MANUAL DE PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDAR DEL LABORATORIO DE MICOLOGIA
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APOE GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES MANUAL DE PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDAR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 HOSPITALES DE LA RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDAR DEL LABORATORIO DE MICOLOGIA RED DE MICOLOGIA GCBA Elaborado por: Dra. S. Cataldi, L. Guelfand, M. Perrone Fecha: mayo 2008 Versión original Revisado por: Dra. Alicia Arechavala, L. López Moral Fecha: junio 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: APOE GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES MANUAL DE PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDAR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 HOSPITALES DE LA RED DE MICOLOGIA PRÓLOGO El objetivo de este manual es normalizar de una manera clara y sencilla los procesos que se realizan en el Área de Micología y que puedan ser interpretados por profesionales capacitados de la especialidad, para permitir la resolución del trabajo diario del Sector. Por último, la finalidad principal es implementar un Sistema de Gestión de Calidad basado en Normas ISO 9000:2000 teniendo como objetivo principal la mejora continua de los procesos, tratando de lograr la máxima satisfacción de los usuarios de la Red de Micología y otras partes relacionadas. APOE GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES MANUAL DE PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDAR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 HOSPITALES DE LA RED DE MICOLOGIA CONTENIDO PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA EXAMEN MICOLÓGICO DE: 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 PIEL CUERO CABELLUDO UÑAS MUESTRAS RESPIRATORIAS ORINAS MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS SANGRE MÉDULA ÓSEA LIQUIDOS DE PUNCIÓN LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO INMUNODIAGNÓSTICO PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTIFÚNGICA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL APOE- P Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 HOSPITAL.:.................... 1. OBJETIVOS: Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras superficiales de piel 2. ALCANCE: Todas las muestras de piel extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico presuntivo de micosis superficiales de las lesiones de piel. 3. PERSONAL AFECTADO: Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA Micología, 4. REFERENCIAS: Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial Interamericana, 3a edición, México, 2008 Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999 Guía Práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica, Pemán J. , Martín Mazuelos E., Rubio Calvo M.C., 1ª ed. Revista Iberoamericana de Micología, 2001, Bilbao, España 5. DEFINICIONES: Elaborado por: S.Cataldi, M.Carmen Perrone,L.Guelfand Fecha: 8 de enero 2008 Versión Original Revisado: L.L Moral, I.Maldonado Fecha: julio 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: agosto 2011 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL APOE- P Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 2 de 8 HOSPITAL.:.................... Etapa Pre- Analítica PAMR: Manual de Medios y Reactivos PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras Etapa Analítica AMID: Manual de Identificación 01. Dermatofitos 02. Levaduras 03. No Dermatofitos 04. Levaduras Lipofílicas APOE: Manual de procedimiento Operativo Etapa Post- Analítica PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad ANEXOS PLANILLAS 6. RESPONSABILIDADES: Jefe de Sector ó Sección Microbiología / Micología, Bioquímicos a cargo del área Micología 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO El diagnóstico de las micosis superficiales se basa en el hallazgo de hifas o levaduras características, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos. 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Microscopio con objetivos de 10x, 40x y 100x (inmersión) Heladera 2- 8 º C MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL APOE- P Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 3 de 8 HOSPITAL.:.................... Estufa de cultivo a 35- 37 ºC Estufa de cultivo a 28 ºC Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos Cubreobjetos Hojas de bisturí descartables estériles y/o sindesmótomos estériles Cinta adhesiva transparente Ansa bacteriológica Gancho en L Agujas de disección Guantes de látex descartables Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol (SAB+C) Agar Miel Sabouraud (SAB-M) con cloranfenicol (SAB+C) Agar lactrimel con cloranfenicol (LAC) Agar Dermatophyte Test Medium (DTM) Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y cicloheximida (SAB+C+A) Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y aceite de oliva (SAO) Agar Bilis de Buey (ABB) Agar Dixon (ADX) Agar Danker (ADK) 7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRA A ANALIZAR: Escamas de piel recolectadas en forma estéril 7.5 SECUENCIA OPERATIVA: 7.5.1 Precauciones de seguridad: Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) 7.5.2 Procesamiento de la muestra: MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL APOE- P Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 4 de 8 HOSPITAL.:.................... A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada Laboratorio. La muestra obtenida se destinará una parte para el examen directo microscópico, otra para el cultivo y de ser posible reservar material para confirmar -si hiciera falta- el resultado del examen directo. a) Examen microscópico directo: para aclarar la capa córnea de la piel es indispensable recurrir a diversas soluciones que disuelve la queratina sin afectar la morfología de los elementos fúngicos. Las más comunes son las de hidróxido de potasio (KOH) en concentraciones del 10% al 40%, solo o con tinta azul negra permanente de PARKER, KOH con dimetilsulfóxido o blanco calcoflúor para muestras poco parasitadas. Ver (PAMR). Si se emplea KOH, suspender las escamas en una gota del mismo con o sin tinta Parker, cubrir con un cubreobjetos, calentar en la llama del mechero, (evitando llegar a ebullición y formación de burbujas en el preparado), enfriar rápidamente sobre la mesada. Si las escamas fueron obtenidas con cinta adhesiva transparente, colocar una gota de la mezcla KOH y tinta azul Parker para que penetre por capilaridad entre la cinta y el portaobjetos. Para determinar la presencia de bacterias filamentosas que parasitan la piel, se pueden realizar preparaciones teñidas. Para ello, una vez examinada la preparación con KOH sacar el cubreobjetos y resuspender las escamas digeridas en agua destilada, luego colocar la suspensión en un tubo cónico y centrifugar a 2000r.p.m. durante 5 minutos, volcar el sobrenadante y tomar con una pipeta Pasteur el precipitado para realizar un extendido sobre portaobjeto. Dejar secar y luego fijar y teñir con Giemsa al 10%, 30 minutos o con Azul de metileno al 1% durante 5 minutos. b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la realización de los cultivos en medios sólidos. Se sugieren dos o tres medios: (SA B+C), (LAC), (ABAL), (DTM), con y sin cicloheximida (Ver PAMR). Cuando se sospecha pitiriasis versicolor, se debe sembrar el material en medios ricos en lípidos (ácidos grasos de cadena larga) como el Medio de Dixon (ADX), en su defecto Agar miel Sabouraud con el agregado de aceite de oliva estéril (al 2%) (SAO), Medio de Danker (ADK), Agar Sabouraud con bilis de buey (ABB). MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL APOE- P Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 5 de 8 HOSPITAL.:.................... Para sembrar el material, se deben fragmentar las escamas lo más posible, para inocularlas en la superficie del medio de cultivo con un gancho metálico fino, esterilizado a la llama y enfriado en la superficie del agar. Si se emplean tubos, efectuar tres toques en el medio separados por lo menos por 1 cm de distancia entre ellos. Emplear dos o tres tubos con los medios de cultivo elegidos. La incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente o en estufas reguladas a 25º ó 28º C. Si de acuerdo a los datos epidemiológicos del paciente se sospecha Trichophyton verrucosum se deberá incubar a 37º C uno de los tubos sembrados. Cuando se siembran medios para búsqueda de Malassezia spp, se incubarán de 32 a 35 º C durante 7 días en aerobiosis. Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar las tres semanas de incubación. 7.5.3 Resultados: a) Examen directo: Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos” o “Negativo” Si hubo hallazgo se informa según el caso: “Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas”. “ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características compatibles con de dermatofitos” “ Se observan elementos levaduriformes y/o seudohifas” “Se observan levaduras y filamentos cortos característicos de “Malassezia spp” b) Cultivos: Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se descartan los cultivos y se informan “No se obtuvo desarrollo de hongos” o “Cultivo Negativo para hongos” MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL APOE- P Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 6 de 8 HOSPITAL.:.................... Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID) correspondiente a cada caso : POE Identificación Levaduras (AMID02), POE Identificación Dermatofitos (AMID01), POE Identificación no Dermatofitos (AMID03), POE Identificación Levaduras Lipofílicas (AMID04) c) Interpretación: Examen directo Negativo Positivo Negativo Cultivo Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo para levaduras Jerarquizar Si Si Sólo si se aísla dermatofito Si hay desarrollo en los 3 puntos de siembra y compatibilidad con las características clínicas. d) Tiempo de entrega : El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas El cultivo debe entregarse entre los 20 y 30 días. 8. FORMULARIOS Y REGISTROS: Registro de pacientes: General del Laboratorio (libro, informático, etc) Libro interno de Micología Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red Informes: Protocolo resultado de Micosis Superficiales Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red 9. DOCUMENTOS ASOCIADOS: MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL APOE- P Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 7 de 8 HOSPITAL.:.................... PA ( Manual de Procedimiento Pre- analítico) PAMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos) AMID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica ) MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad) 10. ANEXOS Flujograma Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO: Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la piel desde 3 días anteriores a la toma de muestra. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL APOE- P Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 8 de 8 APOE-CC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE CUERO CABELLUDO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 7 1. OBJETIVOS: Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras de cuero cabelludo. 2. ALCANCE: Todas las muestras de cuero cabelludo extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico presuntivo de micosis. 3. PERSONAL AFECTADO: Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología, pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA 4. REFERENCIAS: Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial Interamericana, 3ra edición, México, 2008 Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Prov. de Bs. As. Argentina, 1999 5. DEFINICIONES: Etapa Pre- Analítica PAMR: Manual de Medios y Reactivos PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras Elaborado por: S.Cataldi, M.C.Perrone , L.Guelfand Fecha: 8 de febrero 2008 Versión Original Revisado: S.Cataldi,L.L.Moral,I Maldonado, L.Guelfand Fecha: julio 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: agosto 2011 APOE-CC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE CUERO CABELLUDO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 2 de 7 Etapa Analítica AMID: Manual de Identificación 01 Dermatofitos 04 Levaduras Lipofílicas APOE: Manual de procedimiento Operativo Etapa Post- Analítica PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad 6. RESPONSABILIDADES: Jefe de Sector ó Sección Microbiología/ Micología, Bioquímicos a cargo del área Micología 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO El diagnóstico de las micosis superficiales de cuero cabelludo se basa en el hallazgo de hifas o levaduras características del género Malassezia, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos. 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión) Heladera 2- 8º C Estufa de cultivo a 30 a 34 ºC (para Malassezia) Estufa de cultivo a 28 ºC Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos Cubreobjetos Hojas de bisturí descartables estériles y/o sindesmótomos estériles Pinza de depilar Ansa bacteriológica APOE-CC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE CUERO CABELLUDO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 3 de 7 Gancho en L Agujas de disección Guantes de látex descartables Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol u otro antibiótico o Agar lactrimel con cloranfenicol Agar Dermatophyte Test Médium o Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y cicloheximida Agar Dixon Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y aceite de oliva (SAO) Agar Bilis de Buey (ABB) Agar Danker (ADK) 7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRA A ANALIZAR: Escamas de cuero cabelludo y pelos arrancados de raíz, recolectadas en forma estéril 7.5 SECUENCIA OPERATIVA: Precauciones de seguridad: Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) Procesamiento de la muestra: A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada Laboratorio. De la muestra obtenida se destinará una parte para el examen directo microscópico, otra para el cultivo y de ser posible reservar material para confirmar -si hiciera falta- el resultado del examen directo. a) Examen directo microscópico: para aclarar la capa córnea del cuero cabelludo, es indispensable recurrir a diversas soluciones que disuelve la queratina sin afectar la morfología de los elementos fúngicos. Las más comunes son las de hidróxido de potasio (KOH) APOE-CC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE CUERO CABELLUDO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 4 de 7 en concentraciones del 10% al 40%, solo o con tinta azul negra permanente de PARKER, KOH con dimetilsulfóxido o blanco de calcoflúor para muestras poco parasitadas. Ver (PRMR). Si se emplea KOH, suspender las escamas en una gota del mismo con o sin tinta Parker, cubrir con un cubreobjeto, calentar en la llama del mechero, (evitando llegar a ebullición y formación de burbujas de aire en el preparado), enfriar rápidamente sobre la mesada. b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la realización de los cultivos en medios sólidos. Se sugieren dos o tres medios: Sabouraud – miel, Lactrimel, Dermatofitos medios: con y sin cicloheximida (Ver PAMR). Cuando se sospecha dermatitis seborreica, se debe sembrar el material en medios ricos en lípidos (ácidos grasos de cadena larga) como el Medio de Dixon, o en su defecto agar miel Sabouraud con el agregado de aceite de oliva estéril (al 2%) (SAO), Medio de Danker (ADK), medio de Dixon (ADX) ó agar Sabouraud con bilis de buey (ABB). Para sembrar el material, se deben fragmentar las escamas lo más posible, para inocularlas a la superficie del medio de cultivo con un gancho metálico fino, esterilizado a la llama y enfriado en la superficie del agar. Si se emplean tubos, efectuar tres toques en el medio separados por lo menos por 1 cm de distancia entre ellos. Emplear dos o tres tubos con los medios de cultivo elegidos. La incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente o en estufas reguladas a 25º ó 28º C. Si de acuerdo a los datos epidemiológicos del paciente se sospecha Trichophyton verrucosum se deberá incubar a 37 º C uno de los tubos sembrados. Cuando se siembran medios para búsqueda de Malassezia spp, se incubarán de 32 a 35 º C durante 7 días en aerobiosis. Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar las 3 semanas de incubación. RESULTADOS: a) Examen directo: Si no hubo hallazgo se informa: • “ No se observan elementos micóticos” APOE-CC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE CUERO CABELLUDO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 5 de 7 Si hubo hallazgo se informa según el caso: “Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas. “Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características de dermatofitos” “Se observan levaduras compatibles con “ Malassezia spp” "Se observa pelo endothrix" (cadenas de artrosporos dentro del tallo piloso) "Se observa pelo ectothrix" (vaina de esporas en mosaico o cadenas de artrosporos por fuera del tallo del pelo) "Se observa pelo endo-ectothrix" (cadenas de artrosporos dentro y fuera del tallo piloso) “Se observa pelo fávico” (hifas y burbujas de aire dentro del tallo del pelo) b) Cultivo: Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se descartan los cultivos y se informan “No se obtuvo desarrollo de hongos” o “Cultivo negativo para hongos” Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID) correspondiente a cada caso: POE Identificación Dermatofitos (AMID01), POE Identificación filamentosos (AMID04), POE Identificación Levaduras Lipofílicas (AMID03) c) Interpretación: Examen directo Negativo Positivo Negativo Cultivo Negativo Negativo Positivo Jerarquizar Si Si Sólo si se aísla dermatofito d) Tiempo de entrega : El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas o junto con el cultivo El cultivo debe entregarse entre los 20 y 30 días. APOE-CC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE CUERO CABELLUDO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 6 de 7 8. FORMULARIOS Y REGISTROS: Registro de pacientes: General del Laboratorio (libro, informático, etc.) Libro interno de Micología Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red Informes: Protocolo resultado de Micosis Superficiales Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red 9. DOCUMENTOS ASOCIADOS: PA ( Manual de Procedimiento Pre- analítico) PAMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos) AMID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica ) MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad) 10. ANEXOS Flujograma Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO: Cuando el paciente no suspendió la medicación antifúngica sistémica (de 10 a 15 días) o local (de 3 a 5 días) los días anteriores a la toma de muestra. Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre el cuero cabelludo durante los 3 días anteriores a la toma de muestra. APOE-CC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE CUERO CABELLUDO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 7 de 7 APOE- UN MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE UÑAS Fecha: julio 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 HOSPITAL.:.................... 1. OBJETIVOS: Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras superficiales de uñas. 2. ALCANCE: Todas las muestras de uñas extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico presuntivo. 3. PERSONAL AFECTADO: Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA Micología, 4. REFERENCIAS: Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial Interamericana, 3 a edición, México, 2008 Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999 5. DEFINICIONES: Etapa Pre- Analítica PAMR: Manual de Medios y Reactivos PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras Elaborado por: S.Cataldi, M.C Perrone, L.Guelfand Fecha: 6 de marzo 2008 Versión Original Revisado: ,L.L.Moral, I.Maldonado Fecha: julio 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: julio de 2011 APOE- UN MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE UÑAS Fecha: julio 2011 Versión: 2 Página 2 de 8 HOSPITAL.:.................... Etapa Analítica AMID: Manual de Identificación 01. Dermatofitos 02. Levaduras 03. Hongos Filamentosos APOE: Manual de procedimientos operativos Estándar Etapa Post- Analítica PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad MA: Manual Administrativo ANEXOS PLANILLAS 6. RESPONSABILIDADES: Jefe de Sección Microbiología, Bioquímico a cargo del área Micología 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO El diagnóstico de las micosis superficiales de uñas se basa en el hallazgo de hifas o levaduras características, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos. 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión) Heladera 2- 8º C Estufa de cultivo a 35- 37ºC Estufa de cultivo a 28ºC Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos APOE- UN MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE UÑAS Fecha: julio 2011 Versión: 2 Página 3 de 8 HOSPITAL.:.................... Portaobjetos de vidrio Cubreobjetos de vidrio Hojas de Bisturí descartables estériles o sindesmótomo estéril Ansa bacteriológica Gancho en L Aguja de disección Guantes de látex descartables Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol Agar lactrimel con cloranfenicol Agar Dermatophyte Test Medium Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y actidiona Agar Miel Sabouraud 7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRA A ANALIZAR: Escamas de uñas recolectadas en forma estéril. 7.5 SECUENCIA OPERATIVA: PRECAUCIONES DE SEGURIDAD: Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada Laboratorio. La muestra obtenida se destinará una parte para el examen directo microscópico, otra para el cultivo y de ser posible reservar material para confirmar si hiciera falta el examen directo. APOE- UN MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE UÑAS Fecha: julio 2011 Versión: 2 Página 4 de 8 HOSPITAL.:.................... a) Examen directo microscópico: para aclarar la estructura córnea de la uña es indispensable recurrir a diversas soluciones que disuelve la queratina sin afectar la morfología de los elementos fúngicos. Las más comunes son las de hidróxido de potasio (KOH) en concentraciones del 10% al 40%, con tinta azul negra permanente de PARKER, KOH con dimetilsulfóxido o blanco calcoflúor para muestras poco parasitadas . Ver (PAMR). Si se emplea KOH, suspender las escamas en una gota del mismo con o sin tinta Parker, cubrir con un cubreobjeto, calentar en la llama del mechero, (evitando llegar a ebullición y formación de burbujas de aire en el preparado) enfriando rápidamente sobre la mesada. b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la realización de los cultivos en medios sólidos. Se sugieren dos o tres medios: Sabouraud- miel, lactrimel, Agar banana- avena, Dermatofitos medio con y sin actidiona (Ver PAMR). Para sembrar el material, se deben fragmentar las escamas lo más posible, para inocularlas a la superficie del medio de cultivo con un gancho metálico fino, esterilizado a la llama y enfriado en la superficie del agar. Si se emplean tubos, efectuar tres toques en el medio separados por lo menos por 1 cm de distancia entre ellos. Emplear dos o tres tubos con los medios de cultivo elegidos. La incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente o en estufas reguladas a 25º ó 28º C. Si de acuerdo a los datos epidemiológicos del paciente se sospecha Trichophyton verrucosum se deberá incubar a 37º C uno de los tubos sembrados. Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar las tres semanas de incubación. RESULTADOS: a) Examen directo: Es conveniente entregar este resultado dentro de las 48 horas. Si no hubo hallazgo se informa: • “ No se observan elementos micóticos” Si hubo hallazgo se informa según el caso: APOE- UN MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE UÑAS Fecha: julio 2011 Versión: 2 Página 5 de 8 HOSPITAL.:.................... “Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas. “ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características de dermatofitos” “ Se observan elementos levaduriformes” b) Cultivo: • Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se descartan los cultivos y se informan : “No se obtuvo desarrollo de hongos” o “Cultivo negativo para hongos” • Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID) correspondiente a cada caso : POE Identificación Levaduras (AMID02), POE Identificación Dermatofitos (AMID01), POE Identificación no Dermatofitos (AMID03). • Si hubo desarrollo de un hongo micelial no dermatofito se debe pedir: “Nueva muestra para confirmar el diagnostico”. En la segunda muestra se propone informar junto al genero (y especie) del hongo aislado: “Hongo infrecuente como agente etiológico de onicomicosis, pero se jerarquiza el resultado por haberse aislado en dos muestras consecutivas con directos positivos”. Interpretación: Examen directo Positivo Positivo Negativo Cultivo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo para Jerarquizar Sí Si Sólo si se aísla dermatofito Si es una muestra de uñas de mano, si hay desarrollo en los APOE- UN MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE UÑAS Fecha: julio 2011 Versión: 2 Página 6 de 8 HOSPITAL.:.................... levaduras 3 puntos de siembra de todos los tubos sembrados y si es compatible con las características clínicas. c) Tiempo de entrega : El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas o junto con el cultivo El cultivo debe entregarse entre los 20 y 30 días. 8. FORMULARIOS Y REGISTROS: Registro de pacientes: General del Laboratorio (libro, informático, etc) Libro interno de Micología o sistema informatico Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red (ej: Inst. C.Malbran) Informes: Protocolo resultado de Micosis Superficiales Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red 9. DOCUMENTOS ASOCIADOS: PAMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos) AMID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica) MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad) 10. ANEXOS Flujogramas Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO: APOE- UN MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE UÑAS Fecha: julio 2011 Versión: 2 Página 7 de 8 HOSPITAL.:.................... Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la piel desde 3 días anteriores a la toma de muestra. Si se trata de uñas de pies y el paciente concurrió sin medias y con calzado abierto. Si el paciente no efectuó la preparación previa. Ver (PATT). APOE- UN MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE UÑAS Fecha: julio 2011 Versión: 2 Página 8 de 8 APOE- RE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXÁMEN MICOLÓGICO DE MATERIALES RESPIRATORIOS Fecha: abril 2011 Versión: 2 Página 1 de 9 HOSPITAL.:.................... 1. OBJETIVOS: Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras respiratorias 2. ALCANCE: Todas las muestras respiratorias como material de estudio para el diagnóstico de las micosis broncopulmonares. 3. PERSONAL AFECTADO: Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología, pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA 4. REFERENCIAS: Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial Interamericana, 3a edición, México, 2008 Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999 Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. Javier Pemán, Estrella Martín-Mazuelos, María del Carmen Calvo. Revista Iberoamericana de Micología. 1a edición. Bilbao, España. 2001 5. DEFINICIONES: Etapa Pre- Analítica PAMR: Manual de Medios y Reactivos PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras Elaborado por: M.Carmen Perrone,S.Cataldi, L.Guelfand Fecha: 6 de marzo 2008 Versión Original Revisado por: L.López Moral, L.Guelfand Fecha: enero 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: abril 2011 APOE- RE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA Fecha: abril 2011 Versión: 2 EXÁMEN MICOLÓGICO DE MATERIALES RESPIRATORIOS Página 2 de 9 HOSPITAL.:.................... Etapa Analítica AMID: Manual de Identificación APOE: Manual de procedimiento Operativo Etapa Post- Analítica PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad MA: Manual Administrativo 6. RESPONSABILIDADES: Bioquímico a cargo a cargo del área Micología. 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO El diagnóstico de las micosis del aparato respiratorio se basa en el hallazgo de hifas o levaduras características, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos. 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Microscopio con objetivos de 10x, 40x, 100x (inmersión) Heladera 2- 8 ºC Estufa de cultivo a 35 - 37 ºC Estufa de cultivo a 28 ºC Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos Cubreobjetos Hojas de bisturí descartables estériles o sindesmótomos estériles Ansa bacteriológica Gancho en L Agujas de disección Guantes de látex descartables APOE- RE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXÁMEN MICOLÓGICO DE MATERIALES RESPIRATORIOS Fecha: abril 2011 Versión: 2 Página 3 de 9 HOSPITAL.:.................... Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol (SAB+C) (Obligatorio) o Agar Miel Sabouraud (SAB-M) Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y actidiona (SAB+C+A) Agar BHI con ó sin 5% sangre ovina, con cloranfenicol Agar sangre Otros medios: Agar girasol, Agar glicerinado, Agar tabaco, Agar opacidad, etc. N-acetil cisteína 7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRA A ANALIZAR Muestras obtenidas por expectoración espontánea o por procedimientos invasores según instrucciones del manual (PATT) 7.5 SECUENCIA OPERATIVA 7.5.1 Precauciones de seguridad: Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) Utilizar guantes o manoplas descartables para el procesamiento de la muestra. 7.5.2 Procesamiento de la muestra: A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada Laboratorio. La muestra remitida se destinará una parte para el examen directo microscópico, otra para el cultivo A. ESPUTO –ASPIRADO TRAQUEAL a) Examen microscópico: Volcar el esputo en una placa de Petri estéril, examinar macroscópicamente, seleccionar una parte purulenta y separarla con un ansa estéril o con agujas de disección. Colocar una gota del material así obtenido entre porta y cubreobjeto para realizar el examen microscópico al estado fresco. Con la porción restante efectuar extendidos para coloración de Giemsa, Gram-Weigert, Ziehl Neelsen, Grocott, Azul de Toluidina-O. El examen en fresco se realiza inicialmente APOE- RE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXÁMEN MICOLÓGICO DE MATERIALES RESPIRATORIOS Fecha: abril 2011 Versión: 2 Página 4 de 9 HOSPITAL.:.................... con 100x a fin de recorrer rápidamente varios campos y reconocer si la muestra es representativa, para ello la muestra de esputo apropiada debe tener > de 25 leucocitos (polimorfonucleares neutrófilos) y < 25 células epiteliales escamosas por campo de 100x dependiendo del agente causal. Sin embargo en los pacientes inmunosuprimidos (neutropenicos, VIH +, trasplantados, con tratamientos prolongados con corticoides) aún las muestras poco representativas deben ser sometidas a estudios mediante tinciones, en busca de hongos. Completar el estudio mediante la observación con 400x. de la muestra. Este paso permite la visualización de hongos de dimensiones medianas o grandes, con pared celular gruesa y refringente tales como: seudohifas y blastoconidias de Candida, hifas ramificadas y tabicadas de Aspergillus, Pseudallescheria, etc, filamentos ramificados no septados de zigomicetos, elementos de las formas parasitarias de Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum var duboisii, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis y acúmulos de Pneumocystis jirovec i, (estos últimos se ven mejor en el BAL). Los extendidos teñidos deben examinarse con óptica de inmersión a 1000x. La coloración de Giemsa es útil para observar elementos levaduriformes de Histoplasma capsulatum, la fase parasitaria de Penicillium marneffei, las formas tróficas de Pneumocystis jiroveci y es también la mejor tinción para reconocer las células de la muestra. De estas últimas tienen particular interés los eosinófilos en la aspergilosis broncopulmonar alérgica y los macrófagos en la histoplasmosis y penicilosis. Una variante de la observación al estado fresco es la preparación con tinta china, ver (PAMR) útil para ver las levaduras capsuladas de Cryptococcus neoformans ó C. gatti. Para la búsqueda de P. jiroveci, el material ideal es el BAL, pero cuando éste no puede realizarse, como segunda opción puede recurrirse al esputo inducido mediante nebulizaciones tibias con solución salina isotónica. Este microorganismo puede observarse en fresco a 400x, pero debe confirmarse con extendidos teñidos por las técnicas descriptas en el manual de medios y reactivos (PAMR) Las muestras muy viscosa oueden fluidificarse antes de la siembra empleando algún agente mucolitico (N-acetil cisteína), dejándola actuar a temperatura ambiente hasta que se consigue la fluidificación.. b) Cultivo: Una vez finalizado el examen microscópico se puede agregar al esputo 10 ml de una solución de antibióticos antibacterianos, conteniendo 100 ug/ml de cloranfenicolestreptomicina y dejar en la heladera a 4ºC durante 24 hs. centrifugar antes de sembrar. La otra opción es realizar APOE- RE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXÁMEN MICOLÓGICO DE MATERIALES RESPIRATORIOS Fecha: abril 2011 Versión: 2 Página 5 de 9 HOSPITAL.:.................... directamente la siembra del material en tubos de ensayo con medio de SAB glucosado o miel y agar BHI. Se emplean 6 tubos por muestra, la mitad se incuba a 28ºC y los restantes a 37ºC. Los medios de cultivo deben contener cloranfenicolestreptomicina en la concentración final de 100 ug/ml, en general no se usa la cicloheximida porque puede impedir el desarrollo de Aspergillus, Cryptococcus, Penicillium, etc. B. : Lavado broncoalveolar (BAL), MiniBAL y Lavado bronquial (LB) a) Examen microscópico: El BAL es un material de gran utilidad para el estudio de las micosis broncopulmonares. Se obtiene por fibrobroncoscopía y reduce al mínimo la presencia de elementos contaminantes de la boca y vías aérea superiores. Si la muestra fue adecuadamente obtenida exhibe, un neto predominio de macrófagos alveolares ó células inflamatorias, prácticamente no se observan células bronquiales o epiteliales planas de la boca. El BAL se considera significativo cuando el recuento de células epiteliales planas es < 1 %. Si la muestra no va a ser examinada inmediatamente, se la refrigera a 4ºC. Centrifugar toda la muestra, separar el sobrenadante y con el sedimento llevar a cabo los mismos pasos propuestos para el examen de esputo. El sobrenadante podrá ser utilizado para la detección de ciertos antígenos de hongos patógenos como. Aspergillus fumigatus, y Cryptococcus neoformans por aglutinación de partículas de látex o por técnicas de ELISA. El valor diagnóstico del hallazgo de las diferentes especies fúngicas que colonizan o parasitan el aparato respiratorio es muy distinto. La presencia de ciertas especies, aunque sólo sea en cultivos, tiene importancia cuando se trata de patógenos primarios como: P. brasiliensis, H. capsulatum, C. immitis, B, dermatitidis y P. marneffei . Otras especies sólo tienen valor cuando se los encuentra en el examen microscópico directo y se los cultiva en forma reiterada de diferentes muestras, como son las especies del género Aspergillus, Fusarium spp, Pseudallescheria boydii y Nocardia asteroides. Finalmente algunos hongos sólo pueden ser considerados responsables de la patología respiratoria cuando son observados como invasores de los tejidos en los estudios histopatológicos de biopsia, piezas quirúrgicas, en pacientes inmunosuprimidos; en este caso se encuentran C. albicans y otras especies del género. APOE- RE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXÁMEN MICOLÓGICO DE MATERIALES RESPIRATORIOS Fecha: abril 2011 Versión: 2 Página 6 de 9 HOSPITAL.:.................... 7.5.3 Resultados: a) Examen microscópico: Directo: Es conveniente entregar un resultado de los elementos observados lo más rápido posible como informe preliminar. Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos” Si hubo hallazgo se informa según el caso: ¾ Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios ¾ Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en rueda de timón ¾ Se observan células esféricas de brotación simple (unigemantes) de cuello ancho ¾ Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas ¾ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas ¾ Se observan hifas cenocíticas ¾ Se observan elementos compatibles con P. jiroveci. Tinta china: Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa” Si hubo hallazgo se informa: “Se observan levaduras capsuladas” Coloración de Giemsa: Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa” Si hubo hallazgo se informa según el caso: ¾ Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios. ¾ Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en rueda de timón. ¾ Se observan células esféricas de brotación simple (unigemantes) de cuello ancho. APOE- RE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXÁMEN MICOLÓGICO DE MATERIALES RESPIRATORIOS Fecha: abril 2011 Versión: 2 Página 7 de 9 HOSPITAL.:.................... ¾ Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas. ¾ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas. ¾ Se observan hifas cenocíticas. ¾ Se observan levaduras en casquete intracelulares. ¾ Se observan elementos compatibles con P. jiroveci Coloración de Gram-Weigert: Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa” Si hubo hallazgo se informa: “Elementos compatibles con P. jiroveci” Coloración de Azul de Toluidina-O: Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa” Si hubo hallazgo se informa: “Elementos compatibles con P. jiroveci” Coloración de Grocott Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa” Si hubo hallazgo se informa: “Elementos compatibles con P. jiroveci” ¾ Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios. ¾ Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en rueda de timón. ¾ Se observan células esféricas de brotación simple (unigemantes) de cuello ancho. ¾ Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas. ¾ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas. ¾ Se observan hifas cenocíticas. b) Cultivo: APOE- RE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXÁMEN MICOLÓGICO DE MATERIALES RESPIRATORIOS Fecha: abril 2011 Versión: 2 Página 8 de 9 HOSPITAL.:.................... ¾ Si no hubo desarrollo durante el lapso indicado de incubación se descartan los cultivos y se informa: “No se obtuvo desarrollo de hongos” ¾ Si hubo desarrollo recurrir al manual de identificación (AMID) según el caso e informar: “Género y especie” 7.5.4 Interpretación: El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de un patógeno primario El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal, tiene valor diagnóstico cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente. Tiempo de entrega: De 1 a 4 semanas 8. FORMULARIOS Y REGISTROS: Registro de pacientes: General de laboratorio ( libro, informático, etc) Libro interno de Micología Ficha de examen micológico Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Informes: Protocolo de examen micológico Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado cuando es procesado a través de la Red de Micología GCBA 9. DOCUMENTOS ASOCIADOS: PATT: Manual de toma y transporte de muestra PAMR: Manual de medios y reactivos AMID: Manual de identificación APOE- RE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXÁMEN MICOLÓGICO DE MATERIALES RESPIRATORIOS Fecha: abril 2011 Versión: 2 Página 9 de 9 HOSPITAL.:.................... MB: Manual de bioseguridad MC: Manual de calidad MA: Manual administrativo 10. ANEXOS: Flujogramas Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO: Si la muestra no cumple con las condiciones de toma, conservación y transporte de muestra ver (PATT) POE-OR MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE ORINA Fecha: julio 2011 Versión: 1 Página 1 de 8 1. OBJETIVOS: Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras de orina 2. ALCANCE: Todas las muestras de orina extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico presuntivo. 3. PERSONAL AFECTADO: Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología, pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA 4. REFERENCIAS: Candida Urinary Tract Infections- Epidemiology, Patogenesis, Diagnosis, and Treatment: Executive Summary. Fisher J. Clinical Infections Diseases 2011; 52 (Suppl 6) S 429-S432. Diagnosis, prevention and treatment of catheter-associated urinary tract infection in adults. 2009 International Clinical Practice Guideline from the Infectious Diseases Society America. Urinary Catheter Guidelines. Hooton et al. CID 2010:50 (1 March) • Cumitech 2C: Laboratory Diagnosis of Urinary Tract . Infections.Yvette S. McCarter, Eileen M. Burd , Gerri S. Hall , Marcus Zervos , Susan E. Sharp. March 2009. • INFORME TÉCNICO.Consenso Argentino Intersociedades para el Manejo de la Infección del Tracto Urinario – Parte III. (Sociedades participantes: Soc. Argentina de Infectología (SADI), Soc. Argentina de Urología (SAU), Soc. Argentina de Medicina (SAM), Soc. Argentina de Bacteriología Clínica (SADEBAC), Soc. de Ginecología y Obstetricia de Elaborado por: M.C. Perrone.,S.Cataldi, L.Guelfand Fecha: 6 de marzo 2008 Revisado por Ivana Maldonado, L. Guelfand Fecha: junio 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: julio 2011 POE-OR MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE ORINA Fecha: julio 2011 Versión: 1 Página 2 de 8 Buenos Aires (SOGIBA). Rev Panam Infectol 2008; 10(1):48-57. Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999. 5. DEFINICIONES: Etapa Pre- Analítica PAMR: Manual de Medios y Reactivos PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras Etapa Analítica AMID: Manual de Identificación APOE: Manual de procedimientos operativos Estándar Etapa Post- Analítica PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad 6. RESPONSABILIDADES: Jefe de Sección Microbiología, Bioquímico a cargo del área Micología 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO POE-OR MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE ORINA Fecha: julio 2011 Versión: 1 Página 3 de 8 La confirmación microbiológica del diagnóstico de infección urinaria por agentes micóticos cuando se observan en el sedimento de la muestra y / o se aísla el agente causal en los cultivos. 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x ( inmersión ) Heladera 2- 8º C Estufa de cultivo a 35- 37ºC Estufa de cultivo a 28ºC Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos de vidrio Cubreobjetos de vidrio Ansa bacteriológica de 5 ul (factor de dilución 1/200) o de 10 ul Guantes de látex descartables Agar CLDE Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol Agar cromogénico para levaduras Agar semilla de girasol ó Agar tabaco Tinta China Coloración de Giemsa 7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRA A ANALIZAR: Muestras de orina recolectadas en forma estéril (PATT) 7.5 SECUENCIA OPERATIVA: 7.5.1 Precauciones de seguridad: Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) Utilizar guantes o manoplas descartables para la toma de muestra y procesamiento. 7.5.2 Procesamiento de la muestra: POE-OR MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE ORINA Fecha: julio 2011 Versión: 1 Página 4 de 8 A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente ó sistema informático propio de cada Laboratorio. a) Examen microscópico: Se centrifugan 10 ml de orina a baja velocidad (2000 r.p.m.) durante 10 minutos. El sedimento es examinado el estado fresco, entre porta y cubreobjetos, sin ningún agregado ó con una gota de tinta china diluida cuando se sospecha una criptococosis. La observación se lleva a cabo con óptica seca de 400X. El examen microscópico del sedimento permite observar seudohifas y blastoconidias de las especies de Candida, así como también elementos levaduriformes capsulados de Cryptococcus en las preparaciones con tinta china. Paracoccidioides brasilensis se visualiza en las preparaciones al estado fresco al igual que el Blastomyces dermatitidis Si por datos epidemiológicos la sospecha es Histoplasma capsulatum se debe realizar un extendido teñido con la coloración de Giemsa. b) Cultivos: Para realizar el urocultivo se utiliza un ansa calibrada de 5 µl (factor de dilución 1/200 ) o un ansa de 10 µl (factor de dilución 1/100). Se siembra la orina (sin centrifugar) en una placa de Petri con agar CLDE. En pacientes sondados y en muestras de punción suprapúbica se siembra además 100 µl de orina en CLDE y Agar sangre. Si en directo se observaron levaduras, sembrar tambien en Sabouraud glucosado y/o agar cromogénico. La incubación se efectúa de 35 a 37ºC durante 48hs. Cada colonia crecida equivale a 200 UFC/ml. cuando usamos ansa de 5 µl y equivale a 100 UFC/ml cuando se utiliza un ansa de 10 µl. Si en el examen directo se observan agentes micóticos diferentes a levaduras, se puede sembrar el sedimento urinario en Sabouraud glucosado y agar BHI a 2 temperaturas (28 y 35-37 ºC. Con el objeto de acelerar la identificación de C. neoformans, la muestra de orina puede ser sembrada directamente en medios que detecten la presencia de fenoloxidasa ver (PRMR), e incubados por 7 días. c) Reacciones imnumológicas: El sobrenadante de la orina puede ser utilizado para la búsqueda de antígenos fúngicos, especialmente polisacárido capsular de C. neoformans, por la técnica de aglutinación de partículas de látex sensibilizadas con gamma-globulina de conejo anti-C. neoformans. También pueden buscarse otros antígenos, como las glucoproteínas de Aspergillus spp . POE-OR MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE ORINA Fecha: julio 2011 Versión: 1 Página 5 de 8 7.5.3 Resultados: a) Examen microscópico: Si no hubo hallazgo se informa: “ No se observan elementos micóticos” o “Negativo para hongos” Si hubo hallazgo se informa según el caso: “ Se observan levaduras y/o seudomicelios” “ Se observan levaduras capsuladas” “Se observan elementos levaduriformes esféricos de brotación múltiple, anisométrica o en rueda de timón” “Se observan elementos levaduriformes con artrosporas o blastoartrosporas. “ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas” “ Se observan hifas cenocíticas” “ Se observan cuerpos esféricos con endosporas ó esférulas” NOTA: Sólo en el caso de sospecha epidemiológica de histoplasmosis se informa lo observado en la coloración de Giemsa Si no hubo hallazgo: “ No se observan elementos micóticos” o “Negativo” Si hubo hallazgo: “Se observan levaduras intracelulares en casquete” b) Cultivo: Si no hubo desarrollo durante el lapso indicado de incubación se descartan los cultivos y se informa “Sin desarrollo” ó “Negativo” Monoespecie: Si hubo desarrollo recurrir al manual de identificación (AMID) e informar: “género y especie” Recuento de colonias: se informa en el caso de candidurias Se expresa en UFC/ml Cuando se siembran 5ul, cada colonia crecida equivale a 200 UFC/ml. Cuando se siembran 10ul, cada colonia crecida equivale a 100 UFC/ml. Cuando se siembran 100 ul, cada colonia crecida equivale a 10UFC/ml POE-OR MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE ORINA Fecha: julio 2011 Versión: 1 Página 6 de 8 A diferencia de lo que sucede en las bacteriurias, no hay consenso sobre la utilidad de los cultivos cuantitativos cuando el agente patógeno es un hongo, algunos autores sugieren que el recuento de 1.000 a 10.000 UFC/ml es significativo para las candidurias y cuando se trata de pacientes sondados se habla de un recuento de 100 UFC/ml. Polimicrobiano: Solicitar nueva muestra según manual de toma y transporte de muestra (PATT), en el caso de pacientes sondados, con reciente recambio de sonda o por punción suprapúbica. 7.5.4 Interpretación: Es importante la repetición del urocultivo para confirmar el diagnóstico de candiduria en particular en aquellos pacientes con sonda vesical o en muestras obtenidas por catéter. En el caso de muestras provenientes de punción suprapúbica se jerarquiza el desarrollo de cualquier hongo, sin tener en cuenta el recuento de colonias y NO se solicita una segunda muestra. En el caso de muestras de neonatología, se jerarquiza el desarrollo de cualquier hongo, sin tener en cuenta el recuento de colonias y NO se solicita una segunda muestra. En los cultivos polimicrobianos (más de una especie) se jerarquiza el resultado si se obtienen las mismas especies en más de una muestra. El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de un patógeno primario. El hallazgo de un hongo saprofito ó comensal tiene valor diagnóstico cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente. Tiempo de entrega: Entre 3 a 5 días hábiles en el caso de levaduras y hasta 30 días cuando se trata de patógenos de lento crecimiento. 8. FORMULARIOS Y REGISTROS: Registro de pacientes: General de laboratorio ( libro, informático, etc.) Libro interno de Micología o sistema informático Ficha de examen micológico Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA POE-OR MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO DE ORINA Fecha: julio 2011 Versión: 1 Página 7 de 8 Informes: Protocolo examen Micológico Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado cuando es procesado a través de la Red de Micología 9. DOCUMENTOS ASOCIADOS: PATT: Manual de toma y transporte de muestra PAMR: Manual de medios y reactivos AMID: Manual de identificación MB: Manual de bioseguridad MC: Manual de calidad 10. ANEXOS: Flujograma Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO: Si el paciente no cumple con las condiciones de toma, conservación y transporte de muestra según (PATT) Si el paciente tiene medicación antifúngica sistémica previa a la toma de la muestra. POE-OR MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE ORINA HOSPITAL.:.................... Fecha: julio 2011 Versión: 1 Página 8 de 8 ANEXO 1: FLUJOGRAMA ORINAS MUESTRA DE ORINA Chorro medio (OCM) Al acecho Sonda (OSV) Nefrosomía Punción suprapúbica CULTIVO (OCM :siembra 5 µl/10 µl CLDE) (OSV, PSP:siembra 100µl CLDE – AS) EXAMEN MICROSCÓPICO del sedimento agregar Sab. o agar cromogénico Se observan hongos? No crece? Si “Se observan levaduras y/o seudomicelios” “No se observan elementos micóticos” Poli microbiano No Si Mono microbiano “Sin desarrollo” ó “Negativo” Nueva muestra por mezcla polimicrobiana Se solicita 2° muestra para confirmar el hallazgo (menos PSP) Recuento de colonias Desarrollo de levaduras (ID Pres) Candida albicans Levadura no Calbicans 2° muestra Positiva (con la misma identificación presuntiva) 1.000 a 10.000 UFC/ml (OCM) 100 UFC/ml (OSV) Identificación: Género y especie APOE-MUC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLOGICO DE MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 6 1. OBJETIVOS: • Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras superficiales tanto de mucosas bucofaríngea y vaginal, como de semimucosas de labios, vulva y glande. 2. ALCANCE: • Todas las muestras de mucosas y semimucosas extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico presuntivo. 3. PERSONAL AFECTADO: • Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA Micología, 4. REFERENCIAS: Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial Interamericana, 3ra edición, México, 2008 Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. de Bs. As. Argentina, 1999 5. DEFINICIONES: Etapa Pre- Analítica MR: Manual de Medios y Reactivos PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras Elaborado por: S.Cataldi, M.C.Perrone, L.Guelfand Fecha: 8 de enero 2008 Versión Original Revisado por: : I.Maldonado, L.López Moral Fecha: agosto 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: agosto de 2011 APOE-MUC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLOGICO DE MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 2 de 6 Etapa Analítica AMID: Manual de Identificación 01. Levaduras APOE: Manual de procedimiento Operativo Etapa Post- Analítica PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad 6. RESPONSABILIDADES: Jefe de Sector ó Sección Microbiología / Micología, Bioquímico/s a cargo del área Micología 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO El diagnóstico de las micosis superficiales de mucosas y semimucosas se basa en el hallazgo de seudohifas o levaduras, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos. 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión) Heladera 2-8 º C Estufa de cultivo a 35-37 º C Estufa de cultivo a 28 º C Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos APOE-MUC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLOGICO DE MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 3 de 6 Cubreobjetos Hojas de bisturí descartables estériles y/o sindesmótomos estériles Ansa bacteriológica Gancho en L Agujas de disección Guantes de látex descartables Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol Agar lactrimel con cloranfenicol Agar Miel Sabouraud Agar cromogénico 7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRA A ANALIZAR: Hisopados y frotis obtenidos en forma estéril, a partir de lesiones o secreciones de mucosas o semimucosas. Ver PATT. 7.5 SECUENCIA OPERATIVA: PRECAUCIONES DE SEGURIDAD: • Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada Laboratorio. La muestra recolectada en el hisopo humedecido en SF o en medio de Stuart, se destina al cultivo, y la depositada en portaobjetos para el examen microscópico a) Examen directo microscópico: • Observar la muestra en fresco entre porta y cubreobjetos con objetivo de APOE-MUC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... • b) • • • • EXAMEN MICOLOGICO DE MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 4 de 6 10x y 40x Luego, dejar secar, fijar y teñir con Giemsa al 10%, 30 minutos o con Azul de metileno al 1% durante 30 minutos y si es necesario, realizar coloración de Gram. Cultivos: Sembrar el hisopo en agar Sabouraud (SDA) y/o en agar cromogénico. Incubar a 35º - 37º C durante 10 días. Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar el período de incubación. Luego del cultivo primario es recomendable la siembra en un medio cromogénico (si no se hizo como siembra primaria).El medio cromogénico permite reconocer si en la muestra hay una o más especies.Con la colonia/s aisladas se puede iniciar la identificación presuntiva RESULTADOS: a) Examen directo: Es conveniente entregar este resultado dentro de las 24 horas. Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos” Si hubo hallazgo se informa: “Se observan elementos levaduriformes y/o seudohifas” Debe consignarse además, la presencia de leucocitos o piocitos, células, bacterias y parásitos. b) Cultivo: • Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se descartan los cultivos y se informan “ Negativo” Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID) correspondiente: POE Identificación Levaduras (AMID01) APOE-MUC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLOGICO DE MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 5 de 6 c) Interpretación: Examen directo Negativo Positivo Cultivo Negativo Negativo Negativo Positivo para levaduras Jerarquizar Si Si Sólo si hay desarrollo masivo y en concordancia con las características clínicas. d) Tiempo de entrega : 1 El examen directo puede entregarse dentro de 24 horas o junto con el cultivo 2 El cultivo debe entregarse cumplidos los 10 días. 8. FORMULARIOS Y REGISTROS: Registro de pacientes: General del Laboratorio (libro, sistema informático, etc.) Libro interno de Micología Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red Informes: Protocolo examen Micológico Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red 9. DOCUMENTOS ASOCIADOS: . PAMR: etapa Pre-analítica- Manual de Medios y Reactivos PATT: etapa Pre-analítica- Manual de Toma y Transporte de muestras AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación. APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar PPFI: etapa Post-Analítica -Formularios e Informes APOE-MUC MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MC: MB: EXAMEN MICOLOGICO DE MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 6 de 6 Manual de Calidad Manual de Bioseguridad 10. ANEXOS Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO: Cuando el paciente no suspendió la medicación antifúngica sistémica (10 a 15 días) o local (3 a 5 días) los días anteriores a la toma de muestra. Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la mucosa afectada durante los 3 días anteriores a la toma de muestra. Si los hisopos llegan al laboratorio secos, sin medio de transporte (agua destilada estéril, solución fisiológica estéril o Stuart) APOE-HEMO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL EXÁMEN MICOLÓGICO DE HEMOCULTIVO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 HOSPITAL.:.................... 1. OBJETIVO: Desarrollar el procedimiento a seguir para el cultivo de hongos presentes en muestras de sangre. 2. ALCANCE: Todas las muestras de sangre recolectadas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PRTT). 3. PERSONAL AFECTADO: Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología y Guardia 4. REFERENCIAS: Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM press, American Society for Mirobiology, Washington, D.C. 1998. Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999. Manual of Clinical Microbiology. Murray y col. 8th Edition ASM press U.S.A 2003. Bianchi M, Robles AM, Vitale R, Helou S, Arechavala A, Negroni R. The usefulness of blood culture in the diagnosis of HIV-related systemic mycoses: evaluation of a manual lysis centrifugation method. Med Mycol 2000; 38: 77-80. 5. DEFINICIONES: PAMR: etapa Pre-analítica- Manual de Medios y Reactivos PATT: etapa Pre-analítica- Manual de Toma y Transporte de muestras AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación. APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar PPFI: etapa Post-Analítica -Formularios e Informes Elaborado por: L.Guelfand, M.Carmen Perrone,S.Cataldi Fecha: 6 de marzo 2008 Versión Original Revisado por Laura López Moral, Liliana Guelfand. Fecha: junio 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: 3 de agosto de 2011 APOE-HEMO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL EXÁMEN MICOLÓGICO DE HEMOCULTIVO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 HOSPITAL.:.................... MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad MA: Manual Administrativo LC: Lisis Centrifugación 6. RESPONSABILIDADES: Jefe de Sección Microbiología o Micología Bioquímico a cargo del área Micología 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO El cultivo de sangre se basa en la detección de hongos que desarrollan en los frascos comerciales de equipos automatizados (Bactec o Bact Alert), en frascos de hemocultivos comerciales no automatizados (Britania) o por la técnica de lisis centrifugación (Isolator o de preparación en el laboratorio, ver PAMR). Este método es el más sensible y rápido para la recuperación de algunos hongos de la sangre, especialmente Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans y Fusarium spp.Presenta mejores resultados para los hongos filamentosos, que los obtenidos por las técnicas automatizadas o comerciales no automatizadas. El hemocultivo para la búsqueda de hongos, se indica en caso de sospecha de fungemia en un huésped inmunocomprometido grave y en pacientes VIH positivos para la investigación de Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans, Fusarium spp, Candida spp y otras levaduras. Cuando el paciente esta recibiendo alimentación parenteral hiperlipídica y se sospecha fungemia por Malassezia spp., se debe sembrar el material en medios ricos en ácidos grasos de cadena larga 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión) Heladera 2- 8º C Estufa de cultivo a 32- 35ºC Estufa de cultivo a 28ºC Mechero a gas o eléctrico APOE-HEMO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL EXÁMEN MICOLÓGICO DE HEMOCULTIVO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 HOSPITAL.:.................... Gradillas para tubos Portaobjetos Cubreobjetos Gancho en L Aguja vacutainer Guantes de látex descartables Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol Agar Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y aceite de oliva (SAO) Agar Dixon (ADX) o similares 7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRAS A ANALIZAR: Sangre: La sangre es tomada en forma estéril y recolectada en tubo para la técnica de lisis centrifugación (LC) o en botellas de hemocultivos o en frascos especiales de equipos automatizados de acuerdo a las indicaciones del Manual de toma de muestra (PATT). El método de LC se realiza colocando: • 9 ml de sangre en un tubo estéril con 1 ml de saponina 5% y polianetol sulfonato de sodio al 0.4 % o EDTA para pacientes adultos • 1 a 3 ml de sangre para pacientes neonatos y pediátricos en 0,5 ml de saponina 5% y polianetol sulfonato de sodio al 0.4 % o EDTA (Ver Anexo I Tabla de volemia) 7.5 SECUENCIA OPERATIVA: 7.5.1 Precauciones de Seguridad Biológica Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) 7.5.2 Procesamiento de la Muestra: A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio del Laboratorio. O bien se la prepara para su derivación de acuerdo a las indicaciones del PRTT. APOE-HEMO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL EXÁMEN MICOLÓGICO DE HEMOCULTIVO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 HOSPITAL.:.................... Los tubos de LC se centrifugan a 3000 r.p.m. durante 30 minutos y se descarta el sobrenadante. a) Examen directo microscópico No aplica b) Cultivos: En el método de LC, se siembra todo el sedimento en 4 tubos conteniendo medio de Sabouraud y agar infusión de cerebro y corazón (Ver PRMR). Cuando el paciente esta recibiendo alimentación parenteral hiperlipídica y se sospecha fungemia por Malassezia spp., se debe sembrar el material en medios ricos en ácidos grasos de cadena larga, como el Agar miel Sabouraud con el agregado de aceite de oliva estéril (SAO), Medio de Danker (ADK), Medio de Dixon (ADX) ó Agar Sabouraud con bilis de buey (ABB) . Ver Manual PAMR. La sangre que se recolecta en los frascos comerciales de equipos automatizados o en frascos de hemocultivos comerciales no automatizados (ver PATT), se incuban directamente en estos envases. La incubación de los tubos de LC se realiza a 28º C y 35-37º C, durante 3 a 4 semanas. Es necesario efectuar controles macroscópicos al menos 2 veces por semana para ver, si existe desarrollo micológico. Los frascos de hemocultivos automatizados (Bactec, BacT-Alert) para gérmenes comunes, se incuban en su equipo de 5 días (para búsqueda de levaduras) a 3 semanas (para hongos sistémicos endémicos o filamentosos), a 35ºC. Los frascos de Hemocultivos automatizados (Bactec, BacT Alert) especiales para micobacterias y hongos, se incuban en su equipo correspondiente durante 3 a 4 semanas, a 35-37ºC. Los frascos de Hemocultivos comerciales no automatizados para gérmenes comunes, se incuban en estufa durante 3 a 4 semanas, a 35ºC. Cuando se siembran medios para búsqueda de Malassezia spp, se incubarán de 32 a 35º C durante 3 semanas. APOE-HEMO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL EXÁMEN MICOLÓGICO DE HEMOCULTIVO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 HOSPITAL.:.................... 7.5.3 Resultados: Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se descartan los cultivos y se informan “Negativo” Si durante la incubación se observa desarrollo en los medios sólidos o líquidos, se realiza un examen microscópico en fresco y un informe “preliminar” describiendo los elementos vistos en la microscopia. A los frascos de los hemocultivos automatizados que den un aviso de crecimiento microbiano, se le debe realizar un fresco y un Gram. Si se observan elementos micóticos (levaduras o hifas), se repican a 2 tubos de Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y a 2 tubos de Agar infusión cerebro corazón con cloranfenicol; se incuban a 28 y 35 ºC durante 3-4 semanas). Si en el examen directo del frasco, se observan levaduras redondas sin seudomicelio, se debe preparar un examen de tinta china para ver si se visualizan levaduras capsuladas. Si se observan levaduras compatibles morfológicamente con Malassezia, debe sembrarse en los medios especiales para poder recuperar este género, en los cultivos. Las colonias que desarrollen en los medios sólidos, deben ser examinadas al microscópico para su reconocimiento preliminar. Si son colonias de aspecto levaduriforme y se observaron levaduras redondas, se efectúa una preparación montada en tinta china y se determina la producción de ureasa por un método rápido, así como la detección de fenoloxidasa en el medio de extracto de semillas de girasol (ver PRMR). En las colonias que dan resultados negativos se seguirá la secuencia de identificación de levaduras (POE ID Lev). Si se trata de colonias de aspecto micelial debe hacerse una preparación por disociación montada en azul lactofenol o en líquido de Gueguen, teniendo las precauciones descriptas en el Manual de bioseguridad y continuar su tipificación de acuerdo al flujograma de hongos filamentosos (AMID 04) 7.5.4 Interpretación El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de un patógeno primario. APOE-HEMO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL EXÁMEN MICOLÓGICO DE HEMOCULTIVO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 HOSPITAL.:.................... El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal tiene valor diagnóstico cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente. 7.5.5 Tiempo de entrega del resultado: El resultado del cultivo debe entregarse luego de 1 a 4 semanas de incubación si no hay desarrollo fúngico. Si se observa crecimiento de un hongo durante la incubación, se realiza un informe preliminar o definitivo cuando se concluye con la identificación. 8. FORMULARIOS Y REGISTROS 8.1 Registro de pacientes: General del Laboratorio (libro, informático, etc) Libro interno de Micología ( y/o Libro de hemocultivos / o sistema informático) Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red 8.2 Informes: Protocolo resultado de Hemocultivos Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red 9. DOCUMENTOS ASOCIADOS PR ( Manual de Procedimiento Pre- analítico) PRMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos) PAID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica ) MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad) 10. ANEXOS Tabla de Volemia Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO: APOE-HEMO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL EXÁMEN MICOLÓGICO DE HEMOCULTIVO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 HOSPITAL.:.................... Cuando las muestras llegan al laboratorio coaguladas, volcadas, en condiciones no estériles o en recipientes no adecuados APOE-HEMO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL EXÁMEN MICOLÓGICO DE HEMOCULTIVO Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 HOSPITAL.:.................... ANEXO I: TABLA DE VOLEMIA Volumen de sangre requierido en pacientes pediátricos (RN a 15 años) Peso del paciente (Kg) Pérdida volumen (%) Volumen de sangre (ml) SET 1 Isolator SET 2 Aerobio Anaerobio Isolator Aerobio Anaerobio <1 1.5 0.5 1.5 4 1.1- 2 1.5 1.5 1.5 4.5 2.1-12.7 1.5 3 1.5 3 12.8- 36 1.5 5 5 1.5 5 5 2.9 >36 10 10 10 10 10 10 2.8 Kellog J, Manzella J, Bankert D. J Clin Microbiol 38, 2000 APOE-MO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS EXÁMEN MICOLÓGICO DE MÉDULA ÓSEA Fecha: agosto de 2011 Versión: 2 Página 1 de 6 HOSPITAL.:.................... 1. OBJETIVO: Desarrollar el procedimiento a seguir para el cultivo de hongos presentes en muestras de médula ósea. 2. ALCANCE: Todas las muestras de medula ósea recolectadas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PRTT). 3. PERSONAL AFECTADO: Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología y Guardia 4. REFERENCIAS: Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM press, American Society for Mirobiology, Washington, D.C. 1998. Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999. Manual of Clinical Microbiology. Murray y col. 8th Edition ASM press U.S.A 2003. Bianchi M, Robles AM, Vitale R, Helou S, Arechavala A, Negroni R. The usefulness of blood culture in the diagnosis of HIV-related systemic mycoses: evaluation of a manual lysis centrifugation method. Med Mycol 2000; 38: 77-80. 5. DEFINICIONES: PAMR: etapa Pre-analitica- Manual de Medios y Reactivos PATT: etapa Pre-analitica- Manual de Toma y Transporte de muestras AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación. APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar PPFI: etapa Post-Analítica -Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad LC: Lisis Centrifugación Elaborado por: L.Guelfand, S.Cataldi, M.C.Perrone Fecha:10 de abril 2008 Revisado por: L. guelfand, L.López Moral Fecha: 20 de agosto 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: agosto de 2011 APOE-MO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS EXÁMEN MICOLÓGICO DE MÉDULA ÓSEA Fecha: agosto de 2011 Versión: 2 Página 2 de 6 HOSPITAL.:.................... MO: Médula Ósea 6. RESPONSABILIDADES: Jefe de Sección Microbiología Bioquímico a cargo del área Micología 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO El cultivo de medula ósea es útil para el diagnóstico de micosis sistémicas con compromiso del sistema monocítico-histiocitario, en especial para la histoplasmosis, la paracoccidioidomicosis de tipo juvenil y la criptococosis diseminada. Brinda elevados índices de positividad en los pacientes inmunocomprometidos. Debe reconocerse, sin embargo, que no es una investigación de rutina. La detección de los hongos se realiza utilizando la técnica de Lisis Centrifugacion (Isolator® o de preparación en el laboratorio, ver PAMR). El aislamiento de hongos en médula ósea tiene un gran significado clínico, dado que se trata de muestras que normalmente son estériles. 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión ) Heladera 2- 8º C Estufa de cultivo a 32- 35º C Estufa de cultivo a 28º C Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos Cubreobjetos Gancho en L Guantes de látex descartables Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol (SDA) Agar Miel Sabouraud (SAB+M) Agar Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol (BHI Agar) 7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) APOE-MO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS EXÁMEN MICOLÓGICO DE MÉDULA ÓSEA Fecha: agosto de 2011 Versión: 2 Página 3 de 6 HOSPITAL.:.................... 7.4 MUESTRAS A ANALIZAR: Médula ósea: La MO se recolecta en forma estéril, en un tubo para la técnica de lisis centrifugación (LC) o en botellas de hemocultivos o en frascos especiales de equipos automatizados de acuerdo a las indicaciones del Manual de toma de muestra (PATT). 7.5 SECUENCIA OPERATIVA: 7.5.1 Precauciones de Seguridad Biológica Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) 7.5.2 Procesamiento de la Muestra: A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio del Laboratorio. O bien se la prepara para su derivación de acuerdo a las indicaciones del PRTT. El método de LC se realiza colocando aproximadamente 1 ml de médula ósea en un tubo estéril con 0.1 ml de saponina 5% y polianetol sulfonato de sodio al 0.4 %. Los tubos de LC se centrifugan a 3000 r.p.m. durante 30 minutos y se descarta el sobrenadante. a) Examen directo microscópico Se preparan 3 extendidos del sedimento y se colorean por Giemsa (para hongos y parásitos, Gram (para gérmenes comunes) y Ziehl Neelsen (para BAAR). b) Cultivos: Se siembra todo el sedimento. Para el cultivo de hongos se utiliza los medios de agar Sabouraud y agar Infusión de cerebro y corazón (Ver PRMR). Es aconsejable sembrar 4 a 6 tubos. También deben sembrarse en medios para micobacterias (Lowenstein Jensen, Bactec®, Bact’Alert® u otros) y para gérmenes intracelulares como Salmonella, Listeria, etc. (agar sangre y agar Levine). La incubación de los tubos de LC se realiza a 28º C y 37º C, durante 3 a 4 semanas. Es necesario efectuar controles macroscópicos 2 veces por APOE-MO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS EXÁMEN MICOLÓGICO DE MÉDULA ÓSEA Fecha: agosto de 2011 Versión: 2 Página 4 de 6 HOSPITAL.:.................... semana para ver, si existe desarrollo micológico. Si la muestra fue sembrada en frascos de Hemocultivos automatizados (Bactec, Bac’Alert) para gérmenes comunes, se incuban en su equipo durante 3 semanas, a 35ºC. Si se utilizan los frascos de Hemocultivos automatizados especiales para micobacterias y hongos (Bactec®, Bac’Alert®), se incuban en su equipo correspondiente durante 3 a 4 semanas, a 35ºC. 7.5.3 Resultados: Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se descartan los cultivos y se informan “Negativo” Si durante la incubación se observa desarrollo en los medios sólidos o líquidos, se realiza un informe “preliminar” describiendo los elementos vistos en la microscopia. A los frascos de los hemocultivos automatizados que den un aviso de crecimiento microbiano, se le debe realizar un fresco y un Gram. Si se observan elementos micóticos (levaduras o filamentos), se repican a 2 tubos de Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y a 2 tubos de Agar Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol; se incuban a 28 y 35 ºC durante 3-4 semanas). Si en el examen directo del frasco, se observan levaduras redondas, se debe preparar una tinta china para ver si se visualizan levaduras capsuladas. Las colonias que desarrollen en los medios sólidos, deben ser examinadas al microscópico para su reconocimiento preliminar. Si son colonias de aspecto levaduriforme y se observaron levaduras redondas, se efectúa una preparación montada en tinta china y se determina la producción de ureasa por un método rápido, así como la detección de fenoloxidasa en el medio de extracto de semillas de girasol (ver PRMR). En las colonias que dan resultados negativos se seguirá la secuencia de identificación de levaduras (AMID Lev). Si se observan levaduras redondas, de pared gruesa y refringente, multibrotadas, en “oreja de Mickey” o catenuladas, se debe pensar en Paracoccidioides brasiliensis. APOE-MO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS EXÁMEN MICOLÓGICO DE MÉDULA ÓSEA Fecha: agosto de 2011 Versión: 2 Página 5 de 6 HOSPITAL.:.................... Si se trata de colonias de aspecto micelial debe hacerse una preparación por disociación montada en azul lactofenol o en líquido de Gueguen, teniendo las precauciones descriptas en el MB y continuar su tipificación de acuerdo al flujograma de hongos filamentosos (AMID hongos miceliares) 7.5.4 Interpretación El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de un patógeno primario. El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal tiene valor diagnóstico cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente. 7.5.5 Tiempo de entrega: El cultivo debe entregarse luego de 3 a 4 semanas de incubación. Si hay desarrollo durante la incubación, se realiza un informe preliminar describiendo los elementos vistos en la microscopia. 8. FORMULARIOS Y REGISTROS 8.1 Registro de pacientes: General del Laboratorio (libro, informático, etc) Libro interno de Micología ( y/o Libro de hemocultivos) Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red 8.2 Informes: Protocolo resultado de Medula Ósea o Hemocultivos Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red 9. DOCUMENTOS ASOCIADOS PAMR: etapa Pre-analitica- Manual de Medios y Reactivos PATT: etapa Pre-analitica- Manual de Toma y Transporte de muestras AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación. APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar PPFI: etapa Post-Analítica -Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad APOE-MO GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS EXÁMEN MICOLÓGICO DE MÉDULA ÓSEA HOSPITAL.:.................... 10. ANEXOS Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO: No aplica Fecha: agosto de 2011 Versión: 2 Página 6 de 6 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDOS DE PUNCIÓN APOE- LP Fecha: julio 2011 Versión: 02 Página 1 de 7 1. OBJETIVO: Desarrollar el procedimiento a seguir para el cultivo de hongos presentes en muestras de líquidos de punción. 2. ALCANCE: Todas las muestras de líquidos de punción recolectadas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PRTT). 3. PERSONAL AFECTADO: Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología y Guardia 4. REFERENCIAS: • • • Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM press, American Society for Mirobiology, Washington, D.C. 1998. Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Prov. de Bs. As. Argentina, 1999. Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. Javier Pemán, Estrella Martín-Mazuelos, María del Carmen Calvo. Revista a • Iberoamericana de Micología. 1 edición. Bilbao, España. 2001 A 15 year-review of peritoneal dialysis-related peritonitis: Microbiological trends and patterns of infection in a teaching hospital in Argentina. J. E. Santoianni1*, S. C. Predari1, D. Verón2, A. Zucchini2, A. N. De Paulis1 Revista Argentina de Microbiología (2008) 40: 17-23 ISSN 0325-751417 5. DEFINICIONES: PAMR: etapa Pre-analitica- Manual de Medios y Reactivos PATT: etapa Pre-analitica- Manual de Toma y Transporte de muestras AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación. Elaborado por: S.Cataldi, M.Carmen Perrone Fecha: 10 septiembre de 2009 Versión Original Revisado por: Claudia Garbaz y L.Guelfand Fecha: julio de 2011 Aprobado por: Integrantes de la RM y Coordinador Fecha: julio de 2011 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDOS DE PUNCIÓN APOE- LP Fecha: julio 2011 Versión: 02 Página 2 de 7 APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar PPFI: : etapa Post-Analítica -Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad MA: Manual Administrativo 6. RESPONSABILIDADES: Jefe de Sección Microbiología Bioquímico a cargo del área Micología 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO El diagnóstico de micosis en estos materiales se basa en el hallazgo de hifas o levaduras características, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos. 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Cabina de bioseguridad tipo II Microscopio óptico o de contraste de fase con objetivos de 100x, 400x y 1000x. Heladera 2- 8º C Centrífuga Estufa de cultivo a 32- 35ºC Estufa de cultivo a 28ºC Tubos estériles de propileno con tapa a rosca Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos de vidrio Cubreobjetos de vidrio Ansas estériles descartables o ansa metálica de platino Gancho en L Guantes de látex descartables Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol (SAB+C) Agar Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol (BHI +C) Solución fisiológica Azul de lactofenol MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDOS DE PUNCIÓN APOE- LP Fecha: julio 2011 Versión: 02 Página 3 de 7 Otros medios según resultado de examen directo o sospecha clínica 7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRAS A ANALIZAR: Líquidos: pleural, pericárdico, articular y ascítico. Estas muestras serán obtenidas respetando las técnicas de asepsia y enviadas al laboratorio en tubos cónicos de polipropileno estériles con tapa a rosca. Para su recolección se emplearán jeringas heparinizadas a fin de evitar su coagulación. Ver PRTT 7.5 SECUENCIA OPERATIVA: 7.5.1 Precauciones de Seguridad Biológica Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) 7.5.2 Procesamiento de la Muestra: A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio del Laboratorio, o bien, se la prepara para su derivación de acuerdo a las indicaciones del PRTT. Tomar hasta 10 ml de la muestra en tubo estéril con tapa a rosca, centrifugar a 2000 r.p.m. durante 10 minutos y procesar en cabina de bioseguridad. Descartar el sobrenadante y con el sedimento efectuar preparaciones al estado fresco, extendidos para teñir por los métodos de Gram, Ziehl Neelsen, Kinyoun y Giemsa. Ver PAMR. A continuación proceder a la siembra. a) Examen directo microscópico Los hallazgos del examen microscópico varían con la muestra examinada, en el estudio al estado fresco es posible comprobar la presencia de seudohifas y blastoconidias de Candida, levaduras capsuladas de Cryptococcus, levaduras multibrotantes de Paracoccidioides, esférulas de Coccidioides, hifas cenocíticas e hifas hialinas y septadas de Eumycetes. Las preparaciones teñidas con Gram y con Kinyoun permiten observar filamentos de los Actinomycetales, y en los extendidos coloreados con Giemsa pueden MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDOS DE PUNCIÓN APOE- LP Fecha: julio 2011 Versión: 02 Página 4 de 7 detectarse macrófagos con levaduras intracelulares que corresponden a Histoplasma capsulatum o Penicillium marneffei. Las pericarditis de origen micótico son habitualmente serofibrinosas y en ellas raramente se observa al agente causal. Por el contrario en los últimos años, se ha comprobado un número creciente de pericarditis purulentas producidas por Nocardia que se observa en los extendidos teñidos con Kinyoun. El líquido ascítico se obtiene principalmente de pacientes con diálisis peritoneal intermitente. Cabe recordar que en estos casos se analiza tanto el líquido ascítico como el contenido de las bolsas de diálisis. Resulta de fundamental importancia, concentrar esta muestra para obtener una mejor recuperación. En estos casos se centrifugan 100 ml de muestra a 2000 r.p.m. durante 10 minutos. La presencia de leucocitos en el líquido ascítico aboga en favor de una peritonitis. En el examen microscópico directo al estado fresco se puede observar la presencia de seudohifas o de hifas. La mayor parte de los casos son producidos por hongos del género Candida, siguiéndole en orden de frecuencia las infecciones producidas por Fusarium o Acremonium. En los casos de infección fúngica debe ser estudiada la cánula de diálisis una vez que ésta haya sido extraída. b) Cultivos: La siembra debe realizarse por toques (por lo menos tres) en tubos de ensayo con medio de SDA y agar BHI. Se emplean en general 6 tubos por muestra, la mitad se incuba a 28º C y los restantes a 37º C, ambos durante 4 semanas. Los medios de cultivo deben contener cloranfenicol-estreptomicina en la concentración final de 100 µg/ml, en general no se utiliza la cicloheximida porque puede impedir el desarrollo de Aspergillus, Cryptococcus, Penicillium, etc. Cuando se observan actinomicetos en el examen microscópico no debe utilizarse esta técnica de cultivos pues los antibióticos antibacterianos son letales para estos microorganismos. Si se trata de elementos ácido-resistentes, sospechosos de ser Nocardia, se siembra la muestra en tres placas de Petri con agar infusión de cerebro-corazón sin antibióticos, agar Thayer Martin, Lowestein- Jensen y agar sangre. La incubación puede hacerse a 37º C o de preferencia a 42º C. Las colonias se observan microscópicamente al estado fresco, aquellas que acusen la presencia de bacterias filamentosas son examinadas en extendidos teñidos por la técnica de Gram y repicadas en el MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDOS DE PUNCIÓN APOE- LP Fecha: julio 2011 Versión: 02 Página 5 de 7 mismo medio de cultivo para obtener un desarrollo no contaminado y poder completar la identificación. c) Identificación: Se observan los cultivos, al menos una vez por semana y se identifican por disociación de la colonia desarrollada en solución fisiológica con o sin azul de lactofenol y observación microscópica. 7.5.3 Resultados: a) Examen microscópico: Directo: Es conveniente entregar un resultado de los elementos observados lo más rápido posible como informe preliminar. Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos”. Si hubo hallazgo se informa según el caso: Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios. Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en rueda de timón. Se observan células esféricas de brotación simple (unigemantes) de cuello ancho. Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas. Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas. Se observan hifas cenocíticas. Coloración de Giemsa: Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa” Si hubo hallazgo se informa según el caso: Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios. Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en rueda de timón. Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas. Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDOS DE PUNCIÓN APOE- LP Fecha: julio 2011 Versión: 02 Página 6 de 7 Se observan levaduras en casquete intracelulares. Se observan hifas cenocíticas. b) Cultivo: Si no hubo desarrollo durante el lapso indicado de incubación se descartan los cultivos y se informa: “No se obtuvo desarrollo de hongos” Si hubo desarrollo, informar: “Género y especie” 7.5.4 Interpretación El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de un patógeno primario. El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal tiene valor diagnóstico cuando se conjuga un examen directo positivo, con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente. 7.5.5 Tiempo de entrega: El cultivo debe entregarse luego de 3 semanas de incubación. Si hay desarrollo durante la incubación, se realiza un informe preliminar describiendo los elementos vistos en la microscopia. 8. FORMULARIOS Y REGISTROS 8.1 Registro de pacientes: General del Laboratorio (libro foliado, informático, etc.) Libro interno de Micología Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red 8.2 Informes: Protocolo resultado de Líquidos de punción Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDOS DE PUNCIÓN APOE- LP Fecha: julio 2011 Versión: 02 Página 7 de 7 9. DOCUMENTOS ASOCIADOS PR ( Manual de Procedimiento Pre- analítico) PRMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos) AMID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica ) MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad) 10. ANEXOS Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO: No aplica MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO APOE- LCR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 1 de 8 1. OBJETIVO: Desarrollar el procedimiento a seguir para el cultivo de hongos presentes en muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR). 2. ALCANCE: Todas las muestras de líquido cefalorraquídeo recolectadas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PRTT). 3. PERSONAL AFECTADO: Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología/ Micología y Guardia 4. REFERENCIAS: Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM press, American Society for Mirobiology, Washington, D.C. 1998. Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Prov. de Bs. As. Argentina, 1999. Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. Javier Pemán, Estrella Martín-Mazuelos, María del Carmen Calvo. Revista a Iberoamericana de Micología. 1 edición. Bilbao, España. 2001 5. DEFINICIONES: PAMR: etapa Pre-analitica- Manual de Medios y Reactivos PATT: etapa Pre-analitica- Manual de Toma y Transporte de muestras AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación. APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar PPFI: : etapa Post-Analítica -Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad MA: Manual Administrativo Elaborado por: S.Cataldi,, M.Carmen Perrone Fecha: 10 septiembre 2009 Versión Original Revisado por: L.Lopez Moral, L Guelfand, M. López Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: agosto de 2011 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO APOE- LCR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 2 de 8 Fecha: julio de 2011 6. RESPONSABILIDADES: Jefe de Sección Microbiología o Micología Bioquímico a cargo del área Micología 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO El diagnóstico de micosis en LCR se basa en el hallazgo de levaduras características, en el examen microscópico directo, el aislamiento del agente causal en los cultivos y en la detección de antígenos o anticuerpos. 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Cabina de bioseguridad tipo II Microscopio óptico o de contraste de fase con objetivos de 100x, 400x y 1000x Heladera 2- 8º C Centrífuga Estufa de cultivo a 35-37ºC Estufa de cultivo a 28ºC Tubos estériles de propileno con tapa a rosca Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos de vidrio Cubreobjetos de vidrio Ansas estériles descartables o ansa metálica de platino Gancho en L Guantes de látex descartables Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol (SAB+C) Agar Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol (BHI +C) Solución fisiológica Tinta china Azul de lactofenol MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO APOE- LCR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 3 de 8 Urea de Christensen Fenol oxidasa Agar tabaco Agar cromogénico para identificación presuntiva de levaduras Tarjetas de identificación de levaduras,tipo Vitek o Api 7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRAS A ANALIZAR: LCR remitido en un tubo de polipropileno estéril con tapa a rosca, el volumen de la muestra no debe ser menor a 3 ml. (Ver PRTT) 7.5 SECUENCIA OPERATIVA: 7.5.1 Precauciones de Seguridad Biológica Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) 7.5.2 Procesamiento de la Muestra: A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio del Laboratorio o bien se la prepara para su derivación de acuerdo a las indicaciones del PRTT. El material se centrifuga entre 2000 a 3000 por 10-15 minutos y se procesa en cabina de bioseguridad. El sobrenadante se separa y se guarda para realizar, en caso necesario, reacciones en busca de antígenos o anticuerpos. Con el sedimento se realiza: a) Examen directo microscópico - - Colocar una gota del sedimento con una gota de tinta china diluida (PAMR), entre porta y cubreobjetos y observar al microscopio con objetivo 40x, en busca de levaduras capsuladas de Cryptococcus. Colocar una gota del sedimento entre porta y cubre y observar con microscopio óptico de 400x o de contraste de fase, en busca de elementos micóticos (ya sean levaduras, levaduras multibrotadas, cuerpos redondos con endosporos o filamentos). MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... - EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO APOE- LCR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 4 de 8 Colocar una gota del sedimento y realizar un extendido, dejar secar y colorear con solución Giemsa, observar al microscopio con aceite de inmersión con objetivo 1000x en busca de levaduras intracelulares compatibles con Histoplasma, levaduras, levaduras multibrotadas, cuerpos redondos con endosporos. b) Cultivos: El remanente del sedimento es resuspendido en agua destilada estéril y sembrado por toques (2-3) en tubos con agar-miel o agar glucosado de Sabouraud a 28º y 35-37º y agar infusión de cerebro y corazón a 35-37º C durante 3 a 4 semanas. Deben sembrarse 4 tubos de ensayo por muestra. Los tubos se observar todos los días o por lo menos, tres veces por semana para verificar si hay desarrollo. c) Identificación: -Observación macroscópica: se observa el aspecto y color de las colonias desarrolladas en los tubos de Sabouraud tanto en anverso como en el reverso de los mismos. - Si no se llega a definir realizar macrocolonia (preparar una placa de Petri con Sabouraud y sembrar en el centro de la misma el hongo, incubar 10 días a 37°C y observar). - Observación microscópica: Se coloca entre porta y cubreobjetos una gota de solución fisiológica con o sin agregado de azul de lactofenol y la colonia desarrollada en Sabouraud procediendo a su disociación con ayuda de ansa y ansa en L, se observa al microscopio con objetivo de 200 o 400x la morfología. - Prueba de ureasa (ver PAMR): Para género Cryptococcus - Prueba de fenoloxidasa y/o Agar Tabaco (ver PAMR): Para identificación de especie del género Cryptococcus. -Agar cromogénico: para identificación presuntiva de levaduras. Se realiza una suspensión en solución fisiológica tocando varias colonias desarrolladas en Agar Sabouraud, se siembra la placa de agar cromogénico, se incuba 48-72hs a 28º /35°C y se observa el color desarrollado siguiendo las indicaciones del fabricante. - Inoculación de paneles o tarjetas de identificación tipo Api o Vitek según indicaciones del producto comercial. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO APOE- LCR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 5 de 8 d) Pruebas inmunológicas (Ver APOE- INMU) e) Estudios especiales: Es frecuente, en los casos de meningitis crónica, la necesidad de colocar válvulas de derivación ventrículo-atrial o ventrículo-peritoneal y también es común que dichas válvulas deban ser reemplazadas. Estas circunstancias serán aprovechadas para obtener una muestra de LCR de gran volumen, mayor a 20 ml, lo que incrementa la posibilidad de aislamiento de los agentes causales. Es también aconsejable cultivar las válvulas reemplazadas. Debe tenerse siempre en cuenta que las meningitis crónicas son focos secundarios de micosis sistémicas, que tienen con frecuencia otras localizaciones, algunas de ellas fácilmente abordables para la obtención de materiales de biopsia que permiten el diagnóstico etiológico. Estos focos no neurológicos son encontrados con diferente frecuencia según las micosis, en orden decreciente serían paracoccidioidomicosis, histoplasmosis, coccidioidomicosis y criptococosis. 7.5.3 Resultados: a) Examen microscópico: Directo: Es conveniente entregar un resultado de los elementos observados lo más rápido posible como informe preliminar. Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos” Si hubo hallazgo se informa según el caso: Se observan células levaduriformes con o sin blastoconidias y sin seudomicelios Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en rueda de timón Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas Tinta china: MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO APOE- LCR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 6 de 8 Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa” Si hubo hallazgo se informa: “Se observan levaduras capsuladas compatibles con Cryptococcus spp” Coloración de Giemsa: Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa” Si hubo hallazgo se informa según el caso: Se observan células levaduriformes con o sin blastoconidias y sin seudomicelios Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios. Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en rueda de timón. Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas. Se observan levaduras en casquete intracelulares compatibles con Histoplasma. b) Cultivo: Si no hubo desarrollo durante el lapso indicado de incubación se descartan los cultivos y se informa: “No se obtuvo desarrollo de hongos” o “Negativo para el cultivo micológico” Si hubo desarrollo, informar: Género y especie. c) Pruebas inmunológicas: A) Búsqueda de anticuerpos: Serología para (Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Coccidioides posadasii) según el caso Método: – Inmunodifusión Cualitativa: Resultado: Negativa o Positiva – Inmunodifusión cuantitativa: Resultado: Título (la mayor dilución del suero que tenga reacción de identidad) MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO APOE- LCR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 7 de 8 – Contrainmunoelectroforésis: Resultado: Negativa o Positiva (informar el número de bandas con movilidad catódica y / o número de bandas con movilidad anódica según el caso). B) Búsqueda de antígenos: Detección de antígeno capsular de Cryptococcus Método: – Aglutinación de partículas de látex: Material: LCR (antigenorraquia) – Antigenorraquia cualitativa: Resultado: Negativo ó Positivo – Antigenorraquia cuantitativa: Título (informar la mayor dilución del LCR que tenga reacción positiva) Material: Suero (antigenemia) – Antigenemia cualitativa: Resultado: Negativo ó Positivo – Antigenemia cuantitativa: Título (informar la mayor dilución del suero que tenga reacción positiva) 7.5.4 Interpretación El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por sí solo si se trata de un patógeno primario. El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal tiene valor diagnóstico cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente. 7.5.5 Tiempo de entrega: El cultivo debe entregarse luego de 3 a 4 semanas de incubación. Si hay desarrollo durante la incubación, se realiza un informe preliminar describiendo los elementos vistos en la microscopia. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... EXAMEN MICOLÓGICO LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO APOE- LCR Fecha: agosto 2011 Versión: 2 Página 8 de 8 Pruebas serológicas realizarlas siempre que sea posible y ante la sospecha según epidemiología del paciente y caso clínico. Informar dentro de las 72 hs. 8. FORMULARIOS Y REGISTROS 8.1 Registro de pacientes: General del Laboratorio (libro foliado, informático, etc.) Libro interno de Micología o sistema informático Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red (ej : al Instituto C.Malbran) 8.2 Informes: Protocolo resultado de Líquidos de punción Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red 9. DOCUMENTOS ASOCIADOS PR ( Manual de Procedimiento Pre- analítico) PAMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos) MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad) 10. ANEXOS Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO: No aplica MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 1 de 20 1. OBJETIVO: Desarrollar el procedimiento a seguir para el inmunodiagnóstico de las micosis sistémicas. 2. ALCANCE: Todas las muestras de suero, líquido cefalorraquídeo (LCR), orina, lavado broncoalveolar, según el tipo de prueba a realizar y recolectadas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PRTT). 3. PERSONAL AFECTADO: Personal profesional y técnicos del sector Microbiología, Micología 4. REFERENCIAS: Guía de Diagnóstico de Micosis Sistémicas. “El Laboratorio y el Diagnóstico de las Micosis Sistémicas”. Curso Teórico-Práctico. Departamento Micología. INEI. ANLIS “Carlos G. Malbrán”. Canteros C., Davel G. y Rodero L. 2001 Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. R. Negroni, Dra. L.Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, ed. Federación Bioquímica de la Prov. de Bs. As. Argentina, 1999. Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. J. Pemán, a • • • • • E.Martín-Mazuelos, MC Calvo. Rev Iberoamericana Micol. 1 ed. Bilbao, España. 2001 Conti-Díaz IA, Somma-Moreira RE, Gezuele E, Giménez AC de, Pena MI, Mackinnon JE. Immunoelectroosmophoresis-immunodiffusion in paracoccidioidomicosis. Sabouraudia 1973, 11: 39-41. Kaufman L, Reiss E. Serodiagnosis of fungal diseases. En: Rose N, Conway de Macario E, Fahey J, Friedman H, Penn G. Manual of Clinical Laboratory Immunology, 4th. Ed. ASM, Washington, 1992, p.506-528. Manual of standardized serodiagnostic procedures for systemic micosis. Part I: Immunodiffusion test. Pan American Health Organization, Washington, 1972. Manual of standardized serodiagnostic procedures for systemic micosis. Part II: Complement fixation test. Pan American Health Organization, Washington, 1974. Ouchterlony O. Handbook of immunodiffusion and immunoelectrophoresis. Ann Arbor Science Publisher Inc. 1970 Elaborado por: S.Cataldi, M.C Perrone, A.Arechavala Fecha: julio 2011 Versión Original Revisado por: L.Guelfand , L López Moral Fecha: agosto 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: agosto 2011 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 2 de 20 • Zaror L, Robles AM, Negroni R. Pruebas de inmunodifusión en medios gelosados con el agregado de polietilenglicol 6000 para el serodiagnóstico de las micosis. Rev Argent Microbiol 1978, 10: 61-64. 5. DEFINICIONES: PAMR: Etapa Pre-analítica- Manual de Medios y Reactivos PATT: Etapa Pre-analítica- Manual de Toma y Transporte de muestras AMID: Etapa Analítica -Manual de Identificación. APOE: Etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar PPFI: : Etapa Post-Analítica -Formularios e Informes MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad MA: Manual Administrativo 6. RESPONSABILIDADES: Jefe de Sección Micología/Microbiología (según hospital) Bioquímico a cargo del área Micología 7. DESARROLLO: 7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO Los métodos serológicos permiten detectar anticuerpos específicos que pueden ser el primer elemento diagnóstico de micosis sistémicas endémicas u oportunistas y corroboran la sospecha de las últimas. Ademas complementan al hallazgo del hongo por métodos directos y son de gran utilidad en el seguimiento de las micosis. Cuando el paciente presenta lesiones casi inaccesibles o donde es muy difícil la toma de muestra, la serologia puede convertirse en el único elemento de diagnóstico. Por otra parte, proporciona información rápida y fiable y se utiliza como prueba tamiz, que permite discriminar entre varias micosis a bajo costo. La detección de antígenos circulantes es un método que se utiliza para el diagnóstico rápido de micosis invasoras en huéspedes inmunocomprometidos. Estos pacientes habitualmente no pueden formar anticuerpos y la toma de muestras para el diagnóstico directo puede ser muy difícil o peligrosa. Estos marcadores biológicos permiten iniciar el tratamiento en muchos casos sin la confirmación micológica. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 3 de 20 Por su parte la realización de pruebas cutáneas con antígenos fúngicos permite identificar a individuos infectados por los diversos agentes de micosis profundas y aún superficiales. Otra utilidad es su uso para estudiar la capacidad de respuesta de inmunidad mediada por células en enfermos con algún tipo de inmunodeficiencia. No son útiles para el diagnóstico de enfermedad pero estas pruebas de hipersensibilidad retardada sirven como elemento pronóstico en los pacientes con diagnóstico de certeza. Otro uso es para la realización de encuestas epidemiológicas y para determinar áreas endémicas. La aspergilina tiene un valor diferente ya que se utiliza para estudiar la sensibilización de individuos atópicos con antígenos de Aspergillus y mide la respuesta inmediata (Hipersensibilidad tipo I). 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Portaobjetos de vidrio Pipetas automáticas Perforadores de metal de 1 mm y 3mm de diámetro Pipetas serológicas de 10 ml y 5 ml graduadas 1/10 o pipetas automáticas Cuba de electroforesis Fuente de corriente continua Cámara húmeda Lente de aumento o lupa Papel de filtro tipo Whatman Nº 1 o similar cortado en tiras y en cuadrados Heladera Placas de Petri de 15 mm x 100 mm ó 60 mm x 12 mm Cortador de gel de 7 hoyos ó perforador metálico de 4 mm de diámetro Centrífuga Crioviales con tapa a rosca Lector de placas de ELISA con filtros 405 y 620 nm Placas con oquedades circulares para pruebas de aglutinación Centrífuga para tubos Eppendorf Luz Agitador horizontal tipo VDRL Baño termostatizado 56 °C y 100 °C Jeringas y agujas intradérmicas Reactivos: Se indican los reactivos para cada una de las técnicas que se explican más abajo MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 4 de 20 a. Inmunodifusión (ID) Agar purificado (Agar Noble Difco, Agar Oxoid N°3)/ Agarosa Cloruro de sodio Citrato de sodio Solución fisiológica Fenol Polietilenglicol 6000 Fosfato monobásico de sodio Fosfato dibásico de sodio Azida sódica 1:1000 o mertiolato-borato de sodio 1:10 000 Antígenos estandarizados Agua destilada Sueros control positivo Azul de Coomasie Acido acético glacial Etanol a.1. Preparación de los reactivos de ID Preparación de solución buffer de fosfatos pH 7,4 M/15 Na2HPO4 80,8 ml M/15 NaH2PO4 19,2 ml Preparación de solución fisiológica fenolada 3‰ NaCl 0,85 g Fenol 3 ml Agua destilada c.s.p. 100 ml Preparación del agar para inmunodifusión Agar purificado 1g PEG 6000 1g Solución buffer de fosfatos 1 ml Solución fisiológica fenolada 99 ml Se prepara la solución fisiológica fenolada al 3‰: Al agua destilada se le agregan el NaCl y el fenol. Luego se agrega el agar y el PEG y se mezclan durante 5 minutos. Se lleva a baño de agua a 100 °C hasta su disolución completa y se distribuye en tubos con tapa a rosca con 5 y 15 ml por tubo y se conserva a 4 °C hasta su utilización. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 5 de 20 Preparación de la solución buffer de citrato-cloruro de sodio pH 8,2 Citrato trisódico 5g Solución salina isotónica 100 ml Mezclar bien hasta disolución total del citrato, envasar en un frasco con tapa a rosca. Mantener a temperatura ambiente. Preparación de azul de Coomasie Azul brillante de Coomasie R-250 1g Etanol 90 ml Ácido acético glacial 20 ml Agua destilada 90 ml Disolver el azul en etanol y luego añadir el ácido acético y el agua destilada. Esta solución puede reutilizarse muchas veces. Para decolorar se utiliza la misma solución sin azul. a.2. Preparación de las placas o láminas para ID • Se funde el agar en baño de agua a ebullición y se deja enfriar hasta 55-60 °C. • Se vierte un tubo de 15 ml si se realiza la ID en placa • Para preparar portaobjetos, primero se diluye 1 ml de agar en 7 ml de agua destilada y se cubre el portaobjetos con una capa muy fina y se deja secar hasta formar una película seca y opaca. Luego se agregan 2,5 ml de agar sin diluir. • Se deja solidificar y se puede mantener a 4 °C hasta una semana. Los portaobjetos así preparados deben conservarse en cámara húmeda. b. Contrainmunoelectroforesis (CIE) b.1. Preparación de los reactivos para CIE Preparación de la agarosa para CIE Agarosa Polietilenglicol 6000 Buffer veronal pH 8,2 1g 1g 100 ml MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 6 de 20 Se disuelve la agarosa y el polietilenglicol en el buffer calentando suavemente en baño de agua hasta ebullición. Se envasa en tubos con tapa a rosca,con 10 ml de agarosa y se conserva a 4 °C. b.2. Preparación de las láminas para CIE • Se preparan portaobjetos de la misma manera que para la ID colocando primero una fina película de agar diluido y luego cubriendo con 2,5 ml de la agarosa. • Se deja solidificar y se mantiene en heladera a 4 °C en cámara húmeda hasta una semana. c. Aglutinación de partículas de látex (AL) Esta técnica se utiliza para la detección de antígeno polisacárido capsular de Cryptococcus con equipos comerciales. Preparación de los reactivos • Pronasa: Esta enzima viene liofilizada, cada frasco se reconstituye con 1,75 ml de agua destilada y se fracciona en tubos Eppendorf con 50 μl/tubo y se conserva congelado a – 20 °C. Este reactivo dura así hasta un mes como máximo. Siempre debe comprobarse su actividad con el control correspondiente. • Buffer: El buffer de dilución de muestras 10X debe diluirse para obtener la solución 1X, en general se preparan 10 ml agregando 9 ml de agua destilada a 1 ml de buffer concentrado. • Control negativo: El contenido de este frasco control debe ser inactivado a 56 °C durante 30 minutos antes de comenzar a usarlo. d. ELISA doble sándwich Este método se usa para la detección de antígeno galactomanano de Aspergillus mediante un equipo comercial. 7.3 CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRAS A ANALIZAR: Para la detección de anticuerpos: Suero y LCR remitido en un tubo plástico con MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 7 de 20 cierre hermético a rosca, el volumen de la muestra debe ser de por lo menos 5 ml de sangre y 2-3 ml de LCR dentro de lo posible. Excepcionalmente se pueden utilizar otras muestras. (Ver PRTT) Para detección de antígenos: Suero, LCR, Orina, LBA o algún otro fluido orgánico. Deben ser remitidos en tubos plásticos, apirógenos, estériles con cierre hermético a rosca. El volumen de la muestra debe ser por lo menos de 5 ml de suero, orina, LBA y 2-3 ml de LCR. (Ver PRTT). 7.5 SECUENCIA OPERATIVA: 7.5.1 Precauciones de Seguridad Biológica Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) 7.5.2 Procesamiento de la Muestra: A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio del Laboratorio ó bien se la prepara para su derivación de acuerdo a las indicaciones del PRTT. La sangre, LCR, orina, LBA, se centrifugan a 2.000 r.p.m. durante 10 minutos. Se separa el suero o sobrenadante y se mantiene refrigerado a 4 ºC. Si su procesamiento se demora más de una semana se conserva a -20ºC. A las muestras de suero que se utilizan para la detección de anticuerpos se les añade una gota de azida o mertiolato como conservador. Pruebas inmunológicas Son métodos de diagnóstico indirecto (independientes del cultivo) esencialmente de dos tipos I. II. Reacciones cutáneas in vivo Pruebas inmunológicas in vitro I. Reacciones cutáneas: Llamadas pruebas intradérmicas, sólo tienen valor epidemiológico y pronóstico. El resultado de la intradermorreacción sirve para pronóstico y no indica evolución, porque aún con buena evolución con el tratamiento adecuado, un paciente que mantiene prueba cutánea negativa tiene mayor probabilidad de recidivas, en tanto el que en el momento del diagnóstico tiene prueba positiva o se positiviza con el tratamiento es indicador de buen pronóstico de la enfermedad. También sirve para medir capacidad de respuesta inmune. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 8 de 20 Tipo de antígenos utilizados en estas pruebas: a) histoplasmina b) coccidioidina c) paracoccidioidina d) aspergilina e) esporotriquina f) candidina g) tricofitina La aspergilina tiene un uso y significado diferente ya que se utiliza para medir hipersensibilidad inmediata (tipo I de Gell y Coombs) y semidemorada (tipo III). Determina la sensibilización de un paciente frente a antígenos de Aspergillus (respuesta mediada por IgE) o la formación de complejos inmunes (Fenómeno de Arthus mediado por IgG). Para la primera, la lectura se efectúa a los 15 minutos y usando un control; la lectura semidemorada se realiza a las 6 horas y se observa la presencia de roncha urticariana. El resto de las intradermorreacciones miden hipersensibilidad retardada (inmunidad mediada por células) y se leen a las 48 h midiendo el infiltrado, no interesa el eritema. II. Pruebas inmunológicas in vitro: A. Detección de anticuerpos B. Detección de antígenos circulantes Como ya fue mencionado, aún no está totalmente comprendido el papel de los anticuerpos en la respuesta inmune frente a los agentes fúngicos; sin embargo, la producción de inmunoglobulinas específicas contra los distintos agentes etiológicos de las micosis es de gran utilidad para el diagnóstico serológico. En las micosis sistémicas endémicas se producen anticuerpos en concentración elevada y proporcional a la gravedad de la infección. Estos anticuerpos pueden ser fácilmente detectados por diferentes reacciones inmunológicas que se convierten así en herramientas de gran valor para el diagnóstico y también para el seguimiento de estas patologías. En las formas agudas o subagudas pueden utilizarse técnicas que permiten la detección de anticuerpos de tipo IgM, como la aglutinación directa, hemaglutinación o precipitación en tubo. Sin embargo, sus resultados son positivos solamente en las primeras etapas de la enfermedad y se negativizan en plazos cortos independientemente de la evolución de la afección. Las técnicas que permiten evidenciar anticuerpos IgG son las más utilizadas para el diagnóstico de formas subagudas y crónicas y además permiten seguir la evolución de estas enfermedades. El incremento de micosis en huéspedes inmunocomprometidos que no tienen capacidad para formar anticuerpos adecuadamente, ha requerido el desarrollo de técnicas inmunológicas que permitan detectar antígenos y/o metabolitos circulantes. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 9 de 20 En ocasiones, la combinación de métodos destinados a detectar anticuerpos con técnicas de demostración de antígenos permite llegar o acercarse al diagnóstico de formas graves de estas micosis. II.A.1. Métodos de detección de anticuerpos circulantes II.A.1.1. Inmunodifusión (ID) La prueba más difundida y mejor estandarizada es la inmunodifusión en medios gelosados (agar o agarosa), ya que para su realización no es necesario contar con equipos costosos, es muy fácil de realizar y permite obtener resultados en 48-72 h. Esta es una técnica que se puede emplear como tamiz, probando diferentes antígenos fúngicos, ya que posee sensibilidad adecuada y gran especificidad (< 1% de reacciones cruzadas con antígenos bien controlados). Además puede servir en el seguimiento, como técnica semicuantitativa mediante diluciones seriadas del suero del paciente. En nuestro medio se utiliza para el diagnóstico serológico de paracoccidioidomicosis, histoplasmosis, coccidioidomicosis, aspergilosis broncopulmonar, candidiasis sistémica y en América del Norte también se usa para diagnóstico de blastomicosis. Siempre deben emplearse controles positivos y negativos simultáneamente con las muestras clínicas. Permite diagnosticar el 90 % de candidiasis sistémicas, 90 % de pacientes con aspergilomas, 70 % de las aspergilosis pulmonares alérgicas, 85 % de histoplasmosis, 94 % de paracoccidioidomicosis y 90 % de coccidioidomicosis. Realización de la ID Sacar las placas de la heladera Cortar con la matriz de 7 hoyos o con los perforadores de metal de 4 mm de Esquema 1 diámetro según Retirar los siete cilindros del gel con aguja o una pipeta Pasteur. No dañar las paredes porque provoca una difusión desigual y las bandas luego son difíciles de interpretar. Enumerar los hoyos con marcador indeleble como indica el esquema I (anverso del porta) Con pipeta automática llenar los hoyos 1 y 4 con suero control positivo de referencia Esquema 1 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 10 de 20 1 6 2 7 5 3 4 Los antígenos y sueros no deben sobrepasar el límite del hoyo. Llenar los hoyos 2, 3, 5 y 6 con los sueros que se van a ensayar Revisar que no queden burbujas de aire Tapar la placa e incubar en cámara húmeda una hora a temperatura ambiente Con capilar o pipeta Pasteur colocar el antígeno específico en el hoyo central Colocar la placa en cámara húmeda a temperatura ambiente que no exceda los 25 ºC o en estufa a dicha temperatura Leer diariamente durante tres días las bandas de precipitación antígenoanticuerpo Transcurridas las 72 h a 25 ºC se cubre el gel con buffer citrato de sodio, durante 2-3 h para eliminar bandas inespecíficas. Si la reacción se realiza sobre láminas o portaobjetos, luego del tratamiento con el buffer de citrato, se lavan con agua destilada y luego se envuelven con cuadrados de papel de filtro Watmann previamente humedecido, se dejan secar en estufa, se moja nuevamente el papel para despegarlo y se colorean con azul de Coomasie. Luego se decoloran y así se visualizan mejor las bandas de precipitación. Resultados posibles: Reacción de identidad Reacción de no identidad Identidad parcial Ausencia de bandas de precipitación Interpretación de los resultados de la ID La primera lectura debe realizarse a simple vista, buscando la presencia y el número de arcos de precipitación entre el suero problema y los extractos antigénicos. Las líneas de precipitación específica (antígeno-suero control), se utilizan como patrones de referencia en cada prueba. La aparición de una o más bandas de MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 11 de 20 identidad por la interacción del suero del paciente con el antígeno constituye una “reacción positiva”. Los sueros que dan bandas de precipitación, pero no dan identidad con el suero control (línea específica de referencia) deben considerarse sospechosos y requieren nuevos estudios Ver esquema 2 Pocillo 1: Suero control positivo Pocillo 2: Suero de paciente Pocillo 3: Antígeno Esquema 2 1 1 1 2 2 3 Identidad 3 Identidad parcial 2 3 No Identidad II.A.1.2. Contrainmunoelectroforesis (CIE) La contrainmunoelectroforesis es una técnica que tiene mayor sensibilidad que la inmunodifusión pero que mantiene casi la misma especificidad. Se realiza la prueba de la manera recomendada por Conti-Díaz que consiste en la contrainmunoelectroforesis a la que se agrega una inmunodifusión secundaria, de este modo es posible detectar anticuerpos contra parcelas antigénicas de movilidad catódica que, de otra manera, se perderían. Para su realización se requiere agarosa, y contar con una cuba y fuente de poder para poder realizar la corrida electroforética. Tiene gran valor en pacientes con formas localizadas, aspergilosis broncopulmonar alérgica y es la que brinda mayor proporción de resultados positivos en enfermos con histoplasmosis asociada al SIDA, también puede aplicarse al diagnóstico de la esporotricosis. Realización de la prueba Habitualmente se realiza sobre portaobjetos pero puede realizarse en placas de mayor tamaño si deben analizarse varios sueros simultáneamente. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 12 de 20 Sobre portaobjetos se realizan 2 orificios en el centro del portaobjetos de 2 mm de diámetro separados por 1 cm, luego se realizan 2 orificios de uno de los lados de 4 mm y separados 6 mm de los orificios pequeños. Se coloca el portaobjetos en la cuba y se hacen puentes con tiras de papel de filtro, los orificios grandes deben quedar del lado del polo positivo. Se cargan los orificios pequeños con el antígeno y los grandes con el suero de los pacientes. Se corre durante 1 hora con 5 mA por portaobjetos o 100 V fijos. Una vez terminada la corrida se realizan otros 2 orificios de 4 mm del lado catódico y también a 6 mm de los orificios pequeños, estos últimos orificios se llenan nuevamente con suero (inmunodifusión secundaria). Se mantiene en cámara húmeda, se hacen lecturas diarias y la definitiva se hace a las 72 h luego de cubrir el portaobjetos con buffer de citrato de sodio durante 2 horas. Resultados: Se informa el número de bandas anódicas y catódicas que se observan (Esquema 3). Estos portaobjetos se pueden teñir de la misma forma que las láminas de ID Esquema 3: II.A.1.3. Prueba de fijación de complemento (FC) Otra prueba, estandarizada desde la década de 1970, es la fijación de complemento, que tiene mayor sensibilidad que la inmunodifusión pero tiene hasta un 25% de MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 13 de 20 reacciones cruzadas, en especial con títulos bajos. Cuando esto sucede, se recomienda repetirla en tres semanas ya que el título de anticuerpos específicos suele aumentar 4 ó más veces en tanto que las reacciones cruzadas con antígenos heterólogos suelen mantener títulos estables o aumentar mucho menos que con el antígeno homólogo. El uso combinado de esta técnica con la ID también permite excluir las reacciones cruzadas. FC es la técnica ideal para el seguimiento ya que permite confeccionar curvas serológicas. Sin embargo, en las últimas décadas ha disminuido su empleo ya que es una técnica engorrosa, con muchos pasos, utilización de mucho material y varias causas de error. En ocasiones podría ser reemplazada por el EIA, pero todavía no existen muchos equipos comerciales y los métodos caseros son más difíciles de estandarizar y comparar resultados interlaboratorios. Esta última técnica también presenta el mismo inconveniente que la FC con respecto a las reacciones cruzadas y por lo tanto su uso es más adecuado para seguimiento o acompañada de otros métodos más específicos. II.B.2. Métodos de detección de antígenos II.A.2.1. Aglutinación de partículas de látex (AL) Este método es utilizado universalmente para la detección de antígeno polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans. En la actualidad existen equipos comerciales que cuentan con controles positivos y negativos y proteasa para destruir complejos inmunes, y así aumentar la sensibilidad y especificidad, evitando los falsos positivos, en especial por factor reumatoideo. Esta técnica puede utilizarse con suero o LCR y es útil, tanto para el diagnóstico como para el seguimiento de la criptococosis, ya que los títulos suelen ser proporcionales a la gravedad de la enfermedad y van disminuyendo conforme el tratamiento es efectivo. También es un alerta acerca de las recaídas ya que aumenta en esos casos. El seguimiento debe realizarse siempre con el mismo reactivo, ya que como fue mencionado, no todos tienen el mismo nivel de detección y por lo tanto los títulos no son comparables. La AL también ha sido usada para el diagnóstico de la candidiasis, aunque en ese caso la sensibilidad es baja debido a que los antígenos mananos de Candida se combinan rápidamente con anticuerpos y forman complejos inmunes que son eliminados de circulación (corta vida media). Para aumentar la sensibilidad de esta prueba se requiere la concentración de muestras (suero u orina) o la determinación en varias muestras seriadas. II.B.2.2. Elisa MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 14 de 20 Este método es apto para la detección de antígenos o anticuerpos, tiene gran sensibilidad aunque presenta reacciones cruzadas si se intenta buscar anticuerpos. Se han utilizado diversas variables de esta metodología para aumentar especificidad y sensibilidad y muchas de ellas incluyen el uso de anticuerpos monoclonales con ese objetivo. En la actualidad es una técnica difundida para detectar galactomanano de Aspergillus (para diagnóstico de aspergilosis invasora) y también hay equipos para evidenciar glucuronoxilomanano de Cryptococcus, mananos de la pared de Candida y para diagnóstico de histoplasmosis en huéspedes inmunocomprometidos. II.B.3. Otras técnicas: Numerosos investigadores han desarrollado gran variedad de pruebas inmunológicas para el diagnóstico de las micosis, la mayoría de ellas no se han comercializado y se han empleado solamente en centros especializados. La inmunofluorescencia se utiliza en equipos comerciales para el diagnóstico de neumocistosis, también por esta técnica se detectan anticuerpos antimicelio de Candida. La utilización de Western blot y Dot blot ha sido exitosa en el diagnóstico de algunas formas clínicas de histoplasmosis, blastomicosis y paracoccidioidomicosis. En la actualidad hay equipos comerciales que utilizan la inmunocromatografía para la detección de antígeno capsular de Cryptococcus. Valor e interpretación de las pruebas en las distintas micosis A. Detección de antígenos Criptococosis La detección de antígeno capsular en líquidos orgánicos y especialmente en LCR es importante en meningitis por Cryptpococcus y en otras formas de criptococosis diseminada. Ello se debe a la gran rapidez, sencillez y especificidad de la técnica, que puede hacerse en forma cualitativa o cuantitativa. Cualitativa: Se utiliza para diagnosticar nuevos casos o confirmar reinfección en pacientes inmunocomprometidos (SIDA y otras entidades). Se detecta antígeno capsular que es de naturaleza polisacárida, mediante anticuerpos monoespecíficos, dirigidos frente a él y unidos a partículas de látex. La reacción antígeno-anticuerpo se detecta a simple vista como aglutinación. Cuantitativa: Se emplea en el momento del diagnóstico, para contar con un valor inicial, y para seguimiento de la evolución del paciente ya diagnosticado. Permite evaluar la eficacia del tratamiento antifúngico empleado. Generalmente se realiza en LCR y / o suero. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 15 de 20 Consultar el inserto del equipo comercial y seguir las instrucciones de su fabricante. La sensibilidad de las diferentes técnicas comercializadas varía entre el 93% y el 100% con una especificidad del 93-98%. Pueden ocurrir falsos positivos debido a la presencia de factor reumatoideo o en pacientes con lupus o sarcoidosis, que desaparecen al tratar el suero con 2-mercaptoetanol. También se han descrito falsos positivos al arrastrar medio de cultivo de agar chocolate junto con la colonia, ansas de platino o desinfectantes, así como en la infección sistémica por Trichosporon beigelii. Actualmente se comercializan tiras de inmunocromatografía (IMMY) que tienen muy buena sensibilidad, con resultado muy rápido y sirven para diagnóstico. No tienen utilidad como método cuantitativo ni para seguimiento. Aspergilosis invasora La detección de galactomanano se realiza por técnica de doble sándwich ELISA (Platelia Aspergillus-Bio Rad) con un límite de detección de 1 ng/ml y una sensibilidad de 83-100 % y una especificidad de 71-89 %. Esta técnica reconoce el galactomanano de A. fumigatus, A. flavus y A. niger. La variabilidad en los valores de sensibilidad y especificidad es dependiente de la población examinada, de las condiciones en que se realiza la prueba y el régimen de inmunosupresión que tiene el paciente. Esta prueba sólo se realiza en centros de referencia, ya que el costo del equipo es alto y tiene una fecha de vencimiento corta. II. B Detección de anticuerpos Candidiasis Se ha cuestionado la utilidad de la detección de anticuerpos anti-Candida en pacientes con candidiasis invasora (CI) por presentar dos limitaciones: • la detección en pacientes que están sólo colonizados por Candida. Con antígenos citoplasmáticos habitualmente en pacientes colonizados la ID es negativa y hay títulos altos en endocarditis, u otras formas diseminadas. • la respuesta de anticuerpos puede estar retrasada, reducida o no existir en pacientes inmunodeprimidos. A diferencia de los anticuerpos antimicelio, los anticuerpos anticitoplasmáticos no se positivizan en colonización. Otra metodología que es detecta anticuerpos antimicelio es la inmunofluorescencia, existen equipos comerciales (Vircell), aunque no están disponibles en nuestro país. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 16 de 20 Esta prueba al igual que la CIE se deben aplicar a pacientes con candidemias persistentes, neumonitis, endocarditis, abscesos por heridas intra-abdominales, pacientes con catéteres urinarios o intravenosos, pacientes debilitados, aquellos que reciben tratamiento inmunosupresor antibiótico o antineoplásico prolongado, que presentan fiebre de origen desconocido o cuya enfermedad siga un curso no habitual. Las pruebas serológicas se usan para determinar la significación clínica de los aislamientos de C. albicans y otras especies del género a partir de muestras no estériles. La detección de anticuerpos precipitantes se considera presuntiva de candidiasis sistémica, pero también puede indicar candidemia transitoria o colonización. La ID y la CIE tienen una sensibilidad del 90 % para casos comprobados de candidiasis sistémica, son específicas para todo el género Candida. Cuando se sospecha candidiasis y las reacciones de ID son negativas con el antígeno de C. albicans la prueba debe repetirse con el antígeno de C. krusei. La decisión de tratar al paciente no debe basarse sólo en los datos serológicos, sino en todos los datos clínicos y de laboratorio disponibles. En las pruebas de CIE se debe probar el suero del paciente frente a diluciones del antígeno al ½ y ¼ para determinar la concentración óptima de éste (el exceso de antígeno o de anticuerpo provoca ausencia completa de bandas de precipitación por el llamado fenómeno de zona y se redisuelven por exceso de antígeno o anticuerpo). Un aumento cuádruple del título o uno mayor de 1/8 se considera sugerente de candidiasis invasora. El antígeno de Candida da bandas de precipitación A, B y C frente al suero control. Los sueros de los pacientes que forman de una a tres bandas de identidad con el suero control se consideran positivos. Debe sospecharse candidiasis sistémica cuando el estudio de muestras seriadas de suero muestre conversión de negativo a positivo o aumento del número de bandas de precipitación. Descensos del número de bandas puede indicar éxito de la terapia antifúngica o eliminación de la colonización por remoción de catéteres, sondas o válvulas contaminadas. Aspergilosis crónicas La detección de anticuerpos específicos en suero, es complementario para confirmar el diagnóstico de aspergiloma pulmonar (AP) y de la aspergilosis bronco pulmonar alérgica (ABPA) y en la aspergilosis semiinvasora crónica. También tiene gran utilidad en el seguimiento de estas micosis ya que los títulos descienden o las pruebas se negativizan cuando se logra la curación (ej. después de la cirugía). MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 17 de 20 Sólo se consideran positivos los sueros que dan una o más bandas de identidad con el suero control. Cuando hay reacciones de no identidad, pero sí las bandas de precipitación, se consideran sospechosas y se continúa investigando el caso. Una de las causas de esto último puede ser la presencia de proteína C reactiva (PCR) en el suero del paciente. Esta proteína aparece aumentada en enfermedades inflamatorias y puede reaccionar con un glucopéptido presente en algunos antígenos aspergilares y se denomina sustancia C. Esta sustancia se disuelve en presencia de buffer citrato de sodio al 5 % en solución salina, razón por la cual se lavan las placas con citrato y solución fisiológica (Sol.Fis) durante 2 horas. Las bandas que persisten luego de los lavados y no dan identidad con el suero control, justifican nuevos estudios ya que pueden estar igualmente asociadas a aspergilosis. La presencia de una o más bandas puede indicar aspergiloma (bola fúngica), aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) o aspergilosis invasora crónica. Cuando se observan una o dos bandas puede indicar cualquier forma clínica de la enfermedad. Cuando aparecen tres a cuatro bandas está asociada invariablemente a bola fúngica o aspergilosis invasora crónica. Los sueros de los pacientes deben probarse frente a los antígenos específicos de A .fumigatus, A. níger y A. flavus, por este método ya que no hay prácticamente reacciones cruzadas entre estos antígenos Las reacciones de ID son positivas en el 90 % de los casos de aspergilomas y en el 70 % de aspergilosis broncopulmonar alérgica. Coccidioidomicosis Los enfermos con coccidioidomicosis habitualmente forman anticuerpos específicos que pueden ser detectados por las técnicas serológicas convencionales tanto en suero como en LCR. Los métodos estandarizados son la inmunodifusión en gel de agar, la fijación de complemento, también puede utilizarse la precipitación en tubo en las formas agudas o de primoinfección, esta reacción puede ser reemplazada por la inmunodifusión con antígeno calentado (fracción termoestable) que detecta IgM, en tanto que la fijación de complemento puede suplirse con la inmunodifusión CF (con antígeno no calentado) que permite detectar los anticuerpos IgG que persisten luego de la etapa aguda. Los títulos de la fijación de complemento son proporcionales a la gravedad de la afección pero cuando éstos son ≤ 1/8 puede tratarse de reacciones cruzadas con antígenos de H. capsulatum o B. dermatitidis. En las formas diseminadas los títulos serológicos suelen ser superiores a 1/32; en general cuando el título es ≥ 1/16 se sospecha compromiso extrapulmonar. También MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 18 de 20 se han desarrollado pruebas de enzimoinmunoensayo que son de alta sensibilidad pero menos específicas que las anteriores; recientemente se detectó antigenuria utilizando ELISA para H. capsulatum en 58,3% de pacientes con cocidioidomicois y en base a este equipo se desarrolló uno similar que detecta galactomanano de Coccidioides con un 70,8% de sensibilidad y que solamente presentaba 10,7% de reacciones cruzadas en pacientes con otras micosis sistémicas y la reacción fue negativa en 99,4% de individuos sanos o pacientes con patologías no micóticas. Paracoccidioidomicosis El diagnóstico serológico de esta afección se basa fundamentalmente en las pruebas de inmunodifusión cuali o semicuantitativa y la contrainmunoelectroforesis en tanto que la fijación de complemento es un método que puede realizarse en centros especializados. Los antígenos que brindan mejores resultados son los provenientes de cultivos de fase levaduriforme, sin embargo también pueden utilizarse filtrados de la fase micelial. Una de las principales fracciones antigénicas con alta especificidad es una glicoproteína de 43 kDa, también puede utilizarse el exoantígeno E7. Algunos antígenos crudos pueden dar reacciones cruzadas. Los títulos de anticuerpos son proporcionales a la gravedad de la afección y disminuyen a medida que el paciente mejora. Como habitualmente esta enfermedad no se presenta en inmunodeprimidos graves (que no forman bien anticuerpos), generalmente no se requiere la utilización de técnicas serológicas más sensibles y solamente en laboratorios de investigación se han implementado métodos de detección de antígenos circulantes. En caso de compromiso del SNC se puede emplear la ID o la CIE para evidenciar anticuerpos en el LCR. Histoplasmosis La prueba tamiz es la ID y se consideran pacientes con histoplasmosis activa los que dan reacciones de identidad para una o más bandas con el suero control (especificidad de la 100 %) (bandas M y H). La banda M se encuentra cerca del hoyo del antígeno y la banda H cerca del hoyo del suero. Esta última es menos frecuente y se encuentra con mayor frecuencia en pacientes con histoplasmosis activa y progresiva. La banda M puede ser indicio de una histoplasmosis aguda o crónica, de una infección pasada o de una prueba cutánea reciente. Si no hubo una reacción cutánea previa y aparece la banda M se interpreta como infección precoz, ya que este anticuerpo aparece antes que la banda H y desaparece más lentamente. El 70 % de los pacientes con histoplasmosis comprobada tienen la banda M y sólo el 10 % las bandas M y H. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 19 de 20 Si no hay bandas M y / o H el resultado se interpreta “negativo”. Es necesario tener la precaución de realizar la extracción de sangre para estas pruebas antes de realizar pruebas intradérmicas ya que si estas últimas son positivas pueden positivizar la ID (banda M). Esta prueba junto con la CIE son de gran valor en el diagnóstico de meningitis y dan resultados positivos en el LCR. Las técnicas serológicas estandarizadas para la detección de anticuerpos antiHistoplasma son la inmunodifusión y la fijación de complemento, también puede utilizarse la contrainmunoelectroforesis con muy buenos resultados y en algunos países, también se comercializan equipos para detectar anticuerpos por ELISA. En los enfermos con SIDA estas pruebas solo brindan resultados positivos en menos del 50% de los casos, excepto el ELISA donde la proporción de resultados positivos es mayor. En los pacientes trasplantados también el uso es limitado ya que los títulos suelen ser bajos y ocasionalmente podría ser difícil diferenciar entre histoplasmosis aguda o infección previa. En otros grupos de inmunocomprometidos estas pruebas serán de mayor o menor utilidad según la capacidad de respuesta inmune humoral de los pacientes. Si el resultado es negativo no excluye la enfermedad pero un resultado positivo de alguna de las pruebas de precipitación puede ser el primer elemento de diagnóstico en estos pacientes. También se han utilizado otros métodos de detección de anticuerpos como el Western blot que han demostrado una sensibilidad del 90% en las formas pulmonares agudas con 100% de especificidad utilizando un antígeno deglicosilado. La detección de antígenos en suero y especialmente en orina mediante pruebas de ELISA es ya rutinaria en algunos países, existen al menos 3 equipos comerciales de primera y segunda generación, aunque todavía no se ha logrado la especificidad deseada (hay reacciones cruzadas con paracoccidioidomicosis y blastomicosis, ya que aún no se identificado completamente el antígeno liberado en orina; además pueden encontrarse resultados contradictorios según el equipo utilizado. La sensibilidad mejoraría cuando se tratan las muestras con EDTA y calor para romper los complejos inmunes, También el uso de anticuerpos monoclonales que reconoce epitopes especie-específicos en un ELISA de inhibición ha demostrado una sensibilidad de 71% y especificidad de 98%. También puede detectarse antígeno en LCR y lavado broncoalveolar. Algunos trabajos demuestran que en el 90% de las formas diseminadas se encuentra antígeno en orina y en el 75% de los pacientes con histoplasmosis pulmonar aguda; los títulos de antigenuria serían mayores en las formas diseminadas y su disminución se correlaciona con la mejoría clínica. En nuestro país, aún no se cuenta con equipos comerciales para realizar esta técnica. Los equipos de detección de antígeno galactomanano de Aspergillus también presentan reacciones cruzadas en pacientes con histoplasmosis porque MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS APOE- INMU Fecha: agosto de 2011 Versión: 1 Página 20 de 20 probablemente en histoplasmosis también el carbohidrato eliminado por orina sea galactomanano. Exoantígenos La producción de exoantígenos puede utilizarse para la identificación de cultivos de fase micelial de Histoplasma, Coccidioides, Paracoccidioides que no presenten la morfología característica e independientemente de su capacidad de esporulación. Estos hongos tienen la capacidad de producir antígenos libres de células (exoantígenos). Estos antígenos se detectan por ID utilizando la misma metodología que para la detección de anticuerpos. Se obtienen mediante la extracción con una solución acuosa (1:5000) de mertiolato de sodio que se añade sobre la superficie de un cultivo de 8-10 días y se deja 24-48 h a 25 °C. Se concentra el extracto por ultrafiltración y luego se prueba la presencia de bandas de identidad con un antisuero específico. En la actualidad muchos exoantígenos se utilizan para detectar anticuerpos específicos. APOE-AF MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 Página 1 de 20 1.0) OBJETIVO Determinar la sensibilidad a los antifúngicos frente levaduras de los géneros Candida y Cryptococcus. 2.0) ALCANCE Todos los aislamientos de levaduras de los géneros Candida y Cryptococcus aislados de materiales en donde estos microorganismos pueden ser causa de infección sistémica o infecciones recidivantes por estos agentes. 3.0) PERSONAL AFECTADO Bioquímicos y técnicos del área Micología, pertenecientes a los laboratorios de los Hospitales del GCBA. 4.0) REFERENCIAS 1. Arechavala AI, Ochiuzzi ME, Borgnia MD, Santiso GM. Fluconazole and amphotericin B susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: Results of minimal inhibitory concentrations against 265 isolates from HIV:positive patients before and after two or more months of antifungal therapy.Rev. Iberoam. Micol. 2009; 26: 194-197. 2. Cantón Lacasa E, Martín-Mazuelos E, Espinel-Ingroff A. Métodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifúngicos (documentos M27-A3, M38-A y M44-A). En: Pemán J, Martín-Mazuelos E, Rubio Calvo MC. Guía práctica Identificación y diagnóstico en Micología Clínica. Rev Iberoam Micol Edición en CD 2010 3. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard Third Edition, 2008; M27-A3. Wayne, Pa 19087-1898 USA. Elaborado por: Ivana Maldonado Fecha: noviembre de 2010 Versión Original Revisado por: Liliana Guelfand, Alicia Arechavala Fecha: abril de 2011 Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: julio de 2011 APOE-AF MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 Página 2 de 20 4. Cuenca-Estrella M, Mellado E, Gómez-López A. et al. Evaluation of the Commercial Method ATB® F2 for the Detection in Vitro of Antifungal Resistance and its Correlation with the Reference Method of the European and the Micromethod of the NCCLS. Poster M-1601, 45th Annual ICAAC, New Orleans, September 2005. 5. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. EUCAST. Method for the determination of Minimum Inhibitory Concentration MIC) by Broth Dilution of Fermentative Yeasts. Discussion Document E Dis 7.1; 2002. 6. Manual del Curso a distancia y taller: “Determinación de la resistencia a los antifúngicos en el laboratorio”. Departamento Micología INEI. ANLIS. Dr Carlos G. Malbrán. Buenos aires, Argentina, 2006. 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; Approved guideline, 2004; M44-A. Wayne, Pa, USA. 8. Rodero L, Córdoba S, Vivot W, Campo M, Corfield P, Olguín C, et al. Métodos de difusión con discos para la determinación de sensibilidad a fluconazol en aislamientos de Candida spp. Rev Argent Microbiol 2006, 38: 155-163. 9. Rodriguez- Tudela JL,Donnelly JP, Arendrup MC, Arikan S, Barchiesi F, Bile J, et al. 2008. EUCAST technical Note on fluconazole. Clin Microbiol Infect. 14:193–5. 10. Ochiuzzi ME, Santiso GM, Arechavala AI. Correlation of Etest and Neo-Sensitabs diffusion assays on Mueller-Hinton-methylene blue agar with broth microdilution reference method (CLSI-M27-A2) for testing susceptibilities of Cryptococcus neoformans to amphotericin B and fluconazole.Medical Mycology, 2010; 48:893-896. 11. User’s Guide NEO-SENSITABS TM Susceptibility testing, 18th Ed. 2005/2006. Rosco Diagnostica A/S. 5.0) DEFINICIONES Pruebas de sensibilidad a los antifúngicos. 6.0) RESPONSABILIDADES Jefe de Sección Microbiología, Bioquímico a cargo del área Micología. APOE-AF MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 Página 3 de 20 7.0) DESARROLLO 7.1) FUNDAMENTO Se basa en determinar la sensibilidad de las levaduras frente a los antifúngicos habituales. Las pruebas de sensibilidad se podrán realizan por los siguientes métodos: ¾ Microdilución en caldo (CLSI y EUCAST): A partir de los ‘80, el CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute, antes National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)) inició los trabajos de estandarización de técnicas que permitieran detectar la resistencia in vitro a los antifúngicos. Luego de publicar distintos documentos, M27-T, M27-P, M27-A, en 2002 dio a conocer el documento M27-A2 (estándar aprobado) que sienta las bases para la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) para las levaduras de géneros Candida y Cryptococcus. En 2008 se conoció la última actualización, el M27-A3. Existe otro estándar del European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) documento E. Def 7.1 que permite obtener la CIM para las levaduras del género Candida. Ambos estándares son fiables, reproducibles y muy útiles para la vigilancia epidemiológica y gracias a ellos se puede conocer el perfil de sensibilidad de las distintas especies, y establecer cual sería el tratamiento inicial más adecuado. Sin embargo, la realización de estas técnicas es onerosa y muy laboriosa, por lo que su implementación se ve limitada a los centros de referencia. ¾ ATB® Fungus 3 (ATB F3): técnica no colorimétrico comercial, basado en el método de referencia National Committee for Clinical Laboratory Standards (CLSI). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard. 2002; Document M27-A2. Villanova, Pa. USA y Discusión 7.1 (MR). El ATB® Fungus 3 consiste en una galería de 16 pares de APOE-AF MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 Página 4 de 20 cúpulas, que contienen 5 antifúngicos: anfotericina B (AMB), fluconazol (FCZ), itraconazol (ITZ), Voriconazol (VCZ), 5 fluorocitosina (5FC), en distintas concentraciones. Según el valor de CIM se pueden categorizar los aislamientos como sensibles (S), sensibles dependientes de la dosis o intermedios (SDD) y resistentes (R). En el caso de 5 fluorocitosina (5FC) sólo puede obtenerse a la categoría de sensible (S) o resistente (R). Las galerías y los medios se conservan a 2-8°C en oscuridad hasta la fecha de caducidad indicada sobre el equipo.(Ver inserto) ¾ Discos de fluconazol Malbrán (DM): es un método de difusión en agar para FCZ. El Departamento de Micología INEI, ANLIS “Dr. C. Malbrán" desarrolló y estandarizó este método de difusión en agar, utilizando discos de papel cargados con FCZ. Esta técnica es aplicable a la rutina de los laboratorios y permite realizar el tamizaje para detectar los aislamientos de levaduras del género Candida, sensibles al FCZ. ¾Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco® (T): es un método de difusión en agar. En las Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco®, el antifúngico se encuentra en forma cristalina y se mezcla con una sustancia inerte sin actividad antimicrobiana que no interfiere con ningún aspecto del proceso. Existen varias tabletas para los antifúngicos más habituales en el mercado; pero las más usadas son FCZ y VCZ. Este método se basa en el estándar M44-A que público el CLSI en el 2004. Las tabletas se pueden conservar en heladera entre 2 y 8 °C hasta la fecha de caducidad indicada por su fabricante o a temperatura ambiente por 2 meses. (Ver inserto) ¾ Tiras con gradiente de concentración de un Antifúngico (Etest): Es una técnica cuantitativa para la determinación de la CIM a los antimicrobianos. Consiste en la utilización de una tira de plástico que lleva un gradiente de APOE-AF MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 Página 5 de 20 concentración del antifúngico en µg/ml. El valor de la CIM se indica por la formación de una elipse en la intersección entre el crecimiento del microorganismo y la zona de inhibición. (Ver inserto) ¾ Tarjetas de sensibilidad Vitek 2: es un sistema automatizado, que utiliza tarjetas plásticas descartables, que contienen una serie pareada de diluciones de los siguientes antifúngicos: anfotericina B (rango de concentración 0.25 a 16 g/ml), 5 fluorocitosina (rango de concentración, 1 a 64 g/ml), y voriconazol (rango de concentración 0.125 a 8 g/ml). Deben mantenerse en sus sobres a temperatura entre 2-8ºC hasta ser utilizadas. La lectura y la interpretación se realizan en forma automática, a través del software del equipo. 7.2) REACTIVOS: ¾ Microdilución en caldo (CLSI, EUCAST): • Medio RPMI 1640 • Glucosa al 2% (solo EUCAST) • 0.165 M buffer ácido morfolino propano sulfónico (MOPS) • Drogas antifúngicas • Placas para cultivo celular estériles • Lector de microplacas a 405 nm (solo EUCAST) ¾ATB® Fungus 3 (ATB F3): ● ATB Fungus 3 (bioMérieux, Marcy I`Etoile, France) - 25 galerias de ATB FUNGUS 3 en embalaje individual - 25 tapas de incubación - 25 ampollas de ATB F2 Medium APOE-AF MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS HOSPITAL.:.................... Fecha: julio 2011 Versión: 01 Página 6 de 20 - 25 fichas de resultados - 1 ficha técnica ¾Discos de fluconazol Malbrán (DM), Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco® (T): • Placas de Petri de 10 cm de diámetro • Solución 0,15 M de cloruro de sodio estéril (solución salina 0,85%) (SSE) • Agar Muller- Hinton • Glucosa • Azul de metileno • Discos de fluconazol Malbrán (DM) 25µg • Tabletas de Neo Sensitabs 1µg y TM Rosco (T): fluconazol 25 µg, voriconazol itraconazol 8 µg, ketoconazol 15 µg, anfotericina 10 µg, 5- fluorocitocina 1µg, caspofungina 5 µg. ¾ Tiras con gradiente de concentración de un Antifúngico (Etest): • Solución 0,15 M de cloruro de sodio estéril (solución salina 0,85%) (SSE) • Placas de Petri de 10 cm de diámetro • Medio RPMI 1640, o Mueller Hinton con azul de metileno. • Glucosa al 2% • Bacto agar • Tiras con los antifúngicos: anfotericina, fluconazol, itraconazol, 5fluorocitocina, caspofungina, anidulafungina, voriconazol, posaconazol, ketoconazol ¾ Tarjetas de sensibilidad Vitek 2: • Tarjetas de sensibilidad Vitek 2 (AST YSO1)Solución fisiológica estéril • Tubos de poliestireno APOE-AF MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 Página 7 de 20 7.3) MUESTRA: Aislamiento previamente identificado de Candida spp o Cryptococcus spp 76.4) TÉCNICA Es muy importante que el inoculo se prepare de colonias aisladas independientemente de la metodología utilizada. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) ¾ CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) Método de referencia de microdilución M27-A3 Medio de cultivo: RPMI 1640 con glutamina y sin bicarbonato (Gibco, ICN, Oxoid, Sigma), tamponado a pH 7 con 0.165 M de buffer ácido morfolino propano sulfónico (MOPS) (ICN, Sigma) Antifúngicos: Anfotericina B, Azólicos, Equinocandinas. Debe tenerse en cuenta la potencia de la droga utilizada para calcular la concentración de la solución madre a preparar. Las soluciones concentradas de antifúngicos insolubles en agua se preparan en DMSO. Los antifúngicos solubles en agua: FCZ, 5-FC, caspofungina (CPF) y micafungina (MCF) se disuelven en agua. La solución madre en el primer caso debe ser de 1 600 μg/ml (100 veces superior a la concentración más alta de antifúngico a ensayar) y en el caso de drogas solubles debe ser 10 veces superior a la mayor concentración de antifúngico a ensayar. Las soluciones madre se guardan en alícuotas de 1,1 ml en crioviales estériles y se congelan a -70 °C (máximo 6 meses) o a -40 °C (hasta 2 meses) Placas: se utilizan placas de 96 pocillos estériles con tapa con fondo en U. Preparación de la dilución de antifúngicos: se recomienda el método de las diluciones dobles seriadas aditivas. APOE-AF MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 Página 8 de 20 Para antifúngicos solubles las concentraciones finales van de 64 a 0,12 μg/ml. A partir de la solución madre se prepara la serie de diluciones 10 veces superiores a las que se utilizarán y luego se diluyen 1/5 añadiendo 4 ml de RPMI a cada tubo con 1 ml de la correspondiente solución de antifúngico y se dispensan 100 μl de cada una de ella en los pocillos de 1 a 10 (concentraciones de 128 a 0,25 μg/ml) que es el doble de las concentraciones finales deseadas. En el caso de drogas insolubles, se preparan de la misma manera los tubos con diluciones a una concentración 100 veces superior a cada concentración final deseada en DMSO. Luego se diluye 1/50 (100 μl de esta dilución en 4,9 ml de RPMI) y así quedan preparados en concentración doble a la concentración final deseada (entre 32 y 0,06 μg/ml). Se llenan los pocillos de 1 a 10 de cada de todas las filas con las distintas concentraciones de antifúngico, en el pocillo 11 se colocan 100 μl de RPMI (para utilizar como control de crecimiento) y en el pocillo 12 se colocan 200 μl de RPMI que sirve como control de esterilidad. Una vez preparadas, las placas se conservan envueltas en bolsas plásticas o papel de aluminio y se congelan a – 70°C o – 40 °C hasta el momento de su uso (la caducidad de la placa debe referirse al momento de preparación de la solución madre). Preparación del inóculo: Cada aislamiento almacenado o congelado debe tener al menos 2 pases por agar de Sabouraud glucosado (SDA). El inóculo se prepara tomando 5 colonias > 1 mm de un cultivo de 24 h en SDA que se resuspenden en SSE (NaCl 0,85%), se agita y se lee en espectrofotómetro a 530 nm para ajustar a densidad óptica de 0,5 McFarland (1-5 x 106 UFC/ml), se diluye 1:1000 en medio RPMI (1-5 x 103 UFC/ml) y esta es la suspensión que se utiliza para inocular las placas (doble de la concentración final). Se siembran 100 μl en cada pocillo del 1 al 11. En el caso de Cryptococcus el cultivo es de 48 h en SDA. APOE-AF MANUAL DE PROCEDIMIENTOS GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS HOSPITAL.:.................... Fecha: julio 2011 Versión: 01 Página 9 de 20 Siempre debe realizarse un control del inóculo utilizado sembrando una placa de agar cromogénico con 10 μl del pocillo control (11) y a las 24 h se cuentan las colonias, esto permite controlar pureza y concentración del inóculo. Incubación: las placas se incuban a 35 °C durante 48 h para Candida y 72 h para Cryptococcus. Lectura: la lectura visual se realiza con la ayuda de un espejo. Para los azoles y 5-FC la CIM es la concentración más baja de droga que produce una reducción aparente del crecimiento de la levadura ≥ 50% comparada con el control de crecimiento a las 48 h de incubación. Para las equinocandinas: la lectura es igual que para azoles pero se realiza a las 24 h. La CIM de AMB es la concentración más baja de antifúngico que inhibe el crecimiento de la levadura totalmente (100% de inhibición). Cepas control de calidad: C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei ATCC 6258. Puntos de corte: Se dispone de puntos de corte para: FCZ, VCZ, ITZ, equinocandinas y 5-FC. Antifúngico Intervalos de las CIM (μg/ml) Sensible S-DD Intermedio Resistente Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64 Itraconazol ≤ 0,12 0,25 - 0,5 ≥1 Voriconazol ≤1 2 ≥4 5-fluorocitosina ≤4 Caspofungina ≤2 >2 Micafungina ≤2 >2 Anidulafungina ≤2 >2 8 – 16 ≥ 32 APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 10 de 20 ¾ EUCAST (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases): método de referencia E. Def 7.1 del EUCAST Medio de cultivo: RPMI 1640 con 2 % de glucosa tamponado a pH 7 con 0.165 M buffer ácido morfolino propano sulfónico (MOPS) (Sigma, Chemical Co, St. Luis EUA). Antifúngicos: se ensaya la actividad in vitro de AMB (potencia 80%) y 5-FC (potencia 99,9%) (Sigma, Chemical Co, St. Luis EUA), FCZ (Pfizer, S. A., Argentina) (potencia 99,9%) e ITZ (Janssen, Argentina) (potencia 99,9%). Las soluciones stock de AMB, ITZ y FCZ se preparan en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, Chemical Co, St. Luis EUA) y la de 5-FC en agua destilada estéril (ADE). Los rangos de concentraciones en μg/mL : AMB e ITZ 0,015-16, 5-FC y FCZ 0,13-128. Micrométodo: se utilizan placas para cultivo celular estériles (96 celdas de fondo plano) (Nunclon 167008, Nunc, Naperville, IL, EUA). Se dispensan 50 µL por pocillo de las distintas concentraciones de antifúngicos desde la columna 1 a la 11, la columna 12 se reserva para ser cargada con medio de cultivo sin inóculo (control de esterilidad y blanco de lectura). Las placas así preparadas se conservan a –70ºC durante un tiempo máximo de 2 meses. Inóculo: para todos los métodos, el testeo se realiza a partir de un cultivo de 24 h a 35ºC en agar Sabouraud. Se prepara un inóculo de turbidez 0,5 McFarland en solución 0,15 M de cloruro de sodio estéril (solución salina 0,85%) (SSE) (aproximadamente 1-5 x 106 UCF/mL). Se siembran las microplacas y se incuban 24 y 48 h. La lectura se realiza en un lector de microplacas a 405 nm (Labsystems Multiskan Multisoft, Basingstoke, UK). Se calcula el 100% de crecimiento promediando la absorbancia de las celdas controles sin droga, y se considera la CIM para AMB cuando la disminución de la densidad óptica sea de un 95% comparada con el control de crecimiento, mientras que para los azoles se considera una reducción del 50%. APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 11 de 20 Se consideraran los siguientes puntos de corte en μg/mL: Antifúngico Intervalos de las CIM (μg/ml) Sensible S-DD Intermedio Resistente Fluconazol ≤2 4 ≥4 Itraconazol ≤ 0,13 0,25 - 0,5 ≥1 Voriconazol ≤1 2 ≥4 5-fluorocitosina ≤4 Anfotericina* ≤1 8 – 16 ≥ 32 >2 *No hay puntos de corte disponibles, estos son valores sugeridos según las CIM poblacional de los aislamientos. ¾ATB® F3: la técnica se lleva a cabo siguiendo estrictamente las indicaciones del fabricante. ATB® F3 consiste en una galería que contiene 16 pares de cúpulas. El primer par, sin antifúngico, sirve de control de crecimiento. Las 15 cúpulas siguientes contienen 5 antifúngicos en las siguientes concentraciones: 5-FC 4 y 16 μg/ml, AMB 0,5-16 μg/ml; FCZ 0,25- 128 μg/ml; ITZ 0,125- 4 μg/ml y VCZ 0,06- 8 μg/ml. Inóculo: a partir de un cultivo puro de hasta 96 hs se realiza una suspensión de turbidez equivalente a 2 de la escala McFarland, luego se transfiere 20 μl de esta suspensión al ATB F3 Medium y se procede a inocular las galerías distribuyendo 135 μl de ATB F3 Medium por cúpula (aproximadamente 3x104 levaduras/ml o 4x103 levaduras por cúpula). Se coloca la galería en un contenedor hermético con un papel absorbente humedecido. Se incuba 24 hs (+/- 2 horas) en aerobiosis a 35ºC. Cuando el crecimiento es insuficiente se incuba 24 hs más. En todos los ensayos se APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 12 de 20 verifica la presencia de un crecimiento suficiente en las cúpulas testigo. La lectura se realizará de manera visual. Se tomaran como puntos de corte los siguientes valores de CIM para Candida spp.: Antifúngico Intervalos de las CIM (μg/ml) Sensible S-DD Intermedio Resistente Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64 Itraconazol ≤ 0,13 0,25 - 0,5 ≥1 Voriconazol ≤1 2 ≥4 5-fluorocitosina ≤4 Anfotericina* ≤1 8 - 16 ≥ 32 >2 *No hay disponibles puntos de cortes, estos son valores sugeridos según las CIM poblacional de los aislamientos. Para Cryptococcus neoformans: Antifúngico Intervalos de las CIM (μg/ml) Sensible Fluconazol ≤4 5-fluorocitosina ≤4 S-DD Intermedio 8 Resistente ≥ 16 8 - 16 ≥ 32 Métodos de difusión en agar ¾Discos BD-BBL, Oxoid, Discos de fluconazol Malbrán y Tabletas de NeoSensitabs Rosco® (T): APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 13 de 20 A partir de un cultivo de 24 h a 35ºC en Agar Sabouraud glucosado, se prepara un inóculo de turbidez 0.5 McFarland en SSE. Se utilizan placas de Petri de 10 cm de diámetro, con 25 ml de agar MullerHinton, suplementado con 2 % de glucosa y con el agregado de azul de metileno, en una concentración final de 0.5 μg/ml (medio MHm). La superficie de la placa de petri con medio MHm se hisopa en tres direcciones con el inoculo correspondiente. Luego se colocan los discos/tabletas de antifúngico, con la ayuda de pinza estéril. Se incuban las placas invertidas a 36 ± 2°C, durante 24 horas. Si transcurridas las 24 hs de incubación, los halos no son claramente distinguibles, se prolonga la incubación 24 horas más para dar lugar a especies de desarrollo más lento Lectura e interpretación de los resultados: Lectura: Se utiliza un calibre o una regla para medir el diámetro del halo externo de la zona de inhibición. Importante: realizar la lectura de las colonias con desarrollo confluente. Dentro de la zona de inhibición pueden crecer colonias que muestren un diámetro menor al de las colonias externas. Estas colonias no deben ser consideradas mutantes resistentes. Interpretación de los resultados: Discos de Fluconazol Malbrán Antifúngico Fluconazol Diámetro del halo en mm Sensible ≥ 16 A determinar por CIM < 16 APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 14 de 20 Tabletas de fluconazol Neo Sensitabs TM Rosco Antifúngico Diámetro del halo en mm Sensible S-DD Intermedio Resistente 14-10 <10 Anfotericina B* ≥ 15 Fluconazol ≥ 22 21-15 ≤14 Itraconazol ≥16 15-10 <10 Voriconazol ≥17 16-14 ≤13 5-fluorocitosina ≥20 19-12 ≤11 Caspofungina ≥15 14-12 ≤11 Ketoconazol ≥30 29-23 ≤22 ¾ Tiras con gradiente de concentración de un Antifúngico (Etest): A partir de un cultivo de 24 h a 35ºC en Agar Sabouraud glucosado , se prepara un inóculo de turbidez 0.5 McFarland en SSE. El medio empleado es RPMI-2% glucosa con 1,5% de Bacto agar. La superficie de la placa de petri con RPMI-2% glucosa con 1,5% de Bacto agar se hisopa en tres direcciones con el inoculo correspondiente. Luego se coloca la tira de plástico con el antifúngico, con la ayuda de una pinza estéril. Se incuba a 36 ± 2°C, durante 24 horas. Si el crecimiento es lento se incubaran 24 horas más. Los criterios de interpretación son los siguientes: Se tomaran como puntos de corte los siguientes valores de CIM para Candida spp.: AMB*, sensible (S) ≤ 1μg/ml y resistente (R) > 2 μg/ml ; 5-FC, S ≤ 4 μg/ml, sensible dependiente de la dosis o intermedio (SDD) 8-16 μg/ml y R ≥ 32 APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 15 de 20 μg/ml; FCZ, S ≤ 8 μg/ml, SDD 16-32 μg/ml y R ≥64 μg/ml e ITZ, S ≤0.125μg/ml, SDD 0.25-0.50 μg/ml y R ≥1 μg/ml, VCZ S ≤ 1μg/ml, SDD 2 μg/ml y R ≥ a 4μg/ml. *No hay disponibles puntos de cortes, estos son valores sugeridos según las CIM poblacional de los aislamientos. Antifúngico Intervalos de las CIM (μg/ml) Sensible S-DD Intermedio Resistente Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64 Itraconazol ≤ 0,125 0,25 - 0,5 ≥1 Voriconazol ≤1 2 ≥4 5-fluorocitosina ≤4 Caspofungina ≤2 Anidulafungina ≤2 Anfotericina B ≤1 8 - 16 ≥ 32 >2 ¾ Tarjetas de sensibilidad Vitek: Realizar en un tubo estéril de poliestireno, una suspensión en S.F. estéril, de un subcultivo de la levadura, obtenido luego de 24 hs de incubación en agar Sabouraud a 35°C. Ajustar la turbidez a 2.0 de escala McFarland, usando el instrumento provisto por bioMérieux, DensiChek, y diluir según las indicaciones del fabricante Una vez preparado el inóculo, se introducen a lo largo del cassette del equipo, el tubo y una tarjeta para cada microorganismo a evaluar. Los cassettes cargados se introducen en el aparato ; a continuación y de manera automática se produce el llenado de las tarjetas, su incubación y lectura. APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 16 de 20 El tiempo de incubación varía entre 9.1 a 27.1 hs, según la velocidad de crecimiento del pocillo control libre de antifúngico. Los resultados se expresan como CIM en µg/ml. Análisis de resultados: según los puntos de corte de CLSI Antifúngico Intervalos de las CIM (μg/ml) Sensible S-DD Intermedio Resistente Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64 Itraconazol ≤ 0,13 0,25 - 0,5 ≥1 Voriconazol ≤1 2 ≥4 5-fluorocitosina ≤4 8 - 16 6.5) PRECAUCIONES DE SEGURIDAD: • Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) 6.8) CONTROL DE CALIDAD Candida krusei ATCC 6258 y Candida parapsilosis ATCC 22019 ATB F3: CIM μg/ml Antifúngico C. parapsilosis C. krusei Fluconazol 1-4 8-32 Itraconazol 0,125-0,5 0,125 - 0,5 Voriconazol 0,06-0,125 0,125 - 0,5 S I/R 5-fluorocitosina ≥ 32 APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... Anfotericina B MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 17 de 20 ≤ 0.5 0,5-2 Tabletas de fluconazol Neo Sensitabs TM Rosco: Antifúngico Diámetro del halo en mm C. parapsilosis C. krusei Fluconazol 22-23 - Itraconazol 19-26 16-22 voriconazol 28-37 16-25 anfotericina 20-26 17-23 ketoconazol 26-35 22-29 Discos de Fluconazol Malbrán: Antifúngico Fluconazol Diámetro del halo en mm C. parapsilosis C. krusei 8-10 25-32 Tiras con gradiente de concentración de un Antifúngico (E-test): APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 18 de 20 CIM µg/ml, 48 hs Antifúngico C. parapsilosis C. krusei Anfotericina B 0.25-1 0.5-2 Anidulafungina 0.5-4 0.016-0.125 Caspofungina 0.25-2 0.25-1 Fluconazol 1-4(8)* - 5-fluorocitocina 0.064-0.25 - Itraconazol 0.064-0.25 0.25-1 Ketoconazol 0.032-0.125 0.25-1 Posaconazol 0.032-0.125 0.125-0.5 Voriconazol 0.016-0.064 0.25-1 *algunas colonias ocasionalmente podría dar 8 µg/ml 6.9) VALORES NORMALES No corresponde a esta práctica. 6.10) INTERFERENCIAS Existen aislamientos poco habituales que podrían no ser evaluados por estos métodos y deben ser enviados a centros de referencia. 6.11) INTERPRETACION Discos Malbrán Esta técnica es accesible a la rutina de los laboratorios y permite detectar los aislamientos de levaduras del Género Candida, sensibles al fluconazol. APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 19 de 20 Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco® (T) Varios estudios encontraron algunos errores very major con aislamientos de C. tropicalis cuando se ensayo FCZ, por este motivo este test nunca debe ensayarse como única prueba, siempre se debe largar en paralelo con otro método. ATB® Fungus 3 (ATB F3) La categoría de sensible dependiente de la dosis (DD) se refiere a aquellos aislamientos que responden al tratamiento cuando se utilizan dosis más elevadas de la droga. Algunas recomendaciones deben tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados de las pruebas de sensibilidad: ATB F 3 recomienda interpretar como intermedias las cepas de C. glabrata que presenten un resultado sensible (S) al fluconazol y/o itraconazol, debido a la sensibilidad media natural de esta especie a estos antifúngicos. También se debe tener en cuenta que C. krusei es una especie intrínsecamente resistente al fluconazol, el test debe ser interpretado resistente automáticamente. Algunas especies como C. albicans y C. tropicalis pueden presentar el fenómeno de crecimiento residual (trailing) que implica una sobreestimación de la CIM de los antifúngicos nitrogenados (fluconazol, itraconazol). Los métodos de difusión por disco o tabletas son asequibles, de fácil realización y detectan aislamientos susceptibles a FCZ. Pero el método de difusión con disco de Malbrán es más eficaz para detectar aislamientos sensibles a FCZ que las Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco®. 6.12) INFORME Para los métodos de difusión en agar: Discos de Fluconazol Malbrán se informará como S o a determinar por CIM y Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco®, el resultado si informará como S, SDD o R a FCZ y/o VCZ. APOE-AF GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES RED DE MICOLOGIA HOSPITAL.:.................... MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: julio 2011 Versión: 01 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS Página 20 de 20 Para ATB F 3 se informará el valor de la CIM en μg/ml, para AMB, FCZ, ITZ y VCZ y la categoría de S, SDD o R. Para 5FC si es S o R. Para las tiras de plástico (E-test) se informará el valor de la CIM en μg/ml, y la categoría de S, SDD o R. Y de la misma forma para las tarjetas Vitek 2. 7.0) REGISTROS Cuaderno de Micología. 8.0) ANEXOS No posee.
