INDICE PÁGINA 1. RESUMEN 6 2. INTRODUCCIÓN 7 2.1. La

INDICE
PÁGINA
1. RESUMEN
6
2. INTRODUCCIÓN
7
2.1. La industria de celulosa Kraft en Chile
7
2.2. La materia prima y proceso productivo Kraft
9
2.3. Efluentes, los tratamientos empleados para su depuración y la
11
gestión ambiental de la industria
2.4. Los compuestos extractivos de la madera: Los fitosteroles
14
2.5. Las alteraciones endocrinas provocadas por la exposición a los
16
CDE.
2.6. Modo de acción de los compuestos disruptores endocrinos y sus
17
propiedades físico-químicas
2.7. Saccharomyces cerevisiae y la tècnica YES (Yeast Estrogen Assay)
21
(YES)
3. HIPÓTESIS DE TRABAJO
26
4. OBJETIVOS
26
4.1. Objetivo general
26
4.2. Objetivos específicos
26
5. METODOLOGÍA
27
5.1. Actividad estrogénica
27
5.1.1. Cepa de levadura recombinante
27
5.1.2. Preparación de las soluciones del medio de cultivo
27
5.2. Crecimiento de levadura recombinante: Análisis previos
30
5.3. Cultivo de levadura
31
5.3. Preparación de soluciones para el ensayo
32
1
5.4.
Preparación
de
solución
de
Rojo
clorofenol
β-D-
33
galatopiranosido (CPRG, reactivo cromogénico)
5.5. Preparación de las diluciones para el ensayo
33
5.6. Técnica “Yeast Estrogen Assay” (YES)
34
5.7. Análisis de resultados
36
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
37
6.1. Crecimiento de levadura recombinante: Análisis previos
37
6.2. Ensayo Yeast Estrogen Assay (YES)
39
7. CONCLUSIONES
48
8. REFERENCIAS
49
2
INDICE DE TABLAS
Tabla I. Plantas de celulosa Kraft operantes, actualmente, en Chile así
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8
como también se ven detalladas el tipo de celulosa que producen y el
río al cual vierten sus Riles
Tabla II. Potenciales contaminantes provenientes de la industria de
12
celulosa
Tabla III. Anomalías endocrinas ocasionadas por la exposición a los
18
efluentes de celulosa Kraft o a algún compuesto especifico presentes en
ellos
Tabla IV. Propiedades físico-químico de compuestos presentes en el
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efluente de celulosa Kraft
Tabla V. Velocidad de crecimiento especifico del biosensor a distintas
38
temperaturas, mediante ala ecuación 2
Tabla VI. Concentraciones efectivas (EC50) obtenidas para el EE2,
42
Estigmasterol y β-sitosterol a través de la aplicación de una regresión
logarítmica a las curvas dosis respuestas, entregadas por el programa
Origin versión 6.0
Tabla VI. Potencia relativa estrogénica para cada fitoesterol con
45
respecto al patrón
3
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructuras químicas de algunos fitosteroles y ácidos
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20
resínicos detectados en los efluentes de celulosa Kraft
Figura 2. Lac-Z: Gen reportero; hER: Gen receptor de estrógenos
24
humanos; ERE: Elemento de respuesta estrogénica; CPRG: Clorofenol
rojo-β-D-galactopiranosido (Reactivo cromogénico)
Figura 3. Balanza analítica marca Precisa, modelo XB 120 A
28
Figura 4. Peachímetro c/ electrodo Sentix 41, Marca WTW, modelo
29
Inolab pH level 1
Figura 5. Espectrofotómetro marca Spectronic Unicam, modelo Génesis
31
10UV
Figura 6. Cámara de Flujo Laminar marca Misonix Modelo PCR 6
32
Figura 7. Agitador orbital c/regulación de tiempo y Tº, marca LAB-LINE,
32
modelo Enviromental Shaker
Figura 8. Estufa marca Termo Areus, modelo B6
35
Figura 9. Lector de placas EL x 800, BioTex
36
Figura 10. Gráfico que demuestra los resultados obtenidos de los
37
cultivos de levadura, realizados con distintas cantidades de inóculos
(μL), incubados a distintas temperaturas por un tiempo que va desde las
0 a 192 h
Figura 11. Velocidad específica de crecimiento del biosensor a distintas
39
temperaturas
Figura 12. Placas que resultaron tener resultados erróneos (coloración
40
roja) puesto que daban positivo al compuesto control (negativo o
4
blanco), el cual en este trabajo corresponde al etanol absoluto
Figura 13. Placa con la respuesta de un viraje de color correcto, cuando
41
se utiliza agua ultrapirogénica
Figura 14. Respuesta obtenida del ensayo YES, para un rango de
43
dilución de 54,48 μg/L a 26,61 ng/L del compuesto patrón (17αetinilestradiol)
Figura 15. Respuesta obtenida del ensayo YES, para un rango de
44
dilución de 100 mg/L a 50 μg/L del compuesto patrón (β-sitosterol)
Figura 16. Actividad de la enzima muestra β-galactosidasa frente a
44
Estigmasterol en un rango de dilución de 100 mg/L a 50 μg/L
5
1. RESUMEN
Compuestos con actividad hormonal llamados comúnmente compuestos disruptores endocrinos
(CDE) son encontrados en bajas concentraciones en efluentes finales de celulosa Kraft. Efectos
observados, principalmente en peces habitantes en las cercanías de las descargas de dichos
efluentes hacen pensar que compuestos presentes en los efluentes de celulosa son los
responsables de dichas anomalías. Específicamente a compuestos que forman parte de la
fracción de los extraíbles de la madera y se denominan fitoesteroles. Ellos presentan una
estructura química similar a la del colesterol, y debido a sus propiedades físico-químicas, como
el coeficiente octanol-agua (Kow) presentan una nula solubilidad en agua y una alta afinidad a
las matrices lipídicas, dificultando su eliminación en el ambiente. Para detectar este tipo de
compuestos y su potencial estrogénico, existe el biosensor Saccharomyces cerevisiae
recombinante, el cual posee la capacidad de detectar compuestos con actividad endocrina, por
medio de respuestas colorimétricas, debido a que posee inserto un gen estrogénico humano a
nivel cromosomal y un elemento de respuesta estrogénica a nivel plasmidial. El objetivo de este
trabajo es, evidenciar la presencia de compuestos con actividad estrogénica en los efluentes de
celulosa Kraft. Para ello se trabajó con 2 fitoesteroles puros (estigmasterol y β-sitosterol),
detectados en el efluente de celulosa Kraft, a los cuales se le midió su potencial estrogénico
mediante la concentración efectiva 50 (CE50), obtenida de la técnica YES (Yeast Estrogen
Assay). Los resultados indican que estos compuestos poseen actividad estrogénica a una
concentración de 0,00023 mg/L para el β-sitosterol y de 0,00126 mg/L para el estigmasterol. Se
concluye que los efluentes de la industria de celulosa Kraft poseen compuestos que presentan
un potencial estrogénico, además, el biosensor utilizado posee una alta sensibilidad analítica,
capaz de detectar compuestos con bajo potencial estrogénico. Por otro lado, la técnica
conocida como YES es una herramienta útil para evaluar compuestos que posean potencial
estrogénico, presentes en mezclas complejas como lo es el efluente de celulosa Kraft.
6
2. INTRODUCCION
2.1 La industria de celulosa Kraft en Chile
En las últimas dos décadas, el sector forestal ha presentado un gran desarrollo gracias a la
industria de celulosa Kraft, alcanzando una notable competitividad en el ámbito internacional.
En la actualidad, según datos de la CORMA (Corporación Chilena de la Madera), Chile ocupa el
quinto lugar como exportador mundial. Este notable desarrollo se ve reflejado en los 3 millones
de toneladas de pulpa producidas al año. Es más, se estima que para el año 2008 alcanzaría el
orden de los 4,7 millones de toneladas al año, dejándola en el cuarto lugar a nivel mundial. Esta
producción se debe, principalmente, a las 13 industrias de celulosa, localizadas en el sur de
Chile, de las cuales 9 usan procesos Kraft (ubicadas entre la séptima y décima región) mientras
que, 4 de ellas realizan procesos mecánicos (Xavier, 2006). En este contexto, la región del Bío
Bío, se destaca
en la producción de celulosa Kraft, debido a que genera un 46 % de la
producción nacional, razón por la cual alrededor del 62% de este tipo de industrias se asientan
allí.
Específicamente, el desarrollo de esta industria, en Chile, comenzó a partir del año 1959 con la
puesta en marcha de la planta de Laja. Luego, se le sumaron dos nuevas plantas: Arauco I y
Constitución, pero el crecimiento no se detuvo ahí, ya que en la década de los 90' se
construyeron cuatro plantas más: Santa Fe, Pacifico, Arauco II y Licancel. Por otra parte, desde
el año 2000 aparecen tres nuevas industrias: Nueva Aldea, Valdivia y la ampliación de Santa Fe
(Tabla 1) y, este desarrollo se ve reflejado a través del aumento de la producción de celulosa al
año y hace cada vez más notable la gran expansión y desarrollo de esta industria (Vidal et al.,
2007).
Estas
industrias
están
comandadas
por
dos
grandes
empresas,
Compañía
Manufacturera de Papeles y Cartones (CMPC) y Celulosa Arauco y Constitución (CELCO).
7
Tabla I. Plantas de celulosa Kraft operantes, actualmente en Chile. Se detallada el tipo de celulosa que producen y el cuerpo
receptor al cual vierten sus Riles.
Planta
Región
Propietario
Proceso
Tipo de
celulosa
UKP
Producción
(miles ton/año)
335
Tratamiento
de efluentes
P: CL; S: LG;
Pro: LO
Cuerpo acuático
receptor
Mar-Océano-Pacífico
Constitución
VII
CELCO
Kraft
s/blanqueo
Laja
VIII
CMPC
Kraft c/ECF
BSKP-UKP
345
Río Bío-Bío
CELCO
Kraft c/ECF
BSKP-BEKP
260
P: CL; Pro:
MBBR+LO
P: CL; S: LA
Arauco I
VIII
Santa Fe
VIII
CMPC
Kraft c/ECF
CG-MS
1160
P: CL; Pro:
MBBR+LO
Río Bío-Bío
Pacifico
IX
CMPC
Kraft c/ECF
BEKP
490
P: CL; S: LA
Río Bío-Bío
Árauco II
VIII
CELCO
Kraft c/ECF
BSKP-BEKP
470
P: CL; S: LA
Mar-Océano-Pacífico
Licancel
VII
CELCO
Kraft c/ECF
BSKP
110
P: CL; S: LA
Río Mataquito
Valdivia
X
CELCO
Kraft c/ECF
BSKP-BEKP
430
P: CL; S: LO;
T: DAF
Río Cruces
Nueva Aldea
VIII
CELCO
Kraft c/ECF
BSKP-BEKP
850
P: CL; S: LO;
T: DAF
Río Itata
Mar-Océano-Pacífico
P: Tratamiento Primario; S: Tratamiento Secundario; T: Tratamiento Terciario; Pro: Proyecto; CL: Clarificador Gravitacional; LG: Lagunas; LA:
Laguna Aireada Extendida; LO; Lodos activados; DAF: Floculación + Flotación; MBBR (Movil Bed Biofilm Reactor), Extr: Vidal et al., 2007.
8
2.2. La materia prima y proceso productivo Kraft
La celulosa es el principal componente de la madera (Xavier et al., 2004). Es básicamente una
fibra vegetal que varía en longitud y espesor según el tipo de árbol. Los árboles utilizados para
producir celulosa se clasifican en dos grupos dependiendo de las características de su madera:
las coníferas o árboles de fibra larga, encontrándose aquí diferentes especies de pinos y
abetos, y las latifoliadas o árboles de fibra corta, dentro de las que se pueden mencionar a las
variedades de eucaliptos, abedules, álamos y acacias.
En Chile, las materias primas más utilizadas por la industria de celulosa Kraft son: maderas
blandas correspondientes a Pinus radiata, el cual tiene fibras de celulosa de 2 a 3 mm de
longitud obteniendo de él, la celulosa conocida como BSKP (celulosa blanqueada de fibra
larga), y por otro lado, se encuentran las maderas duras correspondientes a Eucaliptos
globulus, el cual a su vez, posee fibras de 0,6 a 0,8 mm de longitud, obteniendo de él, la
celulosa conocida como BSKE (celulosa blanqueada de fibra corta). Ambas especies son
cultivadas en nuestro país principalmente desde la VII hasta la X región (Xavier, 2006) con un
buen nivel de productividad, y con una buena tasa de madurez tanto para pino (20-25 años)
como para eucalipto (10-15 años).
El proceso productivo Kraft, apunta principalmente a para separar las fibras de celulosa de los
demás componentes de la madera, principalmente de la lignina (Chamorro et al., 2005). Este
proceso puede dividir en 4 pasos: descortezado, astillado, digestión y blanqueo. El cual
comienza con la recepción de la madera, la cual es recibida en rollizos, los cuales son troncos
de dimensiones ya estandarizadas, los que descortezados en discos rotatorios de gran
dimensión y que giran a cierta velocidad y, transformados en astillas, las que después son
enviadas a una pila de acopio para su homogeneización. Las cortezas retiradas de las astillas
9
son recuperadas y quemadas en las calderas de poder para producir vapor y energía eléctrica
para satisfacer a toda la planta.
Desde la pila de acopio, los chips, son clasificados por sus tamaños y llevados a la etapa de
cocción, también conocida como digestión. Para ello, en un principio son conducidas hacia la
tolva de astillas, en la cual son pre-impregnadas con una solución de licor blanco, la cual es una
solución acuosa de soda cáustica compuesta por hidróxido de sodio (NaOH) y sulfuro de sodio
(Na2S), la que finalmente rompe las uniones de la lignina y de las fibras de celulosa.
Posteriormente las astillas pasan a un digestor, en el cual se cosen con una mayor cantidad de
licor blanco, a altos niveles de temperatura y presión, pero controladas. El licor blanco con la
lignina disuelta, se convierte en una solución acuosa residual muy compleja, compuesta de
material orgánico y reactivos sobrantes, conocida como licor negro. Este último, se concentra
para ser quemado en unos equipos denominados calderas recuperadoras para ser procesado
en el sistema de recuperación de productos químicos y energía (Oñate, 2006).
La parte orgánica del licor negro produce energía en el proceso de combustión, generando el
vapor que se utiliza en la producción de energía eléctrica para calefaccionar a toda la planta.
Mientras que la parte inorgánica se recuperan después del proceso de combustión y son
usadas en la etapa de caustificación para regenerar el licor blanco usado en la cocción.
Finalmente de la etapa de cocción, se obtiene una pasta de celulosa, la cual es lavada a altas
temperaturas con la finalidad de retirar el licor negro residual aun contenido en ella.
Posteriormente, esta fibra lavada es llevada a un estanque de soplado donde se le reduce la
presión y para liberar así las fibras que aún permanecen compactas y, así pasa a ser clasificada
en varios filtros. La pasta, ahora lavada y filtrada se denomina celulosa cruda o sin blanquear.
Esto, debido a que dicha pasta aún contiene una cantidad considerable de lignina, la cual es
10
responsable de su coloración café. Es por ello, que se procede a blanquearla. En el proceso de
blanqueo se pierde entre un 5 y 9% de la pasta de celulosa cruda. La pasta procedente de la
etapa de blanqueo es preparada para su secado, la cual contiene un altísimo contenido de agua
(entre 98 y 99%). Además, aquí con la pasta se forma una lámina uniforme. Este equipo es
accionado por varios rodillos, los cuales con la ayuda de la gravedad y bombas de vacío, sacan
el agua de la pasta. Luego, de formada la lámina, ésta se corta formando pliegos, los cuales se
apilan, se prensan y se embalan formando los fardos para, a su vez, éstos formar los units, los
que finalmente son almacenados en las bodegas. Posteriormente, se seca y se embala
(PAPELNET, 2007).
Se debe considerar que para producir una tonelada de celulosa, no sólo conlleva el uso del
recurso forestal (3 m3 de madera), sino además de ingentes volúmenes de agua (30 m3),
energía (60 toneladas como gas natural) e insumos químicos (140 Kg) (Zaror, 2007).
En los años 80’ la cantidad de agua consumida por tonelada de celulosa producida oscilaba
entre los 120 y 140 m3. En la actualidad, se consumen solo 40 m3. Esto ha sido posible gracias
a que el agua con la que se realiza el proceso productivo, se limpia para posteriormente, ser es
reutilizada, lo que se conoce como un ciclo cerrado.
2.3. Efluentes, los tratamientos empleados para su depuración y la gestión ambiental de
la industria
A pesar de su gran desarrollo, esta industria ha sido por años considerada como una de las
principales fuentes de contaminación del medio ambiente, debido a su toxicidad, carga
orgánica, sólidos en suspensión y color (Ali and Sreekrishnan, 2001), y a la toxicidad, atribuida
principalmente a la fracción de compuestos extraíbles (Kovacs et al., 1992). Es así como esta
11
industria ha tenido que enfrentarse a grandes desafíos y presiones tales como las sociales,
económicas y ambientales.
Debido a la misma complejidad, en cuanto a la composición de las maderas utilizadas como
materia prima, los efluentes de la industria celulosa Kraft son mezclas extremadamente
complejas, con sustancias de alto y bajo peso molecular (Vidal et al., 2001), encontrándose una
variedad de contaminantes que en algunos casos son difíciles de detectar, caracterizar y por
ende, clasificar (Tabla II).
Tabla II. Potenciales contaminantes provenientes de la industria de celulosa.
Tipo de contaminante
Gases
Problemas y fuente
Gases de mal olor (Mercaptano, ácido sulfhídrico;
proveniente
del
pulpaje,
óxidos
de
azufres
proveniente del proceso de recuperación en
hornos de cal.
Efluentes
Sólidos
suspendidos,
pigmentos,
fibra).
(partículas
Compuestos
de
corteza,
orgánicos
(hemicelulosa, azucares, ligninas, fenoles, resinas,
fitoesteroles). Disolventes inorgánicos (hidróxido
de sodio, sulfato de sodio)
Partículas
Partículas
de
cenizas,
provenientes
de
quemadores
Residuos Sólidos
Sólidos provenientes de lodos de tratamiento
primarios y secundarios
Sin embargo, frente a todo lo anteriormente expuesto, esta industria ha reaccionado de una
manera muy responsable frente a esta situación, basándose en la gestión ambiental y
tecnología, planteándose el claro objetivo de producir más limpio. Para ello, ha realizado
grandes modificaciones para cumplir dicho objetivo, firmando en el año 1999 el primer acuerdo
12
de producción limpia. Entre dichas modificaciones se pueden mencionar, el hecho de haber
disminuido considerablemente la cantidad de agua y de materia prima, requerida para realizar
su proceso productivo. Por otra parte, ha incorporado tecnología que le permite recuperar
reactivos, ahorrándose materiales y energía. A su vez, ha generado cambios en el proceso de
blanqueo, sustituyendo el blanqueo con el típico y dañino cloro elemental (blanqueo
convencional) como agente oxidante, por el blanqueo de tipo ECF (libre de cloro elemental)
cuyo agente blanqueador es el dióxido de cloro, llegando a emplear el proceso TCF
(Totalmente libre de cloro) en el cual se ha eliminado completamente el cloro en cualquiera de
sus formas utilizando alternativamente otros agentes oxidantes, tales como: oxígeno (O2),
peróxido (H2O2) y ozono (O3).
Por otra parte, han adoptado tecnologías primarias (clarificadores gravitacionales) para eliminar
sólidos suspendidos (SS), y secundarias para eliminar la carga orgánica. Un ejemplo de
tratamiento secundario, corresponde a sistemas aeróbicos con biomasa suspendida tales como
lagunas aireadas y lodos activados y por otra parte, sistemas con biomasa inmovilizada tal
como MBBR (Movil Bed Biofilm Reactor), Además, se han dispuestos tratamientos terciarios
para eliminar compuestos específicos, como el color.
Sin embargo, a pesar de la implementación de este tipo de tecnologías, estudios han
demostrado la presencia de contaminantes con actividad hormonal presentes en los cuerpos de
agua receptores de los efluentes de celulosa Kraft. Estos contaminantes están llegando, a
través de las descargas de los efluentes de dicha industria y, al parecer están generando
anomalías a nivel endocrino, específicamente estrogénicas, en algunos organismos acuáticos
que habitan las zonas donde se realizan dichas descargas (Hewitt et al., 2005).
13
2.4. Compuestos extractivos de la madera: Los Fitosteroles
Como ya se mencionó, al parecer las gestiones y nueva tecnología implementada por la
industria de celulosa Kraft, no han sido suficientes ya que, lamentablemente, estudios señalan
la presencia de nuevos contaminantes presentes sus efluentes. Se trata de sustancias con
actividad hormonal. Al respecto, investigaciones han demostrado que existen alteraciones
crónicas en la función endocrina de una creciente cantidad de especies de animales, por
exposición a estas sustancias entre los cuales encontramos a crustáceos, aves, mamíferos y
peces (Argemi et al., 2005). Y al parecer, es en estos últimos organismos en los que el daño
generado ha sido más evidente.
Estos contaminantes, tienen una estructura química similar a la del colesterol, ya que
comparten el mismo núcleo (ciclopentanoperhidrofenantreno) y una cadena lateral que los
diferencia entre sí (Guang-guo et al., 2002). Es por esto último, que ingresan con mucha
facilidad a las rutas metabólicas de los organismos expuestos y, con esta misma facilidad
mimetizan la acción de las hormonas endógenas, es decir, de las hormonas que realmente
debieran estar actuando en aquel momento y entregar la respuesta adecuada. Lo cual,
evidentemente genera un desequilibrio hormonal, pues altera las vías endocrinas normales y
por ende, la homeostasis del organismo, lo cual se traduce en anomalías endocrinas (Sumpter,
2005).
A estos compuestos con actividad hormonal se le han denominado compuestos disruptores
endocrinos (CDE). Algunos de estos CDE son de origen natural, como por ejemplo, los que se
encuentran en los compuestos extractivos de la madera. Dentro de estos últimos, los más
preocupantes son los fitosteroles. Dicho de otra manera, éstos compuestos son hormonas
naturales de la madera y constituyen, junto con los fitostanoles, los componentes esenciales en
14
las membranas celulares. Sin embargo, al ser descargados a los cuerpos de agua, pueden
causar distintos tipos de alteraciones (Shiliro et al., 2000).
Sin duda, la proporción de estos compuestos en los efluentes de celulosa, está determinada por
el tipo de materia prima que es utilizada en el proceso productivo de dicha industria. Por
ejemplo, la madera de Pinus radiata, posee una cantidad de extractivos que varían entre los 0,5
a 7,0% y que es rica en ácidos resínicos mientras que, en menor grado Eucaliptos globulus,
presenta entre 0,2 a 3,5% de estos extractivos, siendo sus maderas ricas en fitosteroles
(LaFleur, 1996).
Estos compuestos son liberados a través del proceso de digestión del proceso productivo
empleado por la industria de celulosa Kraft y, pasan a formar parte del licor negro de dicha
etapa. No obstante, el problema no son los contaminantes presentes en el licor negro que
posteriormente es recuperado, sino que son los contaminantes que quedan adherido en la fibra
sucia y que son eliminados con el agua de lavado, es decir, pasa junto con ésta a la posterior
etapa, correspondiente a lavado, y es producto de ese lavado a la fibra que se genera un
residuo líquido que contiene una mínima parte del licor negro y por ende, de esos nuevos
contaminantes. Estos no son recuperados y pasan, con los demás residuos líquidos del proceso
productivo, a los sistemas de tratamientos pero que, lamentablemente, debido a las
propiedades físico-químicas que presentan no pueden ser degradados en su totalidad y
finalmente una pequeña porción llega a los cuerpos de agua, causando las anomalías
endocrinas.
15
2.5. Las alteraciones endocrinas provocadas por la exposición a los CDE
Como se mencionó anteriormente, pareciera ser que la atención de estos compuestos se ha
centrado principalmente en organismos acuáticos, debido a que ellos son los que están en un
contacto más directo con los efluentes. Además, los efectos se dan a conocer en un período de
tiempo relativamente más corto de lo que se dan a conocer en los demás seres vivos,
probablemente, por tener un contacto más íntimo de estos organismos con los compuestos. Ya
que justamente, es el ambiente acuático el que recibe la mayor cantidad de contaminantes de la
industria de celulosa, entre otras. Como consecuencia, se han observado ciertas alteraciones
estrogénicas en organismos habitantes en lugares cercanos a las descargas de efluentes de
celulosa Kraft. Dentro de las afecciones observadas, se pueden mencionar efectos como, la
feminización de peces machos, el aumento de vitelogenina, reducción del tamaño de sus
gónadas, prematura madurez sexual, inducción de citocromo P-450, disminución en la
producción de hormonas reproductivas, mortalidad de ovas, depresión de la fecundidad,
disminución de la fertilidad, graves deformidades en las crías y alteraciones en las
características sexuales secundarias. Algunas de estas afecciones son presentadas en la Tabla
III (Hodson et al., 1996; Janz et al., 1997; Kukkonen et al., 1999; Munkittrick et al., 1997;
Larsson et al., 2002; Tamagawa et al., 2005; Campbell et al., 2006). Estudios realizados por
Servos et al. (1996), y Kostamo et al. (2004), infieren que los responsables de tales efectos son
las hormonas naturales de la madera. Las que pueden son capaces de mimetizar a las
hormonas normales y producir alteraciones a nivel fisiológico y bioquímico con incidencia en el
sistema reproductor.
En nuestro país, investigaciones realizadas por Orrego et al. (2006), en peces machos juveniles
de la especie Onchorynchus mikiss habitante en las cercanías
de las descargas de los
efluentes de celulosa Kraft, evidencian alteraciones a nivel homeostático. En
general se
16
observa un cambio a nivel estrogénico, ya que los peces presentan un incremento en la
maduración de las gónadas y de la concentración de vitelogenina plasmática (VTGp). Sin
embargo, aún no se conocen los compuestos específicos que causan dichas alteraciones.
Se debe considerar que el o los efectos varían de acuerdo a la especie, edad, sexo, su
potencial endocrino y principalmente, el momento de la exposición. Se ha podido comprobar
que esta última parece tener más importancia que la misma dosis ingerida puesto que, a partir
de este se pueden determinar el carácter de gravedad y su evolución. Se destaca como la
exposición más critica a la comprendida en el tiempo de desarrollo embrionario, ya que en éstas
se alteran las etapas en las que el embrión se esta desarrollando y que por ende, definirá el
futuro individuo, así como también su sexo. Involucra toda la embriogénesis del futuro ser
incluyendo el neurodesarrollo (Olea and Zuluaga, 2001).
2.6. Modo de acción de los compuestos disruptores endocrinos y sus propiedades físicoquímicas
En condiciónes normal, la hormona endógena se une al receptor celular, lo cual desencadena
una serie de procesos correspondientes esperados en forma de cascada. Todo compuesto que
modifique algún proceso natural, estimulando o inhibiendo cualquiera de sus etapas, es
considerado en endocrinología como un compuesto xenobiótico o como los hemos llamado
hasta ahora, CDE (Landman et al., 2006). A su vez, aquellos compuestos que interfieran
directamente sobre el accionar de los esteroides naturales son denominados xenoestrógenos o
xenoandrógenos.
17
Tabla III. Anomalías endocrinas ocasionadas por la exposición a los efluentes de celulosa Kraft o a algún compuesto especifico
presentes en ellos.
Especie
Efluente y/o
Concentración en
compuesto
efluente final
Carassius auratus
β-sitosterol
75-1200 (μg/L)
Gambusia holbrokii
Celulosa Kraft
Efectos
Inducción de MFO
Decrecimiento de hormonas
Referencia
McLatchy et al., 1997
Jenkins et al., 2003
0,14 nM
masculinas
Zoarces viviparous
Celulosa Kraft
-----
Mayor porcentaje de embriones
Oncorhynchus mykiss
Celulosa Kraft
-----
Inducción de EROD y
Larsson et al., 2002
Oakes et al., 2005
vitelogenina
Oncorhynchus mykiss
Celulosa Kraft
-----
Decrecimiento de hormonas
Larsson et al., 2006
masculinas
Daphnia magna
Celulosa Kraft
20 % efluente
Crecimiento Abdominal
Xavier et al., 2005
Oryzias latipes
Celulosa Kraft
-----
Baja densidad de espermios
Kiparissi et al., 2003
Oncorhynchus mykiss
Celulosa Kraft
-----
Inducción de MOF
Burnison et al., 1999
Rainbow trout
Celulosa Kraft
-----
Inducción de vitelogenina
Mellanen et al., 1996
18
Esto se debe a que, como ya se ha mencionado, estos compuestos pueden mimetizar la acción
de las hormonas endógenas, uniéndose al receptor específico propio de éstas, lo cual es
considerado como una de sus características más importantes, ya que les permiten interferir en
la reacción ya sea bloqueándola o generando reacciones más potentes o provocar respuestas
más débiles que las normales y en el momento inadecuado (Birkett and Lester, 2003). También
pueden unirse a los receptores específicos y no activarlos, actuando como antiestrógenos o
antiandrógenos ya que antagonizan la acción de las hormonas (Argemi et al., 2005).
Estudios realizados consistentes en el análisis de los efluentes industriales han permitido
afirmar que, efectivamente, muchos de estos compuestos disruptores endocrinos, tanto
artificiales como naturales, están presentes en los riles (Zeng et al., 2002) y que no todos tienen
el mismo potencial tóxico (Sumpter, 2005). Los compuestos más comunes encontrados en los
riles de celulosa, corresponden al campesterol, estigmastanol coumestrol, genistein, ácido
abiético, ácido dehidroabiético, ácidos grasos, ácido pimárico y cloroguiacoles entre otros,
destacando al β-sitosterol y estigmasterol, los cuales forman principalmente el licor negro
(Lacorte et al., 2003) (Figura 1).
Sin embargo, se debe tener en cuenta que el comportamiento de los disruptores endocrinos es
influenciado por sus propiedades físico-químicas, es decir, debido a estas propiedades, dichos
compuestos pueden permanecer o transformarse en ambiente. Esto último, ya sea por medio
de la absorción de éstos a la superficie del sólido o en la biota propiamente tal (Birkett and
Lester, 2003).
Dentro de estas propiedades físico-químicas se pueden mencionar a la solubilidad del agua, la
cual les otorga un potencial de disolución, la constante de ley Henry’s, favoreciéndoles el poder
evaporarse, el coeficientes de partición orgánico/carbono (Koc) y el octanol/agua (Kow) (Tabla
19
IV). Se puede indicar que a mayor valor de log Kow (coeficiente de partición octanol/agua) el
compuesto tiene una mayor bioacumulación. Sin embargo, esta condición sólo se cumple para
aquellos compuestos que presentan log Kow< 6.
O
HO
COOH
Campesterol
Ác. dehidroabiético
OH
HO
HO
β-sitosterol
O
O
Genistein
Estigmasterol
OH
CO OH
Ácido abiético
Figura 1. Estructuras químicas de algunos fitoesteroles y ácidos resínicos detectados en los
efluentes de celulosa Kraft.
Se conoce que los fitoesteroles debido a sus propiedades físico-químicas, no están siendo
removidos, en su totalidad, con los sistemas de tratamientos implementados por la industria de
celulosa Kraft, incluso se evidencia que compuestos como el estigmasterol, es incrementado
luego de un tratamiento por laguna aeróbica (Cook et al., 1997). Es decir, que a pesar de tener
nuevas tecnologías, no son lo suficientemente eficientes pues un porcentaje considerable
continúa en los vertidos finales.
20
2.7. Saccharomyces cerevisiae, recombinante y la tecnica YES (Yeast Estrogen Assay)
Las recientes investigaciones están siendo orientadas a detectar la actividad estrogénica y
androgénica de compuestos específicos contenidos en el efluente de celulosa Kraft y su
potencialidad como disruptores endocrinos. Cabe destacar que la atención ha sido enfocada en
el desarrollo de métodos de “screening”, para clasificar las sustancias estrogénicas (De Boever
et al., 2001). Sin embargo, los resultados de estos análisis no son los mismos debido a la
distinta sensibilidad que presentan las técnicas o los organismos expuestos (Formal et al.,
2002).
Comúnmente, para la detección de compuestos con actividad endocrina, se han empleado
técnicas analíticas y ensayos basados en respuestas bioquímicas y fisiológicas en organismos,
con gran efectividad, como la espectrometría (UV, visible, IR) y cromatografía (CGMS, HPLC)
(Campos et al., 2004). Sin embargo, estas técnicas son muy complejas y de alto costo
operacional. Además, la caracterización de la mayoría de los compuestos con disrupción
endocrina, no ha podido ser determinado, debido a la gran complejidad que presenta el efluente
de celulosa Kraft (Shaughnessy et al., 2007). Además, el hecho de que estos compuestos se
encuentran en una muy baja concentración, dificulta su identificación a través de técnica
analíticas.
21
Tabla IV. Propiedades físico-químico de compuestos presentes en el efluente de celulosa Kraft.
Compuesto
C (μg/L)*
Punto de
Log Kow
fusión (°C)
Solubilidad
Peso
mg/L 20°C
Molecular
Referencias
Ác. abiético
283-800
139-142
<5 ≈3
4.75
250
Xavier, 2006
Ác.
-----
-----
<5≈3
5.11
-----
Xavier, 2006
-----
300
5,9
-----
270,24
Mahmood-Khan and
dehidroabietico
Genistein
Hall, 2003
β-sitosterol
75-1200
165-167
9,65
< 0.0001
414,72
Mahmood-Khan and
Hall, 2003
Campesterol
7,6
-----
-----
-----
400,7
Mahmood-Khan and
Hall, 2003
Estigmasterol
32,1
139-142
10,20
< 0.0001
414,70
Mahmood-Khan and
Hall, 2003
Estigmastanol
1,8
-----
9,43
-----
416,7
Mahmood-Khan and
Hall, 2003
C*: Concentración en el efluente final.
22
No obstante, persiste la necesidad de implementar técnicas efectivas para cumplir dicho
objetivo, es por ello, que se ha recurrido a la utilización de los biosensores. Estos últimos son
organismos manipulados genéticamente con un fin. Ellos poseen componentes que reconocen
cambios físicos o químicos y que al estar unidos a ciertos elementos, producen una señal en
respuesta al impacto presente en el ambiente. Pueden, a su vez, ser clasificados en tres tipos:
celular, molecular y tejido fino (Bousse, 1996).
Principalmente, se debe destacar al biosensor que lleva por nombre Saccharomyces cerevisiae
recombinante. Esta levadura, fue modificada genéticamente en el Departamento de Glaxo en
Inglaterra, con el objetivo de otorgarle la capacidad de detectar el potencial estrogénico de
compuestos con actividad hormonal, por medio de respuestas colorimétricas, esto mediante la
técnica que lleva por nombre “Yeast Estrogen Assay” (YES) según lo establecido por el
protocolo de Routledge and Sumpter (1996). Este ensayo está basado en la expresión de la
enzima β-galactosidasa, la cual es usada como medida de actividad del receptor frente a un
compuesto estrogénico ya que, en presencia del compuesto estrogénico se estimula la
actividad transcripcional del biosensor y así, se expresa la respuesta del gen reportero (Xie et
al., 2004).
Saccharomyces cerevisiae es un organismo se conoce totalmente su genoma está totalmente,
además, es considerado como modelo simple de célula eucariótica. Para transformarlo en un
biosensor, como ya se mencionó, fue necesario modificarlo genéticamente. Dicha modificación,
específicamente, consistió en la adición de un receptor estrogénico en el ADN de la levadura
(hER-α) instalándose como un gen cromosomal (Roda et al., 2006), y un gen reportero a nivel
plasmidial (Lac-Z), el cual codifica para la síntesis de la enzima β-galactosidasa gracias a la
ayuda del promotor transcripcional o elemento de respuesta estrogénica (ERE) y a un promotor
fuerte (PGk).
23
Receptor
Activado
Estrógeno
ERE
PGk
Lac-Z
3
CPRG
Amarillo
4
2
β-galactosidasa
5
CPRG
Rojo
1
hER
Citoplasma
Medio
Levadura
Figura 2. Esquema que muestra como ocurren las reacciones en cadena en la levadura,
inducidas luego de que un compuesto estrogénico se une al receptor de estrógenos humano.
hER: Gen Receptor de Estrógenos Humano; ERE: Elemento de Respuesta Estrogénica; PGk:
Plásmido de expresión; Lac-Z: Gen reportero que induce la expresión de la enzima βgalactosidasa.
La presencia del contaminante con un potencial estrogénico, en el medio, es detectada por el
biosensor. El contaminante se une al receptor hormonal, el cual se transforma en un receptor
activo, este estimulan al activador transcripcional y se expresa el gen reportero, el cual induce a
la expresión de la β-galactosidasa. Esta última, sale al medio y en presencia del reactivo
cromogénico (CPRG), se produce un viraje de color, el cual va de amarillo a rojo. El producto de
este último, se detecta cuantificando la actividad enzimática correspondiente, medido finalmente
con un espectrofotómetro (Sanseverino et al., 2005) a absorbancia de 550 nm y 630 nm (Birket
and Lester, 2003).
24
Este método se realiza actualmente en Brasil, pero es aplicado a aguas residuales domesticas.
Sin embargo, ya se está ocupando en estudios realizados en los efluentes de las industrias de
celulosa, para detectar o no compuestos con actividad estrogénica. Por ejemplo, en U.S.A y
Alemania. En este último país, Hamm et al. (2006), evaluaron 16 muestras de efluentes de
pulpa química mediante el YES de levadura recombinante, 10 muestras fueron probadas
positivas, 7 de ellas eran efluentes de celulosa Kraft con tratamiento distintos tipos de
tratamientos para sus efluentes.
25
3. HIPOTESIS DE TRABAJO
Existen compuestos específicos puros, derivados de compuestos extractivos de la madera,
presentes en un efluente de celulosa Kraft y que presentan actividad estrogénica detectada por
el biosensor Saccharomyces cerevisiae, recombinante
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general.
Evaluar la actividad estrogénica de compuestos específicos puros, presentes en un efluente de
celulosa Kraft.
4.2. Objetivos específicos.
1. Evaluar la respuesta del biosensor, Saccharomyces cerevisiae recombinante,
mediante compuestos de referencias.
2. Evaluar la actividad estrogénica de compuestos específicos puros, contenidos en
efluente de celulosa Kraft mediante Saccharomyces cerevisiae recombinante.
26
5. METODOLOGÍA
5.1. Actividad estrogénica
La actividad estrogénica de los compuestos específicos puros detectados en los efluentes de
celulosa Kraft, fue determinada mediante la técnica Yeast Estrogen Assay (YES), realizada
según la metodología descrita por Routledge and Sumpter (1996).
5.1.1. Cepa de levadura recombinante
La cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae recombinante, fue modificada genéticamente
por el Departamento de Genética da Glaxo, para ser usada como un test en la identificación de
sustancias que pueden interactuar con el gen humano (hER), el cual controla la expresión del
gen reportero Lac-Z produciendo la enzima β-galactosidasa. La cepa a utilizar en este ensayo,
fue donada por la profesora Marcia Dezotti del Departamento de Ingeniera Química de Polución
de Aguas de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil.
5.1.2. Preparación de las soluciones del medio de cultivo
Preparado previamente para un nuevo cultivo de levadura. Este medio se compone de: 45 mL
medio mínimo, 0,5 mL de vitaminas, 5 mL de solución de glucosa, 1,25 mL de solución de ácido
aspártico, 0,4 mL de solución de L- Treonina y 125 μL de una solución de Cobre II. Todas las
mediciones de los reactivos, fueron realizadas en la Balanza analítica marca Precisa, modelo
XB 120 A (Figura 3).
27
a) Preparación del medio mínimo (pH 7,0 - 7,1)
El medio mínimo se preparó en 1 L de agua HyPure Cell Culture marca HyClone por la adición
de 13, 61 g de KH2PO4 (98% Fluka), 1,98g (NH4)2SO4 (Scharlau), 4,2g de KOH pellets
(Scharlau), 0,2g de MgSO4 (Merck), 1 mL de solución de Fe2(SO4)3 (40 mg/50 mL H2O) 50 mg
de L-Leucina (98% Sigma), 50 mg de L-Histidina (99% Sigma), 50 mg de Adenina (99% Sigma),
20 mg de L-Arginina-HCl (98% Sigma), 20 mg de L-Metionina (98% Sigma), 30 mg de LTirosina (98% Sigma), 30 mg de L-Isoleucina (98% Sigma), 30 mg de L-Lisina-HCl (98%
Sigma), 25 mg de L-Fenilalanina (98% Sigma), 100 mg de L-ácido glutámico (98% Sigma), 150
mg de L-Valina (98% Sigma), y 375 mg L-Serina (99% Sigma). Posteriormente, la solución fue
estandarizada a pH 7,1 en el Peachímetro c/ electrodo Sentix 41, Marca WTW, modelo Inolab
pH level 1 (Figura 4), almacenada en frascos de vidrio, esterilizados a 121º C por 15 minutos y
guardados a temperatura ambiente.
Figura 3. Balanza analítica marca Precisa, modelo XB 120 A.
28
b) Preparación de solución de vitaminas
Una solución de vitaminas se preparó en 180 mL de agua HyPure Cell Culture marca HyClone
por la adición de 8 mg Tiamina (98% Sigma), 8 mg Piridoxina (98% Sigma), 8mg Pantetonato
de calcio (98% Sigma), 40 mg Inositol (98% Sigma) y, 20 mL de solución de Biotina (2mg/100
mL de H2O) (99% Sigma). Posteriormente, esta solución fue filtrada a través de una membrana
estéril de 0,2 μm. Posteriormente fueron guardadas en alícuotas de 10 o 20 mL, a 4º C en
frascos de vidrio esterilizados.
Figura 4. Peachímetro c/ electrodo Sentix 41, Marca WTW, modelo Inolab pH level 1.
c) Preparación de solución de Glucosa
Una solución de 20% p/v (20g/100mL) de D (+) glucosa (98% Merck), fue preparada y
esterilizada en alícuotas de 20 mL de agua HyPure Cell Culture marca HyClone, a 121° C por
10 minutos y guardada a temperatura ambiente.
29
d) Preparación de solución de ácido L-aspártico
Una solución stock de 4 mg/mL (400 mg/ 100mL) de ácido aspártico (98% Sigma), fue
preparada y esterilizada en alícuotas de 20 mL de agua HyPure Cell Culture marca HyClone, a
121°C por 10 minutos y guardadas a temperatura ambiente.
e) Preparación de solución de L-Treonina
Una solución stock de 24 mg/mL (600 mg/25 mL) de L-Treonina (98% Sigma), fue preparada y
esterilizada en alícuotas de 5 mL de agua HyPure Cell Culture marca HyClone, a 121° C por 15
minutos y guardadas a 4°C.
f) Preparación de solución de Sulfato de Cobre II
Una solución de 20 mM (0,5 g/100 mL de agua HyPure Cell Culture marca HyClone) de sulfato
de cobre (II) fue preparada, filtrada en membrana estéril de 0,2 μm esterilizada. La solución fue
guardada a temperatura ambiente en frascos de vidrio esterilizados.
5.2. Crecimiento de levadura recombinante: Análisis previos
Previo a la aplicación de la técnica se realizaron cultivos realizados con distintas cantidades de
inóculos de levadura (μL), incubados a distintas temperaturas por un determinado tiempo. Los
cultivos realizados fueron: 250 μL a 26º C, 250 μL a 28º C, 500 μL a 28º C, 250 μL a 30º C, 250
μL a 32º C y uno de 1000 μL a 28º C. Todo esto, se realizó para la obtención de datos que
permitieran un crecimiento óptimo para la levadura, debido a la necesidad de obtener un
30
número total de 4x107 células de levadura. Sólo teniendo tal número se puede hacer uso del
biosensor en la técnica YES. Para verificar dicho valor, se midió la absorbancia (A) de cada uno
de los cultivos realizados desde el tiempo 0 a 192 (h) cada 24 h, a través del espectrofotómetro
marca Spectronic Unicam, modelo Génesis 10UV (Figura 5) a una longitud de onda de 630 nm.
Dicha absorbancia debe tener un valor entre 0,8–1,0 (Boever et al., 2001), lo cual indica que se
cuenta con el número de células de levadura indicado anteriormente. Si la A es < 0,8, se
adiciona un pequeño volumen de levadura (de 0,2 a 0,2 ml), por otra parte, si A > 1, se adiciona
medio de cultivo. El cultivo de la levadura debió ser realizado en una cámara de flujo laminar
marca Misonix Modelo PCR 6 (Figura 6).
5.3. Cultivo de levadura
En un frasco T estéril de 50 mL, se adicionaron 10 mL de medio de cultivo más 100 μL de
levadura y luego, se incubó en el Agitador Orbital c/regulación de tiempo y Tº, marca LAB-LINE,
modelo Enviromental Shaker (Figura 7), a 28° C e 100 rpm durante 24 horas para ser utilizada
en el ensayo.
Figura 5. Espectrofotómetro marca Spectronic Unicam, modelo Génesis 10UV.
31
Figura 6. Cámara de Flujo Laminar marca Misonix Modelo PCR 6.
Figura 7. Agitador orbital c/regulación de tiempo y Tº, marca LAB-LINE, modelo Enviromental
Shaker.
5.4. Preparación de soluciones para el ensayo
Las soluciones ocupadas en el ensayo corresponden a un patrón ó compuesto positivo de 17αetinilestradiol (EE2) con una pureza de 99%, Sigma. Un blanco ó compuesto negativo (Etanol
absoluto). Y dos compuestos puros de fitoesteroles: β-sitosterol y Estigamasterol
32
Para la obtención de la curva del patrón se tomaron concentraciones entre 54,48μg/L-26,6 ng/L.
Para la preparación de los compuestos puros se realizaron soluciones Stock de estigmasterol,
(100mg/25mL de etanol absoluto) posteriormente, esta solución fue sonicada en el Sonicador
marca Transsonic 460. Para β-sitosterol (100mg/25mL de etanol absoluto), se realizó el mismo
procedimiento que para el fitoesterol ya mencionado. Las soluciones mencionadas fueron
almacenadas a 4° C.
5.5. Preparación de solución de Rojo clorofenol β-D-galatopiranosido (CPRG, reactivo
cromogénico)
Una solución stock de 10 mg/mL de Rojo β-D-galactopiranosido (90%, Fluka) fue preparada
en agua HyPure Cell Culture marca HyClone, y guardada a 4° C en frascos de vidrio
esterilizados. Esta solución contiene el sustrato sobre el cual actúa la enzima βgalactosidasa, liberada por el biosensor, cuando ésta detecta un compuesto con potencial
estrogénico en el medio. Así, dicha enzima rompe la unión de este reactivo y libera al medio,
una molécula de galactosa y una de rojo clorofenol, este último es responsable de la
coloración roja que nos hace posible saber que la levadura ha detectado dicho potencial.
5.6. Preparación de las diluciones para el ensayo
Para cada ensayo se prepararon dos microplacas (Corning). Una de ella corresponde a la placa
de dilución y la otra la del ensayo propiamente tal. En la primera se realizaron diluciones
seriadas en duplicado para el compuesto patrón o 17α-etinilestradiol, desde el pocillo n°1 al
n°12, quedando con concentraciones de 54,48 μg/L a 26,61 ng/L. En otro par de filas, se realizó
33
la dilución seriada para estigmasterol y para β-sitosterol. Ambos compuestos quedaron con
concentraciones de 100 mg/L a 50 μg/L.
Para hacer las diluciones, se adicionaron 100μL de etanol absoluto en 12 pocillos de la fila de la
placa de dilución del blanco, menos en el pocillo n°1. Mientras que en el pocillo n°1 se adicionó
200μL de solución stock de 17α-etinilestradiol o de las muestras, según corresponda. Por otro
lado, en el pocillo n°2 se adicionó 100μL de solución del 1° y se agitó. A su vez, en el pocillo n°3
se adicionó 100μL de solución del 2° y se agitó. Así se continuó, sucesivamente, hasta el último
pocillo de la fila.
Todo este ensayo debe estar en las condiciones máximas posibles de esterilidad por lo mismo
todos los pasos, a partir de la placa de dilución, se realizaron en la Cámara de Flujo Laminar
marca Misonix Modelo PCR 6. Sólo una vez listos estos pasos, se continua en lo que respecta a
la placa de ensayo.
5.7. Técnica “Yeast Estrogen Assay” (YES)
Luego, de terminada las diluciones en la placa de dilución se procedió a realizar la placa de
ensayo. Sin embargo, antes de esto se prepararon dos tubos. Para la preparación del primer
tubo se adicionaron 25 mL de medio de cultivo a un tubo falcón de 50 mL, a este mismo se le
agregaron 250 μL de la solución de CPRG (10mg/mL) y 25μL de solución del Tubo 2. Para la
preparación de este último, se adicionaron 4 mL de medio de cultivo a un tubo falcón de 10 mL,
además de 1,1 mL de un cultivo de levadura de 24 horas al día del ensayo.
34
Una vez preparados estos medios, se procede a adicionar 10μL de cada pocillo de la placa de
dilución a la placa de ensayo. De la mezcla realizada en el tubo 1, se transfirió una alícuota de
200μL a cada pocillo de la microplaca. Luego de este procedimiento las microplacas fueron
selladas con cinta de autoclave, y agitadas vigorosamente por 2 min. Finalmente, cada placa
fue incubada por 72 horas a 30º C. en la estufa marca Termo Areus modelo B6 (Figura 8).
Figura 8. Estufa marca Termo Areus, modelo B6.
Cumplido el tiempo de incubación se procedió a retirar las placas de la incubadora y se dejaron
descansar por una hora a temperatura ambiente. La respuesta se consideró como positiva al
cambio de color amarillo a rojo, el cual fue medido espectrofotométricamente a través del lector
de placas EL x 800, BioTex a dos longitudes de onda, 550nm (color reflejado en la actividad de
la β-galactosidasa) y a 630nm (turbidez) (Figura 9).
35
Figura 9. Lector de placas EL x 800, BioTex.
5.8. Análisis de Resultados
El análisis de resultados se realizó por medio del programa Origin version 6.0 en el cual se
ingresaron los siguientes datos: concentraciones de dilución de cada uno de los 12 pocillos de
cada fila, desviación del compuesto patrón y la absorbancia corregida. Esta última resulta de
una ecuación matemática (Ecuación 1).
A 550 nm – (A 630 nm – A media del blanco 630 nm)
Ecuación 1
Donde A 550 nm corresponde a la absorbancia del compuesto a 550 nm, A 630 nm es la absorbancia
del compuesto a 630 nm y, A
media del blanco 630 nm
es la absorbancia media obtenida de todos los
pocillos blanco a 630 nm.
Posteriormente, se obtiene una curva sigmoidal a la que se aplica logaritmo en base 10 para
finalmente obtener la concentración EC50, la cual seré explicada más adelante.
36
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Crecimiento de levadura recombinante: Análisis previos
Para determinar las condiciones óptimas de crecimiento de la levadura se realizaron distintos
cultivos a diferentes temperaturas y concentración del biosensor. Los resultados indican que el
óptimo de la cepa para realizar el ensayo, corresponde a un cultivo inoculado con 500 μL de la
cepa de Saccharomyces cerevisiae, recombinante, e incubado a 28 ºC, durante 24 h. Con la
necesidad de obtener una densidad óptica del cultivo entre 0,8 y 1 a 630 nm (Figura 10).
3,0
0.80
0.66
Absorbancia 630 nm
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
24
48
72
96
120
144
168
192
216
Tiempo (h)
26 °C
28 °C
28 °C
30 °C
32 °C
Figura 10. Gráfico que demuestra los resultados obtenidos de los cultivos de levadura,
realizados con distintas cantidades de inóculos (μL), incubados a distintas temperaturas por un
tiempo que va desde las 0 a 192 h.
37
En un cultivo posterior, se inocularon 1000 μL, los cuales fueron incubados a 28 ºC durante 24
horas. Este óptimo de temperatura se demostró también en la velocidad de crecimiento
específico del biosensor (Figura 11). Cumplido ese tiempo, el cultivo demostró tener una mejor
absorbancia para realizar la técnica YES (A 1,0). Esto último, indica que es posible la
realización de la técnica después de 24 horas pero, con la adición de un inóculo más
concentrado. A través de la medición de la absorbancia del cultivo de levadura se pudo obtener,
una cinética de la velocidad de crecimiento especifico del biosensor a distintas temperaturas
(Tabla V), mediante la Ecuación 2.
dx
=
µX
Ecuación 2
dt
Donde dx, corresponde a la variación de la concentración de la levadura y dt a la variación en el
tiempo y, µ corresponde a la velocidad de crecimiento especifica del biosensor.
Tabla V. Velocidad de crecimiento especifico del biosensor a distintas temperaturas, mediante
la Ecuación 2.
Temperatura
Velocidad de
(ºC)
crecimiento
20
0
26
0.0088
28
0.0188
30
0.0119
32
0.0054
38
0.020
Vel. esp.crem, u
0.015
0.010
0.005
0.000
20
22
24
26
28
30
32
34
Temperatura (°C)
Figura 11. Velocidad específica de crecimiento del biosensor a distintas temperaturas.
De acuerdo a lo anterior se concluyó trabajar, a una temperatura de 28ºC, con un inóculo de
1000 μL de un cultivo de 24 horas.
6.2. Ensayo Yeast Estrogen Assay (YES)
La actividad estrogénica de dos compuestos específicos puros detectados en los efluentes de
celulosa Kraft, estigmasterol y β-sitosterol, fue determinada mediante el uso de la técnica Yeast
Estrogen Assay (YES) para la obtención de la EC50. Esta última, es la concentración en la que
se produce una actividad estrogénica igual al 50% del compuesto patrón (Hamblen et al., 2003),
el cual en este trabajo, correspondió al 17α-etinilestradiol (EE2) y fue determinada para cada
compuesto a través del programa Origin versión 6.0. De este último, se obtienen curvas dosis
respuestas (obtenida usando el método de regresión logarítmica), resultantes de los valores de
la absorbancia corregida (nm) (variable dependiente) y la concentración de actividad
estrogénica (variable independiente).
39
Durante los primeros ensayo en el periodo de incubación de la placa (72 h), se evidencia una
coloración roja en la mayoría de los pocillos, incluyendo la del control (etanol, control negativo),
los cuales debían permaneces sin viraje de color. De acuerdo a esto, se plantea que el agua
utilizada (agua nanopura tratada por un sistema milliQ) tanto para la dilución de los compuestos
como para la preparación del medio mínimo, posee compuestos con potencial estrogénico, los
cuales estaban induciendo una respuesta positiva errónea (Figura 12). Por lo tanto, no es
posible utilizar el agua nanopura.
Figura 12. Placas que resultaron tener resultados erróneos (coloración roja) puesto que daban
positivo al compuesto control (negativo o blanco), el cual en este trabajo corresponde al etanol
absoluto.
Para la solución de este problema, se recurrió al uso de agua ultrapirogénica o HyPure Cell
Culture marca HyClone, para la preparación de todas las soluciones, tanto de las del ensayo
como las del medio de cultivo de la cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante.
Resuelto el problema de la coloración errónea en el compuesto negativo, utilizando el agua
HyPure Cell Culture marca HyClone, se obtuvieron los resultados correctos. En estos últimos,
40
después de las 72 horas de incubación, el compuesto control seguía presentando una
coloración amarilla producto de la presencia del reactivo cromogénico, mientras que, los
compuestos que tenían un potencial estrogénico presentaban una coloración rojiza. Esto
evidencia que, efectivamente el agua milliQ utilizada en los primeros ensayos, presentaba
compuestos con actividad estrogénica y que estaban induciendo la actividad de la βgalactosidasa del biosensor. A su vez, indica que este microorganismo genéticamente
modificado, posee una alta sensibilidad analítica ya que, es capaz de detectar compuestos aún
con bajo potencial estrogénico en su medio. Además, dicho biosensor es capaz de generar una
serie de reacciones en cadena, las cuales se traducen en la expresión de la enzima βgalactosidasa, la cual sale al medio y reacciona con reactivo cromogénico (CPRG) produciendo
un cambio en el color del medio de amarillo a rojo. Esto último es posible ver en la Figura 13.
A
B
Figura 13. Placa con la respuesta de un viraje de color correcto, cuando se utiliza agua
ultrapirogénica.
Los dos fitoesteroles evaluados mostraron tener un potencial estrogénico reflejado en la
concentración
efectiva
(EC50),
destacándose
al
β-sitosterol
ya
que,
demostró
una
estrogenicidad mucho más fuerte que la presentada por el estigmasterol. Específicamente, y
41
como lo indican los resultados de la Tabla VI, se puede observar que el 17α-etinilestradiol
presenta un potencial estrogénico de 6.46E-05 μg/L, mientras que el β-sitosterol y estigmasterol
presentaron una EC50 de 2.30E-04 μg/L y 0.001262 μg/L, respectivamente. En otras palabras, el
β-sitosterol es 3,8 veces menos estrogénico que el EE2, mientras que, el estigmasterol es 21
veces menos potente que el compuesto patrón. No obstante, estas diferencias no significan que
estos compuestos no tengan un potencial estrogénico.
Tabla VI. Concentraciones efectivas (EC50) obtenidas para el EE2, Estigmasterol y β-sitosterol a
través de la aplicación de una regresión logarítmica a las curvas dosis respuestas, entregadas
por el programa Origin versión 6.0.
Compuesto
EC50 (μg/L)
EE2
0,0000646
Estigmasterol
0,001262
β-sitosterol
0,000230
Estos hallazgos sugieren que el EE2, a pesar de no estar presentes en los efluentes de
celulosa Kraft, se ha detectado en los efluentes domésticos, llegando a través de éstos, a los
sistemas de tratamiento. Sin embargo, al no ser depurado en su totalidad, las mínimas
concentraciones detectadas, en los cuerpos de agua sugieren que dicho compuesto, presenta
actividad estrogénica
(Routledge et al., 1998), al igual que el estigmasterol y β-sitosterol
(presentes en los efluentes de celulosa Kraft). Estos compuestos mencionados podrían ser los
responsables de las alteraciones estrogénicas observadas en peces machos expuestos a los
efluentes domésticos y de celulosa Kraft. De hecho, autores señalan que el β-sitosterol puede
causar alteraciones endocrinas a los 14 μg/L (Bruchet et al., 2002).
42
Los resultados entregados por el biosensor mediante el ensayo YES para el compuesto patrón,
pueden observarse en la Figura 14. La exposición de los seres vivos a los disruptores
endocrinos es masiva y universal, ellos no discriminan. A su vez, nadie esta expuesto a un sólo
compuesto, es más, muchos de ellos podrían no actuar solos sino, en combinación con otros
(Hilscherova et al., 2000). Los efectos endocrinos que están siendo observados en los
organismos que habitan las cercanías de donde se vierten lo efluentes de celulosa Kraft hacen
surgir la necesidad de conocer más acerca de estos compuestos y su potencial estrogénico, sin
embargo, los análisis a estos efluentes, biológicamente tratados, apenas han sido explorados
hasta ahora (Hamm, 2006).
2.2
Actividad B-galactosidasa (Acorregida)
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
1E-7
1E-6
1E-5
Log concentración (M)
Figura 14. Respuesta obtenida del ensayo YES, para un rango de dilución de 54,48 μg/L a
26,61 ng/L del compuesto patrón (17α-etinilestradiol).
43
Actividad B-galactosidasa (Acorregida)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
1E-4
1E-3
0.01
Log concentración (M)
Figura 15. Respuesta obtenida del ensayo YES, para un rango de dilución de 100 mg/L a 50
μg/L del compuesto patrón (β-sitosterol).
2.2
Actividad B-galactosidasa (Acorregida)
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2
-0.4
1E-4
1E-3
0.01
Log concentración (M)
Figura 16. Actividad de la enzima muestra β-galactosidasa frente a Estigmasterol en un rango
de dilución de 100 mg/L a 50 μg/L.
44
Debido a la gran complejidad química de estos compuestos y la mezcla de ellos, aumentan su
efecto adverso sobre los sistemas biológicos, actuando con una mayor fuerza en poblaciones
que están cerca de aquellas industrias. Por otra parte, las características físico-químicas de los
compuestos juegan un rol importantes en la distribución de éstos en el ambiente.
Por otra parte, para hacer una comparación más directa del potencial estrogénico de cada
compuesto evaluado en el ensayo, fue determinada la potencia relativa estrogénica (PR) tanto
para el estigmasterol β-sitosterol calculada a partir de la Ecuación 3. Esta para cada sustancia
con referencia al EE2 (Tabla VII).
PR =
EC50EE2
Ecuación 3
EC50 muestra
Tabla VII. Potencia relativa estrogénica para cada fitoesterol con respecto al patrón.
Compuesto
PR
Estigmasterol
0.0511
β-sitosterol
0.2808
El impacto ambiental que generan los efluentes de la industria de celulosa Kraft, puede
provocar serias consecuencias a nivel ambiental. Considerando que investigaciones realizadas
evidencian que estos compuestos están siendo detectados en los efluentes de celulosa Kraft a
concentraciones que superar el poder de su estrogenicidad. Van Den Heuvel et al. (2002),
realizaron un estudio en los efluentes de celulosa Kraft con tecnología de blanqueo tipo ECF y
detectó en ellos, el campesterol (7,6 μg/L), estigmasterol (21,1 μg/L) y β-sitosterol (165,4 μg/L).
45
Estos vertidos en general han sido evaluado a través de estudios de toxicidad aguda, por medio
de respuestas letales (mortalidad) o a través de estudios de toxicidad crónica, con respuestas
subletales (fertilización, crecimiento, comportamiento) (Priha, 1996). Sin embargo, en las
últimas cuatro décadas, los efluente de celulosa Kraft, han sido relacionados con problemas en
el sistema reproductor endocrino.
Lo grave, es que pareciera no haber tratamiento que nos libre de ellos, puesto de que, hay
estudios que dejan en claro de que estos compuestos no están siendo eliminados por los
tratamientos empleados por esta industria en la depuración de sus riles. Esto último, hace que
estos compuestos lleguen, a los cuerpos de agua y estén actuando perjudicialmente sobre un
sin número de organismos, principalmente acuáticos, lo cual se puede observar con cierta
facilidad en los peces que son expuestos a efluentes previamente tratados (Howell et al., 1980;
Hartley et al., 1998; Hewitt et al., 2000; Houtman et al., 2004; Shaughnessy et al., 2007).
Al respecto, se han realizado investigaciones en las que se observa un efecto crónico e
irreversible de alteración hormonal (Servos et al., 1996; Cook et al., 1997; Kostamo et al., 2004;
Sumpter, 2005; Orrego et al., 2006; Vidal et al., 2007). De hecho, Chile no es la excepción de
esta invasión de compuestos con actividad hormonal. Es así como se dan a conocer, por
primera vez en Chile, las alarmantes evidencias obtenidas en estudios de campo, experimentos
de laboratorio y estadísticas, para plantear en términos científicos, pero accesibles para todos,
el caso de este nuevo peligro. Y es así mismo, como nace la necesidad de caracterizarlos,
evaluar, además de conocer su capacidad endocrina como también los efectos adversos que
pueden ocasionar en la población y en el medio ambiente. Actualmente, la atención ha sido
dirigida a identificar los productos químicos, principalmente estrogénicos, porque muchos de los
efectos demostrados en la fauna parecen ser una consecuencia de la feminización de machos
(Sumpter, 2005).
46
Sin lugar a dudas, estamos frente a un problema emergente, real y silencioso, que está
dispuesto a atentar contra la salud ambiental. Lo curioso es que los enemigos, ahora son
sustancias naturales y más aún, son parte de nuestra vida y han llegado a convertirse en parte
integrante de nuestra economía industrial, difundiéndose con asombrosa facilidad por todo el
ambiente (White et al., 1994).
Como se ha podido observar, es importante conocer los compuestos presentes en el efluente
de celulosa Kraft que pudiesen causar disrupción endocrina, debido al panorama que se
enfrenta este tipo de empresa los próximos años, con el creciente aumento de demanda de
celulosa blanqueada, lo que posteriormente resultara en una mayor cantidad de estos
contaminantes al medio ambiente, en especial el acuático y con estos resultados se darían a
conocer detalladamente los distintos potenciales estrogénicos, de manera de estimar los
riesgos asociados a este ámbito industrial, y poder tomar medidas de prevención y protección.
47
7. CONCLUSIONES
•
Las condiciones óptimas para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae, recombinate son
1000 μL levadura incubados durante 24 h a una temperatura de 28 ºC.
•
La concentración efectiva 50 del estigmasterol es de 0,001262 μg/L , para el β-sitosterol
0,000230 μg/L mientras que para el EE2 fue de 0,0000646 μg/L
•
La potencia relativa estrogénica (PR) del estigmasterol con respecto al potencial del 17
α-etinilestradiol es de 0,051 y para el β-sitosterol es de 0,28.
48
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