Perfiles de transcriptoma revela la regulación transcripcional por ADN metiltransferasa inhibidor de la 5-Aza-2´-desoxicitidina que mejora la pigmentación rojo en manzanas "Granny Smith" en bolsas (Malus domestica) Resumen: El color rojo de las manzanas (Malus domestica) es un rasgo atractivo para los consumidores. El cultivar "Granny Smith" de piel verde desarrolla una pigmentación roja después del tratamiento de embolsado. La metilación del ADN juega un papel importante en varios procesos de desarrollo en las plantas. Para explorar las posibles funciones de la metilación del ADN en la pigmentación de las manzanas "Granny Smith" empaquetadas, primero analizamos el contenido de antocianina de la piel de la fruta después del tratamiento con el inhibidor de la metiltransferasa del ADN 5-aza-20-deoxycytidine (5aza-dC). Los resultados revelaron un aumento en el contenido de antocianinas en las frutas envasadas después del tratamiento con 5-aza-dC, mientras que no se detectaron antocianinas en las frutas no empaquetadas. Además, se identificaron 8482 genes expresados de manera diferencial entre los grupos tratados con 5-aza-dC y los grupos control mediante la secuenciación del ARN, incluidos los genes que codifican los factores de transcripción, las enzimas relacionadas con la acumulación de antocianinas y las metilasas. Los cambios en la expresión de estos genes pueden ser responsables de la propagación inducida por 5-aza-dC en frutos de "Granny Smith". Los hallazgos proporcionan una evidencia novedosa de la participación de la metilación del ADN en la pigmentación roja de las manzanas sin piel roja. 1. Introducción Las frutas de Apple (Malus domestica) son populares entre los consumidores y una importante fuente de nutrientes [1]. El color rojo de piel de manzana se atribuye a la presencia de antocianinas [2]. Las antocianinas constituyen una clase importante de pigmentos flonoides y representan una excelente fuente de antioxidantes que contribuyen a la salud humana [3–5]. Por lo tanto, la abundancia de antocianinas en la piel de manzana afecta la elección y comercialización de los consumidores [6]. El principal pigmento de la antocianina presente en la piel de la manzana es la cianidina 3-galactósido [7]. Los genes estructurales directamente involucrados en la biosíntesis de antocianinas en manzanas han sido bien caracterizados, e incluyen genes que codifican la fenilalanina ammonialiasa (PAL), 4-coumarato coenzima A ligasa (4CL), chalcone sintasa (CHS), chalcone isomerase (CHI), flvanona 3- hidroxilasa (F3H), dihidro avonol 4-reductasa (DFR), leucoantocianidin dioxigenasa (LDOX) y UDP-glucosa: flavonoide 3-Oglucosiltransferasa (UFGT) [8,9]. La expresión de estos genes estructurales está regulada en el nivel transcripcional por el complejo MYB-bHLH-WD40 (MBW), que incluye R2R3-MYB, componentes básicos de helix-loop-helix (bHLH) y WD40 [10,11]. Además, la biosíntesis de antocianinas está regulada por otros factores de transcripción (FT), como NAM / ATAF / CUC (NAC) y el dominio de la proteína que contiene un triptófano-arginina-lisina-tirosina (WRKY) miembros de la familia [12,13]. Actualmente, se sabe poco sobre cómo se regula la expresión de TF en el proceso de pigmentación de la piel roja en cultivares de manzanas no rojas. La metilación del ADN es una modificación epigenética prominente en los genomas de eucariotas, y se ha relacionado con el color del fruto. Por ejemplo, en dos cultivares de orquídeas de Oncidium, las diferencias en el estado de metilación del ADN afectan la pigmentación de antocianina mediada por CHS en los tejidos fl orales [14]. Además, en comparación con la pera Max Red Bartlett de piel roja (Pyrus communis), el aumento de la metilación del promotor PcMYB y la expresión reducida de PcMYB se informaron en un fenotipo de piel verde [15]. De manera similar, en las manzanas "Honeycrisp", las frutas con rayas rojas muestran niveles de metilación en general más bajos en toda la región promotora de MYB que las frutas con rayas verdes [16]. Además, el tratamiento de ensacado regula negativamente la metilación del ADN del promotor MYB, lo que da como resultado una pigmentación roja en los cultivares de manzanas sin piel roja como "Granny Smith" y "Mutsu" [17,18]. Sin embargo, los mecanismos de metilación del ADN responsables de la pigmentación de la piel roja en cultivares de manzanas no rojas no han sido bien documentados. La metilación de la citosina está regulada por las metiltransferasas del ADN (metiltransferasa (MET) y la citosina-5) -metiltransferasa (DRM) [19] y la desmetilasas (demethylase (DME) y el supresor de la rotura de genes (ROS)) [20]. La regulación adecuada de la citosina en la metilación es esencial para mantener la estructura de la cromatina y retardar la expresión génica apropiada [21,22]. La 5-aza-20desoxicitidina (5-aza-dC) es un inhibidor fuerte de la metilación del ADN que puede unirse de manera irreversible a las enzimas metiltransferasa cuando se incorpora al ADN. La exposición de las plantas a la 5-aza-dC exógena puede inducir variaciones fenotípicas al restringir la metilación del ADN. Una variedad de especies de plantas han mostrado este fenómeno, como el enanismo en el arroz (Oryza sativa) [23], la floración temprana en Arabidopsis [24] y la fresa (Fragaria vesca) [25], y el desarrollo anormal de fl ores y la morfología de la hoja en papa ( Solanum ruiz-lealii) [26]. "Granny Smith" es una manzana de piel verde, que puede tornarse de color rojo cardinal después del tratamiento de embolsado durante la maduración de la fruta en la región de la meseta de Loess de China [27,28]. En un estudio reciente, encontramos que el tratamiento con 5-aza-dC indujo la biosíntesis de antocianinas en "Granny Smith" [17]. El presente estudio se llevó a cabo para explorar más a fondo los mecanismos de la pigmentación roja en frutos empaquetados de "Granny Smith" después del tratamiento con 5-aza-dC. Se realizó un análisis de RNA-seq para comparar los transcriptomas de las pieles de “Granny Smith” con y sin tratamiento con 5-aza-dC después del empaquetamiento. Los resultados revelaron que numerosos genes se expresaban diferencialmente, incluidos los genes que codifican los FT, las enzimas relacionadas con la acumulación de antocianinas y las metilasas. Estos hallazgos proporcionan información sobre la expresión génica diferencial en la respuesta al tratamiento con 5-aza-dC (desmetilación) y mejoran nuestra comprensión de los mecanismos reguladores asociados con la pigmentación roja de las manzanas "Granny Smith" y posiblemente otras frutas no rojas. Resultados 2.1. Cambios en los patrones de pigmentación rojos en la piel de las manzanas "Granny Smith". En comparación con sus respectivas frutas de control, las frutas envasadas se volvieron de color rojo gradualmente durante el tratamiento con 5-aza-dC, mientras que las frutas no marcadas no cambiaron de color (Figura 1A). Cuando las manzanas tratadas con 5aza-dC se expusieron a la luz, el contenido de antocianinas en las cáscaras de las frutas embolsadas aumentó y fue significativamente mayor en las frutas tratadas que en las frutas de control. Sin embargo, en las frutas no marcadas, no se detectaron antocianinas en ninguno de los dos grupos durante el transcurso del tratamiento con 5-aza-dC (Figura 1B). Además, el contenido de clorofila no difirió significativamente entre los tratamientos tratados y el control de los grupos embolsados o no embolsados (Figura 1C). Los resultados sugieren que 5-aza-dC indujo la biosíntesis de antocianinas en la piel de la manzana envasada. Figura 1. Efecto del tratamiento con 5-aza-20-desoxicitidina (5-aza-dC) sobre el color de la piel y la pigmentación en manzanas "GrannySmith". (A) Cambios de colores de color. (B) Características dinámicas de la cianidina 3-galactósido y (C) diferencias en el contenido de clorofila. Las barras de error indican la desviación estándar (SD) obtenida de cuatro replicados biológicos. Diferentes letras de fondo indican una diferencia entre las diferencias entre los grupos tratados y de control de las frutas embolsadas o no empaquetadas mediante la prueba de rango múltiple de Tukey (p <0.05). 2.2. ARN-Seq y análisis de anotación de genes expresados diferencialmente (DEG) Para obtener una visión global de los mecanismos moleculares responsables de los cambios de color de la piel en manzanas en bolsas después del tratamiento con 5-aza-dC, se recogieron muestras de piel tratadas con 5-aza-dC (T) y de control (CK) 0 días después de la exposición de 5 Frutos a la luz tratados con -aza-dC (DAFT, T1 y CK1) y a 15 DAFT (T2 y CK2) para el análisis transcriptómico. En la Tabla 1 se presenta un resumen estadístico de los resultados de RNA-seq. La tasa de mapeo genómico fue mayor que 55.61%, y la tasa de mapeo genético alcanzó 50.33–64.21%. Los diagramas de Venn de todos los DEG en muestras de piel de los grupos T y CK se muestran en la Figura 2. En los grupos T, 2892 DEG fueron regulados al alza y 3688 a la baja; en los grupos CK, solo 1703 DEG estaban regulados al alza y 3462 a la baja. Por lo tanto, un mayor número de genes se alteraron en los grupos T que en los grupos CK, lo que sugiere que 5-aza-dC tuvo una gran influencia en los frutos de manzana. Tabla 1. Rendimiento y calidad de las bibliotecas de RNA-seq de genes expresados diferencialmente (DGE) de pieles de manzana "Granny Smith". CK, control; Tratamiento con T, 5-aza-20-desoxicitidina; 1-, 0 días después de la exposición de las frutas tratadas a la luz; y 2, 15 días después de la exposición de las frutas tratadas a la luz; -1 y -2 representan la replicación 1 y 2, respectivamente. Figura 2. Diagramas de Venn de todos los genes y genes expresados diferencialmente (DEG, por sus siglas en inglés) en muestras de piel entre grupos tratados con 5-aza-dC y de control de manzanas "Granny Smith" en bolsas. (A) Intersección del diagrama de Venn que muestra todos los DEG identificados en los análisis de pares (CK1 frente a CK2 y T1 frente a T2). (B, C) Intersección del diagrama de Venn que muestra los DEG regulados hacia arriba y hacia abajo entre pares, respectivamente. Se utilizaron los análisis de enriquecimiento de la vía de Ontología Genética (GO) y Enciclopedia de Genes y Genomas (KEGG) de Kyoto para identificar respectivamente los procesos biológicos y las funciones enriquecidas en DEG. Los términos biológicos de GO significativamente enriquecidos incluyeron aquellos en las categorías de actividad celular, procesos metabólicos específicos y biosíntesis, transducción de señales hormonales y respuesta al estímulo y la señalización (Figura 3). Las vías enriquecidas con KEG se relacionaron con procesos bioabéticos y biosintéticos específicos (Tabla 2). Entre estas vías, la biosíntesis de avonoides más enriquecida de manera significativa fue la sugerencia de que 5-aza-dC tuvo un efecto importante en el color de la manzana. Tabla 2. Análisis de enriquecimiento de la ruta KEGG de DEG en pieles de manzana "Granny Smith" (p <0.05). Figura 3. Grupos de términos de ontología génica anotados (GO) en la categoría de "proceso biológico" enriquecidos en 3281 DEG en pieles de manzana "Granny Smith". Los DEG se clasi fi caron en categorías específicas de “proceso biológico” utilizando DAVID. 2.3. Expresión de genes relacionados con la biosíntesis de antocianinas Con el fin de explorar el efecto de 5-aza-dC sobre la pigmentación de la piel roja en manzanas "Granny Smith", se identificaron los genes estructurales y reguladores involucrados en la biosíntesis de antocianinas (Figura 4). Niveles transcripcionales de genes estructurales, como PAL, 4CL, CHS, CHI, F3H, DFR, LDOX y UFGT, se incrementaron en respuesta al tratamiento con 5-aza-dC. En particular, niveles de transcripción de tres PALs (LOC103430265, LOC103433222, y LOC103450046), tres 4CLs (LOC103440010, LOC103426517) y LOC103427406); Tres F3Hs (LOC103406836, LOC103437875, y LOC103455413), un DFR (LOC103450464), dos LDOXs (LOC103437326 y LOC103437327) y cuatro UFGT ...... fueron significativamente regulados al alza en el grupo T2. Además, los niveles transcripcionales de genes relacionados con otras vías metabólicas fl avonoides también se incrementaron significativamente en el grupo T2, incluido un gen de la fl avonol sintasa (FLS) (LOC103410752), dos leucoanthocyanidin reductasa (LAR) genes (LOC103420366 y LOC103431832), y cuatro antocianínina ANR) genes (LOC103406204, LOC103413696, LOC103434638, y LOC103454616; Figura 4A). Además, los niveles de transcripción de siete genes MYB (LOC103444202, LOC103450804, LOC103455611, LOC103440174, y LOC103424187, Controles de administración), y siete genes de bHLH (LOC103400005, Controles de administración), y siete genes de bHLH (LOC103400005). el grupo T2, mientras que otros genes candidatos MYB, bHLH y WD40 estaban regulados al alza en el grupo T1 (Figura 4B). Figura 4. Esquema simplificado y mapa de calor de la expresión de genes relacionados con la biosíntesis de antocianinas en las pieles de manzana "Granny Smith". (A) Expresión génica estructural en pieles de manzana "Granny Smith". Las flechas de línea recta y de línea discontinua indican pasos continuos y discontinuos, respectivamente. (B) Expresión génica reguladora en las pieles de manzana "Granny Smith". Las flechas con diferentes colores indican diferentes genes reguladores. PAL, fenilalanina amoniaco liasa; 4CL, coenzima A ligasa de 4 coumarato; CHS, chalcone sintasa; CHI, chalcona isomerasa; F3H, avanona 3-hidroxilasa; DFR, dihidro fl avonol-4-reductasa; LDOX, leucoanthocyanidin dioxygenase; UFGT, UDP-glucosa: flonoides-3-O- glucosiltransferasa; FLS, fl avonol sintasa; LAR, leucoanthocyanidin reductasa; ANR, antocianidina reductasa. Los nombres de las enzimas, las identificaciones de los genes y los patrones de expresión se indican al lado de cada paso. La escala de color de la derecha representa los fragmentos transformados por registro por kilobase de la transcripción por valor de Millones (FPKM). 2.4. Los factores de transcripción se expresan diferencialmente en respuesta al tratamiento con 5-Aza-dC En nuestro estudio, se alteraron 114 TFs putativos en respuesta al tratamiento con 5-azadC y podrían regular la biosíntesis de antocianinas en frutos embolsados de "Granny Smith". En particular, tres motivos básicos de cremallera de la región / leucina (bZIP), siete dominios GATA de fi lizador de zinc (GATA), 17 NAM / ATAFs / CUCs (NACs), tres dominios similares a la proteína de unión al promotor de QUAMOSA (SPL) y 25 dominios de proteínas que contienen los motivos de triptófano-arginina-lisina-tirosina (WRKY) aumentaron significativamente en el grupo T1. mientras que dos GATA, seis NAC, dos SPL, seis WRKY y tres proteínas de la cremallera de leucina de homeodominio (ATHB, por sus siglas en inglés) estaban significativamente reguladas al alza en las frutas del grupo T2. Además, cinco bZIP, cuatro GATA, 11 NAC, dos SPL, cuatro WRKY y tres ATHB se regularon a la baja en respuesta al tratamiento con 5-aza-dC (Figura 5). 2.5. Expresión de los genes relacionados con la metilación del ADN Los niveles de expresión de los genes de la ADN metiltransferasa (MET y DRM) y de la desmetilasa (DME y ROS) se investigaron en respuesta al tratamiento con 5-aza-dC. SixMETs y dos DRMsesigni fi camente regulados a la baja en los grupos T en comparación con los grupos CK. Además, entre los genes de desmetilasa, tres DME y una ROS se indujeron ligeramente en el grupo T1 (Figura 6). Estos hallazgos sugieren que el patrón de metiloma en manzanas podría ser alterado dinámicamente por el tratamiento con 5-aza-dC. Figura 6. Representación en el mapa de calor de los patrones de expresión de los genes de metilasa en las pieles de manzana "Granny Smith". DME, desmetilasa; ROS, represorofgenesilación; DRM, ADN (citosina-5) -metiltransferasa; MET, metiltransferasa. Las columnas y filas en el mapa de calor representan muestras recolectadas en diferentes puntos de tiempo para los cuales se retiraron las bolsas. La escala de color de la derecha representa el valor de FPKM transformado por el registro. 2.6. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) Validación de DEGs Para validar la confiabilidad de los perfiles de expresión obtenidos a partir de RNA-seq, seleccionamos 13 DEGs para qRT-PCR usando cebadores específicos para con fi rmar los cambios en la expresión génica detectados en el análisis transcriptomental. Estos genes fueron PAL, CHS, CHI, F3H, LDOX, UFGT y DFR, la biosíntesis de antocianinas de allinvolvedin, WD40 y MYB1, que regulan la biosíntesis de antocianinas, y MET, DRM, DME y Tertisias asociadas con la DNAmethylation. El intercambio exacto de DDEG en varios puntos de datos varió entre los métodos RNA-seq y qPCR (Figura 7A). Sin embargo, las tendencias de expresión globales fueron muy consistentes (coeficientes de correlación de Pearson R2 = 0.8854) (Figura 7B), lo que confirma la confiabilidad de los resultados de RNA-seq. Figura 7. Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (qRT-PCR) de DEG en pieles de manzana "Granny Smith". (A) Niveles de transcripción y resultados de qRT-PCR de 13 genes seleccionados identificados en la secuenciación de ARN. El eje y izquierdo indica los datos de expresión correspondientes de RNA-seq (histograma gris). El eje y derecho muestra el nivel relativo de expresión génica medido por qRT-PCR (líneas negras). El eje x representa el tiempo (días) después del tratamiento con 5-aza-dC. Las barras representan el error estándar (SE; n = 4). (B) Comparación entre los valores log2 de las relaciones de expresión génica obtenidas a partir de los métodos RNA-seq y qRT-PCR. 3. Discusión 5-Aza-dC es un eficaz inhibidor de la metilación del ADN [21] y es una herramienta ideal para descubrir el fenómeno de la redención de fenómenos de redención. En el trabajo realizado, investigamos la formación de pigmentación roja en la piel de la manzana "Granny Smith" en bolsas después del tratamiento con 5-aza-dC. Por lo que sabemos, este es el primer informe sobre los efectos de 5-aza-dC en la pigmentación de las manzanas basada en la secuenciación de transcriptomas. 3.1. La 5-aza-dC afecta la acumulación de antocianinas en la piel de las manzanas "Granny Smith" Después del tratamiento con 5-aza-dC, el contenido de antocianinas en la piel de manzana aumentó notablemente (Figura 1B), lo que sugiere que la pigmentación roja aumentada se atribuyó a la antocianina contenido. En particular, la transcripción de genes implicados en la vía de biosíntesis de antocianinas aumentó sustancialmente en la piel de la fruta después del tratamiento con 5-aza-dC (Figura 4). Esto indica que 5-aza-dC promueve la biosíntesis de antocianinas en manzanas "Granny Smith" después de retirarse de las bolsas. Además, el análisis de la ruta de KEGG reveló que la biosíntesis de flonoides más enriquecida de manera significativa (Tabla 2) sugiere que 5-aza-dC tuvo un efecto importante en el color de la manzana. La biosíntesis de las antocianinas suele estar regulada por diversos FT, especialmente el complejo MBW [29]. Anteriormente, se descubrió que MYB era un regulador crucial de la acumulación de antocianinas y de la pigmentación de la fruta en las manzanas [30,31]. En el presente estudio, se identificaron 28 R2R3-MYB TF en muestras de piel de manzanas “Granny Smith” envasadas después del tratamiento con 5-aza-dC, siete de las cuales estaban significativamente aumentadas en la transcripción en el grupo T2, correspondiente a genes estructurales relacionados con la antocianina. Biosíntesis (Figura 4). Estos resultados indican que estos MYB podrían ser reguladores cruciales en la acumulación de antocianinas en "Granny Smith" en bolsas después del tratamiento con 5-aza-dC. Además, se encontró que la coexpresión de MYB y bHLH activa la expresión de DFR y UFGT, lo que lleva a la acumulación de antocianinas en la nectarina (Prunus persica) [32]. En nuestro estudio, siete genes bHLH estaban significativamente regulados al alza en el grupo T2, mientras que la expresión de otros genes bHLH estaba regulada al alza en el grupo T1 de manzanas "Granny Smith" después del tratamiento con 5-aza-dC (Figura 4B). Estos resultados sugieren que la familia bHLH participa en la síntesis de antocianinas inducida por 5-aza-dC a través de los diferentes patrones de expresión. 3.2. Regulación epigenética de MYB en manzanas "Granny Smith" después del tratamiento con 5-Aza-dC La interrupción de la acumulación de antocianinas se ha relacionado con cambios en la metilación o desmetilación del ADN en el promotor del regulador maestro de antocianinas MYB [15,16,31]. En comparación con "Honeycrisp" y "Royal Gala" [16], las diferencias en los niveles de metilación entre el control y las frutas tratadas con 5-azadC fueron más evidentes en "Granny Smith" [17], que refleja el sorprendente contraste en la pigmentación entre dos frutos (es decir, una pérdida casi completa de antocianinas en los frutos de control frente a la pigmentación roja en los frutos tratados con 5-aza-dC). Los tres tipos de citosina (CG, CHG y CHH) en la región de −1898 a −1633 pb del promotor MYB (LOC103444202) mostraron niveles de metilación más altos en las pieles de manzana "Granny Smith" después de 5-aza-dCtreatment (SupplementaryFigureS1). De manera similar, la metilación de la miel ha sido observada en los tipos de citosina que se encuentran en el pompón de PCMYBinpears [15]. En la región de −2026 a −1870b, la metilación de dos tipos de citosina (CHH y CHG) en las pieles de frutas fue dramáticamente más baja en los primeros grupos que en los últimos, pero la CG no fue significativamente diferente entre las frutas tratadas con 5-aza-dC y las frutas de control (Figura 1) . Este patrón de metilación en el − 2026 al − 1870bpregionparece aparentemente, aunque no único. Sincethe − 2026to − 1870bpregionislocatedfurtherupstreamthanthe − 1898 to − 1633 bp region, y como la metilación en la región − 2026 to − 1870 bp se encuentra en un lugar del mismo nombre, se encuentra en un lugar en el mismo Tal trabajo ilustrará aún más el papel epigenético de este tipo de regulación de MYB en manzanas. 4. Materiales y Métodos. 4.1. Materiales vegetales y tratamientos experimentales Se recolectaron frutos de la cultivadora "Granny Smith" en la Estación Experimental de Manzanas Baishui, Northwest A & F University (35◦210 N, 109◦550 E, elevación 850 m; Yangling, China). Los árboles se injertaron en el rizoma M26 (M. domestica) y se plantaron a una densidad de 4 m × 2 m. Las frutas jóvenes se envolvieron con bolsas de papel de dos capas (interior rojo, exterior marrón; Hong Tai, Xi’an, China) 40 días después de la plena floración. Antes del día de la cosecha comercial, los papeles externos se retiraron a los 160 días después de la plena floración. Para proteger las frutas embolsadas de las quemaduras solares, los papeles internos se retiraron dos días después de los papeles externos. Las frutas sin el tratamiento de embolsado (frutas no empaquetadas) se utilizaron como controles para la comparación. El tratamiento de 5aza-dC se aplicó de acuerdo con Ma et al. [17]. En pocas palabras, todas las frutas se dividieron en dos grupos y un grupo se untó con 5-aza-dC 1 mM (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) Más 0,1% (v / v) de Tween-20. El otro grupo sirvió como control y se trató de manera simulada con un volumen igual de agua destilada estéril. Se guardaron todas las frutas en la cámara (25 ° C) durante 24 horas expuestas a la luz blanca (540 µmol · m − 2 · s − 1) a 25 ° C con un fotoperíodo de 16 h. El experimento de 5-aza-dC se realizó antes del anochecer, alternando cada día hasta que se completó. Las pieles de manzana fueron cuidadosamente cosechadas en seis puntos de tiempo; 0, 2, 4, 6, 9 y 15 días después de la exposición de frutas tratadas con 5-aza-dC a la luz (días después del tratamiento con 5-aza-dC, DAFT). La piel de la fruta (~ 1 mm de grosor) se recolectó utilizando un pelador de manzanas de acuerdo con el método descrito por Qu et al. [39]. Las pieles de muestras candidatas a 0 y 15 DAFT se sometieron a secuenciación de transcriptoma y análisis de expresión. Todas las pieles se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. 4.2. Medición del contenido de antocianinas y clorofila La medición del contenido de antocianinas se realizó como se describió anteriormente [40]. Aproximadamente 0,5 g de piel de manzana se molieron finamente en 5 ml de HClmetanol al 1% (v / v) durante 24 horas a 4 ° C en la oscuridad y se centrifugaron a 13.000 × g durante 10 minutos a 4 ° C. El análisis se llevó a cabo en un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) equipado con un detector de matriz de fotodiodos (PDA) (Waters, Milford, MA, EE. UU.). La separación de los cocinas se completó en una columna de 18 columnas (5 µ, 250 mm × 4,6 min. Calderiamina, EE. UU.) Con cicidina3galactosideasastandard (sigma). La clorofila se extrajo con acetona al 80% y el contenido se determinó en un espectrofotómetro ultravioleta UV-2550 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japón) de acuerdo con lo descrito anteriormente [41]. Se realizaron cuatro réplicas biológicas independientes para cada experimento. Los datos se expresan como medias ± desviación estándar y se evaluaron mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de las pruebas de Tukey (p <0.05) utilizando el software SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.) 4.3. Extracción de ARN, preparación de biblioteca y RNA-Seq Para garantizar la confiabilidad de los datos, se secuenciaron dos muestras de cada tipo de piel. El ARN total de las muestras por triplicado se extrajo utilizando el reactivo de ARN más TRIzol (Tiangen, Beijing, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La calidad del ARN se evaluó en un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.). Se utilizaron muestras con un número de integridad de ARN (RIN)> 7.5 para la secuenciación profunda. El ARNm total se enriqueció y se dividió en trozos pequeños para usar como plantillas para la síntesis de ADNc, y los fragmentos de ADN se produjeron con un kit de extracción QiaQuick PCR (Qiagen, Venlo, Países Bajos), se repararon en el extremo, se aplicaron en poli (A) y se ligaron a los adaptadores de secuenciación de Illumina. Después de la electroforesis en gel de agarosa, se usaron productos adecuados como plantillas para la amplificación por PCR, y la biblioteca resultante se secuenció usando un Illumina HiSeqTM 2500 de Gene Denovo Biotechnology Co. (Guangzhou, China). En total, se obtuvieron cuatro series de lecturas en bruto, correspondientes a los tratamientos a 0 DAFT (T1) y 15 DAFT (T2), y los controles a 0 DAFT (CK1) y 15 DAFT (CK2). 4.4. Gene Denovo Biotechnology Co., Ltd realizó el procesamiento de datos de RNASeq y el mapeo de lecturas en el genoma de Apple. (Guangzhou, China). Para obtener lecturas limpias de alta calidad, las lecturas sin procesar se filtraron aún más mediante la eliminación de secuencias adaptadoras, secuencias de lectura de poli-N y secuencias de baja calidad. Todas las lecturas limpias se mapearon en el genoma de la manzana (M.domestica) [42] utilizando SOA-Paligner / soap2 [43]. Cleanread se rediseñó con el genoma de referencia y las transcripciones se reconstruyeron con iones de Cuf [44]. 4.5. Análisis de datos de RNA-Seq Se utilizó para el análisis estadístico la exactitud de los datos de control, y solo las lecturas restantes de alta calidad (lecturas limpias) se usaron para el análisis estadístico. El nivel de expresión génica se calculó utilizando el método de lecturas mapeadas Fragmentos por kilobase de transcripción por millón (FPKM) [45]. Los DEG entre los grupos tratados con 5-aza-dC y los grupos de control se identificaron en los dos puntos temporales diferentes. Los valores de p iniciales se ajustaron utilizando el enfoque de Benjamini y Hochberg [46] para minimizar la tasa de descubrimiento falso (FDR). Los DEG se asignaron si el cambio de pliegue era ≥2 y el FDR era <0.05. La anotación funcional de los DEG se realizó como se describió anteriormente [47].4.5. Análisis de datos de RNA-Seq Se utilizó para el análisis estadístico la exactitud de los datos de control, y solo las lecturas restantes de alta calidad (lecturas limpias) se usaron para el análisis estadístico. El nivel de expresión génica se calculó utilizando el método de lecturas mapeadas Fragmentos por kilobase de transcripción por millón (FPKM) [45]. Los DEG entre los grupos tratados con 5-aza-dC y los grupos de control se identificaron en los dos puntos temporales diferentes. Los valores de p iniciales se ajustaron utilizando el enfoque de Benjamini y Hochberg [46] para minimizar la tasa de descubrimiento falso (FDR). Los DEG se asignaron si el cambio de pliegue era ≥2 y el FDR era <0.05. La anotación funcional de los DEG se realizó como se describió anteriormente [47]. Los DEG se sometieron a análisis de enriquecimiento de la vía de Ontología de genes (GO) y Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG). Para el análisis de enriquecimiento de GO, todos los DEG se asignaron a la base de datos de GO (disponible en línea: http://www.geneontology.org/), yDAVID(availaonline: https://david.ncifcrf.gov/) se usó para identificar las funciones biológicas principales [48]. El análisis de enriquecimiento de la ruta KEGG se realizó utilizando la base de datos apropiada (disponible en línea: http://www.genome.jp/kegg/) para revelar rutas metabólicas y de transducción de señales significativamente enriquecidas [49]. Significativo GO / KEGG enriquecimiento de DEGs en comparación con el fondo del genoma fue de fi nido mediante pruebas hipergeométricas. Los valores p calculados se sometieron a una corrección FDR utilizando FDR ≤0.05 como umbral. 4.6. Validación de los RT-qPCR Los ARN totales se transcribieron de forma inversa a los ADNc utilizando un kit de mezcla maestra PrimeScript (TaKaRa, Dalian, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. La amplificación y el análisis de PCR en tiempo real se realizaron en un instrumento iQ5.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) Utilizando un kit de Taqa Premix Ex Taq (TaKaRa) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó un programa de dos pasos, con un arranque en caliente inicial a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 sy 60 ° C durante 34 s. Las curvas de fusión se generaron utilizando el siguiente programa: 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min y 95 ° C durante 15 s. El gen de actina (GenBank: GQ339778.1) se utilizó como control interno para la normalización. Los cebadores específicos se diseñaron utilizando el software Primer 5, y la información se detalla en la Tabla S1. Los datos fueron analizados según el método 2−∆∆CT - [50]. Cada reacción se realizó por cuadruplicado. Las diferencias entre los medios se analizaron utilizando ANOVA de una vía seguido de pruebas post-hoc de Tukey (p <0.05). Un valor de p <0,05 indicó una diferencia significativa. 4.7. Accesibilidad de datos Los datos de secuenciación se han depositado en el repositorio del Archivo de Lectura de Secuencias NCBI con los números de acceso SAMN07972616, SAMN07972617, SAMN07972618, SAMN07972619, SAMN07972620, SAMN07972620, artículos de los que se trata en las partes de la red, en los que se realizan las actividades. / bioproject / 416952), que se lanzará el 31 de diciembre de 2018. 5. Conclusiones En este estudio, el tratamiento con 5-aza-dC mejoró la pigmentación roja en frutas en bolsas de manzanas "Granny Smith". La secuenciación de ARN reveló un total de 8482 DEG entre los grupos tratados con 5-aza-dC y los grupos de control de frutas envasadas. Después del tratamiento con 5-aza-dC, casi todos los genes estructurales y reguladores, como CHS, CHI, F3H, DFR, LDOX, UFGT, MYBandbHLH implicados en la vía biosintética de la tianocianina, fueron regulados al alza. Además, bZIP, GATA, NAC, SPL, WRKY y ATHB tenían más probabilidades de tener una conexión estrecha con la pigmentación roja en las frutas envasadas después del tratamiento con 5-aza-dC. Además, los MET, los DRM, los DME y los ROS pueden participar en la pigmentación roja inducida por 5-aza-dC a través de diferentes patrones de expresión. Concusiones En este estudio, el tratamiento con 5-aza-dC mejoró la pigmentación roja en frutas envasadas de manzanas "Granny Smith". La secuenciación de ARN reveló un total de 8482 DEG entre los grupos tratados con 5-aza-dC y los grupos de control de frutas envasadas. Después del tratamiento con 5-aza-dC, casi todos los genes estructurales y reguladores, tales como CHS, CHI, F3H, DFR, LDOX, UFGT, MYBandbHLH involucrados en la vía biosintética de la antocianina se incrementaron. Además, bZIP, GATA, NAC, SPL, WRKY y ATHB tenían más probabilidades de tener una conexión estrecha con la pigmentación roja en las frutas envasadas después del tratamiento con 5-aza-dC. Además, los MET, los DRM, los DME y los ROS pueden participar en la pigmentación roja inducida por 5-aza-dC a través de diferentes patrones de expresión. Los datos del transcriptoma y los DEG proporcionan información valiosa para desentrañar los mecanismos reguladores de la pigmentación roja inducida por 5-aza-dC en frutas en bolsas de manzanas "Granny Smith" y posiblemente otras frutas de manzanas que no son rojas.
