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CHOLERA O1
SMARTTM II
25 Determinaciones
Reorder No. 89-113225R
Un inmunoensayo colorimétrico
para la detección directa de Vibrio cholerae O1
(sólo para uso de investigación)
NEW HORIZONS DIAGNOSTICS CORPORATION
9110 Red Branch Road
Columbia, Maryland 21045 USA
e-mail: [email protected]
410/992-9357 / Fax 410-992-0328
El Cholera SMARTTM II (Sensitive Membrane Antigen Rapid Test) es un
inmunoensayo colorimétrico en formato de flujo lateral, diseñado para la detección
presuntiva directa y rápida de Vibrio cholerae O1 en muestras clínicas, como apoyo a los
métodos de cultivo tradicionales.
Uso:
Introducción: Las epidemias de cólera causadas por Vibrio cholerae O1, continúan
siendo devastadoras y de gran relevancia global, sobre todo en muchos países en vías de
desarrollo. Clínicamente el cólera puede variar desde una presentación asintomática,
hasta una diarrea severa con pérdida masiva de líquidos, lo que conlleva a
deshidratación, desbalance hidroelectrolítico y muerte. Vibrio cholerae O1 causa esta
diarrea secretora mediante colonización del intestino delgado y la producción de una
potente toxina. Por la importancia clínico-epidemiológica del cólera, es crítico determinar,
tan pronto como sea posible, si el organismo está presente o no en las heces diarreicas
de un paciente con diarrea acuosa.
Este método es rápido, simple y confiable para detectar Vibrio cholerae O1 y tiene gran
valor para los clínicos en el manejo de la enfermedad y para los oficiales de salud pública
para implementar las medidas de control. Los anticuerpos monoclonales de “NHD”
proveen especificidad para el antígeno O1 de Vibrio cholerae, evitando los problemas
inherentes que se han encontrado en el uso de anticuerpos policlonales anti-O1 para la
identificación de V. cholerae O1 a partir de muestras. La prueba de Cholera SMARTTM II
es simple y se puede realizar en aproximadamente 15 minutos. La prueba Cholera
SMARTTM II de flujo lateral reemplaza el sistema de flujo de muestra a través del Cholera
SMARTTM previamente utilizado, el cual se basaba en un sándwich de anticuerpos
monoclonal – anticuerpo policlonal. Pruebas in house del Cholera SMARTTM II han
mostrado un desempeño equivalente al del Cholera SMART TM.
Principio de la prueba: El Cholera SMARTTM II es un ensayo rápido, cualitativo en
formato de flujo lateral. Un anticuerpo monoclonal específico anti-A, marcado con
partículas de oro coloidal (coloración roja), es aplicado a una membrana y luego secado.
La muestra se coloca en un dispositivo de filtración y si es necesario, se trata previamente
con buffer de extracción. Cuando se dispensan en el hoyo de muestra (S),
aproximadamente 4 gotas de la muestra clínica tratada, a través del dispositivo de
filtración, este conjugado con oro coloidal reacciona con el antígeno A presente en la
muestra y migra a lo largo de la membrana hasta alcanzar dos zonas de captura de
anticuerpos, (T) Test y (C) Control. Aquellos conjugados anticuerpo-oro coloidal, que se
han unido al antígeno de V. cholerae O1 presente en la muestra, se unirán luego en la
zona de captura del anticuerpo anti-V. cholerae O1, observándose una línea de color rojo,
detectable a simple vista, indicando un resultado positivo para la muestra en (T). Si no
hay V. cholerae O1 presente en la muestra, no se formará ninguna línea en (T) y la
muestra continuará migrando hasta alcanzar la línea del control positivo (C), la cual no es
específica para el antígeno A, cualquier exceso de conjugado anticuerpo-oro coloidal será
retenido en la línea (C), evidenciándose como una línea roja. La línea en (C) debe ser
visible para asegurar que el aparato está trabajando de manera apropiada. La aparición
de una línea en (C) es indicativo de una muestra negativa por V. cholerae O1. La
aparición de dos líneas, una en (T) y otra en (C) es indicativa de una muestra positiva por
V. cholerae O1. El tiempo total para realizar la prueba es menor a 20 minutos.
Materiales provistos:
Cada kit contiene lo siguiente en cantidades suficientes para realizar 25 determinaciones:
“Foil pouch” (paquete de papel aluminio):
Cada paquete contiene un aparato de
Cholera SMARTTM II
“Chase buffer” (buffer de arrastre):
Cada botella de Chase buffer contiene
agua procesada, detergentes y 0.05%
azida de sodio (preservante)
“Positive control reagent”
(reactivo control positivo):
La botella de reactivo control positivo
contiene organismos de V. cholerae O1
inactivados con calor en buffer con 0.05%
azida de sodio (preservante)
“Extraction buffer” (buffer de extracción):
La botella de buffer de extracción contiene
tris salina buferizada con EDTA y 0.05%
azida de sodio (preservante)
Specimen filtering (filtración de muestras):
Aparato para filtración de muestra: Tubo de plástico suave y tapa con filtro.
Gotero de vidrio: El gotero de vidrio está marcado a los 0.3 / 0.5 ml
Goteros de plástico: Goteros de plástico desechables
Almacenamiento y estabilidad: PRECAUCIÓN: NO CONGELE
La fecha de expiración del kit, anotada en la etiqueta de la caja, depende del
almacenamiento apropiado de los componentes. Los reactivos se pueden mantener, ya
sea refrigerados, o a temperatura ambiente (2 ° a 3 0 ° C).
Precauciones:
1. Se deben seguir las mismas medidas de bioseguridad en la manipulación y
disposición de los materiales empleados en la prueba, que las que se aplican con
cualquier otro material microbiológico / clínico.
2. Todos los reactivos contienen 0.05% azida de sodio (preservante). La azida de
sodio puede reaccionar con el plomo y el cobre de las tuberías formando metales
de azida altamente explosivos. Para descartar, puede hacerlo en el drenaje con
agua abundante.
3. Los reactivos se han probado como una unidad. No sustituya reactivos de lotes
diferentes.
4. No use reactivos que ya cumplieron con la fecha de expiración.
5. No diluya ninguno de los reactivos. Esto tendrá un impacto tanto en la sensibilidad
como en la estabilidad de la prueba.
Recolección y manipulación de muestras:
La muestra debe ser un espécimen fecal. Las muestras que no se van a analizar
inmediatamente se deben congelar. Alternativamente, las muestras se pueden colocar en
Agua Peptona Alcalina (APA) a una dilución 1:10 (volumen de muestra : volumen de APA)
e incubar por un máximo de 24 horas antes de realizar el análisis.
El uso de hisopados rectales no está recomendado. Si se va a emplear un hisopado
rectal, el mismo se debe colocar en 1 ml de APA e incubar a 23 – 40°C por un máximo de
24 horas antes de realizar el análisis. El transporte de hisopados rectales en Medio Cary
Blair puede reducir la sensibilidad de la prueba. Sin embargo, si se va a emplear este
método de transporte, se recomienda colocar directamente el hisopo en el aparato de
filtración, conteniendo 1 ml de buffer de extracción y mezclar vigorosamente.
Preparación de la muestra:
1. Si la muestra es líquida, use el gotero plástico desechable para colocar la muestra
en el tubo de plástico del aparato de filtración. Llene aproximadamente la mitad
del tubo. Coloque la tapa provista para tal fin. Mezcle bien. Si la muestra
contiene partículas grandes, las mismas se deben dejar sedimentar antes de
dispensar la muestra en el aparato de filtración.
2. Si la muestra es semisólida o formada, use un palito de madera para colocar una
porción de la muestra en el tubo de plástico del aparato de filtración. Llene
aproximadamente una cuarta parte del tubo. Usando un gotero de vidrio, adicione
al tubo aproximadamente 0.5 ml de buffer de extracción. Coloque la tapa del tubo
y cierre bien. Mezcle vigorosamente. La agitación vigorosa va a producir
suficiente volumen de muestra para ser procesada. De lo contrario, adicione 0.5
ml más de buffer de extracción y agite de nuevo. Si aún es difícil que la muestra
atraviese el filtro, del aparato de filtración, se debe dejar que las partículas grandes
de la muestra sedimenten. Es importante no diluir las muestras más de lo
sugerido, ya que esto podría reducir la sensibilidad de la prueba.
Procedimiento de la prueba:
1. Recolecte la muestra de heces y siga las indicaciones para asegurarse de que la
misma se encuentra en forma líquida.
2. Abra el sobre de aluminio “foul pouch” y saque el dispositivo de flujo lateral
Cholera SMARTTM II. Saque los contenidos. Marque el dispositivo con la
identificación de la muestra empleando un marcador permanente.
3. Invierta y oprima el dispositivo de filtración de muestra para dispensar 4 gotas en
el hoyo de muestra (S) del dispositivo de flujo lateral.
Antes de dispensar la muestra, mediante presión al vial, asegúrese de que la tapa
del dispositivo de filtración esté bien cerrado (observación del traductor, no es
parte del texto original del panfleto)
4. Espere aproximadamente 3 minutos o hasta que la muestra se haya absorbido en
el hoyo de la muestra. Luego adicione dos gotas de “Chase buffer” en el hoyo de
la muestra.
5. Lea los resultados después de 15 minutos (no más de 30 minutos) después de
adicionar la muestra. Observe el desarrollo de color en el Control (C) y la línea
Test (T) y anote los resultados. Utilice la tabla para interpretar resultados. Las
reacciones positivas fuertes pueden producir resultados en menos de 10 minutos.
Control de calidad:
Realice el control de calidad del Cholera SMARTTM empleando el reactivo “Positive control
reagent” cada día que va a realizar la prueba para asegurar el desempeño apropiado del
kit.
1. Abra el sobre de aluminio y saque el dispositivo de flujo lateral Cholera SMARTTM
II. Saque los contenidos y marque el dispositivo como Control Positivo utilizando
un marcador permanente.
2. Adicione 4 gotas del “Positive control reagent” en el hoyo de la muestra del
dispositivo de flujo lateral Cholera SMARTTM II.
3. Siga los pasos 4 – 5 del punto anterior.
4. Deberán aparecer dos líneas: una en la línea Control (C) y otra en la línea Test (T),
indicando una muestra positiva. Si no aparece una línea roja en la línea Test (T) o
en la línea Control (C) y en la línea Test (T), revise las instrucciones y repita la
prueba. Si el resultado del control de calidad no es satisfactorio, no reporte los
resultados de las pruebas realizados en ese día. Por favor contacte New Horizons
Diagnostics para obtener asistencia técnica o para reemplazar las pruebas a los
teléfonos: 1-800-888-5015 o (410) 992-9357.
5. El “Chase buffer” podría ser empleado como Control Negativo y para realizar la
prueba se sigue el procedimiento descrito anteriormente.
6. La aparición de una línea roja sólo en la línea Control (C), indicará que la muestra
es negativa. También se puede emplear como control negativo un cultivo de
Vibrio cholerae no O1.
Resultados:
Prueba positiva
Aparición de una línea roja clara en las marcas Control (C) y Test (T).
Prueba negativa
Aparición de una línea roja clara sólo en la marca Control (C) y
ausencia de línea roja en la línea Test (T).
Inválido
Aparición de una línea roja sólo en la línea Test (T) y ausencia de
línea roja en la línea Control (C).
Inválido
No se observan líneas coloreadas. La muestra no migró.
Ilustraciones:
S
T
C
S
S
POSITIVO
S
S
T
C
C
INVALIDO
T
T
C
C
NEGATIVO
S
T
C
INVALIDO
Limitaciones del procedimiento:
1. Los resultados obtenidos con el uso de esta prueba rápida se deben
complementar con otra información disponible, incluyendo síntomas y resultados
del cultivo. No se pretende que el Cholera SMARTTM II se emplee como el único
diagnóstico para las infecciones por V. cholerae O1.
2. Cholera SMARTTM II no detecta Vibrio cholerae no O1, incluyendo V. cholerae
O139, una nueva cepa epidémica que causa cólera en el sudeste asiático. Las
cepas de V. cholerae no O1 pueden causar diarrea y otros síntomas similares a
las que presenta V. cholerae O1.
3. El Cholera SMARTTM II no ha sido validado para su uso con especímenes fecales.
El uso de hisopos y especímenes como orina, saliva o exudados de heridas no ha
sido confirmado.
4. Cholera SMARTTM II reconoce un antígeno presente en el lipopolisacárido de V.
cholerae O1. La prueba detecta tanto bacterias viables como no viables, pudiendo
resultar positivo aún después de un tratamiento exitoso.
5. Cholera SMARTTM II puede diferenciar V. cholerae serogrupo O1 de V. cholerae
serogrupo no O1, pero no permite diferenciación entre los serotipos de V. cholerae
O1 (Inaba, Ogawa), ni tampoco puede eliminar la realización de la prueba de
sensibilidad a los antibióticos.
Valores esperados:
El cólera produce epidemias y es endémico en ciertas áreas del mundo. Fuera de estas
áreas, la ocurrencia del cólera es muy rara. Casos esporádicos de gastroenteritis
causada por V. cholerae O1 se han identificado en áreas no endémicas, usualmente
asociados al consumo de mariscos crudos, viajes a áreas epidémicas, ingestión
accidental de comida o agua contaminada o otros comportamientos de riesgo.
Características del desempeño:
Cholera SMARTTM II ha mostrado un desempeño equivalente al del Cholera SMARTTM en
pruebas de laboratorio.
Sensibilidad analítica
La sensibilidad analítica del Cholera SMARTTM II se analizó empleando suspensiones de
V. cholerae O1 a partir de un cultivo puro. Se prepararon diluciones a partir de una
suspensión bacteriana inicial y el número de bacterias fue estimado por densidad óptica a
650 nm. Cholera SMARTTM II detectó, de manera consistente, suspensiones que
contenían al menos 2 x 107 ufc / ml de V. cholerae O1 (tanto del serotipo Inaba como
Ogawa).
Cholera SMARTTM II fue analizado con ocho cepas de V. cholerae O1, incluyendo cepas
Inaba y Ogawa y fue positivo para todas las cepas analizadas.
Reacciones cruzadas:
La reactividad cruzada del Cholera SMARTTM II para otros organismos se valoró usando
suspensiones de cultivos puros conteniendo > 108 ufc / ml. Ninguno de los organismos
analizados mostró ninguna reacción cruzada en la prueba. Los organismos probados
fueron (en el paréntesis se indica el número de cepas analizadas): Aeromonas hydrohila
(2), Escherichia coli (3), Pseudomonas aeruginosa (1), Salmonella Typhi (1), Serratia
marcescens (1), Shigella dysenteriae tipo 1 (1), V. cholerae no O1 (3), Vibrio
cincinnatensis (1), Vibrio damsela (1), Vibrio harveyi (1), Vibrio hollisae (1), Vibrio ordalii
(1) y Vibrio vulnificus (2).
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