mutaciones

Mutantes HBV
¿Qué problemas se nos presentan
actualmente en el diagnóstico de
laboratorio de hepatitis B?
Ciertos resultados de laboratorio
pueden generar dudas respecto
de su veracidad.
• Pacientes con marcadores Anticuerpos
Anti HBs Ag y Hbs Ag positivos
• Pacientes con Anticuerpos Anti HBs Ag
positivos y DNA HBV positivos
• Donantes con serología negativa para
AgHBs en bancos de sangre y HBV
DNA positivo
¿Que son las mutaciones?
• Las mutaciones constituyen un
acontecimiento natural que ocurre durante la
replicación viral en donde los cambios de
ácidos nucleicos puede traducirse en cambios
en la secuencia de amino ácidos en la
proteína.
• Esto se debe a la alta tasa de replicación y a
la baja fidelidad de la polimerasa viral, debido a
que carece de “proof –reading”
Mutaciones del HBV
Mutante
Región
mutada
Mecanismo
Agente
Oportunidad
Frecuencia
E menos
Gen
preCore
Presión
inmune
(selección)
Respuesta
natural
o
IFN
Infección
crónica
Frecuente
Superficie
Gen S
Presión
inmune
(escape)
HBIg o
Vacuna
Inmunización
en
alta
endemicidad
Muy poco
frecuente
YMDD
Gen pol
Terapéutica
(resistencia)
LAM
Infección
crónica
Frecuente
Métodos: para cada una de ellas, pueden utilizarse diferentes métodos (LiPA, PCR
primer específica, PCR/hibridación específica, etc.) pero el método de referencia es la
secuenciación de la región genómica específica. (Pawlotsky, Gastroenterology
2002;22:1554--1568)
2002;22:1554
HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR
Mutantes de escape HBsAg se han reportado e
identificado como tales en la literatura desde
1990.
No tienen distribución geografica especifica
Oon y col. Mencionan una tasa de mutantes de
escape del 4.6% (16 de 345) en neonatos
vacunados nacidos de madres positivas para
HBsAg.
El porcentaje de re-infecion debido a mutantes
de escape por inmunoprofilaxis (HBIG) en
tranplansplantados hepáticos presenta un
rango entre el 8.3% y el 57%.
• Kalinina y col. Reportó la primera evidencia
que mutantes en el gen S HBV como causa
de una hepatitis fulminante.
– Este fenomeno pudo haber disparado la muerte
celular provocando la falla hepática.
– La mutación Gly 145 Arg fue una de las
implicadas en este caso.
Kalinina, et al. 2000. A Dominant Hepatitis B Virus Population
Defective in Virus Secretion Because of Several S-Gene Mutations
from a Patient With Fulminant Hepatitis. Hepatology 34: 385 - 394.
Wild-type gly at 145
Modelo de HsAg de Chen et al. 1996. Proc.
Natl. Acad. Sci. 93: 1997-2001.
Mutant arg at 145
Mutantes de Escape más
frecuentes?
• EL cluster de mutante HBsAg más común
está presente entre los aa 111 - 145. La de
mayor prevalencia esta reportada en gly-145arg en el segundo loop del determinante a
del HBsAg.
• Otras menos frecuentes que se encuentran
externas al doble loop o dentro del mismo
son: Thr1126-Ser ; Met133-Leu; Asp 144Ala; Gln129-His
Importancia clínica
• “Las variantes de escape a la vacuna en los
amino ácidos 144/145 puede establecer
infecciones persistentes en niños.
• Cuando se compara pacientes transplantados
de hígado infectados predominantemente con
HBV salvaje con los infectados con mutantes
de escape HBsAg (aa144/145), estos últimos
presentan un curso clínico menos
favorable y una sobrevida menor del graft”
Locarnini, S. A. 1998. Hepatitis B Virus Surface Antigen and Polymerase
Gene Variants: Potential Virological and Clinical Significance.
Hepatology 27: 294 - 297.
El 90% de los neonatos infectados con HBV
serán portadores crónicos, con un porcentaje
de mortalidad que oscila entre el 15-25 %
EL CDC estima que 22,000 madres positivas
HBV que dan a luz ,el porcentaje de mutantes
de escape para HBsAg esta entre el 1 – 4.6 %
Por lo tanto el potencial de mutantes en esta
poblaciónde recien nacidos estaría entre 2001000 por año.
ATENCION EN..........
• Individuos que solo presentan serologia positiva para Ac.
anti HBc
• Pacientes con HBsAg y Anti HBsAg positivos
• Severa inmunosupresión en pacientes con Ac. anti HBsAg
• Resultados discordantes de HBsAg con diferentes ensayos
• Resultados serológicos como HBeAg positivo y HBsAg
negativo
– Indicación: solicitar DNA HBV por PCR y en lo posible
secuenciación del loop del HBsAg
• Detección de DNA HBV positivo por NAT y
HBsAg con resultado negativo o divergente en
bancos de sangre
Implicancia:
» evitar la donación
» realizar estudios para mutación
» seguimiento clínico del donante
EVOLUCION DE MEDICINA
TRANSFUSIONAL
Pilares Básicos
Screening de Donantes
Transfusion Segura
Test
NAT
&
Test Serologicos
Perspectives in Health • Vol. 10, No. 2 • 2005
Por que usar NAT en
Bancos de Sangre
• NAT PCR es positivo antes que la serología
•Reduce el riesgo de transmitir infecciones
•Elimina los costos en salud para el diagnóstico
y tratamiento de los mismos
•Mejora la confianza en la seguridad de las
bolsas a transfundir
Ventajas :
• Marcadores negativos en el
periodos de ventana
• Immunovariantes de cepas virales
no detectatos por los test
serologicos
• Chequeo de los procedimientos
serologicos y viceversa.
viceversa
BUSCH, JAMA 289(8): 959-962. 2003
NAT HBV?
•HbsAg esta ausente en:
Disminución de la replicación y síntesis de proteínas de
HBV posterior a coinfección con HCV
Mutaciones en el dominio de la polimerasa que resultan en
una ineficiente replicación
HBsAg presente pero no detectable
Presencia de inmunocomplejos circulantes
Mutaciones en el loop hidrofilico mayor
HBV Replicación
1
H B s A g (n g /m l)
H B V -D N A (c o p ie s /m l)
1,00E+10
1,00E+09
1,00E+08
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
0,1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
• Replicación : 2.56 días
• Periodo de VentanaAg/AB : 56 días
• Periodo de Ventana -NAT
: 30 días
Days after infection
ASSAL, TRANSFUSION 2009; 49 : 301301-310
Riesgo Estimado de Transmitir
HBV
• HBV
1 : 90.000
(60.000-128.00)
Reducción estimada del riesgo de
transmisión por transfuciones HBV, por
implementación de NAT
Ventana estimada
(Días )
HBV
EIA
NAT
56
30
Reduccion Riesgo Estimado
%
x 106 donations
(95% CI)
27
8.3 (5.7 – 10.9)
Metodologías disponibles
• PROCLEIX® TIGRIS® Novartis
• Cobas AmpliScreen y Cobas Taq
Screen MPX ®Roche
En nuestro laboratorio
• Se corre la serologia y NAT en forma
conjunta
• NAT : Pooles de 6 bolsas o inferiores
• El procesamiento dura 8 hs.
• Se realizan análisis de correlación entre
serologia y NAT
• Repiticiones se realizan al día siguiente
Nuestra experiencia .......
COBAS AMPLISCREEN
HCV
HIV
HBV
COBAS Amplicor Autoanalizer
Amplificación y Detección Automatizada
Integridad de los Resultados
Internal control /Estandart
Cuantificado
•Demuestra que la
amplificación ha ocurrido en
cada muestra
•Asegura que los resultados
negativos son verdaderos
AMPERASA
• Especificamente detecta y
destruye todo acido nucleico
amplificado previamente sin
afectar el target que uno desea
amplificar
Resultados
Validación Ampliscreen
Resultados: Correlación del 100%
Sensiblidad
Roche : limite de deteccion son 5 UI/ml o 30
copias/ml
Sensibilidad Analítica 2
Muestra 24018 : 18 UI/ml
Repeticiones
Correlación
Muchas gracias por su atención.
Beatriz.livellara@ hospitalitaliano.org.ar