peso armónico
y en todo paralelo (Fig. 30, y 31 especialmente; Anexo VI, Tabla 1) hecho que habla a las
claras de la salud general de esas preñeces. Tras el parto y la lógica brusca disminución del
peso por la eliminación del feto, las membranas ovulares y los líquidos correspondientes,
las hembras del grupo EtOH retomaron el aumento de peso con una pendiente levemente
mayor que las del grupo Control, acercándose al peso de estas hacia el final de la lactancia
(Figs. 30 y 31) incluso a pesar de que estaban dando de mamar a sus crías. Nuevamente,
esto habla de la salud general de ambos grupos.
En el protocolo de EPE con prevención del daño, se puede apreciar que la evolución del
peso gestacional de las hembras de los 4 grupos de tratamiento fue en todo paralelo (Fig.
57, de mejor apreciación en la curva de la Fig. 58; Anexo VI, Tabla 2). Se observa también
que ni la evolución del peso ni los pesos finales se vieron alterados por la administración
de buspirona o solución salina por vía sc a las hembras de este protocolo entre los días E13E20. Nuevamente, luego del brusco descenso de peso postparto, los cuatro grupos de
hembras que amamantaron a sus crías (esta vez, y a diferencia del protocolo anterior) sin
recibir EtOH, aumentaron de peso también de manera armónica y comparable entre sí (Fig.
58).
232
Discusión
En los animales adolescentes sometidos a 6 semanas de exposición al EtOH con
posterior abstinencia de 10 semanas, y en los animales adultos expuestos crónicamente por
6 semanas, se observaron aumentos de peso en todo comparables entre los grupos de
animales control (Control y Control/R) y los tratados (EtOH y EtOH/R). A este respecto
véase la Fig. 72 y consúltense las subsecciones IV.3.1. y IV.4.1. de los Resultados.
Nuevamente, esto es indicador fiable de la salud general de los animales sometidos a
experimentación, independientemente del grupo de tratamiento al que hubieran pertenecido,
y que el EtOH no ocasionó efectos mayores en lo relativo a este parámetro.
V.1.4.
Efectos generales de la exposición prenatal al etanol sobre la descendencia:
La salud de las crías habidas de una madre es indicador certísimo de la corrección
general de sus respectivas gestaciones.
En ambos protocolos de EPE la duración de la gestación ha sido la misma y normal: 22
días. Las camadas habidas de los distintos grupos de tratamiento en uno y otro protocolos
fueron de tamaños estadísticamente equivalentes (Fig. 32 y 59; Anexo VI, Tablas 1 y2). El
peso al nacer de estas crías (parámetro importantísimo de salud fetal) tampoco difirió
estadísticamente aunque se observó una leve tendencia a ser menor el de las crías de las
madres del grupo EB en el protocolo de EPE con prevención del daño (algo más notable
en las crías hembras; Fig. 59 y Anexo VI, Tabla 2). Si bien estadísticamente las diferencias
de peso no fueron significativas, nótese que el peso al nacer de las crías machos y hembras,
en este protocolo, presenta el mismo perfíl, con una leve disminución no significativa
233
Discusión
(reitero a riesgo de resultar repetitivo en demasía) paras los/las hijos/as de los grupos que
recibieron buspirona. Naturalmente, deberían realizarse experimentos adicionales con la
finalidad de determinar si esta aparente tendencia en la disminución del peso de las crías
continúa observándose en la descendencia de aquellas madres que reciben buspirona
durante la gestación (independientemente de que hubieran bebido o no EtOH). ¿Tendrá
algún efecto la buspirona sobre el peso de las crías al nacer?
La cantidad de machos nacidos por cada hembra nacida parece haber sido levemente
menor para las madres sometidas a EPE. Este es un efecto que ya se ha observado en
humanos: los fetos masculinos son más sensibles que los femeninos a los efectos
intrauterinos del EtOH y terminan en aborto más frecuentemente lo que podría causar una
menor tasa de natalidad de varones entre los hijos de madres alcohólicas (Spohr y
Steinhausen, 1996). Ahora bien, en el EPE sin prevención del daño, aunque
estadísticamente no fue significativo, se observó una tendencia a la presencia del mismo
fenómeno (ver subsección IV.1.1.6. de la sección de Resultados). En el protocolo de EPE
con prevención del daño por administración de buspirona, aunque las diferencias fueron
(otra vez) no significativas, parece haber habido una reversión de la relación
machos/hembra con un aumento relativo de los machos en el grupo EB con respecto al ES
(Fig. 59 y Anexo VI, Tabla 2). Al igual que en el caso del peso, es necesario aumentar la
cantidad de sujetos con experimentos nuevos para ver si la tendencia se mantiene y la
fuerza estadística se incrementa. Mientras tanto, cabe preguntarse: ¿tendrá algún/os efecto/s
la buspirona sobre el sexo de las crías nacidas tras la EPE? ¿Prevendrá la buspirona el
aborto de fetos masculinos que llegan así a término?
Tras nacer, el peso postnatal de las crías en ambos protocolos de EPE fue aumentando
234
Discusión
en forma paralela y comparable, siendo no significativamente distintos en ningún punto
temporal desde P0 hasta P21 en el protocolo de EPE sin prevención del daño (Fig. 33) y
desde P0 hasta P88 en el de prevención del daño con buspirona (Fig. 60). Es importante
destacar, en este último caso que, a pesar de las diferencias de tratamiento prenatales, la
administración de buspirona (tampoco la de EtOH) no parece haber alterado la evolución
ponderal postnatal incluso hasta bien entrada la adultez de las crías. Otro hecho más que
habla en favor de la salud general de estas crías.
Se sabe que el consumo de EtOH por parte de madres que están en período de
amamantamiento puede interferir con la lactancia e inducir trastornos nutricionales en las
crías lactantes (Heil y Subramanian, 1988; Little et al., 1989; Mennella, 2001; Mennellay
Beaucham, 1991). Sin embargo, en el protocolo de EPE sin prevención del daño no hubo
diferencias en la ganancia de peso durante el período postnatal en el que las crías recibieron
EtOH a través de la leche materna hasta el momento del destete y fijación (P21),
comparado con el de las crías Control (Fig. 33). De este modo, la ingesta por vía oral, en
la leche materna, de bajas concentraciones de EtOH9 no indujo ningún daño físico mayor.
En fin que, de todo lo dicho, sumado a que en ningún caso se observó la presencia de
malformaciones orgánicas ni de microcefalia, se desprende claramente que el presente es
un modelo válido, en ratas, de los ARND observados en los seres humanos.
9
Cfr. subsección I.3.3. (Farmacocinética materno-fetal y en el recién nacido).
235
Discusión
V.2. Las neuronas “oscuras” o la Zellschrumpfung:
V.2.1.
Hallazgos con el Nissl en la corteza frontal:
La coloración de Nissl con el azul de toluidina es un procedimiento particularmente a
propósito para escudriñar las células del tejido nervioso (colorea al 100% de las células
presentes) y “la herramienta fundamental para estudiar la citoarquitectura cortical”10. Por
ello se prefirió, por sobre otras técnicas más modernas pero menos rendidoras, “al sencillo
cuanto perfecto método imaginado por este sabio”11.
Remito al lector a la subsección IV.1.2. para la descripción detallada de las alteraciones
que se encontraron en la CxF de las crías macho de edad P21 sometidas a EPE sin
prevención del daño. Aquí solamente me atendré al análisis de su posible significación.
Buscando lo que estas alteradas neuronas piramidales pudieran significar me topé con
literatura reciente que les adscribe un origen, en general, artefactual. Serían originadas por
la mala manipulación de los cerebros tras ser fijados, por una fijación defectuosa o
retrasada (extenso tiempo de autólisis postmortem). Así, en dos trabajos recientes, Bernard
Jortner (Jortner, 2005, 2006) se alinea entre los que taxativamente afirman que las neuronas
“oscuras” (como las llama este investigador) son simples artefactos de técnica. Entre sus
referencias cita 5 veces a Jan Cammermeryer –a quien sigue en sus ideas– y previene sobre
la mala interpretación de estas neuronas en los estudios de neurotoxicología (mala noticia,
entonces, para nuestros hallazgos, si esto fuera así). Muestra una muy ilustrativa fotografía
de neuronas alteradas en la capa V de la corteza motora de ratas intoxicadas
10
Cfr. Outes, 1981, pág. 43.
11
Cfr. Ramón Cajal, 1899; tomo I, pág. 118.
236
Discusión
transdérmicamente con un pesticida (la N,N-dietil m-toluamida o DEET). Adscribe la
apariencia de estas neuronas a la mala fijación y manipulación de los cerebros, en mi
opinión, por qué, llamativamente, la lesión se observa en la capa V o en la III y no en todas
las capas de la corteza bajo la zona “lesionada”.12
En 1975, Ebel Ebels, de la Universidad de Gröningen, en Holanda (Ebels, 1975) observó
fácilmente células de Purkinj oscuras en el cerebelo de ratas jóvenes, muertas por
decapitación; eran animales de edad P16 y mayores. Sin embargo, en animales más jóvenes
(de P0-P12 días de edad) a esas neuronas oscuras, no las observó nunca. El autor concuerda
con Cammermeyer y otros en que las células oscuras son un artefacto evitable. Pero sus
hallazgos le sugieren, sin embargo, que la posibilidad de ocurrencia de este tipo de
artefacto dependa del estado madurativo de la neurona en cuestión. Luego veremos que
esto puede estar relacionado con el citoesqueleto, los Nfs más específicamente, y en
particular con la forma como cada uno de los tipos de proteínas que conforman a los Nf (68,
160 y 200) se van agregando a estos según va madurando la neurona. Pero vayamos ahora
al trabajo de Jan Cammermeyer.
Este neuropatólogo belga mudado a los EUA, en una serie de artículos muy citados, pero
principalemente en uno de 1961 (Cammermeyer, 1961)13 pretendió establecer que las
neuronas oscuras son simples artefactos de técnica. En este artículo, una revisión, hace gala
de erudición citando 165 referencias bibliográficas entre las cuales a muchos grandes de la
neurohistología y neuropatología (entre ellos Cajal, Nissl, von Economo o Spielmeyer), a
12
Recordemos al pasar que Jortner es profesor de patología en el Colegio Regional de Medicina Veterinaria
de Virginia-Maryland, en EUA (¡!). Y no menciona para nada a Gallyas (véase más abajo), en sus trabajos.
Parecería no haberlo leído.
13
El artículo lleva el sugestivo título “La importancia de evitar las neuronas «oscuras» en neuropatología
experimental” (Cammermeyer, 1961). Se comprenderá mi desazón al leer su título.
237
Discusión
la vez que descree de los hallazgos de
todos ellos (¡!). Realizó una extensa
serie de experimentos con los que creyó
demostrar que estas neuronas son
artefactos por mala fijación14 o que son
producto de la mala manipulación de las
muestras de cerebro antes o después de
su
extracción
del
Inexplicablemente
cráneo.
para
Figura 96. Figuras 1C (izquierda) y 2C (derecha) correspondientes al
trab ajo de 1961 de Jan C am m erm eyer en el que m uestra neuronas
oscuras (d), ne uron as de m orfología no rm al (n) al lad o d e a qu ellas,
y un oligoden drocito (o) “hinchado” (sw ollen) según él, p ero d el q ue
se ap recia claram ente que em ite una d end rita ap ical en sacacorcho
p or lo q ue, en rig or d e verd ad , ha d e adscrib írsela com o neurona y no
co m o oligoden drocito. A la d erech a, neu ronas oscuras c on clara
d isp osición encolum nad a y con el eje m ayor alterado en su d irección.
Tom ado y m odificado de C am m erm eyer, 1961.
un
neuropatólogo, confunde una neurona colapsada e hipercromática (idéntica a las halladas
en nuestro trabajo) con un oligodendrocito “hinchado” (¡!) y como tal lo señala en su figura
1C (Fig. 96). A pesar de que muestra excelentes fotografías (como la de su figura 2C)
tampoco él explica por qué estas células artefactuales se ubican, extraña y llamativamente,
en columnas, exactamente del mismo modo en que las hemos visto nosotros (Fig. 96).15 En
su erudición, no obstante, hace un aporte enorme: da la más completa lista de sinónimos16
de esta alteración morfológica de las neuronas y discute acerca de muchas de ellas
14
Usó fijadores en soluciones tan ácidas como pH 1,5-4,5 que alteran la carga de las proteínas citosólicas,
según sabemos hoy pero que bien podría fácilmente haber intuido entonces.
15
Es muy posible que Cammermeyer haya desconocido, al momento de escribir su trabajo, aquel en el que
Mountcastle describió la organización columnar de las neuronas en la corteza somatosensorial del gato
(Mountcastle, 1957).
16
Sinonimia recopilada por Cammermeyer (Cammermeyer, 1961) (entre paréntesis el autor y año de la
primera descripción): célula oscura o cromófila (Koneff, 1886, 1887); células cromófilas, osmiófilas o
argirófilas (Kotlarewsky, 1887); célula picnomorfa (Nissl, 1895); célula retraída y oscura (Ramón y Cajal,
1909); célula cortical contraída, célula retraída del ganglio sensorial (Ramón y Cajal, 1913); célula contraída
o retraída, contracción o retracción simple, célula ganglionar esclerótica (Spielmeyer, 1922); célula
hipercromática (Miskolczy, 1925); célula especial del lóbulo del cíngulo y del lóbulo de la ínsula (von
Economo, 1925, 1926); célula homogenea retraída (Gildea y Cobb, 1930, 1931); célula pescado (Stern,
1936); célula de Purkinje tipo II (Hydén, 1943); cromofilia, hipercromasia, cromofilia extrema, cromofilia
de actividad incialmente aumentada, cromofilia de actividad disminuida (Einarson, 1945, 1946); células
ganglionares multiangulares sensibles a la formalina (Bacsich y W iburn, 1953); célula siderófila (Hägqvist,
1958); reacción axonal primaria (Grünthal y W alther-Büel, 1960).
238
Discusión
(desdeñándolas a todas por erróneas). Pero
por esta enumeración se puede seguir la
“genealogía”, si se quiere, de esta
alteración.
Existe una extensa serie de trabajos,
tanto argentinos como extranjeros, que
documentaron, desde hace más de 100
años, la existencia de este tipo de
alteraciones neuronales ante distintos tipos
de circunstancias patológicas, tóxicas o no.
Veamos algunas de ellas.
Las mismas alteraciones estructurales
que nosotros hemos encontrado en el soma
de las neuronas, o la disposición en
sacacorcho de las dendritas apicales de las
neuronas piramidales de la CC, o de los
axones en los estriosomas del Strt o las
F igura 97. A lteraciones en sacacorcho observadas: arriba , p o r
Tagliaferro et al. (2006) en las dendritas apicales (IC Q p ara M A P 2) de las neuronas piram idales del área C A 1 el H ipp de ratas
tratadas crónicam ente con un ag onista d e los receptores
cannabinoides; abajo a la izquierda, axones en sacacorcho (IC Q
p ara N f-200) ob servados p o r R am os et al. (2000) en el Strt d e
ra ta s, 1 día d espués de la finalización de u n tratam ien to
depleción crónica de la 5-H T utilizando P C P A ; abajo a la derecha,
neurona citom egálica nN O S -ir observada por Loidl et al. (1997)
en e l S trt de una rata d e 6 m eses de e dad so m etida a a sfixia
perin ata l.
alteraciones nucleares visibles al óptico, las han constatado también, en nuestro medio: i)
Tagliaferro et al. (2006), han descripto, con técnicas de ICQ para la MAP-2, cambios
estructurales similares en las dendritas apicales (que transcurren por el stratum radiatum)
de las neuronas piramidales del área CA1 del Hipp en experimentos de exposición crónica
de ratas Wistar a un agonista de los receptores cannabinoides (el WIN-55,212-2) (Fig. 97);
ii) Ramos et al. (2000), tras la exposición crónica de ratas Wistar a una droga (la p-
239
Discusión
clorofenilalanina, PCPA) que produce la depleción de 5-HT por inhibición irreversible de
la TPH, han mostrado también alteraciones estructurales del citoesqueleto (con ICQ para
los Nf-200) en los axones que corren por
los estriosomas del Strt (Fig. 97); iii) Loidl
et al. (1997), tras un tratamiento de asfixia
perinatal a ratas Wistar, han mostrado,
también en el Strt y en la CxF, cambios
morfológicos similares en las dendritas de
neuronas citomegálicas que muestran
actividad
de
NADPH-diaforasa
e
inmunorreactividad para la nNOS (Fig.
97); iv) Benítez et al. (1996), esta vez
desde
el
terreno
de
la
clínica
neuropsiquiátrica, mostraron también estos
mismos cambios en neuronas agrupadas en
“nidos” en las capas III y V de la corteza
órbitofrontal anterior de un sujeto de 30
años
de
edad17
(además
de estas
alteraciones, M.G. tenía un cuerpo calloso
adelgazado notoriamente en su porción
posterior)18 (Fig. 98); v) más atrás en el
Figu ra 98. M icrosco pía óp tica de las capas III y V de la co rteza
órbitofrontal anterior del cerebro de M .G . A rriba, grupo neuronal
anorm al con d isp osición en islote; tod as las neuronas con
d en dritas ap icales en sacaco rch o. E n m e dio , n eu ro n a s
ano rm ales en la capa V de la m ism a región , algu na s no rm ales y
otras con la m ism a alteración. A bajo, nótese la dendrita apical en
sacacorcho (p unta de flecha neg ra) en una neurona q ue
co nserva u n núcleo de a sp ec to aún norm al co n nucléo lo eviden te
sim ilar a los nuestros. E sta neuro na, seguram ente , era to davía
vital al m om ento de m orir M .G . M odificado de B enítez et al., 1996.
17
M.G., alias “La Iguana”, un psicópata grave, antisocial, ladrón y asesino. Murió al intentar escapar de una
persecución policial.
18
Exactamente igual que el cuerpo calloso de Ángela (cfr. en la subsección I.1. la Fig. 1A).
240
Discusión
tiempo, Jacinto Carlos Orlando (Orlando, 1952), en su tesis doctoral apadrinada por Braulio
Moyano, mostró con el Nissl, neuronas piramidales con esclerosis y atrofia celular en las
capas III, V y VI de la CxF de sujetos afectados por la enfermedad de Marchiafava-Bignami
(la degeneración sistemática de las fibras comisurales que se observa en el alcoholismo
crónico) (Fig. 99); vi) Christfried Jakob, el maestro e iniciador de la escuela
neuropsiquiátrica germano-argentina, en un estudio anatomopatológico realizado en
cerebros de esquizofrénicos (Jakob y Pedace, 1938) mostró, también en la CxF, “focos de
desintegración lacunar” con ausencia total de pirámides corticales y, aunque no lo menciona
explícitamente, en la periferia de estas lagunas de desintegración se observan pirámides
claramente retraídas y con dendritas en sacacorcho (Fig. 99); vii) cinco años antes, Braulio
A. Moyano en su tesis doctoral (Moyano, 1933), apadrinada por su maestro, Ch. Jakob,
mostró neuronas piramidales en todo similares en la capa III de la CC de pacientes
dementes (Fig. 99). Moyano, en su descripción de la atrofia de Pick, hace explícito que
sigue la de Spielmeyer de 1922 (véase más abajo; Spielmeyer denominaba Zellschrumpfung
a esta alteración).19 Dice Moyano:20 “Las células presentan los grados sucesivos de la atrofia
esclerótica (Zellschrumpfung) retracción de la célula, contornos rígidos, dendritas
flexuosas, el núcleo opaco, la sustancia cromática (del citoplasma) forma una masa
compacta, amorfa” (las itálicas son mías). En otro lugar (Moyano, 1954), tras mostrar la
misma fotomicrografía, afirma que esta esclerosis celular es un “proceso crónico, se
caracteriza por la retracción y oscurecimiento de la célula, los senderos claros que dejaban
entre sí los grumos cromáticos desaparecen, el núcleo se hace picnótico: proceso
19
Una de las descripciones que, entre otras, tildara de inexacta Cammermeyer en 1961.
20
Moyano, 1933; pp. 41-42.
241
Discusión
irreparable, lleva a la destrucción lenta
celular” (las itálicas son mías).21
Entre los de la literatura internacional, se
pueden consignar los siguientes trabajos
antecedentes que muestran a estas neuronas
“oscuras” y a las dendritas en sacacorcho a
ellas asociadas en la casi totalidad de los
casos: i) en modelos experimentales de
hipoxia-isquemia cerebral con posterior
reperfusión (Iizuka et al., 1989; Kövesdi et al.,
2007; Nedergaard, 1987; Onizuka et al.,
1996); ii) modelos de traumatismo encéfalocraneano en ratas (Gallyas et al., 2006a;
Ooigawa et al., 2006); iii) un modelo de
esclerosis
lateral
amiotrófica
en
ratas
transgénicas (Rafalowska et al., 2006); iv) un
modelo de enfermedad de Huntington en
ratones R6/2 transgénicos (Petersén et al.,
2005); v) un modelo de enfermedad de
Alzheimer en ratones transgénicos que
sobreexpresan la presenilina-1 humana (Chui
et al., 1999); vi) un modelo de peritonitis fecal
F ig u ra 9 9 . N e u r o n a s e s c l e r ó tic a s y a tró fic a s
(zellschrum p fung). A rriba, deta lle de la figura 20 de la te sis
de O rlando sobre la enferm edad de M archiafava-B ignam i en
los alcoholista s cró nicos. E n m edio, el desierto lacunar en la
corteza fro nta l de paciente s esquizofrénicos según lo
m ostraran Jakoby P ed ace. A bajo, atrofia celular en la
dem encia de P ick ta l com o lo expusiera M oyano en su te sis
d octoral. En las tres fotos, las flechas y p untas d e flecha
(ausentes en los originales) señalan a las neuronas
alteradas. T om ado y m od ificad o d e O rland o, 1952; J ak ob y
P edace, 1938; y M oyano, 1933.
21
Moyano, 1954; t. II, pág. 23. Veremos luego, en la explicación que da Gallyas en 1992 y 2004 a estos
fenómenos, que afirma lo mismo que decían ya Moyano y Spielmeyer 60 a 80 años antes.
242
Discusión
en cerdos (Papadopoulos et al., 1999); vii) un modelo de dolor neuropático crónico por
constricción nerviosa periférica (Mayer et al., 1999); viii) un modelo de injuria neuronal
leve (por nado forzado) o severa (por inyección local de ácido iboténico en el hipocampo)
(Ishida et al., 2004); ix) un modelo de neuroexcitoxicidad por aplicación iontoforética de
ácido kaínico en la amígdala de ratas (Hajnal et al., 1997); x) en modelos de lesión por
distintos tipos de descargas eléctricas (Islam et al., 1994; Zsombok et al., 2005); xi) en un
trabajo realizado en humanos viejos normales, en el que se estudió la agregación
acumulativa de la proteína J (otro tipo de MAP, axónica predominantemente) de manera
más prominente en las capas II-IV de las CxF y entorrinal (Yang et al., 2005) y en otro
trabajo, en el contexto de estudios de infarto cerebral en ratas, se ha encontrado en neuronas
piramidales de las capas III y V de la CxF de ratas viejas normales (20 meses edad) que
algunas dendritas apicales tenían una estructura claramente en sacacorcho (Schroeder et al.,
2003).22
También destacable es la figura 16 del Lehrbuch der Psychiatrie de Eugen Bleuler,23
quien muestra, bajo el título de degeneración fibrilar de Alzheimer (¡¿?!), dos neuronas al
Bielchowski con prolongaciones que adoptan un “aspecto serpenteante o parecido al
alambre” (Bleuler, 1967). No podía ser de otra forma, y también don Santiago Ramón y
Cajal muestra alteraciones en todo semejantes, en sacacorcho, en su obra Sobre la
degeneración y regeneración del sistema nervioso (Ramón Cajal, 1913). Finalmente, el
antecedente más remoto, a quién el mismo Cajal cita, es un trabajo de 1898 del belga Jean
22
Cfr. su Fig. 3Db.
23
Eugen Bleuler (1857-1940), el psiquiatra suizo a quien se debe la denominación actual de las
esquizofrenias.
243
Discusión
Demoor (1867-1941) (Demoor, 1898).24 Demoor, al igual
que Cajal y otros, llama a los cambios neuronales que nos
ocupan como “estado neuronal moniliforme” porque el
aspecto
que
adoptaban
en
su
microscopio
las
prolongaciones neuronales afectadas hacía recordar al de
las hifas y pseudohifas de la Candida albicans
(antiguamente llamada Monilia albicans). Además de
haber realizado experiencias en amebas, leucocitos,
heliozoarios, Actinospaerium, y otros organismos
Figura 100. E stado m oniliform e de las
neuronas. A rrib a, en la corteza cerebral d e
p erros “m orfinizados” (m od ificad o d e
D em oor, 1896) y abajo, neuronas olfatorias
d e ranas som etid as a la acción de la
co ca ína (m odifica do de D em oor, 18 98 ).
inferiores, Demoor obtuvo estas mismas alteraciones en
perros, ranas (Fig. 100) y ratones sometidos a intoxicación con cocaína, alcohol, hidrato de
cloral, cloroformo, electricidad, éter, gas de alumbrado, exponsición al frío, en animales
normales en período de hibernación. También, en humanos, las observó en cerebros de
imbéciles, afectados de “demencia consecutiva”, epilépticos y paralíticos generales.
Más allá de que las teorías explicativas que ensaya han sido dejadas de lado hoy en día
(movimientos ameboideos de las prolongaciones, responsabilidad de estos cambios en el
mecanismo de producción del sueño o del pensamiento) debe reconocérsele a Demoor que
intuyó que este estado de la neurona (también llamado estado perlado de Renaut o
desintegración granular [körnige Zerfall] de Verworn) comenzaba en los apéndices
piriformes de Stefanowska –nuestras espinas dendríticas– y a partir de ellas se propagaba
24
Como siempre, y con muchas otras cosas, debo mi eterno agradecimiento a mi gran amiga Patricia
Tagliaferro quien pudo conseguir para mí (¡en archivo .pdf!) el artículo original de Demoor en la National
Library of Medicine de EUA, por intermedio de la National Institute of Health Library.
244
Discusión
al resto de las dendritas.25
Pero, quizás, la mejor descripción de estas
neuronas, la más clara, se deba a Walther
Spielmeyer
(1869-1935),
un
eminente
neuropatólogo alemán, autor de un famosísimo
texto de neuropatología (Spielmeyer, 1922) en el
que, en su figura 30, muestra una “célula ganglionar
esclerótica con un grueso apéndice sinuoso y
puntiagudo” en un preparado de Nissl (Fig. 101).
Véanse más arriba, la Fig. 34 de esta tesis y
confróntesela con la de Spielmeyer. Huelgan las
Figura 101. C o rre sponde a la figura 30 de la
N europ atolog ía de Sp ielm eyer. V éase la descripción
en el texto.
palabras.
Actualmente, existen trabajos que proponen la utilización de técnicas tintoriales
específicas para este tipo de neuronas (también llamadas oscuras o argirófilas por distintos
autores). Algunos de estos colorantes son: i) el fluoro-jade C (Schmued et al., 2005) y ii)
la fucsina ácida-vanadio con contratinción con azul de toluidina o hematoxilina (Victorov
et al., 2000). Además de estos dos últimos métodos, existen también otras técnicas
tintoriales histológicas (todas ellas, impregnaciones argénticas) para poner en evidencia este
tipo de neuronas: el método de la argirofilia III (Gallyas et al., 1990) y la técnica aminocupro-argéntica de de Olmos (de Olmos et al., 1994).
25
En la página 231 de su trabajo hay dos frases premonitorias: i) “En la neurona, el estado moniliforme es
una reacción de contracción” (¡!); y ii) “El estudio en profundidad de la fisiología de las espinas o apéndices
piriformes dará probablemente la solución al problema” (¡!). ¡Más de 100 años después seguimos debatiendo
los mismos problemas!. Paradojas de la historia, a pesar de las excelentes descripciones de Demoor, Ernesto
Lugaro (psiquiatra italiano e introductor del término plasticidad en referencia al tejido nervioso) por no
encontrar en sus propios experimentos los mismos hallazgos que Demoor, había tildado a este de cometer
errores en su técnica experimental, ya en 1896 (Demoor, 1898).
245
Discusión
Ferenc Gallyas, un investigador de la Universidad de Pécs, en Hungría, es quien ha dado
una explicación acerca del origen de la morfología de estas neuronas que, a mi modo de
ver, resulta mucho más convincente que las
que postulan el origen artefactual. La “teoría
de la transición de fase gel-a-gel de la
compactación ultraestructural holocelular”,
como él la ha denominado. Dos son los
trabajos en los que adelanta y expone su teoría
(Galllyas et al., 1992, 2004). Permítaseme
transcribir textualmente una traducción mía
de lo que Gallyas postula a fin de evitarme
disquisiciones más largas.
Fi g ura 102. G ráfico q ue intenta exp licar los p rincip ios
energéticos im plicados en la teoría de la tran sición de fase
gel-a-gel de la co m pactación u ltraestructural holocelular d e
G allyas. V er en el texto los d etalles d el p roceso. M od ificad o
de G allyas, 1992.
“La teoría de la transición de fase gel-a-gel postula que numerosos sitios de unión no
covalente de las proteínas en el “citoplasma acuoso” están involucrados no en mantener su
conformación, tal como se la observa in vitro, sino en acompañar mutuamente la conformación
in vivo de cada una, uniendo iones potasio y adsorbiendo moléculas de agua en múltiples capas
ordenadas. La estructura en gel resultante, que es continua en toda la célula y se ancla a los
elementos ultraestrucuturales “visibles” [las organelas], almacena energía en forma de uniones
no covalentes. Si esta energía libre almacenada se libera en cualquier punto intracelular por
acción de algún tipo de energía de activación exógena, tal energía servirá como energía de
activación para los puntos vecinos (principio del dominó) [Fig. 102]. Si se asume como cierta
la existencia de tal estructura citoplasmática en gel, la compactación ultraestructural de toda
la célula que se ve en las neuronas consiste de dos estadíos, que son los siguientes: una fuerza
física o un proceso patometabólico transmite la energía de activación solamente a un punto en
cada dominio somatodendrítico (estadío inicial) y su ultraestructura deviene compactada en el
próximo estadío. Subsecuentemente, en este punto inicial, el cambio conformacional de las
moléculas proteínicas se acompaña por la liberación de moléculas de agua e iones potasio, y
se propaga por toda la estructura del gel gracias a la liberación de energía libre no covalente
almacenada (fase de propagación). En otros términos, se propaga por todo el gel citoplasmático
246
Discusión
un cambio conformacional cooperativo en las proteinas de la matriz del supuesto gel
citoplasmático. Como resultado final, el gel se encoge, causando que los elementos
ultraestructruales “visibles” [las organelas] se acerquen unos a otros (compactación)
extruyendo a las moléculas de agua y a los iones potasio que son liberados fuera de la célula
a través de numerosos poros no visibles de la membrana plasmática. Teniendo todo esto en
cuenta, es el proceso de propagación el que determina las características morfológicas
intracelulares, independientemente del factor de iniciación. Por otro lado, el proceso de
inciación es, al determinar cuáles son las neuronas que se compactarán, el que juega un papel
importante en delinear el patrón de distribución de las neuronas afectadas”. (Gallyas et al.,
2004) (las itálicas y los agregados entre corchetes son míos).
Nótese que el proceso de propagación que postula Gallyas ya había sido intuido u
observado 100 años antes (Demoor) y que es en las espinas dendríticas donde la MAP-2,
molécula crítica del citoesqueleto y que regula el estado de polimerización de los MTs, se
halla libre y en estrechísima relación molecular con los eventos sinápticos (potenciación
y depresión a largo plazo, comunicación transináptica bidireccional independiente de los
neurotransmisores, acción local de las quinasas y fosfatasas con acción fosforilante y
desfosforilante sobre la MAP-2, etc.).26
En muchos de sus trabajos Gallyas muestra imágenes de microscopía electrónica en las
que se observan procesos astrocitarios perineuronales edematizados, hinchados, y a los que
él interpreta como habiendo absorbido parte del agua extruída de la neurona afectada por
el proceso descripto (es más que factible si se recuerdan las funciones del astrocito como
tampón de potasio extracelular y sus conexiones con los vasos sanguíneos por medio de sus
pies chupadores). Cammermeyer, por otro lado, en su trabajo de 1961, muestra excelentes
imágenes de microscopía óptica de neuronas en proceso de retracción (cfr. sus figuras
26
Cfr. I.5.3.2. (La proteína asociada a los microtúbulos de tipo 2) y la subsección VII.4.4. (Estrucutra de
la proteína asociada a microtúbulos de tipo 2 (MAP-2)) del Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas
relevantes al presente trabajo) en esta tesis, y, especialmente, la excelente revisión de Sánchez et al., 2000.
247
Discusión
9B,D,F) con claros y amplios espacios perineuronales del mismo tipo de los que se
observan en la Fig. 50L de este trabajo, marcado por cabezas de flecha blancas. En los
cortes al Nissl, si se observa en detalle a las neuronas más retraídas de la Fig. 34G,H,I, se
puede detectar un delgado halo claro perineuronal refringente, compatible con un delgado
espacio de edema perineuronal.27
Más allá del factor “etiológico” que potencialmente determine el inicio de este proceso
de retracción, una vez que ha comenzado, según Gallyas, el cambio se propaga por toda la
célula (recuérdese a Demoor). Este proceso sería, en definitiva, el modo morfológico de
manifestación de múltiples noxas actuando sobre las neuronas susceptibles. Y el tipo de
aspecto morfológico observado, en sí mismo, no sería más que la traducción visible del
daño a una vía final común. Vía final común que, en virtud de varios elementos que
veremos más adelante, es factible que sea es el citoesqueleto y, como afirma Gallyas en su
artículo de 1992, más específicamente, los Nfs.
Abandonemos por ahora la Zellschrumpfung.
Otro aspecto importante a destacar en esta subsección con respecto a los hallazgos en
los cortes al Nissl en las ratas machos de edad P21 sometidas a EPE, es la presencia (entre
las mismas neuronas afectadas por la Zellschrumpfung) de una célula que tiene todo el
aspecto morfológico de un Nb en migración (Fig. 34C5, marcada con el asterisco). Esta
célula se encontró en la CxF de animales en los que, según hemos visto (Fig. 8 abajo, Fig.
27
Es posible que este espacio perineuronal no se observe tan claramente en los cortes al Nissl de la Fig. 34
porque son, recuérdese, cortes gruesos de vibrátomo, de 50 :m de espesor, que fueron cortados con la
finalidad principal de realizar experimentos de ICQ. Si estos espacios perineuronales estuvieron presentes
alrededor de las neuronas retraídas quizás se hubieran puesto mejor en evidencia con cortes más finos,
incluidos en parafina y realizados con micrótomo.
248
Discusión
11 y subsección I.4.3.5.) ya no debería estar. No es normal hallar un Nb migrando28 en un
animal que habría sido destetado de no haber sido fijado. Pero ténganse en cuenta a este
respecto, varios trabajos previos de otros investigadores que indican que el EtOH, actuando
durante el desarrollo, induce un retraso (delay) general en todos los procesos madurativos
(Miller, 1986, Vallés et al., 1996, 1997). No sería descabellado especular aquí con que el
AMF ha retrasado la migración de algún Nb o que, habiéndolos dañado antes de migrar,
han detenido su migración sin alcanzar a diferenciarse a neuronas.29 De cualquier modo que
hubiera sido, para desentrañar este misterio sería necesario emprender nuevos
experimentos.
Ahora bien, cómo explicar, siquiera tentativamente, las alteraciones observadas en las
neuronas (su Zellschrumpfung) y, particularmente, su especial disposicón.
Hemos visto que en la mayoría de los trabajos sobre las neuronas “oscuras”,
independientemente del tipo de noxa productora, en general, las neuronas afectadas se
ubican paralelamente a la superficie pial en las capas III y V, principalmente, de animales
adultos y, con menor frecuencia, en las capas II-VI (es decir, todo el grosor del derivado de
la original PC). En el trabajo de Benítez et al. (1996) vimos que las neuronas alteradas se
disponían en las capas III y V de la corteza órbitofrontal anterior pero también en islotes
28
No podemos saber, en rigor de verdad, sólo por su aspecto morfológico, si estaba migrando o no; quizás
estaba detenido en su migración. Pero, migrando o no, lo cierto es que es un Nb bipolar. Cfr. las Fig. 34C 5
con la Fig. 9 izquierda. Por otro lado, no pude encontrar ni una célula similar en los animales Control, a pesar
de haber inspeccionado los cortes muy exhaustivamente.
29
Especulemos. Si ese Nb hubiera estado destinado a dar origen a una macroneurona, es evidente que no ha
terminado de migrar radialmente, ya que estas se detienen tras hacer contacto con las cC-R en la ZM/PP. Si,
por otro lado, hubiera estado destinada a dar origen a una microneurona (originada en la eminencia
gangliónica lateral y arribada a la PC tras migrar tangencialmente por la ZI), se detuvo en su migración radial
final y en su diferenciación antes de haber originado una pirámide pequeña o una célula estrellada.
249
Discusión
dentro de esas capas.30 En el trabajo de Jakob y Pedace (1938), en disposición
circunferencial alrededor de desiertos lacunares en la corteza frontal. En nuestro trabajo,
las neuronas con la Zellschrumpfung se dispusieron, claramente, en columnas.
¿Existe algún factor unificador que pueda explicar estas distintas presentaciones
lesionales? En tren de especulación se podría decir que si una hipotética noxa actúa durante
el desarrollo cortical en un momento x, podrían verficarse al menos dos situaciones básicas
en relación a la corticogénesis. Por un lado, si todos los Nb recién generados al momento
de actuación de la noxa se vieran afectados en una región particular, la imagen que uno
esperaría ver en el adulto (en caso de que las celulas migraran finalmente y no murieran por
apoptosis o necrosis) sería la de neuronas dispuestas con una organización laminar (en una
o varias capas) ya que, en principio, habrían migrado todas durante el período de acción del
tóxico. Su localización en cuanto a las particulares áreas corticales se correspondería con
la del particular momento durante el cual se desarrolló tal área (los conocidos períodos
ventana de susceptibilidad particular de cada órgano o región de que habla la
embriología).31
¿Y en el caso de nuestras ratas P21 sometidas a EPE? Si nos atenemos a la veracidad de
30
Sumado esto a la alteración del cuerpo calloso del cerebro de M.G., en todo igual al visto en Ángela (Fig.
1), y que se sabe que puede ser originado por el AMF (Bookstein et al., 2001, 2007; Miller et al., 1999; Paul
et al., 2007), he llegado a preguntarme: M .G. ¿habrá sido hijo de una madre alcohólica? Imposible saberlo
ya.
31
Una noxa, actuando en un determinado momento, puede afectar el desarrollo de determinada área cortical
y no de otras. Por ejemplo, podrá afectar, potencialmente, el área 11 de Brodmann (órbitofrontal); así podría
explicarse lo visto en el caso M.G. de Benítez et al. (1996). O podrá afectar potencialmente las áreas 17, 18
y 19 (occipitopolares); así podría explicarse también la polimicrogiria del lóbulo occipital que se ha
observado en la RM N de Ángela (Fig. 1). Más aún: en virtud de que cada área cortical finaliza su maduración
a distintas edades postnatales, diferentes de la de las otras áreas (recuérdense las áreas mielogenéticas
primordiales, intermediarias y terminales de Flechsig –1896– y la finalización de su mielinización a distintas
edades postnatales), una misma noxa de actuación prenatal podrá manifestarse en su acción en distintos
momentos de la vida del sujeto que la sufrió. Y, según el área afectada, se manifestará en la forma de distintos
cuadros clínicos, a semejanza de lo que ocurre con un epiléptico cuyo foco epileptógeno está en la amígdala
o en el occipital. Misma noxa, mismo mecanismo de daño, distintas manifestaciones neuropsiquiátricas.
250
Discusión
la hipótesis de la unidad radial de Rakic (Rakic, 1988, 2003a) que postula, no sólo que los
Nb postmitóticos migran siguiendo el andamiaje que les proveen las cGR, sino también que
los Nb que migran por una misma fibra radial tienen un orgien clonal (es decir, son
originados por la multiplicación mitótica de la misma cNEp –o de la misma cGR más
adelante en el desarrollo–) (cfr. Fig. 6), y que estos Nb se disponen finalmente en la misma
columna cortical, es factible especular con que la clara disposición columnar lesional
observada en nuestras ratas podría estar indicando que el EtOH, de algún modo, lesionó
leve pero certeramente a un grupo particular de cNEp o cGR (una leve lesión clonal de
células madre). Así, éstas se habrán multiplicado repetidas veces por mitosis, habrán dado
origen a Nb que, tras migrar hacia la PC se dispusieron correctamente32 en las distintas
capas corticales dentro de las mismas columnas. Posteriormente, tras diferenciarse los Nb
a neuronas maduras, tras extender neuritas para establecer circuitos y contactos sinápticos
a la vez que expresaban nuevas proteínas de Nfs para consolidar su citoesqueleto y la forma
neuronal, ha de haberse manifestado la alteración biofísica de que habla Gallyas en su
teoría de la transición de fase gel-a-gel de la compactación ultraestructural holocelular.
¿En qué momento y cuál pudo haber sido el factor determinante de la aparición de la
Zellschrumpfung a lo Gallyas? No lo sabemos. Pudo haber sido un factor externo a las
mismas neuronas afectadas o, quizás también, interno a ellas y determinado por alteraciones
en la estructura de los mismos Nfs. O el mismísimo EtOH. Pero, cualquiera que fuera el
origen, podemos ciertamente suponer que el factor desencadenante habrá sido leve ya que
las neuronas inmediatamente vecinas, de aspecto normal, evidentemente, han tolerado sin
mayores consecuencias la presencia de tal factor.
32
Alguna que otra con su eje alterado; cfr. Fig.34C 4 la neurona marcada con flecha doble. Nada es perfecto,
se ve.
251
Discusión
Las neuronas alteradas que descubrimos en la CxF de las crías P21 sometidas a EPE
poseían prolongaciones celulares, axón y dendritas. Es factible pensar entonces que han
recibido conexiones sinápticas de otras neuronas y las habrán hecho, a su vez con otras
neuronas. Habrán tomado parte de ciertos circuitos sinápticos.
Uno de los mecanismos que se postulan que están involucrados en la epileptogénesis es
la existencia de ciertos circuitos neuronales anómalos como, por ejemplo, aquellos que
determinan las neuronas sobrevivientes o regenerativas en la esclerosis hipocámpica que,
tras años de convulsiones, intentan reparar el daño (Mathern et al., 1997). Entre los ARND
se cuenta, sugestivamente, la epilepsia.
Estas mismas neuronas, aún sin generar “tormentas eléctricas” en el cerebro podrían
fácilmente generar “tormentas cognitivas o conductuales” si llegan a asentar en
determinadas áreas corticales que subyacen a tales rendimientos. Así, estas neuronas
pueden estar en parte, en la base de las enfermedades neuropsiquiátricas a que puede dar
lugar el AMF y la EPE.
V.2.2.
Hallazgos en el cuerpo estriado y en la corteza frontal con la microscopía
electrónica:
La totalidad de los hallazgos obtenidos con el MET son plenamente concordantes con
lo observado en la microscopía electrónica con el Nissl y con la teoría de Gallyas. Veamos.
En principio, los núcleos de las neuronas. No se observaron imágenes nucleares
compatibles con el proceso de muerte por apoptosis a pesar de las claras alteraciones
252
Discusión
estructurales de los núcleos (indentaciones únicas y profundas o múltiples y pequeñas,
escotaduras profundas, cuasi-lobulación). Aunque pudieran parecerlo, tampoco son
compatibles estas imágenes con las alteraciones nucleares que se ven en otro proceso,
recientemente descripto, de muerte celular programada: la paraptosis (Sperandio et al.,
2000).33 Podría haberse pensado válidamente en ella, dado que la paraptosis es frecuente
durante el desarrollo y en procesos neurodegenerativos (Bröker et al., 2005). Sin embargo,
en la paraptosis es característica la presencia de vacuolización citoplasmática (igual que en
la necrosis) y edematización mitocondrial y del retículo endoplasmático (Sperandio et al.,
2000). Nada de esto se vió en las neuronas que contenían a los núcleos morfológicamente
anormales, tanto fuera en el Strt como en la CxF.
Más comunes en el Strt, menos en la CxF, es normal la presencia, en estas dos áreas
prosencefálicas, de algunas pocas34 interneuronas medianas GABAérgicas con dendritas sin
espinas (medium-sized type I aspiny neurons, del Strt). Con citoplasma pálido,
ocasionalmente también se encuentran neuronas estrelladas con núcleos indentados en la
capa II de la CC (Cragg, 1976). En los preparados de MET de nuestras ratas de P5 y P21
sometidas a EPE, sin embargo, la presencia de neuronas que poseían este tipo de núcleos,
muchos de ellos muy indentados, era frecuente y se correspondieron con las imágenes
nucleares indentadas que se observan en la microscopía óptica (cfr. Fig. 49I,J,K y la
Fig.50H,I,J con la Fig. 34C-I). No se los observó en los cortes de los animales Control.
Los axones y las dendritas llamativamente sinuosas tanto en el Strt como en la CxF no
33
Debo el conocimiento de este tipo de muerte celular a Laura Caltana que me alertó sobre su existencia y
acerca del hecho de que algunas imágenes nucleares de nuestras fotomicrografías al electrónico tenían
semejanza con las de la paraptosis. ¡Gracias, Lau!
34
En el Strt de la rata en proporción de un escaso 4-5% del total de las neuronas en tanto que en los primates
puede alcanzar el 23% (Graveland y DiFiglia, 1985).
253
Discusión
se hallaban universalmente en todos los cortes, ni siquiera en todo el corte cuando había
una región afectada sino que, por el contrario las alteraciones parecían disponerse en
“parches” o “islotes”. Lo visto en la MET se correlaciona perfectamente con los hallado en
los experimentos de ICQ con los marcadores citoesqueléticos (Nf-200 y MAP-2). Más aún,
las imágenes de MET permiten entrever el desorden del citoesqueleto (cfr. Fig. 49F –axón
normal– con 49G,H –axón anormal–).35 El citoesqueleto, evidentemente, se ha visto
alterado por la EPE.
Las alteraciones de las mitocondrias constituyen (casi) todo un capítulo aparte. Hemos
visto ya que se encontraron mitocondrias muy largas, delgadas y desplazadas a la periferia
dentro de dendritas corticales (Fig. 50A,B), onduladas o zigzagueantes (Fig. 50C,E,F),
acodadas y de formas bizarras e incluso bifurcadas en horquilla bidente (Fig. 49A-D, Fig.
50E,G).
Normalmente, las mitocondrias son, de por sí, organelas pleomorfas y, en forma aislada
y raramente, es posible encontrar, en animales en todo aspecto normales, cualquiera de
estas formas mitocondriales como también se las puede observar en varias condiciones
anormales (Cervós-Navarro et al., 1999; Djaldetii, 1982; Setoguti, 1977). También en
animales normales, raramente, pueden observarse mitocondrias bifurcadas en las dendritas
apicales de neuronas piramidales corticales; en el interior de estas dendritas normales se
han descripto mitocondrias de hasta 10 :m de longitud (Cragg, 1976).
Entonces, ¿en qué se diferencian las mitocondrias por nosotros halladas en los animales
P5 y P21 sometidos a EPE, de las mitocondrias normales raramente hallables en animales
35
Con MET de alto voltaje, con la cual se pueden alcanzar muy grandes amplificaciones, con réplicas de
criofractura incluso, sería posible obtener mayor resolución y dilucidar con mayor fineza la alteración
ultraestructural en el citoesqueleto. Para ello serán necesarios nuevos experimentos.
254
Discusión
normales? Simplemente, en que nuestros animales Control no las presentaban. A pesar de
que se inspeccionó la misma cantidad de grillas de animales EtOH y Control, en iguales
áreas e incidencias de corte, no fue posible hallar estos tipos de morfología mitocondrial
en los animales Control ni tan solo una vez.
Más aún, existen numerosos antecedentes acerca de las alteraciones que el EtOH induce
no sólo en la morfología sino también en la fisiología de las mitocondrias. El EtOH hace
que las mitocondrias produzcan más especies reactivas del oxígeno que lo normal, que se
altere su estado redox (recuérdese el incremento de equivalentes reductores en forma de
NADH y NADPH debida a la metabolización del EtOH y los efectos tóxicos del
acetaldehído),36 que esas especies reactivas del oxígeno y otros radicales libres induzcan
la peroxidación lipídica (con el consiguiente daño a las membranas biológicas) y el ataque
oxidativo directo a muchas proteínas, entre ellas las numerosas que poseen las mismas
mitocondrias en sus membranas interna y externa (Cahill et al., 2002); además de lo
anterior, el daño oxidativo alcanza también al ADN de la mitocondria (Cahill et al., 2002).
En neuronas humanas inmaduras en cultivo, el daño al ADN y la funcionalidad
mitocondrial pueden contribuir a disparar fenómenos de apoptosis (de la Monte y Wands,
2001).
Nuevamente en el terreno de la morfología, se ha encontrado en la miocardiopatía
alcohólica humana y en un modelo en ratas de esta misma enfermedad, que las
mitocondrias pueden desplazarse de su ubicación sarcoplasmática habitual y entrar al
núcleo de los miocardiocitos en gran cantidad (¡!) (Bakeeva et al., 2001). En los
hepatocitos, las alteraciones de la ultraestructura mitocondrial son de antiguo conocidas,
36
El acetaldehído, por sí solo, es capaz de provocar daño mitocondrial ultraestructural y funcional (Lane y
Lieber, 1966; Lieber, 2000).
255
Discusión
siendo una de las más características la aparición de mitocondrias muy grandes
(megamitocondrias), de aspecto globuloso y frecuentemente bizarro, con disminución del
número y alteración de la orientación normal de las crestas mitocondriales y aparición de
estructuras cristaloides en la matriz que a menudo se torna electrón-lúcida y vesiculada
(Flax y Tisdale, 1963; Koch et al., 1977). Estas alteraciones se observan incluso en sujetos
humanos alcoholistas aún sin enfermedad hepática (Koch y Gamboni, 1977) o alimentados
con dietas nutricionalmente adecuada (Lane y Lieber, 1966) y pueden ser parcialmente
revertidas con la abstinencia (Koch et al., 1977).
Resumiendo los hallazgos de la MET, es posible aseverar que, aún habiendo sido
llamativos, los cambios encontrados en las neuronas (sus núcleos, axones, dendritas o
mitocondrias) no denotaron un compromiso letal de la vitalidad celular. Esto posiblemente
se relacione con el hecho de que las alcoholemias alcanzadas no fueron altas en ningún
momento durante la gestación. Así, el daño, según lo visto, fue leve. Pero existió. Y fue
duradero en el tiempo.
V.3. La exposición prenatal al etanol:
El sistema serotoninérgico está íntima y extensamente involucrado en el desarrollo del
SNC. La depleción de 5-HT así como la EPE en altas concentraciones pueden retrasar su
desarrollo. Por lo tanto, es posible que algunos de los efectos del EtOH durante el
desarrollo sean debidos a sus efectos deletéreos sobre el sistema serotoninérgico y la
interacción de este con la astroglia y el sistema nitrérgico.
256
Discusión
Las crías en desarrollo recibieron EtOH intraútero a través de la placenta y
postnatalmente a través de la leche de sus madres durante toda la lactancia hasta el día del
destete natural (P21).De este modo, el desarrollo completo del SNC de las crías de rata se
cumplió bajo la influencia del EtOH. Esta exposición incluyó al equivalente al tercer
trimestre de la gestación humana, durante el que se lleva a cabo parte del período
sinaptogénico, un período de de crecimiento explosivo del cerebro (llamado brain growth
spurt, en inglés). Este período es enteramente postnatal en la rata, desde el nacimiento y
hasta el momento de la apertura ocular (P0-P14); en los humanos es pre- y postnatal
(Bonthius y West, 1988).
Para evaluar los efectos de este tipo de exposición de bajo nivel sobre el sistema
serotoninérgico en sí mismo, se utilizaron dos marcadores neuronales: la TPH y la misma
5-HT.
La expresión de la TPH estuvó muy aumentada (4 a 5 veces) en los dos núcleos fuentes
de la 5-HT estudiados en el mesencéfalo (NDR y NMR). La 5-HT también aumentó en
ambos núcleos pero en el NDR no alcanzó niveles estadísticamente significativos en tanto
que en el NMR el aumento fue evidente si bien que no tan importante comparado con el
mucho mayor incremento de la inmunorreactividad de su enzima biosintética. El aumento
de los niveles de la TPH-ir podría estar indicando un aumento en la expresión de la enzima
misma, una disminución de su reciclado (degradación seguida de síntesis de novo) con la
consecuente acumulación en el soma neuronal o ambas cosas a la vez. Si los niveles de
expresión de la TPH estuvieran efectivamente incrementados, estos resultados indicarían,
a su vez, que quizás este nivel de expresión no se correlaciona con un incremento de la
257
Discusión
actividad funcional de la enzima.37
Por otro lado, el aumento de la 5-HT-ir también puede haberse debido al aumento en la
expresión de la TPH, a un aumento parcial de la actividad de la TPH, a un incremento en
el almacenamiento intracelular de la 5-HT o a una disminución de su liberación. En
cualquier caso, y a diferencia de lo que han hallado otros autores con niveles de exposición
alcohólica más altos (Baker et al., 1996a, 1996b; Berggren et al, 2002; Halliday et al.,
1993), los bajos niveles de exposición a que fueron sometidos estos animales no alteraron
el número ni, groseramente, la morfología de las neuronas serotoninérgicas en los NDR y
NMR.38
El 5-HTT se utiliza como marcador de las fibras serotoninérgicas y como tal es útil
incluso si existe una notoria disminución, o incluso depleción, del neurotransmisor dentro
de neuronas y fibras serotoninérgicas (algo que, en base a los antecedentes, era razonable
esperar al experimentar con el EtOH) (Rathbun y Druse, 1985; Whitaker-Azmitia et al.,
1996). El 5-HTT, entonces, se utilizó para evaluar la inervación serotoninérgica distal en
las tres áreas prosencefálicas inervadas por el NDR y por el NMR (Hipp, Strt y CxF). A
fines de valorar en ellas los posibles cambios en el nivel de inervación, se midió el área
relativa de tejido cerebral cubierta por las fibras 5-HTT-ir y se encontró que hubo un
aumento significativo de este parámetro en las tres áreas, siendo este aumento más
importante en el Hipp y en la CxF y algo menos en el Strt. A pesar de ello, los animales
EtOH de P21 no mostraron alteraciones morfológicas en las fibras (hubo, así, un cambio
cuantitativo pero no cualitativo). Este aumento del área relativa de las fibras
37
Téngase presente que los anticuerpos utilizados en ICQ reconocen porciones inmunogénicas de la molécula
pero nada dicen acerca de la funcionalidad que tenía in vivo la proteína reconocida.
38
Aunque sí se observaron algunas prolongaciones en sacacorcho (cfr. Fig. 35B,D).
258
Discusión
serotoninérgicas se podría interpretar como un fenómeno de gemación (sprouting) ocurrido
durante el desarrollo, quizás como fenómeno compensatorio espontáneo distal para
contrarrestar la presencia en el prosencéfalo, en la CC en desarrollo, de una sustancia
teratogénica. Recordemos además, que recién hacia el final de la tercera semana de vida
postnatal de la rata (-P21) es cuando se alcanza el patrón adulto de la inervación
serotoninérgica distal en la CC (Dori et al., 1996) por lo que sería esperable que el patrón
de inervación por nosotros observado aquí sea el que persista más allá en el tiempo y hacia
la adultez.
El análisis morfométrico de la GFAP es un parámetro sensible para evaluar la respuesta
astroglial bajo diferentes condiciones patológicas y experimentales. En nuestros
experimentos, se puso en evidencia un aumento del área celular de los astrocitos en las tres
regiones prosencefálicas evaluadas. Sin embargo, los aumentos fueron de distinta
intensidad: no fue significativo en el Strt en tanto que en la CxF fue importante y más aún
en el Hipp (un órgano cerebral clásicamente muy sensible a todo tipo de noxas). Así, es
evidente que ha existido una respuesta regionalmente diferente a la exposición al EtOH en
el cerebro de la rata. El aumento del área celular (hipertrofia astrocitaria) indica la
existencia de una reacción astroglial. Esta reacción astroglial es una respuesta bien
caracterizada en este tipo celular ante diferentes tipos de daños al SNC (Brusco et al., 1997;
Eng y Ghirnikar, 1994; Mathewson y Berry, 1985; Ridet et al, 1997; Tagliaferro et al.,
1997, 2002). Informes previos de otros laboratorios acerca de la expresión de la GFAP tras
la EPE mostraron tanto aumentos (Fletcher y Shain, 1993; Goodlet et al., 1993; Miller y
Robertson, 1993) como disminución de los niveles (Vallés et al., 1996, 1997) de la misma
proteína o de su ARNm. Esta discrepancia puede haberse debido a las diferencias existentes
259
Discusión
en los paradigmas experimentales utilizados por los diferentes autores, al período del
desarrollo durante el cual se llevaron a cabo los estudios y a los distintos niveles de
exposición al EtOH.
En nuestros experimentos con bajos niveles de EPE, la expresión de la GFAP-ir,
claramente aumentó si bien que no en todas las áreas estudiadas, sugiriendo esto que existió
una respuesta regionalmente diferente a los efectos del EtOH. Sin embargo, téngase
presente que la expresión del gen de la S-100B es controlada en paralelo con la expresión
del gen de la GFAP (Donato, 1999) y la expresión de la S-100B-ir, en nuestros
experimentos, también estuvo concordantemente aumentada. Por otro lado, en ratones
transgénicos que sobreexpresan la S-100B, se ha demostrado además que el incremento de
los niveles de S-100B es capaz de inducir un aumento en la expresión de la GFAP y que
este aumento está involucrado en la respuesta astrocitaria in vivo (Reeves et al., 1994).
Estos últimos informes respaldan nuestros hallazgos in vivo actuales.
En respuesta a la estimulación de sus receptores 5-HT1A, los astrocitos incrementan la
liberación de la proteína S-100B (Donato, 2003). La S-100B estimula la extensión de
neuritas de, entre otras, las neuronas serotoninérgicas. La S-100B funciona como un factor
de extensión de neuritas al interactuar con diferentes proteínas del citoesqueleto como los
Nf-200, Nf-160, MAP-2 y la proteína J en las neuronas; pero también interactúa
directamente con la GFAP en los mismos astrocitos e induce su expresión y estimula la
ramificación de sus prolongaciones citoplasmáticas (que es una de las características de la
reacción astroglial, la hipertrofia) (Azmitia, 2001b; Donato, 2003; Reeves et al., 1994). En
relación a esto, la expresión de la S-100B medida como valores de DOR, en nuestros
experimentos, estuvo incrementada en el Hipp, Strt y CxF al igual que lo estuvo el área
260
Discusión
relativa de las fibras 5-HTT-ir. Se sabe que un efecto causado por la S-100B es,
precisamente, el aumento de la extensión de las fibras 5-HTT-ir. Hemos visto que la 5-HTir se elevó en el NMR y que mostró una tendencia no significativa al aumento en el NDR.
Coincidiendo parcialmente con ello, las dos áreas prosencefálicas inervadas por el NMR
(el Hipp y la CxF) fueron las áreas en las que el 5-HTT-ir mostró un incremento más grande
en su área relativa (gemado de las fibras) mientras que en el área con la inervación recibida
desde el NDR mostró un incremento menor. Sin embargo, estos cambios no fueron
completamente paralelos con respecto a los observados en la S-100B-ir dado que esta
estuvo (sólo levemente) más aumentada en el Strt que en las otras dos áreas. Anque los
hechos parecerían apuntar a una tal cadena de pensamiento, siendo rigurosos, el incremento
en la S-100B puede haberse debido no solamente a un aumento de su expresión sino a (o
también conjuntamente con) una disminución de su liberación. Quizás otros factores (como
por ejemplo otros factores neurotróficos aquí no evaluados), aparte de la 5-HT y la S-100B,
pueden haber estado involucrados en la génesis del fenómeno de gemación observado en
la fibras 5-HTT-ir. De todas maneras, es razonable especular con que un aumento de la
liberación de la 5-HT en las áreas prosencefálicas estimuló la síntesis y liberación de S100B desde los astrocitos la cual, a su vez, estimuló la gemación de las fibras 5-HTT-ir.
Vengamos a considerar ahora al citoesqueleto neuronal. Sabemos que los Nfs son el
componente más importante de su citoesqueleto; determinan íntrinsecamente el calibre
axonal y su remodelación dinámica es necesaria para el crecimiento y guía axonal en su
camino al blanco sináptico a la vez que para el modelado de la forma neuronal (Hoffman
et al., 1987). Los Nf-200 se expresan exclusivamente en las neuronas y junto con los Nf160 están fosforilados en niveles inusualmente altos. La fosforilación puede ser regulada
261
Discusión
por varios mecanismos intracelulares (Hammerschlag et al., 1994). En nuestros
experimentos utilizamos anticuerpos primarios dirigidos contra los Nf-200 como medio
para evaluar a los Nfs maduros en neuronas maduras, debido a que en estas células,
recuérdese, esta proteína es el tipo determinante de la madurez de los Nfs. De tal modo
pudimos determinar que el área relativa de los Nf-200 estaba incrementada tanto en el Hipp
como en el Strt. Por el contario, no se observaron variaciones en la CxF pero en esta región
(igual que en los axones de los estriosomas del Strt) muchas neuronas piramidales
mostraron una dendrita apical ondulante, en sacacorcho o tirabuzón (Fig. 45 D,F). Este tipo
de alteración morfológica es indicativo de una alteración del citoesqueleto por alteración
en su desarrollo o ensamblaje o, una vez ensamblado normalmente, por una alteración
adquirida en su estructura, alteración de orden biofísico, según ha postulado Gallyas.
Por otro lado, el aumento de los niveles de los Nf-200-ir junto con los de la S-100B-ir,
concomitantemente con las alteraciones morfológicas del citoesqueleto podrían sugerir
también que se está ante la presencia de un proceso de maduración acelerado tal como el
visto, por ejemplo, en el síndrome de Down (que sobreexpresa la S-100B, codificada en el
cromosoma 21) o en la enfermedad de Alzheimer. En respaldo de nuestros resultados
vienen los informes previos de otros laboratorios que también han mostrado signos de
desarrollo y maduración acelerados en ratones transgénicos que sobreexpresan la S-100B
como así también cambios morfológicos en las dendritas (en todo similares a los hallados
por nosotros) y que serían compatibles con un envejecimiento temprano (Whitaker-Azmitia
et al., 1997). En esos mismos ratones transgénicos se ha encontrado también un aumento
de la expresión de los Nf-200 y de otros componentes del citoesqueleto tal como lo que
nosotros encontramos aquí (Reeves et al., 1994).
262
Discusión
Finalmente, analicemos a la nNOS. El NO y la nNOS se ralcionan con el sistema
serotoninérgico en diferentes condiciones normales y patológicas (Ramos et al., 2000,
2002; Segieth et al., 2001; Tagliaferro et al., 2001, 2003). En nuestros experimentos, en el
Hipp se detectaron muy bajos niveles de nNOS-ir (que no permitireron su evaluación) pero
en el Strt y en la CxF hubo un aumento muy importante de la nNOS-ir. En experimentos
in vitro con células PC12 se ha demostrado previamente que el EtOH y el factor de
crecimiento nervioso (NGF) inducen sinérgicamente a la nNOS (Phung y Black, 1999) y,
en vista de nuestros resultados, estamos tentados a especular con el hecho de que en ambas
áreas evaluadas con aumento de la nNOS-ir también hubo un aumento muy importante en
la S-100B-ir. Tal como sucedió en el caso del aumento de los niveles de la TPH-ir, no
podemos excluir aquí la posibilidad de que el aumento de la nNOS-ir haya sido debido a
un aumento de la expresión de la enzima así como también a una muy disminuída tasa de
su reciclado (turnover) con la consecuente y lógica acumulación en el soma neuronal. No
mucho tiempo atrás, se ha especulado con que el nivel de la nNOS podría cumplir un rol
protector contra la toxicidad y la microcefalia inducida por el EtOH en el cerebro del ratón
en desarrollo a través de la vía NO-GMPc-PKG (Bonthius et al., 2002). En coincidencia
con ello, nosotros tampoco observamos ningún caso de microcefalia en las crías de nuestras
hembras. Más aún, contrariamente a nuestros resultados a la vez que respaldándolos, se ha
demostrado no hace mucho que la deficiencia de nNOS empeora la microcefalia y la
pérdida neuronal inducidas por el EtOH en los ratones en desarrollo (Bonthius et al., 2002).
El EtOH inhibe la función de los receptores glutamatérgicos NMDA que contienen las
subunidades NR2C y/o NR2D (Allgaier, 2002). Los receptores NMDA inducen la
activación de la nNOS mediada por el GMPc; la nNOS, a su vez, sintetiza NO a partir de
263
Discusión
la arginina. De este modo, en nuestros experimentos in vivo, es posible que los bajos
niveles crónicos de EtOH, al inhibir a los receptores NMDA, indujeran una sobreexpresión
compensatoria de la nNOS. Asumiendo que los niveles incrementados de nNOS-ir
implicaran un aumento conscuente de los niveles de NO, y teniendo en mente que el NO
inactiva a la TPH por vía de la oxidación de residuos sulfhidrilos críticos del sitio activo
de la enzima (Kuhn y Arthur, 1997; Kuhn y Geddes, 1999), es razonable especular con que
los muy incrementados niveles de la TPH-ir que hemos hallado fueran una sobreexpresión
compensatoria tendiente a minimizar los efectos de tal inhibición sobre la biosíntesis de la
5-HT. Esto podría explicar también el incremento relativamente menor del nivel de la 5HT-ir per se dado que la mayoría de la TPH-ir pudo haber estado, catalíticamente, inactiva.
Pero los niveles incrementados de la 5-HT-ir pueden explicar razonablemente el incremento
de la S-100B-ir, el incremento de la GFAP-ir y la reacción astroglial (conjuntamente con
el efecto tóxico directo del EtOH), y así, los niveles aumentados de los Nf-200-ir.
Por lo tanto, una forma de interpretar lo sucedido en este modelo de EPE, crónica y de
bajo nivel, es que el EtOH puede haber actuado como un factor acelerador del desarrollo
en ciertos aspectos moleculares, induciendo una maduración y desarrollos acelerados,
contrariamente a lo observado en otros modelos en los cuales los niveles altos de EtOH
generalmente causan un retraso en la maduración y desarrollo del SNC. Otra forma de
interpretar los hechos, quizás más consistente con lo que hemos anotado con respecto a los
hallazgos de la microscopía óptica al Nissl de la y electrónica, es que los cambios inducidos
por el EtOH son de algún tipo neurodegenerativo activo ya durante el mismo desarrollo del
animal pasivamente intoxicado intrauterinamente.
264
Discusión
V.4. La prevención del daño con buspirona:
La buspirona (Fig. 103)39 es una droga de uso clínico
neuropsiquiátrico en humanos como ansiolítico no
benzodiazepínico
(químicamente
es
una
azaspirodecanodiona). Su mecanismo de acción depende
de una alta capacidad de unión a los receptores 5-HT1A
sobre los cuales posee una acción agonista parcial (con
Fig ura 103. La buspirona en representación
d e fó rm u la e xtendida y en m o d e lo
tridim en sion al de esferas.
menor afinidad se liga también a los receptores 5-HT2 y
D2). Administrada por vía oral, se absorbe completamente pero como es objeto de un gran
efecto de primer paso hepático, su fracción biodisponible es de sólo 0,03 pero en nuestros
estudios la administramos por vía sc a las hembras preñadas por lo que su biodisponibilidad
fue total. En el cuerpo se distribuye generalizadamente, cruza la BHE y pasa a la leche
materna. Se metaboliza en el hígado por hidroxilación a un metabolito inactivo y por
desalquilación oxidativa a otro metabolito que es sólo 20% menos activo que la droga
madre. Su vida media en plasma es de 2-11 hs. Administrada conjuntamente con el EtOH,
a diferencia de las benzodiazepinas, no potencia los efectos deletéreos del tóxico en el
desempeño de tareas cognitivas (Baldessarini, 1996). Existen reportes que indican que la
buspirona disminuye la ingesta de EtOH tanto en humanos alcohólicos (Fawcett et al.,
2000; Lovinger, 1999) como en ratas expuestas al EtOH (Hedlund y Wahlström, 1996;
Kostowski y Dyr, 1992). Sin embargo, este efecto no se observó en nuestros
39
Nombre químico: monoclorhidrato de 8-[4-[4-(2-pirimidinil)-1-piperazinil]butil]-8-azaspiro [4,5] decano7,9-diona
265
Discusión
experimentos.40
Actuando como un agonista parcial de los receptores 5-HT1A de los astrocitos, la
buspirona puede ser capaz de inducir en estos la liberación de la S-100B. A su vez, la
liberación al medio de la S-100B podría prevenir los efectos la EPE en virtud de su acción
neurotrófica y promotora de la extensión de neuritas y del mantenimiento del fenotipo
maduro y diferenciado de las neuronas. Esta es la justificación racional sobre la que asienta
el uso experimental de las drogas agonistas 5-HT1A en general, y de la buspirona en
particular, como droga neuroprotectora en el AMF (Druse et al., 2005; Eriksen y Druse,
2001; Eriksen et al., 2002; Kim y Druse, 1996).
En el protocolo de EPE con prevención del daño se han replicado varios de los hallazgos
básicos del protocolo anterior en el que no se previno el daño.41
La DOR de la 5-HT-ir en el citoplasma de las neuronas de los núcleos del rafe, en los
animales control (CS) (Fig. 61) siguió una curva bifásica con un aumento de la DOR desde
P5 con un pico en P35, una posterior disminución en P60 y un nuevo aumento hacia P90.
El pico de la DOR en el NDR fue menos pronunciado que en el NMR. Estos perfiles
temporales en la evolución postnatal de la DOR de la 5-HT-ir en animales normales (CS),
que reflejarían semicuantitativamente la 5-HT que efectivamente se hallaba in vivo en el
citoplasma las neuronas, se correlacionan con (y confirman) lo ya observado en otros
trabajos en relación a varias características generales del sistema serotoninérgico (D’Amato
40
Cfr. más arriba, la subsección V.1.1. (Consumo de alimento, bebida y calorías) en esta misma sección de
Discusión.
41
Así, por ejemplo, véase en la Fig. 65, el aumento de la GFAP-ir en el Hipp y en la CxF de las crías ES de
edad P21 tal como sucedió en las crías de igual edad en el protocolo anterior. También el aumento de la S100-ir en el Hipp (igual edad y grupo de tratamiento) en la Fig. 67. Sucedió lo mismo con el nivel de 5-HT-ir
medido en los animales ES a la edad P21 en el NDR con respecto a lo visto en el protocolo anterior aunque
en el que nos ocupa ahora no se observó el aumento que sí en aquél.
266
Discusión
et al., 1987; Dinopoulos et al., 1997; Dori et al., 1996, 1998; Galineau et al., 2004; Tanaka
et al., 2006) y, más específicamente, en relación a los niveles en el rafe de la TPH (Rind et
al., 2000) y de la 5-HT mismas (Herregodts et al., 1990). El pico de la DOR en el NMR fue
de mayor intensidad que en el NDR (Fig. 61, línea oscura correspondiente al grupo CS).
El EtOH administrado prenatalmente (grupo ES) abolió el pico de P35 en ambos núcleos
y la buspirona administrada prenatalmente a las madres alcoholizadas (grupo EB) pareció
restaurarlo parcialmente, al menos (completamente) en el NMR.
Algo similar sucedió, y quizás más llamativamente, en el Hipp y la CxF con la GFAP
y la reacción astroglial. La buspirona en el grupo alcoholizado (EB) restauró prácticamente
los perfiles normales del grupo CS (Fig. 63-65). Nuevamente, pero ahora con respecto a la
S-100B, la buspirona, en el Hipp, pareció mostrar un efecto neuroprotector sobre la acción
deletérea del EtOH (Fig. 66 y 67).
También se estudió en este protocolo el efecto de esta droga sobre un marcador
citoesquelético: la MAP-2. Recuérdese que la MAP-2 es, además, marcador de dendritas
y utilizado como medio para evaluar la “salud” de los circuitos sinápticos subyacentes a los
rendimientos cognitivos. En dos regiones prosencefálicas muy sensibles desde el punto de
vista cognitivo (el Hipp y la CxF) los perfiles temporales normales (grupo CS) de expresión
de la MAP-2 fueron distintos (incremento sostenido desde P5 hasta P90 en el Hipp;
pequeño valle en P35, entre P21 y P60 en la CxF). ¿A qué pudo haberse debido esta
diferencia entre los perfiles de las dos áreas en animales normales? Posiblemente, a la
adquisición progresiva de funciones mnésicas en el Hipp a medida que el animal madura
y se desarrolla y, en la CxF es posible que estos cambios se hayan relacionado con los
cambios madurativos que se sabe ocurren en esta región entre el inicio (P35) y la
267
Discusión
finalización (P60) de la adolescencia (véanse más detalles abajo al tratar el protocolo de
exposición durante la adolescencia).42 De cualquier modo, el EtOH alteró profundamente
los niveles de expresión de la MAP-2 en ambas áreas (Fig. 68-70, grupo ES). En todas las
edades postnatales, la MAP-2 vió disminuída su expresión (incluso hasta en la adultez
–P90–) y, así, es lógico suponer que disminuyeron los niveles de los circuitos sinápticos en
éstas áreas y, por tanto, su rendimiento funcional cognitivo (algo que se correlaciona bien
con lo observado en humanso afectos de ARND). La buspirona, previno también este daño
(Fig. 68-70, grupo EB).
¿Qué efectos produjo la buspirona en los experimentos conductuales? A largo plazo,
en las crías ya adultas (P90), parece haber restaurado un parámetro de la actividad
locomotora, medido como la cantidad de cruce de cuadros en sesiones de evaluación de 5
minutos en un paradigma de exposición a un ambiente novedoso en forma de campo abierto
(Fig. 71, arriba). Las ratas que fueron sometidas a EPE (grupo ES), en comparación con los
animales normales (CS), mostraron una tendencia no significativa al incremento de la
actividad locomotora (exploraron más el ambiente novedoso), algo que podría
correlacionarse con lo observado en los humanos afectados de ARND que suelen padecer,
frecuentemente (hasta un tercio de ellos), el trastorno por déficit de atención con
hiperactividad –TDAH– (Famy et al., 1998). Coincidentemente con el incremento de la
exploración, las crías P90 del grupo ES mostraron una tendencia no significativa a
permanecer más tiempo en el cuadro central del dispositivo, lo cual se podría interpretar
42
Evidentemente, es necesario realizar nuevos experimentos con la finalidad de caracterizar en detalle estos
cambios normales.
268
Discusión
como un grado de ansiedad menor en relación a los sujetos normales (grupo CS).43 El
EtOH, en consumo agudo, es un conocido ansiolítico.44 Y la buspirona, también. Pero aquí
nos encontramos con los efectos de la EPE en animales ya adultos por lo que no es posible
adscribir la disminución de la ansiedad en el campo abierto a la acción inmediata del EtOH
o de la buspirona. Es posible, entonces, que las alteraciones morfológicas del sistema
serotoninérgico (que se observaron en los experimentos de ICQ) han sido el substratum
antecedente de esta conducta alterada en los animales ES adultos; y que la acción
neuroprotectora de la buspirona administrada intrauterinamente es la responsable de la
modificación preventiva –tanto morfológica como conductual– observada en los animales
del grupo EB.
La secuencia explicativa posible de los eventos observados puede haber sido la que
sigue: en presencia del EtOH que tiende a provocar una reacción astroglial (con aumento
de la GFAP), acumulación de la S-100B intracitoplasmática y lesión dendrítica con
disminución de su contenido de MAP-2, la buspirona, al estimular a los receptores 5-HT1A
de los astrocitos induciría la liberación de la S-100B por parte de estos (la DOR de la S100B baja), se recompone el citoesqueleto astrocitario (dismuye la GFAP y la reacción
astroglial) y, tras actuar sobre las neuronas, promueve la extensión de neuritas, la
acumulación de MAP-2 dendrítica y el establecimiento de nuevos contactos sinápticos.
Ahora bien, extrapolando entre especies y teniendo en cuenta los riesgos que ello
43
La tendencia natural de la rata es a no permanecer en lugares abiertos e iluminados; son animales, en
general, temerosos a los que no les gusta la exposición que pudiera ponerlos en peligro, por lo que prefieren,
en este paradigma, permanecer cerca de las paredes del dispositivo.
44
D e hecho, muchos humanos psicóticos o adictos a drogas de abuso como la cocaína, utilizan
espontáneamente el EtOH como droga ansiolítica para contrarrestar, estos los efectos de la droga y aquellos
los de su psicosis. O simplemente también los adolescentes normales que lo utilizan con igual finalidad antes
de encarar situaciones ansiógenas, como por ejemplo, hoy en día en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires,
ir a bailar y enfrentarse a personas del sexo opuesto (Avaca, 2006; Sousa Dias, 2008).
269
Discusión
siempre implica en ciencia, y habida cuenta de que la buspirona se halla en uso clínico
humano y es una droga relativamente segura ¿sería también seguro el uso de la buspirona
en embarazadas alcohólicas o en recién nacidos con ARND con la finalidad de prevenir el
daño provocado al feto por el EtOH consumido por la madre?
A pesar de que los datos aquí mostrados y los informados previamente por otros
investigadores (Druse et al., 2005; Eriksen y Druse, 2001; Eriksen et al., 2002; Kim y
Druse, 1996) hacen presuponer que sí podría hacerse, no creo que se debiera antes de
realizar investigaciones más exhaustivas que diluciden ciertos hallazgos que provocan
cierto alerta acerca de la buspirona. Por ejemplo, si bien esta droga en nuestros
experimentos y en los de otros investigadores parece haber sido eficaz como sustancias
neuroprotectora, no es menos cierto que su uso en animales no alcoholizados (grupo CB)
desvió de la normalidad (grupo CS) ciertos parámetros.45 Habrá de tenerse en cuenta aquí
que la buspirona estaría actuando en este caso como droga con una función “plastica”,
neuroprotectora capaz de modificar el desarrollo del sistema serotoniérgico. Pero al ligarse
a los receptores 5-HT1A dendrosomáticos de las neuronas de los núcleos del rafe, estaría
actuando, además, como un inhibidor de la tasa de descarga de potenciales de acción a
partir de estas células y, por lo tanto, disminuyendo la liberación de 5-HT. Por ello, los
efectos farmacológicos finales de la buspirona son de interpretación mecanística compleja.
Todas estas consideraciones llaman a la cautela.
45
Cfr. en la Fig. 61, en el grupo CB, el pico exagerado de la DOR de la 5-HT-ir en P35 y su disminución casi
significativa en P90, ambos en el NDR, o el aumento significativo del mismo parámetro en P5 en el NM R;
también la alteración del perfil normal de la curva CB, con corrimiento del pico de P35 a P60, en el Hipp en
la Fig. 65 –GFAP-ir–. Cfr. también, en la Fig. 71 –conducta– la disminución de la actividad exploratoria y
el aumento de la ansiedad en las crías P90 del grupo CB.
270
Discusión
V.5. Los adolescentes:
V.5.1.
El problema de definir y delimitar la adolescencia en humanos y en ratas:
La adolescencia se puede definir como el período de transición gradual desde la juventud
a la adultez. También como el período de la vida entre la adquisición de la madurez sexual
y la consecución de roles y responsabilidades de adulto (Dahl, 2004; Spear, 2000).
La Organización Mundial de la Salud delimita temporalmente a la adolescencia humana
como el período que va de los 10 a los 20 años de edad (10-14 años: adolescencia
temprana; 14-17 años: adolescencia media; y 17-20 años: adolescencia tardía (WHO, 1986).
Sin embargo, sus límites parecen variar algo arbitrariamente según los tiempos y las
conceptualizaciones cambiantes (Dahl, 2004).
En lo que a las ratas se refiere, el momento exacto de la adolescencia también es motivo
de cierta disputa. Existen dos criterios temporales para definirla: uno de ellos la define
como el período que va aproximadamente desde P30 hasta P42 (concepto estrecho) (Spear,
2000). El otro, entre P28 y P55 (un concepto amplio que toma en cuenta los últimos
cambios de la adolescencia, especialmente aquellos que se ven en las ratas macho (Ojeda
y Urbanski, 1994).
Así, decidimos evaluar ratas macho en edades de P45-P50 (adolescencia tardía en las
ratas), con la intención de mimetizar el contexto de un humano que se involucra en un
consumo excesivo de alcohol, conducta que es altamente prevalente durante la adolescencia
tardía (Monti et al., 2005; Spear, 2004).
271
Discusión
V.5.2.
Cambios nerviosos y conductuales normales durante la adolescencia:
Tanto los seres humanos como las ratas experimentan muchos cambios conductuales
y biológicos notables durante la adolescencia. Al ingresar a la adolescencia, los humanos
incrementan mucho sus interacciones sociales, pasan mucho más tiempo en compañía de
sus pares (incluso más que los adultos entre sí), buscan constantemente experimentar
sensaciones nuevas y frencuentemente se ven involucrados en conductas riesgosas o
potencialmente dañinas; se conducen de forma salvaje e incluso antisocialmente y a
menudo comienzan a beber alcohol o a consumir otras drogas (Spear, 2000; Dahl, 2004).
Entre los 13 y los 15 años de edad se describe un pico de ansiedad en los humanos que
seguramente contribuye (junto a otros factores de riesgo) al frecuente inicio del consumo
de EtOH (Pohorecky, 1991).
Mientras todas estas conductas comienzan con la pubertad misma, en forma más lenta
y tardía se adquieren la mayoría de los desarrollos cognitivos superiores que podrían
oponérseles sensatamente (Dahl, 2004). Hay un desfasaje conductual evidente entre lo que
se puede y lo que se debe.
En los humanos adolescentes muchos de estos cambios frecuentemente los predispone
a iniciar el consumo de alcohol o de otras drogas (Dahl, 2004; Spear, 2000). Muchas áreas
cerebrales cambian notablemente, en particular la corteza prefrontal y las regiones
mesolímbicas prosencefálicas (Lewis, 1997; Spear, 2000). Estas áreas (como la corteza
órbitofrontal) son la base de las funciones cerebrales más elevadas y típicamente humanas,
tales como los sentimientos sociales y los rendimientos éticos (Goldar, 1975; Goldar y
Outes, 1972; Goldar et al., 1993; Kleist, 1934; Welt, 1888).
272
Discusión
Existen muchos cambios químicos y estructurales cerebrales que subyacen a los
conductuales y cognitivos, tanto en los humanos como en las ratas. Muchos de estos
difieren entre uno y otro sexo y que pueden explicar la vulnerabilidad aparentemente más
alta que tienen los cerebros femeninos comparados con los masculinos (Bethea et al., 2002;
Juraska y Markham, 2004; Lewis, 1997; White y Swartzwelder, 2004).46 Los sistemas
neurotransmisores monoaminérgicos, y el serotoninérgico entre ellos, también
experimentan importantes cambios durante la adolescencia (Bethea et al., 2002; Dinopoulos
y Dori, 1995; Dinopoulos et al., 1997; Dori et al., 1996).
Como era de preverse, si se viera interferido en cualquier modo evidente el desarrollo
del cerebro adolescente (tal como en otros períodos del desarrollo cerebral), también
podrían verse comprometidos concomitantemente los rendimientos cognitivos y
conductuales subsecuentes que el individuo hubiera podido alcanzar de no haber sido así.
V.5.3.
Cambios morfológicos duraderos tras la exposición durante la adolescencia
y la abstinencia:
A pesar de que existen abundantes datos acerca de los efectos del EtOH sobre el sistema
serotoninérgico del feto y de los adultos casi no existen datos relativos a este sistema
neurotransmisor y el consumo de EtOH durante la adolescencia.
En el protocolo de exposición al EtOH durante la adolescencia, tras 6 semanas de una
46
Teniendo en cuenta este hecho, sería interesante diseñar experimentos adicionales con la finalidad de
comparar los hallazgos en machos del presente trabajo con los que podrían tener lugar en los cerebros
femeninos y determinar si uno u otro sexo es más vulnerable o resistente que el otro a los efectos del EtOH
bajos las condiciones experementales que he utilizado aquí.
273
Discusión
exposición baja, las ratas macho adolescentes mostraron un descenso significativo de los
niveles de expresión de la 5-HT-ir (medida como DOR; Figs. 73 y 74) en las neuronas del
NDR pero no en las del NMR. No se observó disminución del número de neuronas
serotoninérgicas. Este hallazgo acerca de un sistema serotoninérgico disfuncional tras la
exposición al EtOH en la adolescencia es consistente con la implicación de este
neurotransmisor en las conductas riesgosas, la agresión y el alcoholismo (Barr et al., 2004).
Estos resultados también son consistentes con estudios previos que han demostrado que el
NDR es más sensible que otros núcleos del rafe a los estímulos tóxicos (Gartside et al.,
1997; Tagliaferro et al., 1997). Tras el período de abstinencia, las neuronas del NDR
recuperaron los niveles de 5-HT-ir a un nivel no significativamente diferente del de los
controles, sugieriendo esto que el daño inducido por el EtOH en baja dosis, no fue tan
importante como para imperdir la recuperación. Entre otras estructuras funcionalmente
relacionadas, recuérdese que el NDR envía axones para inervar el Strt, el NMR las envía
al Hipp y entre ambos contribuyen a inervar la totalidad de la CC (Fraser y Hensler, 1994).
A pesar de esta correlación anatómica, en nuestro estudio parece no haber existido una
correlación completa entre el grado de descenso de la 5-HT-ir en el NDR (y la ausencia de
cambios en el NMR) con las alteraciones observadas en sus respectivas áreas blanco de
inervación. Así, por ejemplo, mientras la 5-HT-ir en el NDR se alteró y recuperó en
paralelo con la GFAP-ir, la S-100B-ir, la MAP-2-ir y los Nf-200-ir en una de sus áreas de
inervación (el Strt), la 5-HT-ir del NMR no siguió los cambios observados en el Hipp
sugieriendo este hecho que otros factores, más allá de los estudiados aquí, pueden haber
estado implicados en su génesis. Se necesitan experimentos adicionales diseñados ad hoc
para poder dilucidar este punto.
274
Discusión
En los astrocitos, la GFAP-ir, aumentó significativamente en las tres áreas
prosencefálicas y mostraron una morfología hipertrófica y reactiva, según era esperable
(Figs. 75 y 76). Tras la abstinencia, cuando los animales eran ya adultos, los astrocitos
mostraron una reducción de su área celular y la disminución de la expresión de la GFAP
que tendió, aunque no alcanzó, a los valores control. Esta reducción, de recuperación podría
decirse, fue de magnitud comparable en las tres áreas (77% en el Hipp, 66% en el Strt y
73% en la CxF). Este hallazgo sugiere que, a pesar de que la exposición fue de bajo nivel,
el daño inducido por el EtOH durante la adolescencia tardía fue lo suficientemente intenso
como para inducir efectos residuales a largo plazo en los astrocitos, efectos que fueron
evidentes bien entrada la adultez.
La DOR de la S-100B-ir en el citoplasma de los astrocitos disminuyó, a diferencia de
lo visto en los protocolos de EPE (Figs. 77 y 78). Sin embargo, en ratones adultos knockout para la S-100B, no hace mucho, se ha observado un aumento correlativo de la expresión
de la GFAP a semejanza de lo que hemos visto en este protocolo (Chang et al., 2005). Tal
como se ha hipotetizado ya (Chang et a., 2005) la reactividad glial que observamos puede
haberse debido en parte al efecto tóxico directo del EtOH y no haber estado tanto en
relación con la S-100B y puede reflejar también, de hecho, la disminución intraglial de esta
proteína dado que, se sabe, la S-100B inhibe la polimerización dela GFAP (Bianchi et al.,
1995); de este modo, aunque parezca paradójico, la disminución intracitoplasmática de los
niveles de S-100B en el astrocito se acompañó por aumento de la GFAP-ir.
También encontramos que la S-100B-ir, la MAP-2-ir y los Nf-200-ir disminuyeron
todos claramente (si bien que a distintos niveles) en el Hipp, Strt y CxF (Figs. 79-82).
Teniendo en mente las acciones postuladas de la S-100B sobre las proteínas del
275
Discusión
citoesqueleto, la disminución paralela de estos tres inmunomarcadores es mecanísticamente
consistente y también lo es con hallazgos previos de Azmitia et al. (1995), quienes
encontraron (en las cortezas parietal y temporal, el Hipp y el hipotálamo) un descenso
conjunto en la 5-HT, la S-100B y la MAP-2 luego de una depleción experimental de 5-HT.
El mismo paralelismo se encontró entre el descenso de la MAP-2-ir y de los Nf-200-ir en
el Hipp y la CxF de ratas macho adultas luego de 6 semanas de intoxicación alcohólica leve
en el protocolo de exposición al EtOH en la adultez (ver más adelante). Hasta donde sé, no
existen estudios previos que informen la alteración de la MAP-2-ir y de los Nf-200-ir tras
la exposición al EtOH en la adolescencia.
Dado que las neuronas son críticamente dependientes, en su funcionamiento correcto y
en el establecimiento de nuevos circuitos neuronales, de la integridad del citoesqueleto, los
presentes hallazgos en el Hipp, Strt y CxF se correlacionan en forma consistente con, y
respaldan, informes previos que demuestran que las ratas adolescentes expuestas al EtOH
exhiben trastornos en el aprendizaje y en la memoria espacial (Markwiese et al., 1998;
White y Swartzwelder, 2004) y alteraciones a largo plazo en el funcionamiento cognitivo
(Osborne y Butler, 1983).
Tras la abstinencia, la S-100B-ir retornó a los valores control. El aumento de
recuperación fue de similar magnitud en las tres áreas prosencefálicas sugiriendo que (como
en el caso de la GFAP) la capacidad de recuperación de los astrocitos es similar en las tres
áreas. Tal recuperación estuvo en paralelo con la de la GFAP-ir a pesar del hecho que el
área celular no se recuperó totalmente (efecto “residual”). Pero no fue esta la situación en
el caso de la MAP-2-ir y de los Nf-200-ir. La MAP-2-ir alcanzó los valores control en el
Hipp y en el Strt (tras un aumento de 1,8 y casi 4 veces, respectivamente). Este resultado
276
Discusión
está de acuerdo con hallazgos previos de Putzke et al. (1998), quienes encontraron una
disminución del ARNm de la MAP-2 en varias áreas cerebrales y una subsiguiente
recuperación de sus niveles tras la abstinencia al EtOH. También de acuerdo con los
nuestros están los hallazgos de Whitaker-Azmitia et al. (1997) quienes encontraron en el
Hipp un aumento de la expresión de la MAP-2 en ratones trasngénicos que sobreexpresan
la S-100B. La recuperación pudo haberse relacionado no solo con la de la S-100-ir sino
también con otros factores (tal como ciertos factores neurotróficos que se sabe están
alterados tras la exposición alcohólica) porque, a pesar de la recuperación la S-100B-ir vista
en la CxF, no hubo una tal recuparación en la MAP-2-ir de esta área. De hecho, en la CxF
hubo una recuperación de aumento de 1,42 veces sobre el nivel postexposición que no
alcanzó los niveles pre-exposición. Esto puede estar indicando que, a pesar de la mayor
capacidad plástica y de recuperación del cerebro adolescente, la CxF, como área cortical
filogenéticamente más moderna que es, es también más lábil a las injurias que otras áreas
más antiguas. Y, en consecuencia, la ausencia de recuperación completa en la expresión
de la MAP-2 frontal tras una larga abstinencia, indica que hubo menos dendritas
involucradas en circuitos neuronales en los machos adultos expuestos al EtOH durante la
adolescencia. Esto implica que los animales abstinentes, comparados con los controles,
pueden haber tenido menos habilidades cognitivas correspondientes, algo que se ha visto
más que frecuentemente en los humanos adultos alcohólicos crónicos de gran nivel de
consumo que no recuperan completamente sus rendimientos cognitivos incluso tras una
larga abstinencia. La exposición durante la adolescencia tardía, incluso habiendo sido de
bajo nivel, pero crónica, provocó cambios estructurales tales al cerebro de los animales que
probablemente estuvieran en desventaja en relación con sus controles. Para corroborar si
277
Discusión
los cambios estructurales se correlacionan fehacientemente con un daño conductual
duradero incluso tras la abstinencia prolongada, se necesitaría realizar estudios
conducturales adicionales.
Después del período de abstinencia, los Nf-200-ir no alcanzaron los valores control en
el Hipp a pesar de haber incrementado sus valores post-abstinencia en 3,67 veces desde la
finalización de la exposición. Por el contrario, sí los alcanzaron en el Strt. Y en la CxF
excedieron los valores control en un 33% en lo que parece haber sido un fenómeno de
rebote. Estos resultados nuevamente sugieren que hay, probablemente, otros factores
involucrados en la recuperación de la expresión de los Nf-200 más allá que la proteína S100B per se. También harían falta nuevos experimentos al efecto para aclarar
completamente este hecho.
En cuanto a las notables alteraciones cualitativas del citoesqueleto neuronal (Fig. 85),
es válido considerar aquí lo mismo que se dijo en relación a las neuronas “oscuras” o la
Zellschrumpfung puestas de manifiesto en los protocolos de EPE. No me repetiré y remito
al lector a la subsección correspondiente.47 Llamaré la atención, solamente, sobre el hecho
de que, una vez más, la alteración morfológica persistió en el citoesqueleto de las neuronas
incluso mucho tiempo después de que cesara la noxa (cfr. Fig. 85). Por ellom, es válido
suponer, que aún lastimadas, estas neuronas seguían estando vivas y siendo funcionales (a
favor de ello habla también la conservación del nucléolo visto en los cortes al Nissl).
Quizás su patrón de conectividades y, por lo tanto, los circuitos neuronales en los que
entrarían a formar parte, también estarían alterados. Precisamente, algo similar se observa
en el Hipp de pacientes epilépticos que, tras repetidas convulsiones y por virtud de
47
Cfr. subsección V.2. (Las neuronas “oscuras” o la Zellschrumpfung).
278
Discusión
fenómenos que intentan ser neurorregenerativos, se alteran las vías sinápticas a punto de
partida de neuronas alteradas que vuelven a formar, también, circuitos alterados (Mathern
et al., 1997).
El NO y la nNOS han sido relacionados con el sistema serotoninérgico en diferentes
condiciones normales y experimentales (Kaehler et al., 1999; Ramos et al., 2000, 2002b;
Segieth et al., 2001; Tagliaferro et al., 2001, 2003). El NO modula los cambios de la
liberación de 5-HT tanto basales como los evocados por el receptor NMDA (Segieth et al.,
2001); disminuye la liberación de 5-HT en el Hipp y en el hipotálamo in vivo por vía
GMPc-dependiente e inhibe tónicamente la recaptación de 5-HT (Kaehler et al., 1999; Kiss
y Vizi, 2001; Wegener et al., 2000). Algunos astrocitos (no todos) de los que expresan la
S-100B, co-expresan la eNOS (la isoenzima endotelial) y constituyen otra fuente de NO en
la neocorteza cerebral (Wiencken y Casagrande, 1999). En concordancia con lo observado
por otros investigadores (Dizon et al., 2004), nosotros hemos visto más arriba que la EPE
incrementa los niveles de expresión de la nNOS. Existen informes contradictorios, in vivo
e in vitro, con respecto a los efectos de la exposición aguda o crónica al EtOH sobre la
formación del NO (Chandler et al., 1997; Rossetti y Crespi, 2004; Seo y Rivier, 2003). En
un trabajo, la exposición crónica reguló diferencialmente los niveles del ARNm de la nNOS
en distintas regiones cerebrales (fueron normales en la CxF, disminuyeron en el Hipp y
aumentaron en el Strt) (Naasila et al., 2003). Gerlach et al. (2001) encontraron aumentos
de la expresión de la nNOS en varias regiones cerebrales de humanos alcohólicos crónicos,
incluyendo la CxF, pero no en el Strt ni en el Hipp. En nuestros resultados no se detectaron
alteraciones en las neuronas que expresaban la nNOS-ir en el Strt o la CxF de los animales
adolescentes tras la exposición (Figs. 83 y 84). No obstante ello, tras la abstinencia, la DOR
279
Discusión
de esas neuronas disminuyó en ambas áreas (los valores fueron 0,53 y 0,63 veces del valor
control, respectivamente). La técnica de ICQ no permite, lo dijimos antes, evaluar la
actividad enzimática de la nNOS en los animales EtOH ni en los EtOH/R pero el hecho de
que su expresión estuviera reducida tras la abstinencia sugiere que puede haber tenido lugar
algún tipo complejo de mecanismo adaptativo tanto en la CxF cuanto en el Strt. Es
relevante recordar aquí que el EtOH es un antagonista de los receptores NMDA (Allgaier,
2002), receptor que, a su vez, activa la vía guanilato ciclasa-GMPc-quinasa GMPcdependiente, que a su vez activa a la nNOS. Tras la supresión del EtOH y durante la
abstinencia, es razonable especular entonces con que existió algún grado de regulación en
más (up-regulation) de los receptores NMDA y, si se produjo una mayor cantidad de NO
(a niveles que pueden haber sido dañosos) la reducción de la expresión de la nNOS pudo
haber sido un mecanismo adaptativo tendiente a minimizar el daño. Por otro lado, dado que
el NO inhibe la 5-HT en algunas áreas prosencefálicas (Kaehler et al., 1999; Wegener et
al., 2000) la reducción de sus niveles pueden haber incrementado los niveles de liberación
de la 5-HT y, con esto, puede haber tenido lugar un mayor mecanismo neurotrófico y
neurorreparador por medio de la S-100B. De cualquier modo que fuere, es obviamente
necesario realizar más estudios para aclarar completamente el asunto.
Finalmente, deberíamos considerar una serie de mecanismos que pueden haber ocurrido
en los machos de adolescencia tardía/adultez joven como para determinar los fenómenos
de recuperación que se han observado. Uno de ellos puede haber sido que la recuperación
de los niveles de la 5-HT, actuando sobre los receptores 5-HT1A, pudo haber atenuado el
daño alcohólico y contribuido a la recuperación observada por medio de la acción directa
sobre las neuronas que lo expresan, al inhibir la apoptosis (Adayev et al., 2003) e,
280
Discusión
indirectamente, por medio de la estimulación de la liberación de la S-100B tal como se ha
visto previamente en otras condiciones experimentales (Kim et al., 1997; Tajuddin and
Druse, 1999; Ramos et al., 2004). Independientemente de ello, deberíamos recordar que el
EtOH es un conocido neurotóxico que causa daño a las células madre neurales tanto durante
el desarrollo como en los animales adultos (Crews et al., 2003, 2004; Herrera et al., 2003).
Más aún, en un reciente artículo de Nixon and Crews (2004) los autores mostraron que la
intoxicación alcohólica disminuyó la proliferación celular en el Hipp, y con la supresión
del tóxico hubo una reversión temprana y un posterior aumento explosivo en la
proliferación celular una semana después de la última dosis de EtOH. Aquí debo enfatizar
que en el presente estudio se evaluó la recuperación de la morfología neuronal 10 semanas
después de la cesación alcohólica y que el fenómeno de recuperación que observamos es
fuertemente consistente con los efectos post-alcoholización mostrados por Nixon and
Crews (2004). Sería interesante desde el punto de vista clínico, de las salud pública y social,
diseñar experimentos y desarrollar estrategias farmacológicas que exploten la capacidad de
neuroprevención o de neurorreparación de ciertas drogas como la buspirona o de otras
drogas con probada actividad neuroprotectora para la neurogénesis (Herrea et al., 2003).
* * *
El EtOH es la droga psicoactiva y neurotóxica más comúnmente usada (Ling et al.,
1996). Durante la adolescencia es cuando mucha gente experimenta con el EtOH por
primera vez en sus vidas. La edad de más alta prevalencia en el consumo de EtOH es desde
la adolescencia media o tardía hasta mediados de la década de los 20 años (adolescencia
281
Discusión
media a adultez temprana (Schuckit, 1995; Spear, 2000; WHO, 1986). Se ha dicho que
cuanto antes comienza una persona a beber alcohol, es más probable que más tarde se haga
dependiente de él. Más aún, el inicio temprano del consumo de EtOH es uno de los factores
predictores o marcadores más fuertes (pero no precursor) de la posterior dependencia al
alcohol (Spear, 2000; Barr et al., 2004). Todavía más: se ha asociado la edad en que por
primera vez comienza a beberse en forma regular y el alcoholismo familiar con los rasgos
de personalidad antisocial (Spear, 2000), un trastorno tan gravoso en términos médicos,
morales, económicos y sociales para la calidad de vida de la gente y para la salud social.
Se han llevado a cabo pocos estudios básicos acerca de los posibles beneficios de
manterner una abstinencia prolongada tras un, también prolongado, periódo de intoxicación
alcohólica incluso aunque este período fuera solamente del tipo denominado de bajo
consumo. Es claro que el uso de alcohol durante la adolescencia puede tener,
potencialmente, consecuencias a largo plazo e influir más tarde en las funciones
neurocognitivas.48
Tal como lo han destacado estudios previos, nosotros encontramos que diferentes
regiones cerebrales en la rata macho difieren en su vulnerabilidad a los efectos del EtOH
y en su capacidad de recuperación durante el desarrollo (Brown and Tapert, 2004; Crews
et al., 2000).
En un trabajo reciente, Brown y Tapert (2004) se plantearon las siguientes interesantes
inquietudes acerca del consumo adolescente de EtOH: i) “sigue siendo incierto hasta qué
punto se reparan, con la abstinencia sostenida, la anomalías cognitivas observadas en los
48
Piénsese, solamente, que hay adolescentes y adultos jóvenes que, tras haber bebido crónicamente en su
adolescencia o juventud pueden, más tarde en la vida, incluso, llegar a ser presidentes de una nación, con todo
lo que ello implica.
282
Discusión
jóvenes fuertemente bebedores y si tales anomalías se repararan, que tanta sobriedad
[temporal] se requiere para que los rendimientos y la integridad cerebrales reasuman los
niveles preexposición”; ii) “aún está por verse si la capacidad de recuperación de la
integridad cerebral y de las funciones cognitivas pueden ser más completas en los jóvenes,
cuyos cerebros son más plásticos, o si la recuperación es menos probable porque la injuria
neurotóxica puede haber afectado adversamente el curso de la neuromaduración”; y iii)
“sigue siendo poco claro si el cerebro adolescente es, en última instancia, más vulnerable
a esta toxina [el EtOH] o si serán más resistentes y capaces de recuperarse que los adultos.”
Creo que hemos dado respuesta parcial a estas relevantes preguntas con un modelo de
alcoholismo crónico en ratas macho adolescentes. Es evidente, según surge de nuestro
estudio, que es posible alguna capacidad de recuperación en el SNC de las ratas macho en
la adolescencia tardía luego de la supresión del consumo crónico bajo de EtOH y de
mantener una abstinencia prolongada. Pero esta capacidad de recuperación no es,
claramente, la misma en todas las áreas prosencefálicas y, ciertamente, no es completa en
algunas de ellas (por ejemplo, la CxF). A pesar del hecho de que no comparamos la
resistencia de los animales adolescentes con la de los adultos, sí evaluamos la capacidad
de recuperación del cerebro macho adolescente permitiéndoles pasar por un largo período
de abstinencia. Así, claramente se encontró que, a pesar de su mayor capacidad
neurogenética y plástica, los machos adolescentes no tienen la capacidad para recuperarse
completamente del daño provocado por el consumo crónico de EtOH a bajo nivel en todas
las áreas estudiadas. En lugar de ello, en diferentes áreas mesencefálicas y
prosencefálicas, hubo recuperaciones completas, parciales, o no las hubo para nada o
hubo, incluso, fenómenos de rebote que, no por ello, pueden ser llamados normales.
283
Discusión
Después de todo, beber alcohol crónicamente durante la adolescencia, incluso en bajos
niveles, claramente, no es gratis.
V.6. Los adultos:
Los cambios observados en los animales adultos sometidos a exposición alcohólica
crónica leve los consideraremos principalmente en cuanto contrasten con los anteriores.
La casi la totalidad de las células cerebrales están en proximidad con una fibra
serotoninérgica (Azmitia y Whitaker-Azmitia, 1995). Debido a la amplia extensión del
sistema serotoninérgico y a su interacción con diversos tipos celulares, es de esperarse que
cualquier alteración producida sobre él, se refleje sino en todo, en parte del SNC.
La signficativa disminución de la inervación serotoninérgica distal en las áreas
prosencefálicas estudiadas con este protocolo (5-HTT-ir; Fig. 87 y 88) bien pueden
explicar parcialmente el por qué del surgimiento de los déficits mnésiscos (Hipp), motores
(Hipp), cognitivos (Strt y Cxf), anímicos e ideativos (CxF) observados en los alcohólicos
crónicos tras mucho beber. Lo que se encontró aquí concuerda plenamente con la conocida
acción neurotóxica del EtOH. La reducción observada fue leve49 pero también fue leve la
intoxicación. Son ciertas las alteraciones morfológicas y, para determinar si se acompañan
de manifestaciones en la conducta de los animales, se necesitarían nuevos experimentos.
Los astrocitos, según lo que permitió evaluar la GFAP-ir, estuvieron hipertrofiados,
49
Recuérdese que en otros sistemas (como en la sustancia nigra, por ejemplo) para que aparezcan signos y
síntomas (de enfermedad de Parkinson, en ese caso) es necesario que desaparezcan antes alrededor el 80-90%
de las neuronas dopaminérgicas. Aquí, la inervación se redujo alrededor de “sólo” un 30%.
284
Discusión
mostraron reactividad, signo cierto de daño al SNC. La proteína S-100B-ir aumentó en el
citoplasma de los astrocitos de las tres áreas. Inversamente proporcional al aumento de la
S-100B-ir en los astrocitos, fue la expresión de los Nf-200-ir en las neuronas de las mismas
áreas. Así, allí donde más aumentó la S-100B-ir, más disminuyeron los Nf-200-ir: en el
Hipp. Y, viceversa, allí donde menos aumentó la S-100B-ir (en la CxF), menos
disminuyeron los Nf-200-ir. Sin embargo, en esta última área, aunque la disminución fue
menor que en las otras dos, nuevamente, encontramos alteraciones cualitativas del
citoesqueleto neuronal: las consabidas dendritas apicales en sacacorcho (Fig. 92F). La
MAP-2-ir, nuestro marcador de “salud” dendrítica, mostró que en el Hipp, tanto como en
la CxF, las dendritas estaban alteradas (también se vieron los sacacorchos).
Mecanísticamente, podríamos suponer que la disminución de la inervación
serotoninérgica indujo la acumulación de la S-100B en los astrocitos y su menor
disponibilidad para las neuronas, la disminución y alteración de la normal conformación
de su citoesqueleto y de su estado maduro de diferenciación. Que otros factores han de
haber estado implicados en lo observado, es evidente ya que, a diferencia de los sucedido
con los adolescentes tras 6 semanas de intoxicación, la S-100B, por ejemplo, no disminuyó
en los adultos sino que, por el contrario, aumentó. Nuevos experimentos, al estilo de los
realizados con los animales adolescentes, podrían ser útiles para indicar porqué difieren
entre ambas edades estos hallazgos de alteración y si se recuperan tras la abstinencia y
comparar la recuperación eventual con lo sucedido en los adolescentes.
285
Discusión
V.7. Comparación de los hallazgos entre las distintas edades:
Por último, ¿qué sucedió con cada marcador en cada edad considerada en los distintos
protocolos? ¿Cómo se comportaron evolutivamente ante el mismo estímulo tóxico? Los
distintos protocolos no son enteramente comparables y esto, lamentablemente, es una
debilidad del presente trabajo.
La 5-HT-ir no se modificó en el NDR y aumentó en NMR en las crías sometidas a EPE
desde de E0 hasta P21. En los adolescentes disminuyó en el NDR y no se modificó en el
NMR tras 6 semanas de intoxicación. No es la 5-HTT, es su transportador, el 5-HTT pero,
¿qué pasó con este marcador en los adultos? Disminuyó consistentemente en las tres áreas
prosencefálicas.
¿Qué sucedió con la GFAP-ir, con el área celular de los astrocitos y con su estado de
reactividad ante el estímulo tóxico del EtOH a una concentración del 6,6%? En todas las
edades, en todos los protocolos, en todas las áreas prosencefálicas, la GFAP-ir aumentó.50
Los astrocitos estuvieron hipertrofiados. El daño fue evidente. ¿Se recuperaban del daño?
En los protocolos de EPE (tamto a la edad P21 en el de sin prevención del daño como a
cualqueir edad en el de EPE con prevención del daño), espontáneamente, no. Tampoco en
los adolescentes, aunque tendió a hacerlo. No lo sabemos en los adultos. Sin embargo, con
el uso prenatal de la buspirona, se previno parcialmente el incremento del área celular de
los astrocitos en casi todas las edades postnatales y áreas (sí en el Hipp en P5 y P21 –Figs.
63 y 65– y en la CxF en P35 y P60 –Figs. 64 y 65–; no lo previno en el Hipp en P35 y P60).
50
Las excepciones a lo dicho se observaron en el Strt en las crías P21 del protocolo de EPE sin prevención
del daño (Figs. 41 y 42) y en la CxF de las crías P60 del grupo ES en el protocolo de EPE con prevención del
daño (Figs. 64 y 65).
286
Discusión
¿Qué sucedió con los Nf-200-ir? En el protocolo de EPE sin prevención del daño, en
P21, estaban aumentados en el Hipp y el Strt mas no en la CxF. En los adolescentes, tras
la intoxicación crónica, disminuyeron en las tres áreas y luego de la abstinencia prolongada
siguieron disminuídos en el Hipp, se normalizaron en el Strt y tuvieron un aumento de
rebote en la CxF. En los adultos, tras 6 semanas de intoxicación, igual que lo que sucedió
en los adolescentes, disminuyeron en las tres áreas prosencefálicas. Se ve que,
postnatalmente, en la adolescencia y la adultez, los Nf-200 se compartan de manera similar
tras 6 semanas de exposición in vivo al EtOH pero en los animales expuestos
intrauterinamente la situación postnatal fue inversa.
¿Qué sucedió con la MAP-2-ir, nuestro marcador de dendritas? En la EPE, estaba
postnatalmente disminuída en todas las edades tanto en el Hipp como en la CxF. Esto
implica que ha habido un daño a los circuitos sinápticos y que no se han recuperado
espontáneamente (ES) tras la exposición. Sí pudo prevenirse esta disminución postnatal con
el uso de buspirona. En los adolescentes, la MAP-2-ir disminuyó tras la intoxicación
crónica, en las tres áreas y, tras la abstinencia prolongada, se recuperaron sus niveles en el
Hipp y el Strt mas no en la CxF (un área cognitiva crítica). En los adultos, tras 6 semanas
de EtOH en el agua de bebida, la MAP-2-ir, nuevamente, disminuyó en el Hipp y la CxF;
no pudimos determinar qué le sucedió en el Strt ni sabemos que habría pasado en estos
animales tras una abstinencia prolongada similar a la de los adolescentes. En cualquier
caso, la MAP-2-ir es el marcador más uniforme y consistentemente alterado: a cualquier
edad que se exponga al EtOH a los animales, el daño a las dendritas es cierto, llamativo,
importante y no siempre se recupera tras la abstinencia (CxF); con la buspirona parece
poder prevenirse el daño, en general, más allá de ciertas alteraciones que se observan. En
287
Discusión
todo caso, siempre se manifiesta la alteración morfológica, cualitativa, se haya recuperado
o no, prevenido o no el daño cuantitativo.
¿Qué sucedió con la nNOS? Se vió muy aumentada su expresión en el Strt y la CxF de
las crías P21 sometidas a EPE. En los adolescentes, disminuyó sólo tras la abstinencia tras
haberse mantenido normal luego de la intoxicación.
288
Conclusiones
y Comentarios Finales
“La particular función [del cerebro] es acá la transmisión de los hechos existenciales a través
del flujo cerebral y la consecutiva construcción del Yo con tal grado de claridad que podamos
contraponer los propios límites de nuestros procesos internos individuales con el siempre
configurado mundo exterior.”
Theodor Meynert (1867)1
“El hombre se encuentra profundamente inmerso en ilusiones y en imágenes oníricas, su ojo se
limita a resbalar sobre la superficie de las cosas para ver “formas”, su sensación no conduce
en ningún caso a la verdad, sino que se limita a recibir estmulos y a jugar tecleando sobre el
dorso de las cosas.”2
Friedrich Nietzsche (1873)
“Cuanto más se devela ante nuestro entendimiento la grandeza y el poder de la Creación
viviente tanto más claramente sentimos que detrás del mundo de las manifestaciones aparentes
gobiernan poderes frente a los cuales el saber humano contrapone fuerzas insignificantes de
sólo meras «semejanzas».3
Paul Emil Flechsig (1896).
V.1. Conclusiones:
1. El modelo experimental de AMF en ratas puesto a punto en este trabajo por medio de
la EPE en el agua de bebida, en bajas dosis, en forma crónica, resultó ser un modelo
válido de lo que en los humanos se conoce como trastornos del neurodesarrollo
relacionados con el alcohol (ARND). Esta afirmación se basa en la producción cierta
de daño cerebral microscópico manteniendo a la vez, dentro de los parámetros normales,
el peso al nacer y durante el desarrollo postnatal, la ausencia de microcefalias y
alteraciones groseras del cerebro como así también de malformaciones faciales u
orgánicas congénitas; también hubo ausencia de alteraciones nutricionales en las madres
y en las crías y ausencia de alteraciones en la natalidad. Ttodos estos factores excluyen
1
Meynert (1867), citado en Outes y Eurnekian, 1992. La cita original corresponde al inicio del primer artículo
de una serie en la que el genio de Viena describe la histoarquitectura de la corteza cerebral humana. Esta serie
de artículos se publicó como: M eynert T. Der Bau der Grosshirnrinde und seine örtlichen Verschiedenheiten
nebst einen patologisch-anatomischen Korolarium. Vierteljahrsschrift für Psychatire (1867); 1: 77-93, 198217, 381-403 y Vierteljahrsschrift für Psychatire (1868); 2: 88-113.
2
Nietzsche, 1951; pp 86-87.
3
Flechsig, 1896; pág. 41.
290
Conclusiones y Comentarios Finales
la posibilidad de que se hubiera modelado un FAS. Se confirmó la hipótesis I).
2. Aunque microscópicas y moleculares, hubo alteraciones celulares conspicuas en el
cerebro de las crías de madres alcoholizadas gestacionalmente. Según a que se denomine
daño leve, se confirmó total o parcialmente la hipótesis II).
3. Se produjeron displasias corticales microscópicas en la CxF de las crías con EPE.
4. Se constató un tipo de lesión neuronal que, aunque no exclusiva del AMF, sí es
indicativa de la alteración cierta del citoesqueleto.
5. En las crías de madres alcoholizadas la simple abstinencia (no exposición) postnatal no
permite la recuperación espontánea del daño. Por el contrario, la lesión nerviosa se
conserva, incluso, hasta la adultez (P90). Se refutó la hipótesis III).
6. La administración conjunta con el EtOH de una droga agonista de los receptores 5-HT1A,
la buspirona, permitió prevenir completa o parcialmente, según el caso, muchos de los
daños constatados previamente por la EPE. Se confirmó parcialmente la hipótesis IV).
7. En los animales adolescentes expuestos crónicamente al EtOH se indujeron daños que,
tras la abstinencia prolongada, no se recuperaron o se recuperaron parcialmente o
presentaron cambios sobrecompensatorios. Por lo tanto, se confirmó parcialmente la
hipótesis V).
8. El daño al cerebro adulto, por la exposición alcohólica crónica, evidente y de signo
similar al de los adolescentes en la mayoría de los marcadores. Así, se confirmó la
hipótesis VI).
291
Conclusiones y Comentarios Finales
VI.2.
Comentarios finales:
Alterando el desarrollo del cerebro, en parte afectando al sistema serotoninérgico, a la
astroglía y al sistema nitrérgico, la EPE predispone al uso y abuso de EtOH y otras drogas
en la adolescencia y a la manifestación de personalidades de tipo antisocial o limítrofe que
predisponen aún más al uso de drogas. También hemos visto que el consumo de EtOH
iniciado en la adolescencia predispone a su vez al alcoholismo como enfermedad ya en la
adultez. Y si la alcohólica es una mujer en edad fértil, y si se embaraza y gesta un feto
sometiéndolo a la EPE... el círculo se cierra, y perpetúa el daño.
En 2006, dos renombrados y sagaces investigadores de EUA (Miller y Spear , 2006), con
una dilatada experiencia en investigación básica en el AMF, han emitido una hipótesis en
una prestigiosa revista especializada. Se percataron de que el círculo “vicioso” expuesto en
el párrafo anterior puede ser la base de lo que
ellos llaman “el generador de alcoholismo”
(Fig. 104).
En dos libros publicados en 1857 y 1860,
Morel postuló su teoría de la degeneración de
la especie como la causa de las enfermedades
mentales (Morel, 1857, 1860). Para Morel,
“las
degeneraciones
son
desviaciones
mórbidas del tipo humano normal que son
transmisibles
hereditariamente
evolucionan
progresivamente
y
que
a
Figura 104 . E l gen erador de a lco holism o de M iller y S pea r.
V ersión rem ozada de la decim onónica te oría de la
deg en eración de M orel y M ag nan . Tom ad o de M iller y S pea r,
2006.
la
292
Conclusiones y Comentarios Finales
decadencia”.4 Morel citaba a la intoxicación alcohólica como una de las causas de
degeneración y describió varios casos de hijos de padres alcohólicos. Sin el fondo moral
y religioso de Morel, las ideas de otro psiquiatra francés, Jacques Joseph Valentin Magnan
(1835-1916), sobre la degeneración devinieron en un concepto de regresión en sentido
lamarckiano. A propósito, Magnan estudió la degeneración en pacientes alcohólicos e hizo,
incluso, valiosos experimentos sobre alcoholismo en animales (Magnan, 1874).5 De las
ideas de Morel y Magnan, sumadas a la (mal entendida) teoría de la evolución de las
especies por selección natural de Charles Darwin, surgió, con ciertos coletazos de la
frenología de Gall y de la mano de Cesare Lombroso la teoría de l’uomo delinquente, del
criminal nato. Bien sabemos lo que sucedió con parte de estas teorías en manos de los
nazionalsocialistas alemanes de las décadas de 1930 y 1940, fogoneadas por las ideas del
superhombre de Nietzsche y la superioridad de una “raza” por sobre otras. En todo el
mundo y en el nuestro también, mucha de las ideas de la degeneración dieron origen al
movimiento de la temperancia (que promovía la abstinencia alcohólica), al movimiento
higienista (recuérdese la Liga Argentina de Higiene Mental) y al movimiento eugénico
(recuérdese lo sucedido a los enfermos mentales en la Alemania nazi). Hoy en día, en el
ámbito académico, se ignora soberanamente el concepto de degeneración adquirida como
explicación general de las enfermedades mentales al modo de las líneas de pensamiento de
Morel y Magnan. Pero, desde 1957 (Clarren y Smith, 1978; Jones et al., 1973; Lemoine et
al., 1968; Rouquette, 1957), el FAS y los FASD han venido a ser cada vez más reconocidos
como uno de los efectos de la EPE; ahora sabemos que el consumo de EtOH durante el
4
De esta cita de M orel, quítese la palabra “hereditariamente” (su concepto de herencia era distinto al nuestro)
y se obtendrá la hipótesis del generador de alcoholismo de Miller y Spear.
5
Cfr. el Anexo V (Métodos experimentales de exposición de animales al etanol. Ventajas y desventajas de
cada uno).
293
Conclusiones y Comentarios Finales
embarazo puede dañar el cerebro fetal en desarrollo pasando así a la descendencia el
“estigma de la degeneración” de una madre “degenerada”.
La falta de cultura científica de Miller y Spear los ha llevado a postular una idea
novedosa con 150 años de antigüedad, al modo como Mountcastle (1957) describió las
columnas corticales de Meynert casi 90 años después de que el genio de Viena la observara
en 1867-1868 (Outes y Eurnekian, 1992). Del mismo modo, Clarren, Jones y Smith
describieron el FAS por primera vez, 5 años después de que lo hiciera, por “primera vez”,
Lemoine. Y Lemoine lo describió6 11 años después de que lo describiera, sí por primera
vez, Jacqueline Rouquette, una oscura y olvidada pediatra francesa. Pero ni Morel, ni
Magnan ni Meynert eran personajes desconocidos. La historia, la de la Ciencia también,
muchas veces, se repite.
¿Se repite la historia? En EUA y en Canadá, en ocasiones se enjuicia y encarcela a
mujeres alcohólicas, negras o aborígenes nativas, principalmente, por haber cometido
“maltrato físico infantil” en la figura de sus hijos nonatos, al someterlos a una gestación en
presencia de EtOH (Armstrong, 2003; Goloden, 2005). En ambos países se publican largos
folletos que instruyen a los miembros de las Policías acerca del FAS y su relación con, por
ejemplo, los “sin techo” (¡!) (Laporte et al., 2002; Stade et al., 2004).
Investigadores y los científicos debemos mirar no sólo a nuestros tubos de ensayo,
nuestras grillas de electrónica y nuestras cubetas de Western. También tenemos
responsabilidades éticas y morales para con nuestros colegas actuales y pasados, para con
6
Mejor dicho, lo hizo describir un año antes, en 1967, en la tesis doctoral de un discípulo suyo, Jean-Pierre
Borteyru, que llevaba por sugestivo título “La toxicomanie alcoolique parentale et ses répercussions sur la
desendance” (Borteyru, 1967). La tesis de Rouquette, en 1957, se tituló “Influence de la toxicomanie
alcoolique parental sur le développement physique & psychique des jeunes enfants” (Rouquette, 1957).
294
Conclusiones y Comentarios Finales
nuestros pacientes y, sobre todo, recuérdese, para con la sociedad.
* * *
Nuestro cerebro no es otra cosa que un instrumento, una herramienta de que nos
servimos los animales que lo poseemos para perseverar en la existencia, y propagarla. Esta
herramienta genera regularidades a partir del mundo sensible, crea regularidades allí donde
no las hay; iguala lo desigual. Y crea conceptos y les asigna un valor. Y se sirve de estos
conceptos para predecir el mundo en el que vivimos y permitirnos tener así la oportunidad
de alcanzar la edad necesaria como para poder perpetuarnos en otros.
Si la herramienta ha sido mal forjada mal podrá cumplir, cabalmente, con las funciones
a ella destinadas. Así, la existencia de ese ser poseedor de un cerebro congénitamente
tarado por el alcohol no será, muy lamentablemente, una existencia plena. Muy
posiblemente sufrirá y hará sufrir a otros por efecto de la intemperancia (la de sus
progenitores y la suya propia, eventualmente). Todo aquello que podamos hacer quienes
tenemos la capacidad y la responsabilidad de hacer algo, todas la acciones que podamos
emprender para evitar, minimizar, recuperar o eliminar el daño provocado por el alcohol
a un cerebro en desarrollo, redundará en beneficio no solo de la persona afectada sino
también de su familia, de sus amigos, de sus parejas y compañeros de trabajo, de sus hijos
y nietos. De nosotros mismos, incluso. De la sociedad, en fin.
295
Anexos
Anexo I
Síndrome Alcohólico Fetal (FAS) y trastornos asociados.
Criterios diagnósticos.
VII.1.1. Elementos diagnósticos de Jacqueline Rouquette:1
- Prematuridad.
- Bajo peso y talla al nacer / Bajo peso para la edad gestacional (“niño miniatura”).
- Escaso progreso pondoestatural postnatal.
- Retraso psicomotor paralelo al insuficiente desarrollo físico.
- Microcefalia.
- Facies características (cráneo “abollado” con redes venosas visibles, raíz nasal aplanada, narinas
redondeadas y anchas, labio superior pequeño y “como arremangado”, angioma plano de la frente
persistente más allá de los primeros meses; orejas de implantacón baja y/o en anteversión) (Fig. 105).
- Anorexia.
- “Niño nervioso”: gestos bruscos, sacádicos, temblorosos; atención frágil, fácilmente fatigable.
- Malformaciones asociadas: estrabismo, labio leporino y paladar hendido, pie varo equino, criptorquidia,
hidrocefalia, cardiopatías congénitas, varios tipos de anomalías dactilares.
- Padres negligentes en el cuidado de su desarrollo tanto físico como psicoafectivo.
- Alcoholismo de los padres pero, especialmente, de la madre.
VII.1.2. Criterios Diagnósticos del Institute of Medicine (IoM):2
Categoría 1: FAS con Exposición M aterna al Alcohol Confirmada:
A
Exposición materna al alcohol confirmada.3
B
Evidencia de un patrón característico de anomalías faciales, incluyendo hendiduras palpebrales cortas,
y anormalidades de la región maxilar superior (por ej., labio superior plano, filtrum aplanado,
aplanamiento de la región media de la cara) (Fig. 105).
C
Evidencia de retraso del crecimiento, tal como en, al menos, uno de los siguientes:
1
Confeccionados a partir de Rouquette, 1957.
2
Tomado de Stratton et al., 1996.
3
La exposición materna al EtOH se define como un patrón de ingesta alcohólica excesiva caracterizada por
una ingesta regular sustancial, o por una alta ingesta episódica. La evidencia de este patrón de ingesta debe
incluir a los signos de dependencia al alcohol.
297
i.
bajo peso al nacer para la edad gestacional,
ii. falta de progreso ponderal postnatal no debido a la nutrición,
iii. bajo peso en relación a la talla.
D
Evidencia de anomalías del neurodesarrollo del SNC, tal como en, al menos, uno de los siguientes:
i.
bajo perímetro craneal al nacer,
ii. anomalías cerebrales estructurales (por ej., agenesia parcial o total del cuerpo calloso, o hipoplasia
cerebelosa);
iii. signos neurológicos severos o leves (apropiados para la edad) tales como compromiso de las
habilidades motoras finas, hipo o acusia neurosensorial, pobre marcha en tándem [poor tandem
gait], mala coordinación visuo-manual.
Categoría 2. FAS Sin Confirmación de la Exposición M aterna al Alcohol:
Ausencia del Criterio A. Criterios B-D como en la Categoría 1.
Categoría 3. FAS Parcial con Exposición M aterna al Alcohol Confirmada:
A
Exposición materna al alcohol confirmada.
B
Evidencia de algunos componentes del patrón facial del SAF.
Presencia de al menos uno de los siguientes (C, D o E):
C
Evidencia de retraso del crecimiento, tal como en, al menos, uno de los siguientes:
i.
bajo peso al nacer para la edad gestacional,
ii. falta de progreso ponderal postnatal no debido a la nutrición,
iii. bajo peso en relación a la talla.
D
Evidencia de anomalías del neurodesarrollo del SNC, tal como en, al menos, uno de los siguientes:
i.
bajo perímetro craneal al nacer,
ii. anomalías cerebrales estructurales (por ej., agenesia parcial o total del cuerpo calloso, o hipoplasia
cerebelosa);
iii. signos neurológicos severos o leves (apropiados para la edad) tales como compromiso de las
habilidades motoras finas, hipo o acusia neurosensorial, pobre marcha en tándem [poor tandem
gait], mala coordinación visuo-manual.
E
Evidencia de un patrón complejo de anomalías cognitivas o conductuales inconsistentes con el nivel
de desarrollo alcanzado y no explicado por la carga genética o las condiciones ambientales tales como
dificultades en el aprendizaje; déficits en el desempeño escolar; bajo control de los impulsos;
problemas en la percepción social; déficits del lenguaje; baja capacidad de abstracción y
metacognición; déficits específicos en las habilidades aritméticas; o problemas de memoria, atención
o juicio.
Categoría 4. Defectos Congénitos Relacionados con el Alcohol (ARBD, por la sigla en inglés de Alcoholrelated birth defects):
Lista de defectos congénitos, incluyendo malformaciones y displasias:
298
Cardíacos
CIA
CIV
Transposición de los grandes vasos
Tetralogía de Fallot
Uñas hipoplásicas
Clinodactilia
Meñiques cortos
Pectus excavatum y carinatum
Sinostosis radiocubital
Síndrome de Klippel-Feil
Contracturas en flexión
Hemivértebras
Camptodactilia
Escoliosis
Aplasia, displasia o hipoplasia renal
Duplicación ureteral
Riñón en herradura
Hidronefrosis
Oculares
Estrabismo
Trastornos de la refracción debido a microftalmia
Auditivos
Hipo- o acusia de conducción
Hipo- o acusia sensorial
Otros
Virtualmente cada malformación ha sido descripta en algún paciente con FAS. Sigue siendo
Esqueléticos
Renales
incierta la especificidad etiológica del alcohol para la mayoría de esas anomalías.
Categoría 5. Trastornos del Neurodesarrollo Relacionados con el Alcohol (ARND, por la sigla en inglés
de Alcohol-related neurodevelopmental disorders):
A
Evidencia de anomalías del neurodesarrollo del SNC, tal como en, al menos, uno de los siguientes:
i.
bajo perímetro craneal al nacer,
ii. anomalías cerebrales estructurales (por ej., agenesia parcial o total del cuerpo calloso, o hipoplasia
cerebelosa);
iii. signos neurológicos severos o leves (apropiados para la edad) tales como compromiso de las
habilidades motoras finas, hipo o acusia neurosensorial, pobre marcha en tándem [poor tandem
gait], mala coordinación visuo-manual.
y/o
B
Evidencia de un patrón complejo de anomalías cognitivas o conductuales inconsistentes con el nivel
de desarrollo alcanzado y no explicado por la carga genética o las condiciones ambientales tales como
dificultades en el aprendizaje; déficits en el desempeño escolar; bajo control de los impulsos;
problemas en la percepción social; déficits del lenguaje; baja capacidad de abstracción y
metacognición; déficits específicos en las habilidades aritméticas; o problemas de memoria, atención
o juicio.
VII.1.3. Propuesta de revisión de los Criterios Diagnósticos del Institute of Medicine
(IoM) para los FASD:4
I: FAS con Exposición M aterna al Alcohol Confirmada (todas las características, A-D, son necesarias para
realizar el diagnóstico de esta categoría):
4
Tomado de Hoyme et al., 2005.
299
A
Exposición materna al alcohol confirmada.
B
Evidencia de un patrón característico de anomalías faciales menores, incluyendo dos o más de las
siguientes (Fig. 105):
i.
hendiduras palpebrales cortas ( # al percentilo 10),
ii. borde bermellón fino del labio superior (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum),
iii. philtrum aplanado (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum).
C
Evidencia de retraso del crecimiento pre- y/o postnatal:
i.
D
altura o peso # al percentilo 10, si es posible corregido para las normas de raza.
Evidencia de crecimiento cerebral deficiente o de morfogénesis anormal, incluyendo uno o más de los
siguientes:
i.
anomalías cerebrales estructurales,
ii. perímetro cefálico # al percentilo 10.
II. FAS Sin Confirmación de la Exposición M aterna al Alcohol:
IB, IC y ID, como arriba.
III. FAS Parcial con Exposición M aterna al Alcohol Confirmada (todas las características, A-C, son
necesarias para realizar el diagnóstico de esta categoría):
A
Exposición materna al alcohol confirmada.
B
Evidencia de un patrón característico de anomalías faciales menores, incluyendo dos o más de las
siguientes:
i.
hendiduras palpebrales cortas ( # al percentilo 10),
ii. borde bermellón fino del labio superior (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum),
iii. philtrum aplanado (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum).
C
Otras características, una de las siguientes:
i.
Evidencia de retraso del crecimiento pre- y/o postnatal:
a. altura o peso # al percentilo 10, si es posible corregido para las normas de raza.
ii. Evidencia de crecimiento cerebral deficiente o de morfogénesis anormal, incluyendo uno o más
de los siguientes:
a. anomalías cerebrales estructurales,
b. perímetro cefálico # al percentilo 10.
iii. Evidencia de un patrón complejo de anomalías cognitivas o conductuales inconsistentes con el
nivel de desarrollo alcanzado y que no pueda explicarse por la carga genética, el ambiente familiar
o las condiciones ambientales solamente
a. Este patrón incluye un compromiso marcado en el rendimiento en tareas complejas (tareas de
resolución de problemas complejos, planeamiento, juicio, abstracción, metacognición, y
aritméticas); déficits de alto nivel en el lenguaje receptivo y expresivo; y conducta alterada
(dificultad en las maneras personales, labilidad emocional, disfunción motora, bajo rendimiento
académico, y deficientes interacciones sociales).
300
III. FAS Parcial Sin Confirmación de la Exposición M aterna al Alcohol:
IIIB y IC, como arriba.
V. Defectos Congénitos Relacionados con el Alcohol (ARBD; todas las características, A-C, son necesarias
para realizar el diagnóstico de esta categoría):
A
Exposición materna al alcohol confirmada.
B
Evidencia de un patrón característico de anomalías faciales menores, incluyendo dos o más de las
siguientes:
ii. hendiduras palpebrales cortas ( # al percentilo 10),
iii. borde bermellón fino del labio superior (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum),
iv. philtrum aplanado (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum).
C
Defectos congénitos estructurales en una o más de las categorías sigueintes, incluyendo
malformaciones y displasias (si el paciente presenta solamente anomalías menores, deben estar
presentes dos o más): cardíacos: CIA, CIV, transposición de los grandes vasos; esqueléticos:
sinostosis radiocubital, defectos de la segmentación vertebral, contractura de las grandes
articulaciones, escoliosis; renales: aplasia, displasia o hipoplasia renal, riñón en herradura, duplicación
ureteral; oculares: estrabismo, ptosis, anomalías vasculares retinianas, hipoplasia del nervio óptico;
auditivos: hipo- o acusia de conducción, hipo- o acusia sensorial; anomalías menores: uñas
hipoplásicas, meñiques cortos, clinodactilia de los meñiques, pectus carinatum o excavatum,
camptodactilia, pliegues palmares “en palo de hockey”, trastornos refractivos oculares, orejas “en vías
de ferrocarril”.
VI. Trastornos del Neurodesarrollo Relacionados con el Alcohol (ARND, para realizar el diagnóstico se
requieren tanto A como B):
A
Exposición materna al alcohol confirmada.
B
Al menos uno de los siguientes:
i.
Evidencia de crecimiento cerebral deficiente o de morfogénesis anormal, incluyendo uno o más
de los siguientes:
a. anomalías cerebrales estructurales,
b. Perímetro cefálico # al percentilo 10.
ii. Evidencia de un patrón complejo de anomalías cognitivas o conductuales inconsistentes con el
nivel de desarrollo alcanzado y que no pueda explicarse por la carga genética, el ambiente familiar
o las condiciones ambientales solamente
a. Este patrón incluye un compromiso marcado en el rendimiento en tareas complejas (tareas de
resolución de problemas complejos, planeamiento, juicio, abstracción, metacognición, y
aritméticas); déficits de alto nivel en el lenguaje receptivo y expresivo; y conducta alterada
(dificultad en las maneras personales, labilidad emocional, disfunción motora, bajo rendimiento
académico, y deficientes interacciones sociales).
NOTA: las siguientes consideraciones vales para los criterios diagnósticos propuestos. En cada una de las categorías se asume que la
evaluación genética y médica ha excluído una fenocopia, incluyendo a otros síndromes genéticos y de malformaciones. La exposición
301
materna al EtOH se define como un patrón de ingesta alcohólica excesiva caracterizada por una ingesta regular sustancial, o por una
alta ingesta episódica. La evidencia de este patrón puede incluir frecuentes episodios de intoxicación, el desarrollo de tolerancia o
abstinencia, problemas sociales y/o legales relacionados con la bebida, el involucramiento en conductas físicamente riesgosas mientras
se está bajo los efectos de la bebida, o problemas médicos relacionados con el alcohol tales como hepatopatías. La confirmación puede
ser por entrevista materna o a partir de fuentes colaterales confiables.
Los ARBD y ARND se refieren a condiciones clínicas en las que debe existir una historia de exposición materna al alcohol, y en
las que la investigación clínica o en animales deben correlacionarse la ingesta materna de alcohol con el desenlace observado. Los
ARBD comprende a niños con anomalías estructurales mayores y/o menores que exhiben un crecimiento físico y un desarrollo
intelectual normales. Los ARND comprenden a un patrón específico de conducta y desarrollo alterados en niños con crecimiento y
desarrollo estructural normales.
VII.1.4. Criterios Diagnósticos del Centro para el Control de Enfermedades (CDC)
para los FASD:5
Dismorfia facial:
Basado en normas raciales, el individuo exhibe las tres siguientes características faciales (Fig. 105):
•
philtrum liso (puntaje 4 ó 5 de la Guía Labio-Philtrum de la Universidad de W ashington),
•
borde bermellón delgado (puntaje 4 ó 5 de la Guía Labio-Philtrum de la Universidad de W ashington),
•
hendiduras palpebrales cortas ( # al percentilo 10).
Problemas de crecimiento:
Altura o peso pre- o postnatal, o ambos, # al percentilo 10, confirmados, documentados en cualquier punto
temporal (ajustado por edad, sexo, edad gestacional y raza o etnia).
Anomalías del sistema nervioso central:
I.
Estructurales:
1) Perímetro cefálico # al percentilo 10 ajustado para la edad y el sexo.
2) Anomalías cerebrales clínicamente significativas observables por medio de imágenes.
II.
Neurológicas:
Problemas neurológicos no debidos a fiebre o injurias postnatales, u otros signos neurológicos
leves fuera de los límites normales.
III.
Funcionales:
Rendimiento sustancialmente menor que el esperado para la edad, escolaridad o circunstancias del
individuo, puesto en evidencia por:
1) déficit cognitivo o intelectual global que representa a múltiples dominios o déficit (o retraso
significativo en el desarrollo en los niños más jóvenes) con rendimientos por debajo del
percentilo 3 (2 desvíos estándar bajo de la media para pruebas estandarizadas),
o
2) déficits funcionales por debajo del percentilo 16 (1 desvío estándar bajo la media para
pruebas estandarizadas) en al menos tres de los siguientes dominios:
5
Tomado de Bertrand et al., 2004.
302
a
déficits o discrepancias cognitivas o del desarrollo,
b
déficits del funcionamiento ejecutivo,
c
retraso en el funcionamiento motor,
d
problemas en la atención o hiperactividad,
e
habilidades sociales,
f
otros tales como problemas sensoriales, problemas en el lenguaje pragmático, déficits de
memoria, etc.
Exposición materna al alcohol:
I. Exposición prenatal al alcohol confirmada.
II. Exposición preantal al alcohol desconocida.
Criterios para el diagnóstico de FAS:
Se necesitan los tres hallazgos siguientes:
1. Documentación de las tres anomalías faciales (philtrum liso, bermellón fino, y hendiduras palpebrales
cortas;
2. Documentación de déficits del crecimiento; y
3. Documentación de anormalidad del SNC.
VII.1.5. Código Diagnóstico de 4-Dígitos:6
Este sistema diagnóstico utiliza una escala Likert de 4 grados (donde 1 corresponde a
ausencia y 4 a expresión extrema) para cada uno de las cuatro principales características
diagnósticas:
1) el déficit de crecimiento (ninguna, leve, moderado y significativa);
2) el fenotipo facial del FAS (ausente, leve, moderado y severo) (Fig. 105);
3) el daño o la disfunción del SNC (improbable, posible, probable y definitivo); y
4) la exposición gestacional al EtOH (sin riesgo, desconocido, algún riesgo, alto riesgo).
En la codifición, según el orden previo invariable,cada una de las categorías ocupan sólo
uno y siempre el mismo lugar en el código de 4 dígitos. Así, en esta escala existen,
finalmente, 44 = 256 códigos posibles de 4 dígitos cada uno (desde el 1111 al 4444). Cada
uno de estos 256 códigos se agrupan, y caen, dentro de una de 22 categorías diagnósticas
diferentes (denominadas con letras, de la A a V). Las categorías E-J, K-P, y Q-V sólo
6
Tomado de Astley y Clarren, 2000.
303
difieren por la exposición al alcohol por lo que, esencialmente, hay solamente 9 categorías
diagnósticas únicas en contraste con las 5 categorías del criterio utilizado por los CDC. Para
mayores detalles de este sistema algo engorroso se remite al lector al trabajo original
(Astley y Clarren, 2000). Solo a modo de ejemplo se presenta la grilla siguiente:
3
significativo
severo
definitivo
(4)
moderado
moderado
probable
(3)
leve
leve
posible
(2)
ninguno
ausente
improbable
(1)
Fenotipo
facial del
FAS
4
4
X
X
X
X
Crecimiento
Déficit de
crecimiento
2
Cara
Cerebro
Daño
cerebral
(4)
alto riesgo
(3)
algún riesgo
(2)
desconocido
(1)
sin riesgo
Alcohol
Alcohol
prenatal
Esta grilla se utiliza para registrar el Código Diagnóstico de 4-Dígitos siguiendo los lineamientos
presentados por Astley y Clarren (2000). Un código de 3 ó 4 en la columna Crecimiento o Cara se denomina
como “hallazgo físico centinela” (cuadros gris oscuro). Un código de 2 en la columna Cerebro es un
“trastorno neuroconductual” (cuadro rayado horizontal); un código de 3 ó 4 es “encefalopatía estática”
(cuadros negros). Un código de 3 ó 4 en la columna de Alcohol es “expuesto al alcohol” (cuadros rayado
vertical) y un código 2 es “exposición al alcohol desconocida” (cuadro gris claro). Por lo tanto, el código
ejemplificado (3244) recibiría el nombre de “hallazgos centinela físicos, encefalopatía estática, expuesto al
alcohol).
VII.1.6. Lineamientos canadienses para el diagnóstico del FAS, FAS parcial y los
ARND:7
Los criterios para el diagnóstico del síndrome alcohólico fetal, tras haber excluído otros diagnósticos, son:
A. Evidencia de un compromiso pre- o postnatal del crecimiento, tal como en al menos 1 de los siguientes:
a. Peso o talla al nacer # percentilo 10 para la edad gestacional.
b. Peso o talla # percentilo 10 para la edad.
c. Relación peso/talla desproporcionadamente baja ( # percentilo 10).
B. Presentación simultánea de al menos 3 de las siguientes anomalías faciales a cualquier edad (Fig. 105):
a. Hendidura palpebral corta (2 o más desvíos estándar bajo la media).
b. Philtrum liso o aplanado (puntaje 4 ó 5 en la guía labio-philtrum).
c. Labio superior delgado (puntaje 4 ó 5 en la guía labio-philtrum).
7
Tomado de Chudley et al., 2005.
304
C. Evidencia de compromiso en 3 ó más de los siguientes dominios del sistema nervioso central: signos
neurológicos leves o severos; estructura cerebral; cognición; comunicación; logros académicos; memoria;
funcionamiento ejecutivo y razonamiento abstracto; déficit de atención/hiperactividad; conducta
adaptativa, habilidades sociales, comunicación social.
D. Exposición materna al alcohol confirmada (o no confirmada).
Los criterios diagnósticos para el síndrome alcohólico fetal parcial, tras haber excluído otros diagnósticos,
son:
A. Presentación simultánea de 2 de las siguientes anomalías faciales a cualquier edad:
a. Hendidura palpebral corta (2 o más desvíos estándar bajo la media).
b. Philtrum liso o aplanado (puntaje 4 ó 5 en la guía labio-philtrum).
c. Labio superior delgado (puntaje 4 ó 5 en la guía labio-philtrum).
B. Evidencia de compromiso en 3 ó más de los siguientes dominios del sistema nervioso central: signos
neurológicos leves o severos; estructura cerebral; cognición; comunicación; logros académicos; memoria;
funcionamiento ejecutivo y razonamiento abstracto; déficit de atención/hiperactividad; conducta
adaptativa, habilidades sociales, comunicación social.
C. Exposición materna al alcohol confirmada.
Los criterios diagnósticos para los trastornos del neurodesarrollo relacionados con el alcohol, tras haber
excluído otros diagnósticos, son:
A. Evidencia de compromiso en 3 ó más de los siguientes dominios del sistema nervioso central: signos
neurológicos leves o severos; estructura cerebral; cognición; comunicación; logros académicos; memoria;
funcionamiento ejecutivo y razonamiento abstracto; déficit de atención/hiperactividad; conducta
adaptativa, habilidades sociales, comunicación social.
B. Exposición materna al alcohol confirmada.
El término trastornos congénitos relacionados con el alcohol (ARBD) no debería usarse como un término
diagnóstico paraguas para el espectro de los efectos del alcohol. Los ARBD constituyen una lista de anomalías
congénitas que incluyen malformaciones y displasias y debería usárselo con precaución.
305
Figura 105 . A specto d el fen otipo facial de pe rson as afectadas el A M F y qu e presen tan FA S . A : ne on ato d e 1 d ìa d e ed ad ; nó tese
el m arcado hirsutism o, el labio superio r d elgado, la ausencia del philtrum y la nariz de raíz aplanada, casi en silla en m onta r visible
en el perfil (to m ado de Jones y S m ith , 1973). B : niños de 3 años y 9 m eses de edad y de 2 años y 6 m eses (tom ado de Jones et a l.,
1973). C : pacientes de 17 y de 2,5 años de edad, respectivam ente; nótese cóm o, a p esar de haber llegado a la adolescencia, el
pa cien te d e la izqu ierda aú n presen ta las características faciales típicas d el FA S , algo qu e, sin em ba rgo , pu ed e ir pe rdiénd ose
c on el tie m po y la m aduración (tom ado de C larren y Sm ith, 1978). D : fotom icrog rafías d e m icroscop ía electrónica d e b arrid o d e
fe to s de ra ta norm al (a la izquierda) y afectada por e l FA S (en m ed io) a la m ism a ed ad g estacional, y asp ecto d e un recién nacid o
claram ente m icrocéfalo; nótese, en los fetos de rata, cuán evidente son la m icrocefalia, la m icroftalm ía, y los defectos del
desarrollo fac ial, eviden tes so bre todo en el lab io su perior (m odifica do de S ullik, 20 05 ). E : Fran ço is (34 a ños) y Joseph (22 añ os),
do s h ijo s “de padres alcohólicos”, am bos débiles m entales, p osib lem ente el p rim er registro g ráfico d e p acientes afectados p or
e l F A S , se gú n una litografía del Tratado de M orel (1857). F: K .M ., niña d e 6 años d e edad afectada d e FA S, uno de los p rim eros
ca so s d ocu m en tad os en nuestro p aís (R eich m an et al., 19 79 ).
306
Anexo II
Manifestaciones fenotípicas físicas en el
Síndrome Alcohólico Fetal.8
Grupo de
anomalías
M anifestaciones de presentación clínica
Frecuente
Infrecuente
Pre y perinatales
Retraso del crecimiento intrauterino, bajo
peso para la edad gestacional y bajo peso al
nacer
Craneofaciales
(dismorfismo facial)
Microcefalia, ptosis palpebral, estrabismo,
hipertelorismo, pliegue epicanto, puente
nasal plano, philtrum ausente o hipoplásico,
rotación posterior de las orejas, bordes
palatinos laterales prominentes
Miopía, microftalmia clínica, blefarofimosis,
conchas auriculares malformadas, labio
leporino y/o paladar hendido, dientes
pequeños con esmalte defectuoso
Cardíacas
Soplos (especialmente durante la primera
infancia), comunicación interauricular (CIA)
Comunicación interventricular (CIV),
anomalías de los grandes vasos, tetralogía
de Fallot
Renogenitales
Hipoplasias labiales
Hipospadias, riñones hipoplásicos rotados,
hidronefrosis.
Cutáneas
Hemangiomas capilares, pliegues palmares
aberrantes
Hirsutismo en la infancia, hipoplasia
ungueal especialmente en el meñique
Pectus excavatum
Reducción de la movilidad articular
especialmente de los dedos y codos,
polidactilia, sindactilia, sinostosis
radiocubital, pectus carinatum, apófisis
xifoides bífida, luxación congénita de
cadera, deformidades en flexión de los
dedos, anomalía de Klippel-Feil, escoliosis
Esqueléticas
Musculares
Hernias diafragmáticas, umbilicales o
inguinales, diastasis del recto anterior del
abdomen
8
En base a datos tomados de Clarren y Smith, 1978; Adams y Victor, 1993; Schuckit, 1995; Stratton et al.,
1995.
307
Anexo III
Receptores serotoninérgicos.
Los receptores que tienen a la 5-HT como ligando específico, según las últimas
clasificaciones al uso, se agrupan en cuatro subfamilias de receptores metabotrópicos (7
dominios transmembrana, ligados a proteína G) y una subfamilia constituida por un único
receptor ionotrópico (ligado a un canal iónico) cuyo integrante es el receptor 5-HT3. Se
agrega a estos, un receptor huérfano, no agrupado y atípico, de localización enteral (el
5-HT1P). Se conocen otros dos receptores (5-ht5A y 5-HT5B) que pueden constituir una
familia pero de los que aún se desconoce el mecanismo de acción (ver Tabla 1) (Aghajanian
y Sanders-Bush, 2002).
Los receptores metabotrópicos (Fig. 17) comprenden a los agrupados como subfamilia
5-HT1 (acoplados negativamente a la adenilato ciclasa y que incluyen a los subtipos 5HT1A, 5-HT1D"a, 5-HT1D$ß, 5-ht1E y 5-ht1F); la subfamilia 5-HT2 (estimulan a la fosfolipasa
C y la vía de los fosfoinosítidos, e incluye a los subtipos 5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT2C), y una
tercera subfamilia 5-HT4, 5-ht6 y 5-HT7, que incluye a esos tres tipos de receptores (todos
acoplados positivamente a la adenilato ciclasa).
Los receptores serotoninérgicos están codificados en distintos genes y pueden sufrir
distintos tipos de modificaciones post-transcripcionales que aumentan potencialmente su
variedad y posibilidades de regulación. Los receptores de esta gran familia presentan
patrones diferenciales de expresión, tanto periférico como central. Para la mayoría de ellos
se han desarrollado también drogas agonistas y antagonistas, con mayor o menor
especificidad, útiles a la hora de realizar estudios farmacológicos y de uso clínico en
humanos.
308
Tabla 12. Receptores serotoninérgicos:
Subfamilia y tipo de
receptor*
Locus
humano
Distribución conocida
Mecanismo
efector §
5q11.2-13
H ipocam po (capa de células piram idales),
am ígdala, septum lateral, neuronas
piram idales de la corteza cerebral, corteza
entorrinal (altas concentraciones),
hipotálam o, ND R , núcleo m agno del rafe,
ganglio de la raíz dorsal, células de P urkinj ,
núcleo prepósito del hipogloso, sustancia gris
periacueductal, hipotálam o ventrom edial,
Inhibe A C
A bre canales de K +
5-H T 1D"a
1p34.3-36.3
S ustancia negra, ganglios basales, tubérculo
cuadrigém ino superior
Inhibe A C
5-H T 1D$ß
6q13
S ustancia negra, ganglios basales, tubérculo
cuadrigém ino superior
Inhibe A C
?
Inhibe A C
S ubfam ilia 5-H T 1
5-H T 1A
5-ht 1E
?
5-ht 1F
3p11
C orteza cerebral, estriado, hipocam po, bulbo
olfatorio
Inhibe A C
5-H T 2A
13q14-21
C laustrum , corteza cerebral, bulbo olfatorio,
estriado, núcleo accum bens
E stim ula P LP C
C ierra canales de K +
5-H T 2B
2q36.3-37.1
5-H T 2C
Xq24
S ubfam ilia 5-H T 2:
?
E stim ula P LP C
P lexo coroideo, globo pálido, corteza
cerebral, hipotálam o, septum , sustancia
negra, m édula espinal
E stim ula P LP C
?
H ipocam po, corteza entorrinal, am ígdala,
núcleo accum bens, nervio del tracto solitario
y trigém ino, núcleo m otor dorsal del vago,
área postrem a, m édula espinal
5-H T 4
?
H ipocam po, estriado, bulbo olfatorio,
sustancia negra
E stim ula A C
5-ht 6
?
?
E stim ula A C
5-H T 7
10q23.3-24.3
C orteza cerebral, septum , tálam o,
hipotálam o, am ígdala, tubérculo
cuadrigém ino superior
E stim ula A C
R eceptor 5H T 3
C anal iónico para
cationes
S ubfam ilia 5-H T 4, 5-ht 6, 5-H T 7
S ubfam ilia (?) 5-ht 5A, 5-H T 5B
5-ht 5A
7q36
?
Inhibe A C
5-H T 5B
2q11-13
?
?
periférico, en neuronas del intestino
?
R eceptor 5-H T1P
?
* En algunos casos se utilizan letras en m inúscula debido a que las funciones m ediadas por tales receptores aún no se conocen en tejidos
intactos.
A C : adenilato ciclasa; P LP C : fosfolipasa C .
§
309
Anexo IV
Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo.
VII.4.1. Estructura de la proteína S100B:
La proteína S100B9 es miembro de la familia multigénica de proteínas S100, todas de
bajo PM, que comparten una estructura de tipo hélice-bucle-hélice.10 La familia S100
incluye, al menos, a 25 miembros de expresión exclusiva en los vertebrados y que
pertenece, a su vez, a la gran superfamilia de proteínas ligadoras de Ca2+ (Santamaria-Kisiel
et al., 2006). Los miembros de esta familia son: S100A (tipos 1 a 18), S100B, S100G
(calbindina D9k), S100P, S100Z, profilagrina, tricohialina, y repetina (Santamaria-Kisiel et
al., 2006).
En el ser humano, el gen que codifica a la
S100B se encuentra en el brazo largo del
cromosoma 21 (21q22.3) (Allore et al., 1990).
La
S100B
es
una
proteína
ácida,
F ig u ra 10 6. R ep rese ntación esquem ática de la estructu ra
secundaria de un m onóm e ro d e pro te ína S 100 com o la
S 100 $. N : extrem o am ino-term in a l; H I, H II, H III y H IV :
segm entos h elicoidales; L1 y L2: bucles; H : región b isagra;
C : región carboxilo-term inal. M odificado de D onato, 2003.
homodimérica, formada por dos monómeros
de 91 aminoácidos y 21 kDa de PM, secuencialmente iguales. Ambos monómeros de
S100$ se unen por uniones no covalentes para formar la S100B dimérica. Cada
monómero11 está formado por cuatro regiones helicoidales (denominadas HI, HII, HIII y
HIV) separadas por dos bucles ligadores de Ca2+ del tipo llamado “EF-hand” (el bucle L1,
situado entre HI y HII, comprende a los aminoácidos 18-31 y es de estructura no
convencional – o “pseudocanónica” –) mientras que el L2, situado entre HIII y HIV,
comprende a los aminoácidos 61-72 y es de estructura canónica). Entre las hélices HII y
HIII se ubica una región bisagra, denominada H (por hinge, en inglés). Tras la región HIV
se situa un corto segmento carboxi-terminal (Figs. 106 y 107). El bucle L1, situado hacia
9
También denominada, en ocasiones, con la sigla NEF por neurite extension factor (factor de extensión de
neuritas, en inglés).
10
Helix-loop-helix, en inglés.
11
A la proteína monomérica (y al gen que la codifica) se los denomina, generalmente, S100 $; en tanto que
al dímero conformado se lo denomina S100B o S100b.
310
el extremo amino-terminal del monómero,
liga Ca2+ con una afinidad aproximadamente
100 veces menor (Kd . 200-500 :M) que el
bulce L2 situado hacia el otro extremo (Kd .
10-50 :M) (Santamaria-Kisiel et al., 2006). Si
bien las principales funciones de la S100B
están relacionadas a su capacidad ligadora de
dos átomos de Ca2+ por monómero, puede
ligar también iones Zn2+ con afinidades
nanomolares (Kd = 94 ± 17 nM) en un sitio
distinto a aquel en el que se une el Ca2+; la
unión de un átomo de Zn2+ incrementa
notablemente la afinidad de la proteína por los
Figura 107. R epresenta ción de un m odelo de cinta s de la
p roteína S-100B hum ana en la que los seg m entos
helicoidales se m uestran con núm ero s ro m anos para uno (IIV ) y otro m o nóm ero (I’-IV ’). M odificado de Ferguson y S haw ,
2002.
iones de Ca2+ y por sus proteínas blanco
(Scotto et al., 1998; Wilder et al., 2003). La S100B puede ligar también iones Cu2+ (Kd =
0,46 :M) a razón de 4 ó 6 iones por dímero (en ausencia o presencia de L-ascorbato,
respectivamente) y, en determinadas condiciones, podría disminuir el daño celular
oxidativo por medio del secuestro de iones Cu2+ (Nishikawa et al., 1997).
Tras la unión de dos átomos de Ca2+ a cada
monómero, la S100B se dimeriza y modifica
notablemente su estructura terciaria de modo
tal que el dímero abre su estructura y expone
al medio regiones hidrofóbicas (previamente
ocultas) de su secuencia aminoacídica. Esto le
permite acomodar a (e interactuar con) una
proteína blanco en cada uno de sus extermos
o p u e st os.
P uede
así
en t re c r u z a r
funcionalmente dos proteínas blanco, sean
Fi g ura 108. R epresentación esq uem ática d el p osib le m od o
de interacción d e la p ro teína S 100B dim érica con las
p roteínas b lanco. Las regione s d e reconocim iento (zona
rayada), localizadas en los extrem os d el d ím ero y
conform adas p or p orciones hid rofób icas d e am b os
m o nóm e ros, perm iten la interacción del dím e ro co n
p roteínas b lanco hom ólog as o heterólog as. M od ificad o d e
D onato, 2003.
estas homólogas o heterólogas (Fig. 108). En esta interacción de la S100B con las proteínas
blanco, las regiones bisagra y el segmento carboxi-terminal juegan un papel crítico ya que
le permiten unirse a varias proteínas. Dentro de los astrocitos, en el SNC normal, la S100B
se acumula en estado libre, reducido en los grupos sulfhidrilos de los residuos Cys $68 y
Cys $84. Sin embargo, es secretada en forma oxidada (Scotto et al., 1998). La capacidad
311
promotora de la extensión de neuritas (como las capacidades neurotrófica y mitogénica
glial, en general) depende críticamente de que la S100B dimérica se encuentre en estado
oxidado en los grupos sulfhidrilo de los residuos Cys $68 y Cys $84, ya que la forma
reducida es inactiva en relación a tales funciones (Scotto et al., 1998).
Los niveles de expresión de la S100B dependen de varios factores ambientales. Su
expresión está bajo un fuerte control regulatorio transcripcional y se postula que, en los
seres humanos, la expresión puede estar reprimida constitutivamente en todos los tipos
celulares por elementos regulatorios represores. De este modo, sólo la presencia de factores
inductores que contrarreste los efectos de los represores sería capaz de favorecer la
expresión del gen. Esto permitiría una muy fina y óptima regulación de los niveles de
expresión de la proteína.
VII.4.2. Estructura del receptor para los productos finales de la glucosilación
avanzada (RAGE):
Este receptor fue descripto originalmente en el endotelio de los capilares pulmonares
de terneros recién nacidos, en investigaciones relacionadas al daño vascular que se observa
en la diabetes y que se sospechaba producido por la acumulación y adhesión al endotelio
de proteínas que han sufrido una extensa glucosilación no enzimática; de allí su
denominación (Schmidt et al., 1992; Neeper
et al., 1992).
El RAGE es una proteína transmembrana
de 45 kDa de PM, perteneciente a la
superfamilia de los receptores de superficie
celular símil-inmunoglobulinas con capacidad
de unión a múltiples ligandos. Se lo encuentra
en muchos tipos celulares entre los que se
encuentran las células endoteliales, células del
sistema mononuclear fagocítico, hepatocitos,
células musculares lisas, células mesangiales
y ciertos tipos de neuronas (Valencia et al.,
2004).
F ig u ra 109. E structu ra del R A G E con los dom inios sím ilinm unoglobulina d e tipo V (variab le) y C 1 y C 2 (co nstantes).
Se m uestran los sitios d e unión d e: i) la anfoterina (una
proteína con actividad prom otora de la extensión d e neuritas
de m áxim a expresión d urante el desarrollo y, quizá s, el
lig and o esp ecífico d el R A G E); ii) los p rod uctos finales d e
glucosilación avanzada (A G E s); iii) la S 100A 6 y S 100A 12; y
iv) la S 100B , entre los dom inios V y C 1 . A la derecha,
esquem a de la inm uno globulina G (IgG ) con su típica
estruc tura de do bles cade na s livian as y pesad as; se o bserva
la sim ilitud estructural. A m b as m oléculas se m uestran en sus
fo rm a s tra n sm e m b rana, adherid a s a la m e m b ra n a
citoplasm ática. A se m e ja n za de lo que sucede con la IgG ,
tam bién existen form as secretorias del R A G E (sR A G E ) en las
q ue falta el p eq ueño d om inio intracitop lasm ático.
312
El RAGE está conformado por una cadena de 394 aminoácidos con 3 dominios
globulares extracelulares de 332 aminoácidos (un dominio V y dos dominios C -C1 y C2-)
con estructuras secundarias predominantes de hoja $ plegada en los que reside la capacidad
de unión a sus ligandos; un corto segmento helicoidal intramembranoso de 19 aminoácidos
hidrofóbicos y una pequeña secuencia intracelular fuertemente ácida de 43 aminoácidos que
es crítica para su capacidad de transducción intracelular de señales (Huttunen et al., 1999;
Neeper et al., 1992) (Fig. 109). El gen del RAGE, en el ser humano, está localizado en el
brazo corto del cromosoma 6 (6p21.3), en la región codificante de las moléculas del
complejo mayor de histocompatibilidad de tipo III (CMH III) (Sugaya et al., 1994).
VII.4.3. Estructura de los filamentos intermedios (FI):
Ultraestructuralmente, los filamentos
intermedios forman unas fibras semejantes
a cuerdas de unos 8-12 nm de diámetro y
de longitud variable (pueden sobrepasar los
100 :m).
Las proteínas que constituyen a todos
los tipos de FI están compuestas por unos
310-350 residuos de aminoácidos y tienen
Fig ura 110.. Estructura general d e las p roteínas d e los filam entos
in term edios. E n a) se observa el dom inio central bastoniform e
con estructura terciaria en " -hélice y los dos d om inios g lobulares
de los extrem o s a m ino - y carbo xilo-term ina l. E n b ) se ob serva
q ue el segm ento central se halla interrum p id o p or cortos
segm entos d e unión no helicoid ales. M od ificad o a p artir d e
C oop er, 2002 y B ecker et al., 2007.
unos 45 nm de longitud. Estas proteínas
poseen una cabeza globular en el extremo
amino-terminal, una cola también globular
en el extremo carboxi-terminal y un
dominio bastoniforme central, alargado,
con estructura de "-hélice levógira. En el
dominio
central
se
encuentran
4
subdominos helicoidales (denominados
1A, 1B, 2A y 2B) separados entre sí por
Figura 111. E nsam blaje de los filam ento s inte rm edios desde la
unidad m onom érica con p olarid ad hasta el tetram ero escalonad o
sin po laridad. M odificado a partir de A lberts et al., 2006.
cortos segmentos de unión no helicoidales
(Fig. 110). A medida que se van ensamblando en el citoplasma, dos moléculas de FI se
enrollan en espiral por la zona central helicoidal y conforman un dímero. Dos dímeros se
313
asocian entre sí por medio de enlaces covalentes para formar un tetrámero. Esta asociación
no es simétrica o paralela sino que es escalonada e intercalada, o antiparalela, ya que las
cabezas y las colas globulares de los dos dímeros se asocian en forma despareja; es decir,
las cabezas amino-terminales de un dímero con las colas carboxi-terminales del otro en un
mismo extremo. Así, los dímeros, que tenían una polaridad estructural (por presentar una
cabeza y una cola), se asocian en tetrámeros que carecen de tal polaridad (Fig. 111).
Dado que el tetrámero no es polar, el
FI resultante, ensamblado a partir de la
reunión de estos también carece de tal
propiedad (Karp, 2006).12 Por último,
ocho tetrámeros se unirán luego entre
sí,
en
forma
términoterminal
y
laterolateral por medio de enlaces no
covalentes, para formar el FI cordiforme
(Alberts et al., 2006; Karp, 2006) (Fig.
112).
El agregado o la resección de grupos
fosfato (fosforilación y desfosforilación
de
las
subunidades)
controla
el
ensamblaje y desensamblaje de casi
todos los tipos de FI (Karp, 2006).
Estos cambios controlados del nivel de
grupos fosfatos hace que los FI sean un
componente
del
citoesqueleto
F igura 11 2. E nsam blaje de los filam en tos interm ed ios desd e la
form ación d e octám eros a partir d e d os tetrám eros y la com p osición
final del FI co rdiform e (arriba). E n m ed io, im ag en al m icro sc o p io
e lectrónico de un neurofilam e nto en el que se aprecian los bra zo s
laterales exten d i énd ose desd e el eje central. A b ajo, im agen d e
m icroscop ía electrónica d e un p reparado d e axón obtenid o p or
críofractura en el que se ap recia el entram ado citoesquelético
form ado p or los neurotúb ulos (sólo se ven d os, flechas) y los
neurofilam entos, unid os entre sí p or los b razos laterales (cab ezas d e
flecha). M : m itocond rias. M odificado de A lberts et al., 2006 y Lee y
C leveland, 1996.
fácilmente regulable por las especiales condiciones cambiantes de una célula. Son, por ello,
estructuras particularmente dinámicas.
Los dominios centrales en "-hélice tienen una secuencia aminoacídica semejante en los
diferentes tipos de proteínas de FI lo que determina que, cuando se asocian en haces entre
sí, formen filamentos con un diámetro y una estructura interna similar independientemente
del tipo de FI. Sin embargo, las cabezas y las colas globulares, por el contrario, varían
considerablemente en tamaño y secuencia aminoacídica y, al estar expuestas en la
12
Recuérdese que los otros componentes del citoesqueleto (los microtúbulos y los microfilamentos), a
diferencia de los FI, sí presentan polaridad.
314
superficie, permiten que los FI interactúen entre sí y con otros componentes del citoplasma
(Alberts et al., 2006).
VII.4.4. Estructura de la proteína asociada a microtúblos de tipo 2 (MAP-2):13
La MAP-2 está codificada en el
cromo so ma
2q 34 -q3 5.
Tras
la
transcripción de los 20 exones que
contiene este único gen, se pueden obtener
múltiples isoformas que resultan del
empalme alternativo del pre-ARNm. Sin
embargo, todas las isoformas se agrupan en
dos grandes grupos de alto y bajo PM
(HMWMAP-2
y
LMWMAP -2,
respectivamente, por las siglas en inglés de
high y low molecular weight MAP-2). Las
HMWMAP-2 incluye a las MAP-2A (280
Figu ra 113. A rriba , estruc tura de las M A P -2 de alto y ba jo p e so
m olecular (H M W M A P-2 y LM W M A P-2, resp ectivam ente) con sus
dom inio central (C D ), dom inio de u nión d e la subunidad
regulatoria R II de la P K A (R II), dom inio rico en prolina (P R D ) y el
dom inio de un ión a la tubulina (TB D ). M odificado de S ánchez et
al., 2000. A b ajo, representación d e la M A P-2 unid a a un M T y
posición del dom inio o brazo de pro yección late ral.
kDa) y MAP-2B (270 kDa) y las
LMWMAP-2 incluyen a las MAP-2C (70 kDa) y MAP-2D (75 kDa). Ambos grupos de
MAP-2 poseen, hacia el extremo carboxi-teminal de la molécula, 3 ó 4 secuencias repetidas
espaciadas por 13-14 residuos de aminoácidos, que constituyen los dominios de unión a la
tubulina (TBD, por las siglas en inglés de tubulin-binding domain).14 Inmediatamente antes
de los TBD, todas las isoformas de MAP-2 poseen un dominio rico en prolina (PRD, por
las siglas en inglés de proline rich domain); finalmente, hacia el extremo amino-terminal,
existe en todas ellas una secuencia de 31 residuos de aminoácidos que constituye la región
de unión de la subunidad regulatoria RII de la proteín-quinasa AMPc-dependiente (PKA)
(Fig. 113). La principal diferencia entre las HMWMAP-2 y LMWMAP-2 es la ausencia en
estas últimas de un dominio central constituido por los exones 9-11 del transcripto
13
La mayor parte de los datos de esta subsección los he tomado de la excelente revisión de Sánchez et al.
(2000).
14
La MAP-2 se une por medio de sus TBD a la región carboxi-terminal ácida de los dímeros de tubulina, al
igual que las proteínas motoras (dineína y kinesina) por lo que puede interferir con la unión de éstas a los MTs
y, por ello, con el proceso de transporte de organelas mediado por proteínas motoras.
315
primario. Todas las MAP-2 son moléculas no compactas, flexibles que parecen carecer de
una estructura secundaria definida. La región carboxi-terminal de la MAP-2, incluyendo
a los TBD y PRD, se une estrechamente a los MTs en tanto que el resto de la molécula
(denominado dominio de proyección, y que comprende el extremo amino-terminal) se
proyecta fuera de la superficie del MT formando una especie de extensión en forma de
brazo (Fig. 113).
La M AP-2 es regulada en sus funciones por medio de la acción de importantes modificaciones posttraduccionales de la molécula. M ás allá de algunos mecanismos regulatorios que parecen ser de menor
importancia (como por ejemplo los mediados por el fosfatidilinositol, la glucosilación y la ADP-ribosilación),
los principales mecanismos regulatorios de esta proteína se hacen efectivos por medio de su fosforilación y
desfosforilación en residuos específicos de serina y treonina ubicados en distintos lugares de la cadena
aminoacídica. Así, la M AP-2 es sustrato de numerosas quinasas y fosfatasas.
Entre las proteín-quinasas, se ecuentran: i) la proteín-quinasa AM Pc-dependiente (PKA), para la cual
la M AP-2 posee una secuencia de unión específica donde se une la subunidad RII de la enzima (Fig. xx); la
fosforilación de la MAP-2 por la PKA disminuye su unión a la tubulina y a la actina, aumenta la tasa constante
de disociación de los polímeros MTS, reduce la actividad de nucleación de los MTs inducida por la MAP-2
e inhibe la proteólisis de la MAP-2 mediada por calpaína; ii) la proteín-quinasa II Ca 2+-calmodulinadependiente (CAM KII), una enzima muy abundante en las espinas dendríticas y en las densidades
postsinápticas (que puede estar involucrada en los procesos de almacenamiento de los trazos de memoria);
su acción fosforilatoria sobre la MAP-2 inhibe la acción promotora del ensamblaje de los M Ts y de
entrecruzado de los MFs que posee la MAP-2; iii) la proteín-quinasa Ca 2+/fosfolípidos-dependiente (PKC),
cuya acción fosforilatoria sobre los residuos del TBD y otros lugares de la MAP-2 reduce su capacidad de
inducir la polimerización de tubulina y también inhibe su interacción con la actina de los MFs; iv) las proteínquinasas dirigidas por prolina (PDPKs), un grupo de quinasas con actividad fosforilatoria sobre residuos
de Ser/Thr-Pro capaces de modificar el perfil tridimensional de toda la proteína lo cual, a su vez, puede
modificar su capacidad para interactuar con otras proteínas, su cinética desfosforilatoria, su localización
subcelular o su degradación; entre este grupo de quinasas se encuentran: las quinasas reguladas por señales
extracelulares (ERK),15 las quinasas ciclina-dependientes (CDK), y la glucógeno sintetasa quinasa 3
(GSK3). Las ERKs están asociadas a los MTs; su acción fosforilatoria sobre la región carboxi-terminal de
la MAP-2 puede reducir significativamente su capacidad para inducir la polimerización de la tubulina aunque
la mayoría de los sitios de fosforilación de la MAP-2 por las ERKs están en la región amino-terminal; las
ERKs pueden participar así en la regulación del crecimiento de las neuritas, en la transmisión sináptica y en
la memoria a largo plazo. De las CDKs, la CDK5 es particularmente abundante en las neuronas en las que
pueden jugar un rol importate en la migración neuronal y en la extensión y el crecimiento de las neuritas; las
CDKs se asocian a los MTs y la acción fosforilatoria de las CDKs sobre la funcionalidad de la MAP-2 puede
ser similar a la que ejercen las ERKs. La acción fosforilatoria de la GSK3 sobre la MAP-2 puede modificar
la estabilidad de los MTs (hacia la desestabilización) y controlar el desarrollo neuronal.16
Entre las fosfatasas que la desfosforilan se encuentran las serina/treonina proteín-fosfatasas como la PP1,
PP2A, PP2B (calcineurina, una fosfatasa Ca 2+-dependiente) y la PP2C. La estimulación de los receptores
glutamatérgicos NMDA aumenta la desfosforilación de la MAP-2 presumiblemente por acción de las
fosfatasas PP2B y PP1.
La fosforilación de las MAPs es el principal mecanismo por el cual se regula la dinámica
15
Las ERKs (por las siglas en inglés de extracellular signal-regulated kinases) también reciben la
denominación MAPK/ERK por las siglas en inglés de mitogen-activated protein kinases (MAPK) dado que
varias de las señales extracelulares que las activan son mitógenas y conserva así la misma sigla original que
tenían cuando se las denominaba microtubule-associated protein 2-kinases (MAPK).
16
Es curioso que el litio, una droga que se utiliza en clínica neuropsiquiátrica como estabilizador del ánimo
y antirrecurrencial en la enfermedad maníaco-depresiva, es un inhibidor de la GSK3.
316
microtubular en respuesta a las cambiantes señales extracelulares. Estos cambios de la
dinámica microtubular son cruciales para la morfogénesis y el establecimiento de la
polaridad neuronal. Los altos niveles de fosforilación de la MAP-2 disminuyen su
asociación a los MTs pero también sucede lo mismo con los altos niveles de
desfosforilación. Por ello, se cree que es posible que, más que los niveles totales de
fosforilación de la MAP-2, la ubicación de esos grupos fosfato en la molécula de la MAP-2
sean los determinantes de los niveles de unión intermolecular. Los niveles de fosforilación
de la MAP-2 también determinan su susceptibilidad a la degradación y ello tiene relevancia
para el nivel de ensamblaje de los Mts.
317
Anexo V
Métodos experimentales de exposición de animales al etanol.
Ventajas y desventajas de cada uno.
Un sistema “E” sirve como modelo de otro sistema “R” si el estudio del sistema E
permite conocer íntimamente lo que sucede en R independientemente de cualquier
conexión causal que pueda existir entre E y R. Para que un modelo sea eficiente como tal,
el sistema E debe ser más simple que el sistema R (Tabakoff y Hoffman, 2000).
En las ciencias biomédicas, los modelos experimentales (E) que se llevan a cabo in vivo
permiten reproducir en forma controlada, utilizando animales de laboratorio, uno o varios
aspectos de la realidad (R) observada en los seres humanos con la finalidad última de
comprender sus mecanismos íntimos y/o intervenir en ellos. Por lo tanto, de la correcta
elección del modelo experimental que se utilice dependerá el conocimiento óptimo que se
pueda extraer de él. Huelga aclarar que ese conocimiento, en relación con la realidad, será,
siempre, parcial.
Uno de los primeros investigadores que inició estudios experimentales de alcoholismo utilizando animales
fue Jacques Joseph Valentin M agnan (1835-1916), un célebre neuropsiquiatra francés, quien alcoholizó
perros, cobayos, gatos, y conejos para estudiar los efectos diferenciales del alcohol y una bebida en boga por
entonces: el ajenjo (Amory, 1868; Magnan, 1871, 1874). M agnan, tras comprobar, en perros, que el consumo
de alimentos embebidos en cantidades prefijadas de EtOH era rechazado por los animales tras un período de
consumo inicial, comenzó a administrarles el tóxico intragástricamente a través de sondas orogástricas o de
gastrostomías. Los estudios con animales de laboratorio alcoholizados durante la preñez con el fin de estudiar
a la descendencia comenzaron en 1912 cuando L. B. Nice inició estudios con roedores y en 1913 Charles R.
Stockard utilizando un método de alcoholización de coballos por vía inhalatoria encontró malformaciones
en las crías, bajo peso al nacer, retardo del crecimiento postnatal, alta mortalidad infantil y baja fertilidad en
sus estudios a lo largo de cuatro generaciones. Cole y Davis en 1914 y MacDowell y Vicari en 1917 hallaron
lo mismo en ratones blancos, conejos y ratas. En 1914, Stockard, nuevamente, exponiendo, esta vez, huevos
de gallina a los vapores del alcohol, obtuvo pollitos cíclopes y varios con microcefalia, aplasia o hipotrofia
de segmentos corporales e hipodinamia circulatoria vascular (W arner y Rosett, 1975).
Al momento de mimetizar la realidad del consumo humano de EtOH en un modelo
experimental surgen varias dificultades y factores experimentales a tener en cuenta: i) la
especie animal que se ha de utilizar (las distintas especies animales presentan parámetros
farmacocinéticos distintos para el EtOH,17 el tiempo de generación y el número de crías por
17
Cfr. ut supra, en la Introducción, la nota al pie Nº 18 en la sección I.3.1. (Farmacocinética) y la sección
I.3.5. (Correlación entre el nivel de alcoholemia y las manifestaciones cognitivo-conductuales en la
intoxicación aguda).
318
camada así como la longevidad de los individuos varían de especie en especie); ii) la vía
de administración por la que se ha de suministrar el EtOH puede mimetizar o no la vía de
consumo habitual en los humanos al tiempo que determinar muy diferentes niveles finales
de alcoholemia (vías subcutánea, intravenosa, oral, intragástrica, intraperitoneal,
intrarrectal, inhalatoria); iii) la necesidad o no de provocar mayores o menores cambios
metabólicos y, particularmente, distintos grados de daño hepático semejantes a los
observados en el ser humano (esteatosis hepática, hepatitis alcohólica, cirrosis alcohólica),
grados cuya consecución experimental se correlaciona parcialmente con la longevidad del
animal y el tiempo de exposición al tóxico y la suplementación calóricoproteica o no que
determinarán la normal nutrición o diferentes grados de malnutrición; iv) la facilidad de
implementación de la vía de administración18; v) el costo de mantenimiento y la facilidad
de manipulación de los animales de la especie elegida19; vi) la necesidad de conseguir
niveles de alcoholemia bajos o altos, permanentes o transitorios, en función de los
requisitos experimentales que se hubieren de perseguir; vii) la posibilidad de permitir o no
al animal de experimentación la capacidad de elegir libremente la ingesta de EtOH; viii)
el tipo de estudio experimental que se ha de llevar a cabo (metabólicos, bioquímicos,
morfológicos, conductuales, reproductivos, bioeléctricos, sociales, de intoxicación aguda
o crónica, de dependencia, tolerancia o abstinencia, etc.); ix) el sexo y grupo etario de los
animales que se han de utilizar para mimetizar aspectos humanos (machos y/o hembras
neonatas, infantes, adolescentes, adultas o ancianas); x) la apetencia relativa por el
consumo voluntario de EtOH que presenta cada especie.20
Por todos estos, y otros, factores interrelacionados y variables es que se han generado,
a lo largo de la historia, distintos modelos experimentales para estudiar diferentes aspectos
del alcoholismo humano.
18
Administrar EtOH en el agua de bebida que consumen diariamente los animales es más fácil, por ejemplo,
que administrarla intragástricamente por medio de una gastrostomía, que requiere la realización de un
procedimiento quirúrgico y cuidados postquirúrgicos de los animales.
19
Previsiblemente, la crianza, mantenimiento y manipulación de, digamos, primates, roedores o células en
cultivo, difieren notablemente.
20
Los animales de cepas salvajes, en su mayoría, y a diferencia de los seres humanos, son espontáneamente
reacios a ingerir bebidas alcohólicas y, si se les ofrece la opción, prefieren beber líquidos que no lo contengan;
más aún, dependiendo de la concetración de EtOH que contenga la bebida que se les ofrezca, pueden
disminuir la cantidad diaria total de líquido ingerido o, incluso, llegar a cesar la ingesta líquida, deshidratarse
y morir. Para vencer estas dificultades se han desarrollado, por cría endogámica, varias cepas de ratas y
ratones con preferencia para beber alcohol, incluso por sobre el agua u otras bebidas.
319
VII.5.1. Administración en el agua de bebida:
En este método de exposición se ofrece a los animales de experimentación el EtOH en
solución en el agua de consumo habitual, en concentraciones comunmente variables entre
0,5-10% y, raramente, hasta 20% (v/v).
Entre las ventajas de este método se cuenta el hecho, muy importante, de que es el único
que mimetiza la vía natural de ingesta de EtOH de en los seres humanos. Las soluciones
de uso son muy fáciles de preparar y administrar y no resultan irritativas para los animales.
Se puede lograr una administración “forzada” en la que, para el animal, no hay posibilidad
de elección acerca de qué tomar ya que se le ofrece una sola botella con la solución de
EtOH, o una administración “electiva” por medio del método de elección de dos botellas
en el que los animales pueden decidir y elegir qué tomar, agua o EtOH u otras soluciones
(se les ofrecen distintas combinaciones de botellas con agua o EtOH en solución e, incluso,
se pueden ofrecer botellas con distintas concentraciones de EtOH) (Tordoff y Bachmanov,
2003). Con los procedimientos de “elección” se puede mimetizar lo que hacen los humanos
alcohólicos que, naturalmente, sí tienen la capacidad de elegir si beber o no EtOH y en qué
concentración. Otra ventaja es que los animales reciben alimento sólido estándar de
consumo habitual en el laboratorio y también pueden elegir libremente cuánto y en qué
momento comer (si bien no qué comer), a semejanza de los humanos. Más aún, el alimento
puede ser suplementado o modificado sin perjuicio de la administración del EtOH. Por
último, a diferencia de otros, es un método barato y simple de implementar, incluso a largo
plazo para realizar estudios de alcoholización crónica.
Entre las desventajas se cuentan el hecho de que los roedores de laboratorio presentan
una aversión natural a beber líquidos con EtOH en solución por lo que, en ocasiones, es
preciso realizar períodos de adaptación previos, más o menos largos, en los que se ha de
titular la concentración de EtOH ofrecida, partiendo de concentraciones bajas y aumentando
hasta lograr que consuman la deseada. De su aversión se deriva el hecho de que,
normalmente, tienden a beber menos volumen de líquido que los animales control que
reciben sólo agua, hasta dejar de beber por completo y, eventualmente, deshidratarse hasta
morir; ello limita la concentración máxima que se pude utilizar con este método (-20%).
Así, incluso con las mayores concentraciones de EtOH, se obtienen alcoholemias
generalmente no superiores a los 150 mg/dl, es decir, difícilmente se lleguen a mimetizar
las alcanzadas por humanos alcohólicos crónicos que son grandes bebedores. Tampoco es
320
posible reproducir, en general, el gran consumo, agudo y brusco, que se observa en las
“borracheras” rápidas21, habituales en los grandes bebedores de fines de semana. Otra
desventaja del modelo es que las alcoholemias varían a lo largo del día en función del
patrón temporal de consumo habitual de los animales (la presencia o ausencia de alimento
en el estómago, por ejemplo, es uno de los factores que más fácilmente altera los
parámetros farmacocinéticos del EtOH); esto, si bien se asemeja a lo que sucede en
humanos, impone una dificultad en el control experimental. Finalmente, en función del
corto período de vida de los roedores de laboratorio (2-3 años para las ratas), de las bajas
alcoholemias obtenidas con este método y de que no es posible lograr en general que los
roedores ingieran más del 30% del VCT como derivado del EtOH en soluciones al 15%
(v/v) (Lieber y DeCarli, 1967; Scheig et al., 1966), no es posible provocar en ratas, con este
método, lesiones hepáticas más allás de la hepatitis alcohólica; es decir, nunca se llega a
producir cirrosis (Lieber y DeCarli, 1967).22
VII.5.2. Administración por inyección intraperitoneal:
La administración intraperitoneal (ip) consiste en la inyección con aguja y jeringa, en la
cavidad abdominal, de un volumen de una solución de EtOH de concentración variable
(pero, en general, del 20% v/v) tal que se administre al animal, rápidamente, una dosis
variable entre 0,5-5 g/kg de peso corporal; raramente la dosis sobrepasa los 6 g/kg/dosis en
virtud de las DL50 correspondientes a cada especie.23
Entre las ventajas de este método se cuentan la facilidad de preparación de la solución
y de la administración del tóxico. Otra enorme ventaja en los estudios en los que el control
de la dosis y la alcoholemia es crítica (como en los modelos de FAS) es que se puede tener
un control muy preciso sobre la dosis administrada y, parcialmente, de la alcoholemia
lograda. Tanto en ratones como en ratas, la administración de EtOH por vía ip induce
alcoholemias mayores que aquellas que las que se observan con la utilización de otros
21
Algo que en la literatura anglófona se denomina binge consumption (consumo de juerga o parranda).
22
Este fue el principal factor por el que estos dos autores desarrollaron su hoy famosa y muy comercializada
dieta líquida ya que ambos persiguían la consecución de lesiones del tipo de la cirrosis hepática en animales
de laboratorio para estudiar un modelo de esta enfermedad humana (Lieber y DeCarli, 2001).
23
Cf. ut supra sección I.2.4. (Correlación entre el nivel de alcoholemia y las manifestaciones cognitivoconductuales en la intoxicación aguda) en la Introducción.
321
métodos, como la administración intragástrica.24
En cuanto a las desventajas, también las hay en este método y algunas tan importantes
como las ventajas que aporta. La principal de ellas es la irritación que provoca el EtOH en
contacto con el mesotelio peritoneal. En ocasiones, pueden observarse animales que
intentan aliviarse de la irritación “rascándose” el abdomen. Por cierto que la irritación
podría evitarse disminuyendo la concentración de la solución inyectada pero, en este caso,
el volumen a inyectar para alcanzar igual dosis aumenta tanto que, en la práctica, no se lo
puede administrar sin comprometer, por ejemplo, la excursión ventilatoria de los pulmones
por abovedamiento de la cúpula diafragmática. Por ese motivo, la mayoría de los
investigadores que utilizan este método de administración prefieren inyectar soluciones de
EtOH al 20% (v/v) en solución salina. Una mayor concentración resultaría en un menor
volumen pero conllevaría el incremento de la probabilidad de irritación del peritoneo, y
viceversa. La irritación peritoneal puede provocar, tras repetidas inyecciones y en forma
relativamente rápida, la formación de bridas, sinequias y otras adherencias que pueden
constreñir vísceras abdominales huecas y, en el caso de los estudios gestacionales
precisamente, de los cuernos uterinos y comprometer así el desarrollo fetal. Puede incluso
formarse un plastrón que imposibilita totalmente la realización de cirugías en el abdomen,
en caso de que el experimento lo requiriese. Por último, como la implementación de este
método implica manipular, inmovilizar e inyectar periódicamente a los animales, más allá
del factor agregado de la irritación peritoneal, este método es uno de los que más estrés
genera en los animales de experimentación.
VII.5.3. Administración intragástrica:
La administración intragástrica de soluciones de EtOH en distintos solventes (agua, o
fórmulas lácteas) por medio de un tubo orogástrico es un modo experimental más de evadir
la aversión natural de los animales a ingerir alcohol. Ya utilizado por Magnan en el siglo
XIX (vide ut supra), consiste en colocar por la boca del animal una sonda que, a través del
esófago, llegue a (y quede alojado en) el estómago o en realizar una gastrostomía a través
24
Sin embargo, comparando ambas especies independientemente de la vía de admnistración, los perfiles de
alcoholemia en los ratones son más severos que los que se ven en las ratas, probablemente debido a sus
diferencias farmacocinéticas en la velocidad de metabolización del EtOH (Livy et al., 2003).
322
de la cual se coloca una sonda en el interior del estómago, directamente desde el exterior
y a través de la pared abdominal. Así, se inyectan por ella soluciones de EtOH directamente
en el estómago. La administración intragástrica produce alcoholemias pico menores que las
de la administración ip posiblemente por la presencia en la mucosa gástrica de la enzima
ADH que determina un efecto metabolizador de primer paso (Livy et al., 2003)25. La
administración intragástrica se puede utilizar, además, en los modelos de la denominada
cría artificial (artificial rearing) en la que se realiza una gastrostomía en crías de ratas
neonatales; por medio de la gastrostomía se las alimenta con fórmulas lácteas especiales
para roedores a las que se agrega EtOH. Con este método, según la dosis de EtOH
administrada, se pueden alcanzar altas alcoholemias (300-350 mg/dl) sostenidas en el
tiempo, capaces de inducir microcefalia (Goodlett et al., 1990).
A semejanza de la administración ip, con la intragástrica se puede regular muy
precisamente la dosis con la ventaja adicional de que es más “fisiológica” que aquella dado
que el alcohol ingresa al organismo por el estómago. Se puede además infundir la solución
en forma discontínua (como en la ip) o en forma contínua por gastroclisis y mantener así
niveles altos y sostenidos de alcoholemias. A semejanza de la ingesta por vía oral y a
diferencia de la inyección ip, existe en este método un efecto de primer paso por
metabolización prehepática en la mucosa gástrica.
Las desventajas de este método están a la vista: el procedimiento es altamente estresante
para el animal, tanto sea que se lo sonde por la boca como (y aún más) si se lo opera para
realizarle la gastrostomía (en este último caso se suman los cuidados y las complicaciones
postquirúrgicas). Operativamente, es más complicado y requiere, por parte del operador,
mayor entrenamiento y habilidad manual que en la administración en el agua de bebida o
por vía ip. A pesar de ser este método más “fisiológico” que la vía ip no lo es tanto como
la vía oral ya que el EtOH no pasa por la boca y no tiene contacto, en principio, con la
mucosa yugal, gingival y lingual y se descuidan así muchos de los efectos conductuales
originados por estímulos gustativos, olfativos y cenestésicos.
Una variación de este método, muy utilizado en estudios conductuales llevados a cabo
en animales postnatales tempranos expuestos prenatalmente al tóxico, acerca del
condicionamiento gustativo y olfativo del EtOH, consiste en colocar la sonda directamente
en la boca de animal atravesando para ello, con la sonda, la piel y estructuras subyacentes
25
Cf. ut supra la sección I.2.1. Farmacocinética en la Introducción.
323
de la mucosa yugal (Dominguez et al., 1998). Al inyectarse la solución de EtOH, como los
animales no saben escupir, tragan el líquido muy a su pesar. Sin embargo, este método no
se utiliza primariamente para administrar el EtOH sino para generar efectos locales sobre
la mucosa orofaringolingual que generan importantes correlatos conductuales.
VII.5.4. Administración inhalatoria:
Hemos visto ya que, en 1914, Charles R. Stockard expuso huevos embrionados de
gallina a los vapores del EtOH y obtuvo pollitos cíclopes, varios con microcefalia, y otras
displasias (Warner y Rosett, 1975). La exposición de mamíferos de laboratorio por vía
inhalatoria consiste en alojarlos en cámaras herméticas a través de las cuales se hace
circular aire saturado con EtOH en distintos porcentajes.
Entre las ventajas de este método se cuenta el hecho de que, según la dosis que se utilice,
se pueden alcanzar altas alcoholemias (300-350 mg/dl), sostenidas en el tiempo, capaces
de inducir displasias corticales y microcefalia (Ryabinin et al., 1995), y que se puede evocar
dependencia y abstinencia en especies animales en las que, por su alta tasa metabolizadora
del EtOH (como los ratones) es difícil inducir alcoholemias altas sostenidas por otros
métodos de administración (Goldstein y Pal, 1971). Más aún, regulando el flujo y la
saturación del aire con EtOH se puede modificar la alcoholemia de los animales expuestos
(Kang et al., 2004). Todo ello sin necesidad alguna de manipular al animal.
No obstante, la exposición inhalatoria también tiene las desventajas de que puede ser
irritativa para la vía aérea superior; no es de ningún modo una vía de administración
“fisiológica” que remede ninguna situación humana (ni tan siquiera una laboral); es costosa
desde el punto de vista del equipamiento.
VII.5.5. Administración por dieta líquida:
Algunos de los motivos explícitos que llevaron a Lieber y DeCarli a desarrollar una dieta
líquida nutricionalmente completa y adecuada y en la cual se pudiera adicionar EtOH,
fueron: i) superar la aversión natural de los roedores de laboratorio a beber EtOH; ii) lograr
producir altas alcoholemias sostenidas en el tiempo capaces de producir daño hepático
324
(Lieber, 2000); iii) conseguir, en animales de laboratorio más longevos que los roedores,
que el consumo de EtOH represente hasta el 50% del VCT de la dieta diaria ya que ese
porcentaje es aquel al que puede llegar un humano alcohólico crónico; y iv) reproducir en
esos animales más longevos las alteraciones patológicas observadas en el hígado de
humanos alcohólicos crónicos, principalmente la cirrosis (algo imposible de obtener con
la administración en el agua de bebida ya que lo máximo que se puede lograr es la
esteatosis hepática) (Lieber y DeCarli, 1967, 1994; Lieber et al., 1975).
Entre las ventajas de la dieta líquida Lieber-DeCarli, se cuenta el hecho de que se
pueden obtener consumos diarios de EtOH que son 2-3 veces mayores (12-18 g/kg/d) que
los que se logran con la administración en el agua de bebida, pero por una vía de
administración “fisiológica”. Con estos niveles de consumo no son infrecuentes las
alcoholemias de 100-150 mg/dl. Con esta dieta, los roedores consumen calorías derivadas
del EtOH en relación nunca mayor al 36% del VCT en tanto que en los babuinos se puede
lograr que consuman hasta el 50% (Lieber y DeCarli, 1994). La cantidad de ácidos grasos
en la dieta líquida con EtOH tiene un notable efecto sobre la cantidad de los mismos que
se acumulan en el hígado (Lieber y DeCarli, 1994). El ajuste de los nutrientes en la dieta
es mucho más flexible que en otros métodos por tratarse el alimento de una solución. La
composición relativa de los nutrientes y el porcentaje de EtOH varían según la especie que
se utilice (Lieber y DeCarli, 1994), se pueden adicionar o disminuir los niveles relativos de
lípidos, glúcidos o proteínas, variar los niveles de vitaminas y/u oligoelementos, etc.
También se pueden agregar saborizantes que hagan al líquido de sabor más agradable
(palatable) para el animal y que estimulen así su consumo y contribuyan a vencer la
aversión al EtOH. Con esta dieta, en babuinos26 se puede producir hígado graso en 6-12
meses de exposición contínua (Lieber y DeCarli, 1976, 1994).
Sin embargo, este método de administración también tiene sus desventajas. Es mucho
más costoso que otros métodos. La preparación de la dieta es más engorrosa ya que hay que
prepararla cada día y a veces cada 12 horas; esto se debe a que, al ser un líquido nutritivo
y no poder ser refrigerado mientras se le ofrece a los animales, su tasa de contaminación
microbiana es muy alta y fácilmente se hecha a perder. Su implementación requiere mucho
más cuidado y atención por parte del experimentador. Si no se utilizan los dispositivos
adecuados, por su viscosidad y eventual contaminación, la misma dieta puede taponar el
26
Los babuinos, también llamados papiones, son un tipo de primates cercopitecos del género Papio de los
que hay varias especies; viven unos 30-45 años.
325
tubo dispensador y quedar el animal sin alimento y sin bebida. Si bien la vía de
administración es la oral, no es tan “fisiológica” en comparación con la realidad de los
humanos ya que, en tanto estos consumen alimentos sólidos por un lado y el EtOH en
bebidas alcohólicas por el otro, los animales expuestos a la dieta líquida no pueden desligar
el consumo de líquido del de nutrientes y se ven forzados a consumir uno y otros
conjuntamente. Cuando se introduce el EtOH en la dieta líquida, el consumo total de
nutrientes disminuye lo que obliga a realizar un adecuado apareamiento de las dietas (algo
que, por otro lado, es conveniente realizar con todos los métodos de administración del
EtOH).
* * *
Así bien, hemos visto que existen diferentes métodos de administración del EtOH. Cada
uno de ellos tiene sus propias ventajas y desventajas y la elección que se haga de ellos
dependerá de los objetivos que se han de alcanzar y de los recursos con que se cuenta.
De más está decir que también existen diferentes modelos de exposición al EtOH que
intentan mimetizar diferentes aspectos del consumo humano: el alcoholismo en sí -modelos
de preferencia, de restitución, de autoadministración crónica con fases repetidas de
deprivación, modelo del punto de no retorno- (Spanagel, 2000); el alcoholismo crónico o
agudo tipo borrachera (binge) tanto en animales neonatales, adolescentes o adultos como
prenatalmente (Rifas et al., 1997); los efectos motivacionales positivos y negativos en los
modelos de autoadministración -bebida en la jaula de alojamiento o de condicionamiento
operante- y en los modelos de condicionamiento -de lugar o de sabor- (Cunningham et al.,
2000); el modelado del ansia por el consumo (craving) de EtOH -de utilización en
humanos- (Litt y Cooney, 1999); modelado de la abstinencia postconsumo (Becker, 2000);
y muchos otros. También existen modelos de co-administración de EtOH junto con una o
más drogas, como la cocaína (Wilson et al., 2001) o la nicotina (Balogh et al., 2002;
Penland et al., 2001) por nombrar sólo los más comunes.
Los modelos animales de diversos aspectos del consumo humano son, así, muy
numerosos, y casi cada autor posee uno.
En conclusión, la elección de uno u otro método de administración y uno u otro modelo
de alcoholismo dependerá, en última instancia, de lo que se esté buscando con él y de los
recursos de que se disponga.
326
Anexo VI
Tablas de datos de los parámetros nutricionales evaluados en
los protocolos de exposición prenatal al etanol (EPE).27
Tabla 1. Valores de los parámetros nutricionales evaluados durante los períodos de tratamiento
pregestacional y gestacional en el protocolo experimental de EPE sin prevención del daño:
PERÍODO DE TRATAM IENTO
PREGESTACIONAL
(t = 43 días)
GESTACIONAL
(t = 22 días)
GRUPO DE TRATAM IENTO
PARÁMETROS MEDIDOS
P E S O D E LO S
A N IM ALE S
CONTROL
EtOH
P
CONTROL
EtOH
P
Inicial (g)
225,63 ± 16,22
219,33 ± 21,57
NS
273,9 ± 17,13
245,70 ± 26,18
NS
Final (g)
276,50 ± 18,87
245.67 ± 25,54
NS
376,8 ± 25,12
351,40 ± 39,45
NS
+50,87
26.34
-
+102,9
105.7
-
122,54%
112,00%
-
137,57%
143,02%
-
g/anim al/d
18,14 ± 4,178
13,92 ± 2,635
***
19,59 ± 2,361
16,48 ± 2,080
***
kC al/anim al/d
45,33 ± 10,45
34,8 ± 6,59
***
48,97 ± 5,902
41,20 ± 5,20
***
g/kg/d
73,71 ± 17,26
60,56 ± 12,39
***
64,28 ± 6,00
59,90 ± 6,31
*
kC al/kg/d
184,3 ± 43,14
151,4 ± 30,98
***
160,70 ± 15,01
149,70 ± 15,79
*
m l/anim al/d
35,99 ± 9,211
24,51 ± 4,775
***
38,55 ± 8,022
32,70 ± 4,774
**
146,9 ± 42,08
106,3 ± 21,56
***
126,30 ± 22,67
118,30 ± 10,37
NS
138,19%
72,36 %
-
106,76%
93,66%
-
m l/anim al/d
1,618 ± 0,3147
-
2,159 ± 0,3148
-
g/anim al/d
1,263 ± 0,2462
-
1,683 ± 0,2455
-
kC al/anim al/d
9,058 ± 1,764
-
12,09 ± 1,764
-
m l/kg/d
7,017 ± 1,423
-
7,81 ± 0,6842
-
g/kg/d
5,474 ± 1,110
-
6,092 ± 0,534
-
kC al/kg/d
39,30 ± 7,967
-
43,74 ± 3,83
-
20,61%
-
22,60%
-
D iferencia inicia/final (g)
D iferencia porcentual¶
CONSUMO
D E A LIM E N T O
CONSUMO
D E B E BID A
m l/kg/d
D iferencia porcentual
CONSUMO
DE ETANOL
†
P orcentaje del VC T ‡
INGRESO
CALÓRICO
TOTAL
kCal/animal/d
45,33 ± 10,45
43,86 ± 7,56
NS
48,97 ± 5,902
53,29 ± 6,764
*
kCal/kg/d
184,3 ± 43,14
190,7 ± 35,74
NS
160,70 ± 15,01
193,50 ± 18,74
***
¶
: Base 100 = peso inicial del m ism o grupo.
: Base 100 = grupo opuesto.
‡
: V C T : valor calórico total.
†
27
Todos los datos se informan en valores de 0 ± DE. Referencias: NS: no significativo; *:P < 0.05; **: P <
0,01; ***: P < 0,0001.
327
Tabla 2. Valores de los parámetros nutricionales evaluados durante el tratamiento gestacional en el
protocolo experimental de EPE con prevención del daño por administración de buspirona:
PERÍODO DE TRATAM IENTO GESTACIONAL
(t = 22 días)
GRUPO DE TRATAM IENTO
PARÁM ETROS M EDIDOS
P E S O D E LO S
A N IM A LE S
CS
CB
ES
EB
Inicial (g)
279,0 ± 8,48
268,8 ± 26,52
260,2 ± 32,27
231,0 ± 3,54
Final (g)
376,5 ± 30,41
377,0 ± 31,11
375,2 ± 44,66
327,6 ± 14,2
+ 97,5
+ 108,2
+ 115,0
+ 96,6
134,94%
140,25%
144,19%
141,81%
20,5 ± 2,72
18,68 ± 2,36
17,95 ± 2,14
14,84 ± 2,54
66,46 ± 6,89
62,45 ± 6,79
61,75 ± 6,28
57,11 ± 8,58
kC al/kg/d
166,1 ± 17,22
156,1 ± 16,97
154,4 ± 15,69
142,8 ± 21,46
m l/anim al/d
37,21 ± 5,25
39,89 ± 12,09
32,87 ± 5,88
32,53 ± 4,93
m l/kg/d
120,8 ± 14,05
132,7 ± 36,97
112,3 ± 13,21
121,0 ± 13,6
100,0 %
109,85 %
92,96 %
100,16 %
m l/anim al/d
2,17 ± 0,39
2,15 ± 0,33
g/anim al/d
1,71 ± 0,31
1,69 ± 0,26
kC al/anim al/d
12,1 ± 2,16
11,98 ± 1,82
m l/kg/d
7,41 ± 0,87
8,25 ± 0,9
g/kg/d
5,85 ± 0,69
6,51 ± 0,71
41,36 ± 4,86
46,03 ± 5,01
20,16 %
24,55 %
D iferencia inicia/final (g)
D iferencia porcentual
§
g/anim al/d
CONSUMO
D E A LIM E N T O
CONSUMO
D E B E BID A
g/kg/d
D iferencia porcentual ¶
CONSUMO
DE ETANOL
kC al/kg/d
P orcentaje del VC T
IN G R E S O
C ALÓ R IC O
T OT A L
†
kC al/kg/d
166,1 ± 17,22
156,1 ± 16,97
195,7 ± 19,19
188,8 ± 24,67
5,95 ± 0,37
5,858 ± 0,38
5,923 ± 0,0,39
5,677 ± 0,60
P eso de los % (g)
6,045 ± 0,44
5,969 ± 0,41
6,053 ± 0,27
5,821 ± 0,62
P eso de las & (g)
5,833 ± 0,25
5,746 ± 0,33
5,824 ± 0,47
5,506 ± 0,53
103,63 %
103,88 %
103,93 %
105,72 %
10,0 ± 7,07
13,0 ± 0,0
14,67 ± 2,08
11,67 ± 3,215
1,22 / 1,0
1,0 / 1,0
0,76 / 1,0
1,18 / 1,0
371,1 ± 5,0
401,6 ± 5,0
386,7 ± 19,2
371,9 ± 26,3
P eso global (g)
C R ÍA S
al N A C E R
R elación de peso % / &‡
C antidad por cam ada
R elación % / &
C R ÍA S adultas
§
:
:
†
:
‡
:
¶
Base
B ase
VCT:
B ase
P eso en P 88
100 = peso inicial del m ism o grupo.
100 = grupo C S .
valor calórico total.
100 = peso de las hem bras.
328
Anexo VII
Tablas de datos de los parámetros morfométricos evaluados en
los experimentos de inmunocitoquímica.28
Tabla 1. Parámetros morfológicos evaluados en los experimentos de ICQ realizados en cortes de cerebros de
ratas de edad P21 sometidos a EPE sin prevención del daño.
Grupos de tratamiento
Áreas
evaluadas
Control
EtOH
py
diferencia*
TP H
NDR
0,814821 ± 0,1615 (3)
3,891908 ± 0,8776 (6)
0,0006 / E S
NMR
1,036123 ± 0,6258 (3)
4,201338 ± 0,7399 (4)
0,0019 / M S
5-H T
NDR
0,789988 ± 0,2288 (44)
0,861953 ± 0,2240 (44)
0,1398 / N S
NMR
0,75828 ± 0,2250 (44)
0,961259 ± 0,1642 (35)
< 0,0001 / E S
5-H TT
C A 1 H ipp
0,045419 ± 0,0042 (10)
0,070449 ± 0,0086 (10)
< 0,0001 / E S
S trt
0,064007 ± 0,0166 (15)
0,083047 ± 0,0166 (15)
0,0244 / S
C xF
0,137057 ± 0,0241 (12)
0,214092 ± 0,0472 (13)
< 0,0001 / E S
GFAP
C A 1 H ipp
41,25 ± 22,66 (73)
104,88 ± 36,54 (56)
< 0,0001 / E S
S trt
115,42 ± 76,20 (66)
125,17 ± 75,19 (65)
0,4625 / N S
C xF
26,716 ± 8,77 (45)
46,67 ± 12,28 (20)
< 0,0001 / E S
S -100b
C A 1 H ipp
0,545846 ± 0,2381 (60)
0,662819 ± 0,2070 (60)
0,0048 / M S
S trt
0,762567 ± 0,2234 (44)
1,031389 ± 0,3967 (74)
< 0,0001 / E S
C xF
0,655196 ± 0,1798 (37)
0,796187 ± 0,2370 (69)
0,0021 / M S
N f-200
C A 1 H ipp
0,109472 ± 0,0246 (28)
0,139029 ± 0,0279 (32)
< 0,0001 / E S
S trt
0,164948 ± 0,0718 (31)
0,209525 ± 0,0696 (35)
0,0129 / S
C xF
0,141123 ± 0,0349 (30)
0,148725 ± 0,0300 (40)
0,3316 / N S
nN O S
C A 1 H ipp
n/d**
n/d
-
28
Todos los datos se informan en valores de 0 ± DE (n), donde n corresponde, según el caso, al número de
experimentos realizados, los campos microscópicos o el número de células evaluadas. Referencias: NS: no
significativo; S: significativo; MS: muy significativo; ES: extremadamente significativo; n/d: no detectado
329
Grupos de tratamiento
Áreas
evaluadas
Control
EtOH
py
diferencia*
S trt
1,25206 ± 0,5916 (120)
3,46686 ± 1,3956 (120)
< 0,0001 / E S
C xF
1,575554 ± 0,7858 (80)
3,895683 ± 1,3073 (90)
< 0,0001 / E S
330
Tabla 2. Parámetros morfológicos evaluados en los experimentos de ICQ realizados en cortes de cerebros de ratas
de distintas edades postnatales, sometidas a EPE con prevención del daño por administración de buspirona.
Área evaluada
y edad
postnatal
Grupos de tratamiento
CS
CB
ES
EB
5-H T
N D R P21
0,7268 ± 0,2937 (181)
0,7211 ± 0,2314 (66)
0,7109 ± 0,2539 (99)
0,944 ± 0,4725 (110)
N D R P35
0,8339 ± 0,3726 (180)
1,3090 ± 0,6048 (69)
0,6984 ± 0,2906 (124)
0,736 ± 0,3261 (114)
N D R P60
0,5771 ± 0,2625 (14)
0,6601 ± 0,2471 (65)
0,5992 ± 0,2673 (87)
0,6379 ± 0,3306 (24)
N D R P90
0,7802 ± 0,3739 (36)
0,5814 ± 0,1420 (17)
0,7975 ± 0,3245 (24)
0,4895 ± 0,2130 (26)
N M R P5
0,4560 ± 0,5279 (3)
0,7237 ± 0,0363 (76)
0,3654 ± 0,0901 (12)
0,6536 ± 0,2571 (72)
N M R P21
0,6856 ± 0,2844 (52)
0,5809 ± 0,2901 (26)
0,6351 ± 0,2584 (38)
0,6355 ± 0,2856 (49)
N M R P35
1,0240 ± 0,2857 (48)
0,9628 ± 0,2786 (42)
0,6455 ± 0,2488 (47)
0,9064 ± 0,2574 (46)
N M R P60
0,4895 ± 0,2354 (11)
0,5106 ± 0,2943 (33)
0,5401 ± 0,2745 (54)
0,5980 ± 0,6249 (34)
N M R P90
0,5798 ± 0,3048 (45)
0,7010 ± 0,3393 (50)
3,6929 ± 0,3584 (35)
0,5372 ± 0,2924 (28)
GFAP
C A 1 Hipp P 5
59,45 ± 4,011 (6)
53,15 ± 7,989 (7)
87,02 ± 10,98 (11)
58,01 ± 10,43 (10)
C A 1 Hipp P 21
71,30 ± 11,22 (11)
62,61 ± 9,732 (6)
100,5 ± 19,86 (10)
82,4 ± 10,16 (10)
C A 1 Hipp P 35
62,55 ± 11,55 (18)
67,22 ± 8,186 (16)
109,8 ± 8,592 (9)
74,31 ± 9,23 (6)
C A 1 Hipp P 60
56,76 ± 13,68 (7)
65,39 ± 11,67 (18)
99,61 ± 18,72 (9)
82,87 ± 9,487 (12)
C xF P21
92,75 ± 41,71 (14)
87,54 ± 34,95 (15)
157,8 ± 34,25 (19)
56,12 ± 22,43 (27)
C xF P35
83,15 ± 26,16 (25)
58,98 ± 21,2 (15)
262,1 ± 51,49 (20)
83,54 ± 34,53 (25)
C xF P60
249,3 ± 21,13 (16)
224,35 ± 23,0 (15)
208,6 ± 41,05 (19)
230,5 ± 37,18 (23)
S -100b
C A 1 Hipp P 5
1,230169 ± 0,1254 (12)
1,261706 ± 0,1060 (6)
1,449768 ± 0,1503 (7)
1,251831 ± 0,0956 (6)
C A 1 Hipp P 21
0,852514 ± 0,0786 (13)
0,785282 ± 0,1074 (13)
0,981884 ± 0,2434 (9)
0,719301 ± 0,0678 (9)
C A 1 Hipp P 35
0,776545 ± 0,0575 (12)
0,763052 ± 0,0840 (8)
1,004473 ± 0,1522 (15)
0,731432 ± 0,0673 (14)
C A 1 Hipp P 60
0,920032 ± 0,1342 (4)
1,092655 ± 0,2492 (10)
1,61512 ± 0,3505 (8)
1,217059 ± 0,1855 (9)
M AP -2
C A 1 Hipp P 5
0,183113 ± 0,0405 (9)
0,159163 ± 0,0346 (11)
0,103971 ± 0,0206 (21)
0,252530 ± 0,0526 (16)
C A 1 Hipp P 21
0,184044 ± 0,0331 (19)
0,192216 ± 0,0339 (16)
0,100505 ± 0,0212 (17)
0,172612 ± 0,0286 (15)
C A 1 Hipp P 35
0,191751 ± 0,0423 (19)
0,204010 ± 0,0462 (17)
0,122540 ± 0,0254 (14)
0,225270 ± 0,0360 (10)
C A 1 Hipp P 60
0,210631 ± 0,0470 (13)
0,187820 ± 0,0291 (13)
0,116075 ± 0,0258 (19)
0,246323 ± 0,0383 (14)
C A 1 Hipp P 90
0,236805 ± 0,0342 (13)
0,221908 ± 0,0410 (19)
0,122592 ± 0,0243 (19)
0,223821 ± 0,0289 (19)
C xF P21
0,169508 ± 0,0068 (7)
0,160404 ± 0,0413 (25)
0,097298 ± 0,0269 (37)
0,184044 ± 0,0267 (10)
C xF P35
0,143283 ± 0,0289 (23)
0,158749 ± 0,0315 (35)
0,066469 ± 0,0172 (26)
0,167646 ± 0,0361 (21)
C xF P60
0,167543 ± 0,0395 (28)
0,1854922 ± 0,0592 (13)
0,074279 ± 0,0260 (22)
0,156473 ± 0,0122 (18)
331
Tabla 3. Parámetros morfológicos evaluados en los experimentos de ICQ realizados en cortes de cerebros
de ratas adolescentes expuestas al EtOH y tras la abstinencia.
Área
evaluada
Grupos de tratamiento
Control
EtOH
Control/R
EtOH/R
5-H T
NDR
1,334 ± 0,63 (59)
0,944 ± 0,21 (55)
1,116 ± 0,33 (23)
1,087 ± 0,33 (26)
NMR
0,940 ± 0,23 (25)
1,006 ± 0,26 (32)
1,146 ± 0,34 (15)
1,136 ± 0,28 (36)
G FAP
C A 1 Hipp
61,76 ± 17,12 (49)
100,0 ± 29,40 (28)
62,89 ± 15,16 (47)
78,35 ± 18,33 (84)
S trt
49,96 ± 14,63 (43)
83,99 ± 21,13 (36)
48,99 ± 15,88 (27)
54,64 ± 13,23 (44)
C xF
49,26 ± 16,53 (51)
85,44 ± 22,68 (43)
46,20 ± 12,17 (36)
58,27 ± 18,69 (59)
S -100b
C A 1 Hipp
2,686 ± 1,65 (71)
1,377 ± 0,39 (66)
1,479 ± 0,46 (31)
1,672 ± 0,61 (52)
S trt
2,846 ± 1,65 (45)
1,175 ± 0,27 (61)
1,412 ± 0,41 (27)
1,223 ± 0,33 (38)
C xF
2,624 ± 1,74 (66)
1,687 ± 0,66 (54)
2,785 ± 1,78 (42)
3,399 ± 1,64 (49)
N f-200
C A 1 Hipp
0,0364 ± 0,0114 (30)
0,00659 ± 0,0028 (25)
0,03825 ± 0,0158 (41)
0,02539 ± 0,0121 (30)
S trt
0,04024 ± 0,0177 (57)
0,02021 ± 0,0126 (38)
0,05816 ± 0,026 (39)
0,06968 ± 0,046 (44)
C xF
0,04244 ± 0,0152 (62)
0,01552 ± 0,0079 (48)
0,04993 ± 0,0163 (38)
0,06663 ± 0,0266 (50)
M AP -2
C A 1 Hipp
0,155 ± 0,0256 (20)
0,0793 ± 0,015 (14)
0,1947 ± 0,0249 (10)
0,1798 ± 0,031 (11)
S trt
0,0156 ± 0,008 (22)
0,0049 ± 0,0018 (22)
0,0079 ± 0,0031 (11)
0,0096 ± 0,0041 (16)
C xF
0,0518 ± 0,019 (20)
0,0211 ± 0,0092 (20)
0,0593 ± 0,0129 (10)
0,0343 ± 0,0134 (15)
nN O S
C A 1 H ipp
n/d
n/d
n/d
n/d
S trt
1,403 ± 0,29 (27)
1,609 ± 0,94 (23)
2,412 ± 1,61 (17)
1,269 ± 0,61 (11)
C xF
1,63 ± 0,5 (28)
1,741 ± 0,62 (22)
1,593 ± 0,52 (16)
1,01 ± 0,28 (11)
332
Tabla 4. Parámetros morfológicos evaluados en los experimentos de ICQ realizados en cortes de cerebros
de ratas expuestas al EtOH durante la adultez.
Grupos de tratamiento
EtOH
py
diferencia*
0,170 ± 0,02 (30)
0,126 ± 0,019 (30)
< 0,0001 / E S
S trt
0,225799 ± 0,0130 (30)
0,163077 ± 0,0222 (30)
< 0,0001 / E S
C xF
0,201142 ± 0,0279 (30)
0,166873 ± 0,0273 (30)
< 0,0001 / E S
Área
evaluadas
Control
5-H TT
C A 1 H ipp
GFAP
C A 1 H ipp
80,96 ± 6,78 (40)
155,66 ± 21,13 (40)
< 0,0001 / E S
S trt
130,83 ± 6,81 (40)
178,04 ± 32,93 (40)
< 0,0001 / E S
C xF
102,09 ± 7,82 (40)
149,15 ± 5,86 (40)
< 0,0001 / E S
0,926 ± 0,170 (40)
1,450 ± 0,166 (40)
< 0,0001 / E S
S trt
1,28389 ± 0,0765 (40)
1,55585 ± 0,1183 (40)
< 0,0001 / E S
C xF
1,239833 ± 0,2594 (40)
1,366412 ± 0,0524 (40)
0,0034 / M S
S -100b
C A 1 H ipp
N f-200
C A 1 H ipp
0,303 ± 0,012 (30)
0,152 ± 0,024 (30)
< 0,0001 / E S
S trt
0,246263 ± 0,0605 (30)
0,206219 ± 0,0273 (30)
0, 0016 / M S
C xF
0,160163 ± 0,0385 (20)
0,135945 ± 0,0269 (20)
0,0268 / S
M AP -2
C A 1 H ipp
0,19788 ± 0,0094 (20)
0,127983 ± 0,0328 (20)
< 0,0001 / E S
S trt
n/d**
n/d
-
C xF
0,196691 ± 0,0086 (20)
0,126266 ± 0,0217 (20)
< 0,0001 / E S
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“Por tanto,¿qué es la verdad? Una multitud en movimiento de metáforas, metonimias,
antropomorfismos; en una palabra, un conjunto de relaciones humanas que, elevadas,
traspuestas y adornadas poética y retóricamente, tras largo uso el pueblo considera firmes,
canónicas y vinculantes; las verdades son ilusiones de las que se ha olvidado que lo son,
metáforas ya utilizadas que han perdido su fuerza sensible, monedas que han perdido su
imagen y que ahora entran en consideración como metal, no como tales monedas.”
Friedrich Nietzsche (1873) 1
1
Nietzsche, 1951; pág. 91.