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República de Cuba
Universidad de La Habana
Facultad de Biología
Mecanismos inmunológicos asociados a la
vacunación terapéutica de cáncer con
NGcGM3/VSSP
Tesis en opción al título de Doctor en Ciencias Biológicas
Por
Autora: Lic. Mayrel Labrada Mon, M. C.
Tutor: Lic. Luis Enrique Fernández Molina, Dr. C.
Centro de Inmunología Molecular
La Habana
2014
No pretendo más que lo que el hombre de ciencia, que aun
cuando realiza sus experimentos con la máxima precisión,
minuciosidad y previsión, jamás proclama haber alcanzado
conclusiones definitivas, sino que los contempla con la
mente alerta y espíritu crítico.
M. K. Gandhi
A Camila y Carlos
La gratitud, como ciertas flores, no se da en la altura y
mejor reverdece en la tierra buena de los humildes.
José Martí
En este documento cité las fuentes de los resultados científicos que aparecen publicados
en la literatura especializada, pero ¿y las ideas y sugerencias recogidas en presentaciones,
encuentros y conversaciones con compañeros y amigos?
Estoy en deuda con mi tutor Luis Enrique Fernández; con las oponentes de la predefensa,
Isis Torrens y Marta Ayala, del CIGB; con los amigos y colegas del CIM: Adriana Carr,
Zaima Mazorra, Joel de León, Beatriz García, Circe Mesa, Belinda Sánchez, Kalet León,
Ana María Vázquez, Tays Hernández, Liliana Oliver, Yanín Bebelagua, Arlhee Díaz, Giselle
Hevia e Isabel Pablos; con Federica Benvenuti y Francesca Prete, del ICGEB en Triste,
Italia. Agradezco también las críticas y los consejos de las profesoras de la Facultad de
Biología de la Universidad de La Habana: Fabiola Pazos, Maria Eliana Lanio, María del
Carmen Luzardo y María Cristina Pico.
Agradecimiento aparte hago a Marylin Clavell y Judith Raymond, por su ayuda inmensa con
los ratones.
Gratitud también a mis compañeras de doctorado: Audry Fernández y Tania Carmenate,
con quienes disfruté esta competencia de entrega de expedientes, exámenes, artículos
enviados, aceptados y aparecidos, entrevistas con los oponentes y defensas, porque
ninguna podía quedarse rezagada. Las tres llegamos juntas a la meta.
Agradezco además la paciencia de mi familia, pues fueron muchos los momentos de
ausencia para llegar aquí.
Síntesis
Los tejidos normales de humanos no expresan niveles apreciables de gangliósidos Nglicolilados, sin embargo, su presencia se describe en varios tipos de tumores de pacientes.
Esto, unido al papel de los gangliósidos en la evasión de la inmunovigilancia y en la
progresión tumoral, los convierte en blanco atractivo para la inmunoterapia del cáncer. En el
Centro de Inmunología Molecular se desarrolla la vacuna NGcGM3/VSSP, que incluye al
gangliósido NGcGM3 en las vesículas de membrana externa de la bacteria Neisseria
meningitidis. En este trabajo se estudia el mecanismo de acción de la vacuna
NGcGM3/VSSP en ratones, utilizando el modelo de metástasis espontánea a pulmón del
carcinoma de Lewis. La comprensión del mismo permitirá el empleo de terapias óptimas y
el uso de estrategias de combinación con inmunomoduladores. Se demostró la presencia
del gangliósido NGcGM3 en las diferentes etapas por las que transita el modelo tumoral. La
administración terapéutica de la vacuna NGcGM3/VSSP redujo las metástasis en los
pulmones de los animales tratados, independientemente del carácter emulsivo de la
formulación empleada y de la ruta de administración. Los resultados obtenidos son la
primera evidencia de reclutamiento de células efectoras de la inmunidad adaptativa al sitio
metastásico, por una vacuna basada en gangliósidos.
Abreviaturas
AAT: antígenos asociados a tumores
ADCC: citotoxicidad cellular dependiente de anticuerpo, del inglés: antibody-dependent cellular
cytotoxicity)
Ac: anticuerpo
AcM: anticuerpo monoclonal
AET: antígeno específico de tumores
Ag: antígeno
APC: células presentadoras de antígenos (del inglés: Antigen Presenting Cells)
AS: ácido siálico
ANOVA: análisis de varianza (del inglés: Analysis of Variance)
ATCC: Colección Americana de Tipos Celulares (del inglés: American Type Culture Collection)
BCG: Bacilo Calmette-Guérin
bm-DC: células dendríticas derivadas de precursores de monocitos de médula ósea (del inglés:
bone marrow dendritic cells)
BSA: albúmina de suero bovino (del inglés: bovine serum albumin)
CD: moléculas de diferenciación expresadas en células del sistema inmunitario (del inglés:
cluster differentiation)
cDC: células dendríticas convencionales
CDC:
citotoxicidad
dependiente
de
complemento
(del
inglés:
cytotoxicity
dependent
complement)
CEA: antígeno carcino-embrionario (del inglés: carcinoembrionic antigen)
CIM: Centro de Inmunología Molecular
CMAH: enzima mono fosforil citidina-N-Acetil ácido siálico hidroxilasa (del inglés: cytidine
monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase)
Cmah: gen que codifica para la enzima CMAH
CpG: ácido desoxirribonucleico bacteriano no metilado con secuencias CpG
CTL: linfocitos T citotóxicos (del inglés: cytotoxic T lymphocytes)
DC: células dendríticas (del inglés: dendritic cells)
ELISA: ensayo inmunoenzimático colorimétrico (del inglés: enzime immunosorbent assay)
FACS: citometría de flujo (del inglés: flourescence activated cell sorter)
FITC: isotiocianato de fluoresceína (del inglés: fluorescein iso-thiocyanate)
FLT3-L: ligando de tirosina cinasa Fms-3 (del inglés: Fms-related tyrosine kinase 3 ligand)
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
GM-CSF: factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (del inglés: granulocytemacrophage colony stimulating factor)
HPTLC: Cromatografía de alta resolución en capa delgada (del inglés: high performance thin
layer cromatography)
HSP proteínas de estrés térmico (del inglés: heat shock proteins)
IFN: interferón
IT: inmunoterapia
ITAE: inmunoterapia activa específica
KLH: hemocianina de la linfa del cangrejo Bayoneta (del inglés: keyhole limpet hemocyanin)
LPS: lipopolisacárido
MCI: muerte celular inmunogénica
MDSC: células supresoras de origen mieloide (del inglés: myeloid-derived suppressor cells)
NAcGM3: gangliósido N-acetil GM3
Neu5Ac: ácido N-acetil neuramínico (del inglés: N-acetyl neuraminic acid)
Neu5Gc: ácido N-glicolil neuramínico (del inglés: N-glycolyl neuraminic acid)
NGcGM3: gangliósido N-glicolil GM3
NK: células asesinas naturales (del inglés: Natural Killer)
NKT: células asesinas naturales que expresan el receptor de células T (del inglés: natural killer
T cells)
Nm: Neisseria meningitidis
pDC: células dendríticas plasmacitoides
PE: ficoeritrina (del inglés: phycoerithrin)
PECy5: ficoeritrina-cianina (del inglés: phycoerythrin and cyanine)
poli I:C: ácido polyinosinoico-polycitidílico
QS-21: fracción saponina purificada de la corteza del árbol Quillaja saponaria
SFT: suero fetal de ternera
SSTF: solución salina tamponada con fosfatos
TCR: receptor de células T (del inglés: T cell receptor)
Th: linfocitos T auxiliadores (del inglés: T helper)
TLR: receptores tipo Toll (del inglés: Toll-like receptors)
VLDL: lipoproteínas de muy baja densidad (del inglés: very low density lipoprotein)
VME: vesículas de membrana externa
VSSP: proteoliposomas de muy pequeño tamaño (del inglés: very small size proteoliposomes)
Índice
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 9
2.1
Inmunoterapia de cáncer ........................................................................................... 9
2.1.1
Vacunas de cáncer ...............................................................................................10
2.1.2
Adyuvantes en las vacunas de cáncer ..................................................................11
2.1.3
Los VSSP..............................................................................................................15
2.1.4
Mecanismos de acción de las vacunas de cáncer. ................................................16
2.2
Gangliósidos ............................................................................................................ 20
2.2.1
Localización, características estructurales, biosíntesis y función ...........................20
2.2.2
Los gangliósidos como antígenos asociados a tumores ........................................23
2.2.3
La función N-glicolilada en tumores humanos .......................................................27
2.2.4
Inmunosupresión inducida por los gangliósidos ....................................................29
2.2.5
Papel del gangliósido NGcGM3 en la progresión tumoral .....................................32
2.3
Vacunas de cáncer basadas en gangliósidos .......................................................... 33
2.4
Mecanismos de acción de las vacunas de cáncer basadas en gangliósidos............ 36
2.5
El gangliósido GM3 como blanco de la IT de cáncer ............................................... 38
2.5.1
El preparado vacunal NAcGM3/VSSP ...................................................................39
2.5.2
Racotumumab .......................................................................................................40
2.5.3
El preparado vacunal NGcGM3/VSSP ..................................................................41
3. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 43
3.1
Animales .................................................................................................................. 43
3.2
Líneas celulares y medios de cultivo ....................................................................... 43
3.3
AcM utilizados para la eliminación de poblaciones linfocitarias ................................ 43
3.4
AcM utilizados en la citometría de flujo .................................................................... 44
3.4.1
Para la detección del gangliósido NGcGM3 en la membrana plasmática de las
células tumorales ................................................................................................................44
3.4.2
Para la determinación de moléculas de superficie en las DC ................................44
3.4.3
Para la detección de linfocitos infiltrantes en pulmón ............................................44
3.5
Gangliósidos NGcGM3 y NAcGM3 .......................................................................... 45
i
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
3.6
Los preparados vacunales NGcGM3/VSSP y NAcGM3/VSSP ................................. 45
3.7
Desarrollo de tumores primarios del carcinoma de pulmón de Lewis 3LL-D122 ....... 46
3.8
Modelo de metástasis espontánea del carcinoma de pulmón de Lewis 3LL-D122 ... 46
3.9
Extracción de gangliósidos de las muestras tumorales............................................. 47
3.10
Identificación química del gangliósido NGcGM3 ....................................................... 47
3.11
Identificación inmuno-química del gangliósido NGcGM3 en HPTLC......................... 48
3.12
Identificación inmuno-histoquímica del gangliósido NGcGM3 ................................... 48
3.13
Detección del gangliósido NGcGM3 por espectrometría de masa ............................ 49
3.14
Procedimientos de inmunización en los experimentos con animales ........................ 49
3.14.1
Experimentos de inmunogenicidad en pollos ........................................................ 49
3.14.2
Experimentos de inmunogenicidad en ratones...................................................... 50
3.14.3
Experimentos de evaluación del efecto del preparado vacunal en el modelo
murino de metástasis espontánea a pulmón del carcinoma de Lewis 3LL-D122 ................. 50
3.14.4
Experimentos de medición in vivo de maduración de DC...................................... 51
3.14.5
Experimentos de medición de citocinas en suero ................................................. 51
3.15
3.15.1
Determinación de anticuerpos séricos ...................................................................... 51
Preparación de las muestras para la titulación de los Ac anti-gangliósido
en los pollos ........................................................................................................................ 52
3.15.2
Preparación de las muestras para la evaluación de los Ac anti-gangliósido
en los ratones ..................................................................................................................... 52
3.16 Reconocimiento de la línea tumoral P3X63 por los sueros de los animales
vacunados .......................................................................................................................... 53
3.17
Obtención de las células dendríticas murinas a partir de la médula ósea ................. 53
3.17.1
Obtención de las DC convencionales.................................................................... 53
3.17.2
Obtención de las DC plasmacitoides .................................................................... 54
3.18
Maduración de células dendríticas con NGcGM3/VSSP ........................................... 54
3.19
Determinación de la expresión de moléculas de superficie por FACS ...................... 55
3.20
Determinación de la frecuencia de células inmunes en pulmones ............................ 55
3.21
Medición de citocinas producidas por las DC ........................................................... 56
3.22
Experimentos de eliminación de poblaciones celulares in vivo ................................. 56
3.23
Análisis estadístico ................................................................................................... 56
ii
Índice
4. RESULTADOS....................................................................................................... 59
4.1
La expresión del gangliósido NGcGM3 en el modelo de carcinoma pulmonar de
Lewis 3LL-D122 se incrementa en las metástasis respecto a los tumores primarios .......... 59
4.2
El preparado vacunal NGcGM3/VSSP es inmunogénico en modelos animales ....... 62
4.3
El preparado vacunal NGcGM3/VSSP disminuye las metástasis pulmonares en
el modelo murino estudiado ............................................................................................... 67
4.4
La presencia del gangliósido NGcGM3 en la vacuna es necesaria para la actividad
antitumoral del preparado NGcGM3/VSSP ........................................................................ 70
4.5
La actividad antimetastásica del preparado vacunal NGcGM3/VSSP es
independiente de la vía de administración.......................................................................... 71
4.6
La vacunación con NGcGM3/VSSP induce la maduración de células dendríticas ... 72
4.7
Las células NK y NKT están involucradas en la actividad anti-metastásica del
preparado vacunal NGcGM3/VSSP ................................................................................... 76
4.8
Las células CD8 y CD4 participan en la actividad anti-metastásica del preparado
vacunal NGcGM3/VSSP .................................................................................................... 79
4.9
La vacunación con NGcGM3/VSSP promueve la infiltración de células efectoras
de la inmunidad adquirida al sitio metastásico.................................................................... 81
4.10 El infiltrado de leucocitos correlaciona con la inhibición de la metastización
provocada por la vacunación con NGcGM3/VSSP ............................................................. 83
5. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 85
6. CONCLUSIONES ................................................................................................... 97
7. RECOMENDACIONES ............................................................................................ 99
8. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 101
9. ANEXOS ............................................................................................................ 127
iii
1. ÍNTRODUCCÍON
El cáncer constituye un conjunto de enfermedades que afecta a millones de personas en el
mundo y genera un alto número de muertes cada año. Por la incidencia y la mortalidad
crecientes, así como por el impacto psicológico sobre la población y el hecho de que, por lo
general, los pacientes no mueren por el tumor primario, sino por el desarrollo de metástasis,
se considera un serio problema de salud para la humanidad. En Cuba, durante las últimas
décadas, las neoplasias malignas constituyeron una de las principales causas de
mortalidad, situándose en el 2012 en la primera causa de muerte, con un total de 22 532
fallecidos para todas las edades (MINSAP, 2013).
La terapia del cáncer se basa en el uso simultáneo de diversas alternativas, entre las que
se destacan la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia, la hormonoterapia y la bioterapia;
que incluye la inmunoterapia (IT). Numerosas moléculas son consideradas como blanco
para la IT de cáncer por sus niveles de expresión y la posibilidad de ser reconocidas por los
componentes del sistema inmunológico. En este trabajo se hace referencia a los
gangliósidos, glicoesfingolípidos presentes en la cara externa de las membranas
plasmáticas de las células de los vertebrados (Sonnino et al., 2007). La elección de los
gangliósidos como antígenos asociados a tumores (AAT) y su utilización como blancos de
la IT activa antitumoral, está determinada por su densidad de expresión en la célula tumoral
(Nores et al., 1987; Zhang et al., 1997). Esto constituye la base de la IT activa específica
(ITAE) contra los gangliósidos, que tiene el propósito de generar una respuesta efectiva de
tipo humoral y celular contra el tumor.
En particular, la variante N-glicolilada del gangliósido GM3 (NGcGM3) está ausente en los
tejidos de individuos sanos, mientras que está presente en tumores de mama, melanoma,
colon, recto, hepatocelular, estómago y páncreas, glioblastoma, neuroblastoma, sarcomas,
1
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfomas y mielomas, así como en metástasis
(Carr et al., 2000; Carr et al., 2003; Diaz et al., 2003; Oliva et al., 2006; Blanco et al., 2011a;
Blanco et al., 2011b; Scursoni et al., 2011; Blanco et al., 2012; Blanco et al., 2013). Esta
expresión diferencial permite clasificarlo como un antígeno específico de tumores (AET).
Estudios recientes reconocen además el papel del gangliósido NGcGM3 en la progresión
tumoral (Gabri et al., 2009; Segatori et al., 2012a; Segatori et al., 2012b; Casadesus et al.,
2013). Adicionalmente, de León y col. demostraron que el gangliósido NGcGM3 tiene
funciones inmunosupresoras sobre células dendríticas y células T CD4+ (de Leon et al.,
2006; de Leon et al., 2008).
El desarrollo de terapias antitumorales en el Centro de Inmunología Molecular (CIM, Cuba),
con el fin de incrementar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con cáncer,
es una de las proyecciones fundamentales que tiene la institución. En el CIM se desarrollan
dos preparados vacunales para el tratamiento del cáncer que usan al gangliósido GM3 en
su composición (Estevez et al., 1999). Uno utiliza la variante N-glicolilada y el otro, la
variante N-acetilada (NAcGM3), que es un AAT. Ambos preparados (NGcGM3/VSSP y
NAcGM3/VSSP) se obtienen a partir de la incorporación hidrofóbica del gangliósido
purificado de eritrocitos de caballo (NGcGM3) o de perro (NAcGM3), a las vesículas de
membrana externa (VME) de la bacteria Neisseria meningitidis (Nm), que tiene
características inmunoestimuladoras (Durand et al., 2009).
El estudio del mecanismo de acción del preparado vacunal NGcGM3/VSSP en un modelo
animal que exprese el gangliósido NGcGM3 y que haga énfasis en los mediadores
inmunológicos celulares asociados a la vacunación es relevante para el avance de la ITAE
contra este antígeno (Ag) tumoral. El modelo murino de metástasis espontánea a pulmón
con el carcinoma de Lewis 3LL-D122 (Gorelik et al., 1980; Eisenbach et al., 1983) ha sido
2
Introducción
ampliamente empleado para estudiar terapias antitumorales, pues simula un escenario
similar al desarrollo de los tumores en pacientes, donde en muchos casos luego de la
remoción del tumor primario, aparecen metástasis en órganos distantes. La comprensión
del mecanismo de acción permitirá el empleo de terapias óptimas, así como el uso de
distintas estrategias de combinación con inmunomoduladores. El campo de las vacunas de
cáncer es de gran actualidad y los resultados alcanzados en el desarrollo de estas terapias
en el CIM lo colocan en la primera línea de las investigaciones mundiales relacionadas con
este campo.
Con el preparado vacunal NGcGM3/VSSP emulsionado en Montanide ISA 51
(NGcGM3/VSSP/ Montanide) se realizaron varios ensayos clínicos en Cuba, en pacientes
de melanoma (Osorio et al., 2008; Osorio et al., 2012; Perez et al., 2013) y cáncer de mama
(Carr et al., 2003; Mulens et al., 2010). Los pacientes tratados con NGcGM3/VSSP/
Montanide desarrollan títulos de anticuerpos (Ac) IgM e IgG anti-NGcGM3 y el suero
inmune reconoce a las líneas tumorales murinas L1210 y P3X63, que expresan el
gangliósido NGcGM3 (Carr et al., 2003; Mulens et al., 2010). La ITAE con otras terapias
basadas en gangliósidos, también genera altos títulos de Ac IgM e IgG (Ritter et al., 1991;
Helling et al., 1994; Livingston, 1995a). Sin embargo, en todos los casos sólo se logró la
generación de respuesta humoral (Chapman et al., 2000a; Chapman et al., 2000b;
Ragupathi et al., 2003b).
En un ensayo clínico Fase Ib/IIa con el preparado vacunal NGcGM3/VSSP/ Montanide en
pacientes con melanoma cutáneo avanzado, se encontró vitiligo en tres de 12 pacientes
vacunados (Osorio et al., 2008), aunque el gangliósido NGcGM3 no está presente en el
melanocito. Por otra parte, evidencias experimentales avalan la participación de los
linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTL) en la fisiopatología del vitiligo (Steitz et al., 2005),
desorden de la pigmentación con pérdida local de los melanocitos en la piel. Los CTL no se
3
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
asocian con la respuesta immune anti-gangliósidos, debido a la naturaleza de Ag Tindependiente de estos glicoesfingolípidos. Por tanto, la aparición de vitiligo en los
pacientes tratados con NGcGM3/VSSP/ Montanide sugiere la generación de una respuesta
CTL contra otros Ag presentes en el melanocito.
Sobre la base de los antecedentes descritos se formuló la siguiente hipótesis de trabajo:
La vacunación con NGcGM3/VSSP tiene efecto anti-metastásico en un modelo antígeno
positivo, involucrando a la rama celular efectora de la respuesta inmune.
A partir de esta hipótesis se plantearon los siguientes objetivos:
1. Demostrar que el modelo murino de metástasis espontánea con la línea de
carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122 es adecuado para este estudio.
2. Evaluar la inmunogenicidad y el efecto anti-metastásico del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP en ratones portadores del tumor Lewis 3LL-D122.
3. Caracterizar los mecanismos inmunológicos celulares asociados a la actividad antimetastásica del preparado vacunal NGcGM3/VSSP.
Para
dar
cumplimiento
a
los objetivos
se
desarrollaron
las siguientes
tareas
experimentales:
Para el Objetivo 1:
1.1-Aislamiento del gangliósido NGcGM3, mediante métodos bioquímicos de extracción, de
la línea celular de carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122, de los tumores primarios
generados a partir de la inoculación subcutánea de la misma en ratones C57BL/6 y de las
metástasis espontáneas generadas en ratones portadores de estos tumores.
4
Introducción
1.2-Determinación de la presencia del gangliósido NGcGM3 en la línea celular 3LL-D122,
en sus tumores primarios y en las metástasis espontáneas generadas en ratones C57BL/6
portadores de estos tumores mediante técnicas inmunoquímicas y de espectrometría de
masa.
Para el Objetivo 2:
2.1-Determinación
de
la
inmunogenicidad
en
animales
del
preparado
vacunal
NGcGM3/VSSP, formado con los gangliósidos NGcGM3 natural y sintético, emulsionado o
no en Montanide. Caracterización de la respuesta de anticuerpos inducidos, en cuanto a:
título, isotipo, especificidad y reconocimiento in vitro de líneas tumorales NGcGM3 positivas.
2.2-Evaluación del efecto de la administración terapéutica del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP, con o sin Montanide, en el modelo murino de metastización espontánea a
pulmón con la línea tumoral 3LL-D122.
2.3-Comparación del efecto de la administración terapéutica de los inmunógenos
NGcGM3/VSSP, NAcGM3/VSSP y el complejo de proteínas de las VME de Nm sobre la
metastización espontánea del carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122 en ratones C57BL/6.
2.4-Determinación del impacto de la vía de administración del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP sobre la metastización espontánea a pulmón del carcinoma pulmonar de
Lewis 3LL-D122 en ratones C57BL/6.
Para el Objetivo 3:
3.1-Evaluación de la maduración de células dendríticas murinas y su patrón de secreción de
citocinas, después de la estimulación in vitro e in vivo con el preparado vacunal
NGcGM3/VSSP.
5
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
3.2-Evaluación de la participación de poblaciones efectoras de la inmunidad innata (células
NK y NKT) en el efecto de la vacuna sobre la metastización espontánea del carcinoma
pulmonar de Lewis 3LL-D122 en ratones, mediante experimentos de eliminación de
poblaciones con anticuerpos específicos y de citometría de flujo.
3.3-Evaluación de la participación de poblaciones efectoras de la inmunidad adaptativa
(células T CD8+ y T CD4+) en el efecto de la vacuna sobre la metastización espontánea del
carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122 en ratones C57BL/6, mediante experimentos de
eliminación de poblaciones con anticuerpos específicos y de citometría de flujo.
3.4-Determinación de la correlación entre la inhibición de la metastización espontánea del
carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122 en ratones C57BL/6, provocada por el tratamiento
con el preparado vacunal NGcGM3/VSSP, y el infiltrado leucocitario en pulmones.
La principal novedad científica de este trabajo de Tesis consiste en la demostración, por
primera vez, de que una vacuna de cáncer basada en un gangliósido es capaz de inhibir la
diseminación metastásica mediante un mecanismo efector que involucra células T CD4+ y T
CD8+. Constituye además un aporte al conocimiento la evidencia sin precedente de que el
efecto antitumoral de una vacuna de cáncer basada en gangliósidos se correlaciona con el
incremento de la infiltración de efectores de la inmunidad adquirida, principalmente células
T CD4+, en el órgano diana. La descripción de la expresión del gangliósido NGcGM3 en el
modelo murino de metástasis espontánea con la línea de carcinoma pulmonar de Lewis
3LL-D122, es también una novedad de esta Tesis, así como la demostración del
enriquecimiento de este gangliósido en las células tumorales en la medida que progresa el
modelo.
La disminución de la metastización en el modelo experimental, lograda con la
administración de una formulación del preparado vacunal NGcGM3/VSSP en forma
6
Introducción
terapéutica y sin la necesidad de formar una emulsión con un adyuvante oleoso, como el
Montanide ISA 51, sustentó decisivamente un cambio en la concepción del producto y la
forma de administrarlo a pacientes, que ya ha sido implementado en la experimentación
clínica y ha permitido constatar una disminución relativa de la toxicidad local, acompañada
de un aparente incremento en la eficacia de este preparado vacunal. En esto consiste el
principal aporte práctico de este trabajo. Adicionalmente, el hecho de haber obtenido
resultados similares, al comparar los perfiles de inmunogenicidad alcanzados con los
preparados vacunales formados por los gangliósidos NGcGM3 de origen natural o sintético,
apoya un cambio favorable en la concepción del producto desde el punto de vista
regulatorio.
Los resultados de este trabajo están recogidos en dos publicaciones aparecidas en Expert
Opinion in Biological Therapies (Labrada et al., 2010), y en Human Vaccines and
Inmunotherapeutics (Labrada et al., 2014). Además, los mismos han sido presentados en
eventos nacionales e internacionales.
7
2. REVÍSÍON BÍBLÍOGRA FÍCA
2.1
Inmunoterapia de cáncer
El Instituto Nacional del Cáncer, perteneciente al Instituto Nacional de Salud de los Estados
Unidos, define al cáncer como un conjunto de enfermedades en las cuales el organismo
produce un exceso de células malignas, también llamadas cancerígenas o cancerosas, las
cuales presentan un crecimiento incontrolado más allá de los límites normales. Estas
células son capaces de invadir los tejidos adyacentes normales y propagarse a distancia,
fundamentalmente por vía linfática o sanguínea, lo que se conoce como metástasis.
La terapia del cáncer se basa en el uso simultáneo de diversas alternativas, entre las cuales
se destacan: la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia, la hormonoterapia y la bioterapia;
incluyéndose dentro de esta última la IT. Las diversas terapias hasta hoy no han producido
más que logros parciales, a pesar de los muchos años de investigación dedicados a ella. La
IT, por sus peculiares características, puede significar una terapia con resultados superiores
a los tradicionales.
Los inicios de la IT de cáncer se remontan a los finales del siglo XIX, pero no fue hasta
finales del siglo XX que se retomó con fuerza el tema de la IT activa específica de cáncer.
Esto se debió al descubrimiento y la acumulación de una gran cantidad de evidencias sobre
el reconocimiento de los tumores por el sistema inmunitario. Se han descubierto y
caracterizado muchos Ag que se sobre-expresan en las células malignas comparado con el
nivel de expresión en células normales. Además, se ha verificado la hipótesis de la
vigilancia inmunológica del cáncer, en la cual las células presentadoras de antígenos (APC,
del inglés: antigen presenting cells) reconocen células transformadas y mutágenos, y
activan a otros componentes del sistema inmunitario para eliminarlos (Sahin et al., 1995;
Kaplan et al., 1998).
9
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
2.1.1
Vacunas de cáncer
La IT activa específica ha resurgido vigorosamente desde finales de la década de 1990.
Más de 50 vacunas son evaluadas actualmente en ensayos clínicos. Esto ha estado
motivado por las múltiples evidencias científicas que demuestran la existencia de la
inmunovigilancia tumoral (Burnet, 1970) y la posibilidad de definir y caracterizar AAT (Ko et
al., 2003). Se considera que existen dos generaciones de vacunas de cáncer, que en la
actualidad co-existen en diferentes ensayos clínicos. Una primera generación se basa en
preparaciones celulares, y la otra en entidades moleculares. Las vacunas de la primera
generación, han utilizado células tumorales autólogas irradiadas o extractos de las mismas
como fuente de Ag tumorales, en combinación con adyuvantes (Mitchell et al., 1988; Morton
et al., 2002). Posteriormente, debido a la poca inmunogenicidad de las células tumorales y
a la poca definición molecular de los Ag tumorales, las investigaciones desviaron su
atención a la segunda generación de vacunas, basada en entidades moleculares para la
terapia activa contra el cáncer (Lage et al., 2005). Ejemplo de estas vacunas son: las
compuestas por péptidos derivados de varios Ag tumorales (los más usados: MART-1, gp100, tirosinasa) (Slingluff et al., 2003; Akiyama et al., 2005), las compuestas por proteínas
sintéticas o purificadas del tumor, donde se incluyen proteínas de estrés térmico (HSP, del
inglés: heat shock protein); oncoproteínas mutadas como K-ras y p53; glicoproteínas de la
familia de las mucinas tales como MUC-1; entre otras (Naftzger et al., 1996).
En los estudios de IT activa contra cáncer tienen un papel esencial los blancos tumorales,
los cuales se encuentran clasificados de dos formas fundamentales: los AET y los AAT. Los
AAT son aquellas moléculas las cuales se encuentran expresadas en el tejido normal que le
dio origen al tumor pero están presentes en mayores cantidades en los tumores. Los AET
se restringen a Ag del tumor que no se encuentra en los tejidos normales.
10
Revisión bibliográfica
El microambiente tumoral es otro factor importante a valorar al diseñar una IT activa
específica, ya que éste se ve afectado por la liberación de AAT y AET de la superficie de la
célula tumoral. Se ha comprobado que los linfocitos recuperados de tumores proliferan
menos que los de sangre periférica al mezclarlos con mitógenos o interleucina 2 (IL-2)
(Miescher et al., 1986). Por otra parte, se conoce que existe gran heterogeneidad entre las
células de diferentes tumores y las de un mismo tumor por lo cual algunas variantes
celulares pueden evadir la acción de las terapias dirigidas contra ellas (Nowell, 1986). Se
han observado además, diferencias entre las características antigénicas del tumor primario
y sus metástasis (Chan et al., 1986).
2.1.2
Adyuvantes en las vacunas de cáncer
El desarrollo de vacunas basadas en AAT, que constituyen a fin de cuentas moléculas
propias para las cuales, en su mayoría, operan los mecanismos de deleción tímica central,
encuentra su marco teórico en la teoría del daño, postulada por Polly Matzinger (Matzinger,
1994). Según esta, el real problema del sistema inmunitario no es distinguir entre lo propio y
lo no propio, sino entre lo dañino y lo inocuo. De esta forma, la vacunación contra lo propio
pudiera ser exitosa si ocurre en un contexto de “señales de peligro”, y en esto desempeñan
un papel fundamental los adyuvantes. Por tanto, las estrategias de vacunación utilizadas
contra el cáncer dependen de la calidad del Ag seleccionado (Berzofsky et al., 2004) y del
adyuvante utilizado para la activación de la respuesta inmune, para obtener una eficiente
activación de las APC y una consiguiente activación de los linfocitos CD4+ y CD8+ para
ejercer sus funciones.
Muchos productos han sido empleados como estimuladores inespecíficos del sistema
inmunitario, pero tienen efectos colaterales adversos, por lo que su utilización en humanos
pasa por una compleja evaluación y selección.
11
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
Entre los adyuvantes de origen bacteriano que han demostrado una excelente capacidad
inmunoestimuladora se encuentran el Bacilo Calmette-Guérin (BCG) y el ácido
desoxirribonucleico bacteriano no metilado con secuencias CpG (CpG). El BCG ha sido
utilizado como un agente antitumoral en el tratamiento del cáncer superficial de vejiga y del
melanoma (Duda et al., 1995; Alexandroff et al., 1999), y el CpG ha mostrado la capacidad
de estimular potentes respuestas específicas contra varios tipos de tumores en ensayos
preclínicos (Brunner et al., 2000).
Los adyuvantes bacterianos, tanto las bacterias completas (BCG, Corynebacterium parvum,
Salmonella minessota) o componente de bacterias, que incluyen el esqueleto de paredes
celulares de bacteria, el dimicolato de trealosa, el monofosforil lípido A y el adyuvante
completo de Freund, han sido ampliamente empleados por su gran capacidad de ayudar a
desencadenar una respuesta inmune específica y potente contra el tumor tanto celular
como de Ac. Sin embargo, al utilizarlos, algunos de ellos han provocado ulceraciones en los
sitios de inyección, por lo que se ha debido eliminar el componente bacteriano en las
inmunizaciones (Aucouturier et al., 2002).
La capacidad de todos estos derivados de activar las células dendríticas (DC, del inglés:
dendritic cells) se ha demostrado en diversos escenarios. Por ejemplo, tanto el BCG como
el CpG activan a las DC humanas y murinas, y promueven el aumento en la expresión de
las moléculas de MHC clase I y II, CD80 y CD86 y la secreción de IL-12 (Jakob et al., 1998;
Martin-Orozco et al., 1999; Tsuji et al., 2000).
Está descrito que las células necróticas, pero no las apoptóticas, liberan las HSP (Basu et
al., 2000). Numerosos grupos han demostrado que diferentes HSP pueden activar a las DC
y a los macrófagos, calificando así a las HSP como la primera gran familia de señales de
peligro endógenas (Colaco, 1998). Los complejos HSP-péptidos derivados de tumores se
12
Revisión bibliográfica
han administrado como vacunas de cáncer personalizadas y su acción ha sido evaluada en
múltiples indicaciones, entre las que se incluyen el carcinoma renal, el melanoma
metastásico, el cáncer gástrico y algunos tipos de leucemias (Hoos et al., 2003).
Los estudios dedicados a investigar los mecanismos efectores efectivos contra el cáncer
indican que los AAT son reconocidos por los CTL. Esto sugiere que la actividad de estos
linfocitos es un mecanismo efector contra las células tumorales. Además, se considera el
único fenómeno capaz de tener algún efecto sobre los tumores sólidos (Heath et al., 1999).
Entre los adyuvantes que han demostrado facilitar el fenómeno de presentación cruzada se
encuentran las secuencias de CpG, las HSP, la OmpA y el Detox (Aebischer et al., 2000).
Los Ag peptídicos “chaperoneados” por las HSP purificadas activan respuestas CTL cuando
se inyectaron en ratones (Arnold et al., 1995; Schild et al., 1999). También se ha
demostrado que el CpG conjugado a proteínas solubles media la presentación cruzada de
las mismas, mediante el cambio del mecanismo de captura de las proteínas de pinocitocis a
endocitosis mediada por un receptor del conjugado (Pawelec, 2004).
Otro compuesto que se ha estudiado como adyuvante para vacunas de cáncer es el αGalCer, un glicolípido sintético que potencia la respuesta de los linfocitos auxiliadores tipo 1
(Th1) estimulando a las células T asesinas naturales (NKT, del inglés: Natural Killer T cells)
humanas, que pueden transactivarse con gran velocidad e inducir la producción de
interferón gamma (IFNγ) por las células asesinas naturales (NK, del inglés: natural killer
cells) (Carnaud et al., 1999).
Los adyuvantes vacunales actualmente más utilizados en ensayos clínicos son las sales de
Aluminio (Cottrez et al., 2000), el Montanide (Birkett et al., 2002) y la fracción saponina
purificada de la corteza del árbol Quillaja saponaria (QS21-) (Moore et al., 1999), que
estimulan la respuesta de Ac.
13
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
La bacteria Nm es una de las dos especies patógenas del género Neisseria. El
meningococo, como comúnmente se le conoce, es un diplococo Gram-negativo que
presenta dos membranas celulares separadas por una lámina de peptidoglicano. El 50% del
exterior de la membrana externa lo constituyen moléculas anfifílicas de lipopolisacárido
(LPS), endotoxina principal de esta bacteria. Otros componentes importantes de la
membrana externa son las proteínas transmembranosas, entre las que se encuentran las
porinas, las proteínas unidoras de transferrina, la Opa, la Opc, entre otras (Robinson et al.,
1993).
Los componentes aislados de la membrana externa de Nm se han estudiado como Ag en el
diseño de vacunas contra la meningitis, debido a su alta inmunogenicidad. Sin embargo,
hasta el momento, las únicas vacunas que han mostrado cierta efectividad consisten en
preparados más complejos (Bjune et al., 1991; Sierra et al., 1991). Las VME derivadas de
los meningococos se han utilizado tanto como adyuvantes o transportadores de Ag, como
en la generación de vacunas antimeningocóccicas. Las vacunas antimeningocóccicas en
uso consisten en VME a las que se les eliminó parte del LPS (Bjune et al., 1991; Sierra et
al., 1991). Al evaluar estas preparaciones en humanos, se demostró su inmunogenicidad y
su capacidad de generar títulos de Ac bactericidas. Las VME han mostrado gran capacidad
adyuvante al ser conjugadas a Ag importantes para otras enfermedades. Por ejemplo, al
conjugar el polisacárido tipo B de Haemophilus influenzae a las VME se indujeron Ac
protectores en ratones jóvenes (Ambrosino et al., 1992).
De forma general, las propiedades adyuvantes de estas vesículas y sus variantes parecen
estar asociadas a la presencia del LPS. Por ejemplo, estudios de la capacidad de activar a
las DC de las vesículas derivadas de bacterias salvajes y mutantes que no expresan el
LPS, demostraron que estas últimas eran muy poco efectivas (Steeghs et al., 1999).
14
Revisión bibliográfica
Además, sólo las bacterias salvajes estimulaban la secreción de IL-12, IL-6 y TNFα (Dixon
et al., 2001; Uronen-Hansson et al., 2004). En esta dirección, también hay varios trabajos,
pero con derivados vesiculares de estas bacterias y en ratones deficientes de la
señalización a través de la molécula TLR4, los cuales indican que en ausencia del estímulo
del LPS la activación de las DC es marginal. Los autores de estos estudios, reclaman que
los componentes distintos al LPS tienen alguna contribución a este fenómeno. Sin embargo,
los datos mostrados no son convincentes. Además, en ambos casos se reafirma un papel
protagónico e indispensable del LPS para la polarización hacia Th1 de las células Th (AlBader et al., 2004; Rodriguez et al., 2005).
2.1.3
Los VSSP
Otro adyuvante derivado de las VME lo constituyen los proteoliposomas de muy pequeño
tamaño (VSSP, del inglés: very small size proteoliposomes). Estos VSSP son obtenidos a
partir de la combinación de las VME de Nm y el gangliósido NAcGM3 (Estevez et al., 1999).
La composición molecular de los VSSP ha sido poco caracterizada. Sin embargo, los VSSP
se han evaluado como adyuvantes promotores de la respuesta de Ac específicos por el
propio NAcGM3 (NAcGM3/VSSP) (Estevez et al., 1999; Carr et al., 2001) y contra otros Ag
vacunales (Torrens et al., 2005; Ramirez et al., 2008; Morera et al., 2010; Aguilar et al.,
2012; Fuentes et al., 2012).
Se ha demostrado que los VSSP contienen ligandos de los TLR4 y TLR2, los cuales juegan
un papel muy importante en las propiedades inmunomoduladoras de estos compuestos. Al
evaluar in vitro el efecto de los VSSP sobre las DC, se demostró que éstos constituyen un
estímulo tan potente como el LPS en la inducción de la maduración de estas células. Los
VSSP aumentan la expresión de las moléculas coestimularorias CD40, CD80, CD86 y la
expresión de la molécula MHC-II (Mesa et al., 2004), potencian la producción de las
citocinas IL-1β, IL-12, IL-6 e IL-18, mientras que disminuyen la secreción de IL-10 (Mesa et
15
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
al., 2004; Venier et al., 2007). Experimentos con células T transgénicas Ag-específicas
demostraron que las DC tratadas con los VSSP inducen un fenotipo Th1 en células T
vírgenes CD4+ y facilitan la presentación cruzada de Ag protéicos (Mesa et al., 2004; Mesa
et al., 2006b).
Por otra parte, los VSSP potencian la respuestas CTL en ratones sanos (Mesa et al.,
2006a), generan similares respuestas CTL en ratones portadores de tumor y sanos
(Fernandez et al., 2011), y expanden las células T CD8+ con fenotipo de memoria, a la vez
que protegen la respuesta CTL en ratones leucopénicos (Oliver et al., 2012).
Particular atención se ha puesto en la interacción de los VSSP con las células supresoras
de origen mieloide (MDSC, del inglés: myeloid-derived suppressor cells) identificadas en
ratones por la co-expresión de los marcadores CD11b y Gr1 (Fernández et al., 2014a). El
tratamiento de ratones sanos con los VSSP aumenta la frecuencia de células esplénicas
CD11b+Gr1+, sin embargo las células expandidas son poco supresoras (Fernandez et al.,
2011). Adicionalmente se conoce que los VSSP reducen la capacidad supresora de las
MDCS inducidas por los tumores, afectan su migración al microambiente tumoral y
promueven su diferenciación a DC maduras (Fernandez et al., 2011; Fernández et al.,
2014b).
2.1.4
Mecanismos de acción de las vacunas de cáncer.
El descubrimiento e identificación de los AET y los AAT hizo posible atacar los tumores de
manera específica mediante Ac o células citotóxicas (Rosenberg, 1999; Rosenberg et al.,
2004).
La unión de los Ac al Ag tumoral puede resultar en la activación de la cascada del
complemento. Este fenómeno trae como consecuencia la inflamación (incluye opsonización,
16
Revisión bibliográfica
activación de leucocitos y macrófagos, y el incremento en la permeabilidad vascular) y la
formación del complejo de ataque a la membrana que conduce a la citotoxicidad
dependiente de complemento (CDC, del inglés: cytotoxicity dependent complement). Estos
eventos pueden promover la eliminación de células tumorales circulantes y las
micrometástasis. Los Ac IgM son los mayores activadores del complemento debido a su
naturaleza pentamérica. En el caso de los Ac IgG, la propiedad de mediar CDC la tienen las
IgG1 e IgG3 en humanos y las IgG2a e IgG3 en ratones. Los receptores Fc de estas
subclases de IgG son además los blancos primarios para las células efectoras que median
la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, del inglés: antibody-dependent
cellular cytotoxicity). Los receptores FCδR1 (CD64), FCδRII (CD32) y FCδRIII (CD16),
expresados en un amplio rango de células que incluyen células NK, células T y células del
linaje mieloide, se unen a los Ac que reconocen Ag sobre la superficie del tumor, con la
consiguiente activación del mecanismo citotóxico intrínseco de estas células efectoras.
(Livingston et al., 1997b).
Debido al gran potencial que tiene la respuesta celular para erradicar células tumorales, una
gran cantidad de estudios clínicos y preclínicos están enfocados a la inducción de
respuesta celular contra el tumor, donde se incluye la generación de NK y CTL específicos.
La generación de CTL es un proceso complejo que requiere de al menos dos señales. La
primera es el reconocimiento, mediado por la interacción del receptor de células T CD8+
(TCR, del inglés: T cell receptor) y los péptidos presentados en el MHC I de las APC. La
segunda señal es la coestimulación, mediada por determinadas moléculas en la APC y en
las células T CD8+ o por citocinas derivadas de células Th que se activan al reconocer
péptidos presentados en el MHC II de las APC y moléculas coestimulatorias. En sujetos con
tumor, los Ag tumorales pueden ser presentados por el tumor, pero en la mayoría de los
casos, la interacción del tumor con el sistema inmunitario produce tolerancia en lugar de
17
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
activación debido a, entre otros factores, que las señales coestimulatorias requeridas para
la activación de la células T no son las adecuadas (Dutoit et al., 2002).
El objetivo principal de las estrategias vacunales es convertir a la célula T anérgica en
célula efectora contra el tumor. Sin embargo, en pocos estudios se ha correlacionado la
inducción de estas células y la respuesta clínica. En este sentido, en un ensayo realizado
con una vacuna peptídica en pacientes de melanoma se correlacionó el incremento de la
respuesta CTL en sangre periférica contra los Ag MAGE-1 y MAGE-3 con una respuesta
clínica favorable en un paciente tratado (Jager et al., 2001). En otro estudio con vacunas de
péptidos derivados de Melan A/MART-1, tirosinasa o gp100, se observó una asociación
entre la respuesta clínica y la respuesta CTL específica (Jager et al., 1999). Algunos
pacientes con respuesta clínica favorable mostraron además desarrollo de vitiligo. En otro
trabajo publicado en pacientes de cáncer de colon con metástasis hepáticas, inmunizados
con la vacuna Oncophage, se demostró la activación de células T CD8+ específicas por los
Ag tumorales. El incremento en la frecuencia de estas células después de la vacunación
correlacionó con un aumento en la supervivencia de estos pacientes (Mazzaferro et al.,
2003).
El fenómeno de autoinmunidad provocado por las terapias se ha asociado con un aumento
de la supervivencia de los pacientes. Este fenómeno se ha visto más frecuentemente en
pacientes de melanoma, lo que sugiere que una respuesta inmune potente puede prolongar
la supervivencia pero también producir autoinmunidad (Gogas et al., 2006).
Por otra parte se ha señalado que la diversificación del reconocimiento antigénico
acontecida con algunas estrategias vacunales es beneficioso para la respuesta antitumoral.
Este fenómeno muy bien descrito en los modelos de enfermedades autoinmunes, se inicia
con la respuesta contra un simple epítopo antigénico. Este epítopo es presentado en el
18
Revisión bibliográfica
MHC II de las APC, lo cual activa células Th y células T efectoras que causan la inflamación
crónica y la muerte de la célula blanco. El debris celular, que contiene otros Ag, es
capturado por las APC y presentado de forma cruzada por el MHC I, con la consiguiente
activación de nuevas células T CD8+ específicas por otros epítopos en el mismo Ag
(diversificación intramolecular) o en otras moléculas (diversificación intermolecular). Uno de
los trabajos que abordan este fenómeno fue publicado por El-Shami y cols. que vacunaron
ratones retados con EG7-OVA (línea de timoma EL-4 transfectada con la ovalbúmina) con
el péptido OVA257-264 (de la ovalbúmina) y mostraron una respuesta CTL protectiva frente al
reto con EL-4 que no expresa OVA (el-Shami et al., 1999).
Otro de los mecanismos prominentes para activar al sistema inmunitario contra los tumores
es la muerte celular inmunogénica (MCI). Dependiendo del estímulo inicial, la muerte de las
células de cáncer puede ser inmunogénica o no inmunogénica. La MCI involucra cambios
en la superficie celular (exposición de calreticulina) y la liberación de mediadores solubles
(ATP y la proteína nuclear HMGB1), que ocurre en una secuencia temporal definida, y
operan sobre una serie de receptores expresados por DC (CD91, P2R7 y TLR4), y facilita el
reclutamiento de DC al sitio tumoral (estimulado por ATP), la captura de Ag tumorales
(estimulado por calreticulina), y la presentación óptima de Ag a las células T (estimulado por
HMGB1) (Kroemer et al., 2013). Este proceso resulta en una potente respuesta inmune,
mediada por IFNδ, y dependiente de IL-1β e IL-17; donde participan células T δγ y CTL.
Esto significa que el tumor o las células moribundas del paciente operan como una vacuna
que estimula una respuesta tumor específica, que puede controlar y en ocaciones erradicar
las células de cáncer residuales. Varios tratamientos antitumorales provocan MCI, entre los
que se encuentran quimioterapéuticos como las antraciclinas (Casares et al., 2005), la
ciclofosfamida (Schiavoni et al., 2011), la irradiación (Perez et al., 2009), el ácido
19
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
polyinosinoico-polycitidílico (poli I:C) (Kubler et al., 2011), así como los AcM anti-EGFR 7A7
(Garrido et al., 2011) y el cetuximab (Lee et al., 2011).
2.2
2.2.1
Gangliósidos
Localización, características estructurales, biosíntesis y función
Los gangliósidos son constituyentes característicos de la
membrana plasmática de las
células de los mamíferos y, prácticamente, de todos los vertebrados (Daniotti et al., 2011).
En 1942, Ernest Klent aplicó el término gangliósidos a unos lípidos nuevos que aisló de las
células ganglionales del cerebro. Están particularmente en el cerebro, donde son el 10-12%
de los lípidos totales y el 20-25% de los lípidos de la capa externa de las membranas
neuronales. Fuera de ahí aparecen en muy bajos niveles en el resto de los tejidos animales,
constituyendo el 1-2% de los lípidos totales, y se concentran en la cara externa de la
membrana plasmática, en los llamados parches lipídicos (Sonnino et al., 2007). Los que
aparecen en la leche son derivados de las células secretorias de la glándula mamaria y
tienen importancia nutricional para los recién nacidos, pero ahí han sido poco
caracterizados, así como sucede en general con los provenientes de las comidas. No
aparecen fuera del reino animal.
Son compuestos de naturaleza anfipática (Voet D, 1995), al igual que otros lípidos
formadores de membranas. Por sus características estructurales pertenecen a la familia de
los glicoesfingolípidos (GEL) y están constituidas en su porción lipofílica por la ceramida
(una esfingosina unida a un ácido graso), mientras que la región hidrofílica expuesta al
espacio intercelular posee un oligosacárido lineal de hasta cuatro residuos neutros, al que
se encuentran unidos uno o más residuos de ácido siálico (AS). Se distribuyen en la
superficie celular de manera tal que las cadenas de azúcares sialiladas quedan expuestas
hacia el exterior celular (Sonnino et al., 2007) y presentan patrones de expresión
20
Revisión bibliográfica
específicos, en dependencia del tipo de célula y la etapa de diferenciación en que se
encuentren (Reglero et al., 1982; de Mello Coelho et al., 2004).
La biosíntesis de los GEL comienza a partir de la ceramida (Cer). Lo más común es que se
adicione una molécula de glucosa a la Cer por la proteína transmembrana glucosil-ceramida
sintasa Tipo I, formando la glucosil-ceramida (GlcCer). Se adiciona entonces una galactosa
(Gal) a la GlcCer por la β-1,4-galactosil transfrasa formando la lactosil-ceramida (LacCer),
en el lumen del aparato de Golgi (Durrant et al., 2012). La LacCer es el aceptor de varias
transferasas que generan las principales series de GEL: globo-, isoglobo-, lacto-, neolacto-,
y ganglio-GEL. La LacCer es convertida, por la adición secuencial de diferentes unidades
de monosacáridos, a miembros neutrales o acídicos de la serie ganglio, proceso mediado
por proteínas integrales de membrana glicosil-transferasas Tipo II. Los gangliósidos son
miembros acídicos de la serie ganglio, siendo así la LAcCer la base de todos los
gangliósidos, los cuales son elongados posteriormente por la adición de azúcares y AS.
Este proceso involucra actividades consecutivas de enzimas sialil-transferasas y glicosiltransferasas. Estas enzimas están unidas a la membrana del aparato de Golgi, en una
secuencia que corresponde con el orden de adición de varios de los componentes
carbohidratos. Se han descrito varias sialil-transferasas que usan AS-citidin-monofosfato
(CMP) para transferir el residuo de AS a la cadena oligosacarídica. Alternativamente, la Gal
puede ser adicionada a la ceramida, formando galactosil-ceramida (GalCer), que da lugar a
la síntesis de estructuras menos frecuentes, como el gangliósido GM4 y los sulfátidos
(Daniotti et al., 2011).
La complejidad estructural de estos compuestos ha estimulado la elaboración de varias
nomenclaturas. Son ellas la de Svennerholm (Svennerholm, 1963), la establecida por la
IUPAC-IUB (1978), y la de Wiegandt (Wiegandt et al., 1969). La establecida por
Svennerholm es la más utilizada en la designación de los gangliósidos y entre los más
21
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
frecuentes están: GM3, GD3, GM2, GD2, GM1, GD1a, GD1b, GT1a. Las letras M, D, T y Q
se refieren a la cantidad de residuos de AS: M-mono, D-di, T-tri, y Q-tetra-sialogangliósidos;
y los números 1, 2, 3, 4 se refieren al orden de migración en una cromatografía de placa
delgada (TLC): GM3 > GM2 > GM1.
En general, la estuctura de la Cer tiende a ser relativamente simple. La esfingosina es
usualmente la principal base esfingoide, acompañada por un ácido graso, los cuales
pueden ser de longitudes variables (entre 16-24 carbonos) con pocas o ninguna poliinsaturaciones. La naturaleza de la Cer es importante para su función biológica, pero es el
motivo carbohidrático quien más ha determinado en su función (Hakomori, 1996).
Los AS constituyen una familia muy diversa de aproximadamente 50 tipos de carbohidratos
ácidos alfa-ceto aldónicos con un esqueleto carboxilo de 9 carbonos, presentes en
glicoproteínas y glicoesfingolípidos (Angata et al., 2001). La gran diversidad de los AS está
dada por modificaciones del grupo amino del C5 (con acetil o glicolil), o de los grupos
hidroxilo, en los C4, C7, C8 y C9, por acetato, lactato, sulfato o ésteres de fosfato o ésteres
de metilo (Angata et al., 2001; Wipfler et al., 2011). Los dos AS más frecuentes en
mamíferos son las variantes N-acetiladas (NAc) y N-glicoliladas (NGc) del ácido
neuramínico (ácidos NAc- y NGc-neuramínicos, Neu5Ac y Neu5Gc) (Varki et al., 2001).
Las funciones biológicas en las que se encuentran implicados los gangliósidos han sido
ampliamente abordadas en la literatura. En la superficie celular interactúan con ligandos
solubles u organismos enteros, independientemente de su pequeño tamaño en
comparación con glicoproteínas también expresadas en la membrana (Fishman, 1986;
Siebert et al., 1996). Estas moléculas son también receptores específicos de exotoxinas
bacterianas (Holmgren et al., 1973; van Heyningen, 1980), virus (Schnaar, 1991) y bacterias
(Karlsson, 1989; Teneberg et al., 1990); así como pueden constituir receptores de
22
Revisión bibliográfica
interferones (Andrade et al., 2006), actuar como mediadores de las interacciones célulacélula, donde se destaca su participación en la transmisión de impulsos nerviosos (Thomas
et al., 1990). La interacción de gangliósidos con receptores de factores de crecimiento con
actividad enzimática asociada (Chung et al., 2009; Guan et al., 2011; Huang et al., 2013;
Wang et al., 2013; Kim et al., 2014) vincula a los gangliósidos con la maquinaria
transduccional. El gangliósido NAcGM3 está involucrado en la actividad fosfatasa del
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), al inhibir el crecimiento en líneas
celulares que expresan este último con Ac anti-EGF (Rebbaa et al., 1996; Alves et al., 2002;
Liu et al., 2008; Chung et al., 2009; Huang et al., 2013)
Se ha descrito su papel en la regulación de los eventos relacionados con la proliferación
celular a través de la modulación de proteínas de la membrana que funcionan como
receptores, transductores y transportadores (Hakomori, 1985). Su estructura sufre diversas
alteraciones
durante
el
desarrollo
celular,
la
diferenciación,
la
ontogenia,
las
transformaciones oncogénicas y el envejecimiento, lo cual evidencia una acción reguladora
por parte de estas moléculas sobre las funciones asociadas al crecimiento (Hakomori, 1985;
Saito, 1993) y la regulación del ciclo celular (Spiegel et al., 1996)
Los gangliósidos, han sido también descritos como inmunosupresores de la respuesta
inmune (Shurin et al., 2001).
2.2.2
Los gangliósidos como antígenos asociados a tumores
Los gangliósidos están ampliamente distribuidos en gran cantidad de tumores de diferentes
orígenes. La conformación y configuración de los gangliósidos cambia durante el proceso
de malignización, originando patrones de glicosilación alterados, fenómeno conocido como
glicosilación aberrante y que forma parte de los cambios moleculares asociados a la
transformación oncogénica que han sido descritos durante las últimas décadas (Hakomori,
23
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
1985; Reis et al., 2010). Esta es una de las principales razones que ha permitido su empleo
como blancos de la terapia contra el cáncer (Hakomori, 1985). Estos cambios que sufren
durante el desarrollo tumoral han permitido identificarlos como AAT.
Se conoce que aunque la región hidrofóbica de los gangliósidos es poco inmunogénica,
cualquier cambio en la misma puede variar la orientación o el ángulo de la cadena
sacarídica, exponiéndola para la neosíntesis o la degradación por las enzimas glicosiltransferasas y desglicosilantes, lo cual puede crear nuevos determinantes antigénicos en la
superficie de la células tumorales (Wiegandt, 1980).
Las primeras evidencias de la asociación entre los gangliósidos y el cáncer provienen de
estudios de los niveles de expresión de lípidos en los melanomas humanos realizados por
Portoukalian y cols. (Portoukalian et al., 1979), en los que se demostró la particular
abundancia del gangliósido GD3. Durante los años posteriores, el GD3 fue identificado
como uno de los Ag reconocidos por anticuerpos monoclonales (AcM) generados en
ratones inmunizados con células de melanoma maligno humano (Pukel et al., 1982).
Por esa misma época, los intentos realizados por varios grupos con células tumorales
autólogas o heterólogas, en la inmunización de pacientes de melanoma (Livingston et al.,
1982), y la identificación serológica de los Ag reconocidos, contribuyeron al interés en los
gangliósidos como marcadores tumorales y blancos para la terapia antitumoral. Las células
utilizadas en las inmunizaciones habían sido seleccionadas por su elevada expresión de
glicoproteínas, proteínas y gangliósidos. Sin embargo, los únicos Ag reconocidos por los Ac
producidos por varios pacientes fueron los gangliósidos GM2 y GD2. La inmunogenicidad
particular de estas moléculas en pacientes con melanoma ha sido demostrada una y otra
vez desde entonces (Cahan et al., 1982; Tai et al., 1983; Livingston et al., 1989a; Livingston
et al., 1989b; Portoukalian et al., 1991).
24
Revisión bibliográfica
La glicosilación aberrante de manera general se manifiesta en la síntesis incompleta de
algunos compuestos (Itai et al., 1991; Kannagi, 2004; Kawamura et al., 2008; Wei et al.,
2010; St Hill et al., 2011), en la neosíntesis de estructuras aberrantes que resulta en la
acumulación de ciertos carbohidratos en altas densidades en la superficie (Kannagi et al.,
2008). Este fenómeno ocurre como resultado de alteraciones metabólicas que incluyen la
pérdida de enzimas, la inducción de nuevas enzimas o el incremento anormal en la
actividad de enzimas ya existentes que puedan estar involucradas, tanto en las vías de
síntesis de los glicocompuestos, como en su degradación. Este proceso parece activar
diferentes enzimas, de lo cual resulta en una expresión alterada del patrón de gangliósidos
presente en los tumores (Ogawa et al., 1997; Koike et al., 2004).
La fucosilación anormal es otra de las modificaciones comunes de las glicoproteínas
presentes en las células tumorales, producto de la desregulación de enzimas involucradas
en la adición de residuos de fucosa a los glicanos (Miyoshi et al., 2008).
Las sobrexpresión de los glicoesfingolípidos, en particular de los gangliósidos, es uno de los
cambios cuantitativos en la composición de las células neoplásicas, e incluye alteraciones
en su densidad y distribución en la superficie celular (Dubois et al., 1986; Tsuchida et al.,
1989; Kono et al., 1990; Hamilton et al., 1993). Se ha descrito que el GD2 se expresa en la
superficie de los tumores de origen neuroectodérmico, incluyendo el neuroblastoma y el
melanoma; así como en glioma y en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (Mujoo et
al., 1987). Su expresión es abundante en el 100% de los tumores de neuroblastoma,
independientemente de la edad (Wu et al., 1986). Sin embargo, su expresión en los tejidos
normales es baja y se limita a las neuronas y los melanocitos normales (Tsuchida et al.,
1984; Tsuchida et al., 1989). Adicionalmente, el gangliósido GD2 se ha visto asociado al
crecimiento celular, la diferenciación y la apoptosis (Yoshida et al., 2002). El gangliósido
GD3 ha sido descrito como un marcador de melanoma debido a su sobrexpresión
25
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
(Tsuchida et al., 1989) en este tumor y su baja o restringida expresión en los melanocitos.
Se ha descrito además, sobrexpresión del gangliósido GM2 en varios tipos de tumores,
entre los que se incluyen el melanoma maligno y el neuroblastoma (Portoukalian et al.,
1979).
Los gangliósidos NAcGM3 y GM1 son de amplia distribución corporal (Tai et al., 1988). Los
melanocitos normales contienen, predominantemente, al gangliósido NAcGM3, sin
embargo, en el melanoma el gangliósido NAcGM3 alcanza el 80 % del total de gangliósidos
de las células tumorales. En tanto, la expresión del gangliósido GD3 se incrementa después
de la transformación neoplásica. Cuando el melanoma progresa a variantes altamente
metastásicas hay una variación pronunciada en la relación de gangliósidos NAcGM3:GD3
(Ravindranath et al., 1991). La proporción de gangliósidos NAcGM3:GD3 se invierte durante
la desdiferenciación de melanocitos (15:1) a células de melanoma (1:16) (Ravindranath et
al., 1989). La presencia en estos tumores de cantidades menores de los gangliósidos GM2,
GD2 y 9-O-acetil GD3 puede entonces explicarse por la alteración producida en la
proporción de gangliósidos NAcGM3:GD3. A pesar de que muchos de los gangliósidos
mencionados se expresan en tejidos normales, muchos de éstos han sido evaluados como
blancos para la IT pasiva y activa de pacientes con melanoma.
La evaluación de la presencia de gangliósidos tales como GM2, GD2, NAcGM3 y GD3 en
tumores humanos, así como su distribución en tejidos normales, ha sido posible en gran
medida por el uso de AcM dirigidos contra estos gangliósidos (Durrant et al., 2012).
Otros estudios han demostrado que algunos gangliósidos pueden ser liberados al
microambiente tumoral. Por ejemplo, se ha descrito que los gangliósidos GM2, NAcGM3 y
GD1a son liberados por líneas de meduloblastoma (Chang et al., 1997). Los gangliósidos
así secretados pueden ser internalizados por células T activadas, desencadenando su
26
Revisión bibliográfica
apoptosis y propiciando que los tumores puedan evadir la acción del sistema inmunitario
(Sa et al., 2009).
2.2.3
La función N-glicolilada en tumores humanos
Dentro de los cambios en la glicosilación asociados a las células tumorales se ha descrito la
presencia de derivados sialilados en gran variedad de tumores humanos. En los
vertebrados, los glicanos usualmente terminan con AS, que funcionan como marcadores de
lo propio y que pueden ser reconocidos por varios receptores (nombrados Siglecs), que
median la comunicación inter e intracelular (Paulson et al., 2012).
Los glicoconjugados portadores de la variante NGc del AS se encuentran distribuidos
ampliamente en la mayoría de los mamíferos, pero es difícil su detección en tejidos
normales de humanos y pollos (Feeney et al., 1960; Rosner, 1975; Muchmore et al., 1987;
Brinkman-Van der Linden et al., 2000). Sin embargo, un conjunto de investigaciones
demuestran su carácter de Ag específicos de células tumorales en estas dos especies
(Kikuta, 1985; Hirabayashi et al., 1986; Higashi et al., 1987; Shida et al., 2010).
Los humanos no pueden sintetizar de novo el AS Neu5Gc por hidroxilación oxidativa del AS
Neu5Ac, debido a una pérdida irreversible del exón del gen Cmah que codifica para la
enzima mono fosforil citidina-N-Acetil AS hidroxilasa (CMAH) que participa en esta
transformación (Chou et al., 2002). De forma similar, ratones modificados genéticamente
para que no expresan el gen de la hidroxilasa (Cmah-/-) son incapaces de sintetizar el AS
Neu5Gc (Hedlund et al., 2007; Naito et al., 2007), lo cual sugiere que la fuente de AS
Neu5Gc presente en los tejidos de humanos es exógena (Tangvoranuntakul et al., 2003).
Los tejidos humanos sanos han sido extensivamente evaluados para determinar la
presencia de AS Neu5Gc. La tinción inmuno-histoquímica (IHQ) con Ac específicos contra
el AS Neu5Gc generados en pollos estableció que los niveles de AS Neu5Gc son bajos en
27
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
los tejidos normales, y que aparece fundamentalmente en epitelio y endotelio de vasos
sanguíneos o en células secretoras del epitelio de pulmón, piel, colon, próstata, útero, riñón,
bazo, testículos, páncreas, hígado y estómago fetal (Tangvoranuntakul et al., 2003; Diaz et
al., 2009).
El AcM murino 14F7 (IgG1), generado por inmunización con el gangliósido Neu5Gc-GM3
(NGcGM3) conjugado hidrofóbicamente a lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, del
inglés: very low density lipoprotein) es otra herramienta que permite el estudio de la
presencia de AS Neu5Gc en los tejidos humanos (Carr et al., 2000). Este AcM ha mostrado
ser altamente específico por el gangliósido NGcGM3, sin reactividad cruzada con el
Neu5Gc-GM2 (NGcGM2) ni con su contraparte Neu5Ac-GM3 (NAcGM3) ni con glicolípidos
sulfatados (Carr et al., 2000; Rojas et al., 2013). En un estudio realizado en ratones por
Roque-Navarro y cols. (2008) se observó que el AcM 14F7 induce la muerte celular de la
línea tumoral murina de leucemia L1210 y no de las células normales (linfocitos B y T CD4)
que expresan el gangliósido NGcGM3, por un mecanismo independiente de complemento
que provoca la formación de lesiones en la membrana de la célula tumoral, sugiriendo un
fenómeno tipo oncosis (Roque-Navarro et al., 2008)
La tinción de tejidos humanos con el AcM 14F7 ha permitido identificar la presencia del
gangliósido NGcGM3 en muy bajos niveles en muestras de tejidos sanos de riñón y ovario,
pero no en testículo, próstata ni vejiga (Blanco et al., 2011a). Todos estos trabajos
revisados señalan que en los tejidos normales, solamente se expresa la variante NAc de los
gangliósidos, pero no la variante NGc (Ozawa et al., 1992b).
En contraste a la limitada evidencia de la presencia del AS Neu5Gc en los tejidos normales
humanos, su presencia en los tumores ha sido ampliamente descrita (Malykh et al., 2001).
El AS Neu5Gc fue detectado, al usar inmunofluorescencia, en tumores de mama, colorectal,
28
Revisión bibliográfica
nasofaríngeo, uterino, leucemia, y linfoma maligno, así como en ovario, páncreas y
teratoma (Higashi et al., 1988). Utilizando la inmunotinción sobre TLC, el AS Neu5Gc ha
sido detectado en colon, melanoma, retinoblastoma, tumores del saco de yolk y en el
carcinoma de mama (Amon et al., 2014).
Algunos investigadores han obtenido resultados que confirman la existencia de variantes Nglicoliladas de los gangliósidos GM2, NAcGM3 y GD3 en las células tumorales procedentes
de melanomas, retinoblastomas y de tumores colorectales, de pulmón y provenientes de la
vesícula seminal (Higashi et al., 1987; Hirabayashi et al., 1987; Kawashima et al., 1993;
Hayashi et al., 2013).
El AcM 14F7 ha permitido detectar al gangliósido NGcGM3 en muestras de tumores de
mama y melanoma (Carr et al., 2000; Oliva et al., 2006); en tumores epiteliales malignos del
sistema digestivo como los adenocarcinomas de colon, estómago y páncreas, así como en
tumores gastroesofágicos, carcinomas epidermoides del recto, y en el carcinoma
hepatocelular (Blanco et al., 2011a); en tumores pediátricos como el neuroblastoma y de la
familia de sarcomas de Ewing (Scursoni et al., 2011); en muestras de cáncer de pulmón de
células no pequeñas (Blanco et al., 2012); en muestras de melanoma mucosal oral (Zhong
et al., 2012); así como en linfomas, linfonodos metastásicos y otros sitios metastásicos
(Blanco et al., 2013).
2.2.4
Inmunosupresión inducida por los gangliósidos
La interacción entre las células del tumor y las células del sistema inmunitario es un
fenómeno crítico para el crecimiento tumoral. La hipótesis de que los gangliósidos juegan
un papel fundamental en la supresión de la respuesta inmune antitumoral está soportada
por varios estudios que demuestran su liberación al microambiente tumoral por parte de las
células tumorales (Black, 1980). Los gangliósidos liberados de manera espontánea y en
29
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
cantidades considerables en forma de monómeros, micelas y vesículas de membrana
(Kong et al., 1998; Dolo et al., 2000) poseen cadenas cortas de ácido graso en la porción
Cer (Li et al., 1991; Li et al., 1997). Esto favorece no sólo su liberación al microambiente
tumoral, sino además, su inserción en la membrana de las células del hospedero, e induce
los fenómenos de supresión inmune (Chang et al., 1997). Estudios realizados en pacientes
de melanoma han demostrado el incremento en el suero de la concentración de los
gangliósidos mayoritarios NAcGM3 y GD3, hasta valores entre 20 y 50 μg/mL (Portoukalian
et al., 1993). Además, la concentración de estos gangliósidos se incrementa por encima de
estos valores en el microambiente tumoral y en los ganglios linfáticos de pacientes con este
tipo de tumor (Hamilton et al., 1993).
Junto con estas observaciones muchos estudios han mostrado que los gangliósidos
liberados por el tumor inhiben múltiples pasos de la respuesta inmune celular in vitro. En
este sentido se ha visto la inhibición de las células T auxiliadoras (Th, del inglés: T helper)
(Offner et al., 1987; Chu et al., 1995), de la citotoxicidad de las células (Grayson et al.,
1992) y de la activación de los linfocitos T y B, ya sean estimulados por mitógeno o de
manera Ag específico (Dyatlovitskaya et al., 1987; Ladisch et al., 1992). Se ha observado
además que estos gangliósidos bloquean la producción del factor de necrosis tumoral alfa
(TNFα, del inglés: tumor necrosis factor), así como la presentación de Ag por los monocitos
humanos (Ladisch et al., 1984; Ziegler-Heitbrock et al., 1992). Ellos inhiben además la
generación de las DC funcionalmente activas (Shurin et al., 2001).
Los mecanismos por los cuales los gangliósidos llevan a cabo la supresión del sistema
inmunitario no están totalmente esclarecidos aún, pero existen numerosas evidencias que
confirman su papel inmunosupresor. Uno de estos estudios es el descrito por de León y
cols. (2006), que demostraron la capacidad del gangliósido NGcGM3 de modular
30
Revisión bibliográfica
negativamente la expresión de la molécula CD4 en linfocitos T de ratón y humanos,
afectación que se se correlaciona con su inserción en la membrana plasmática de estas
células. Además, estos autores encontraron que el gangliósido NGcGM3 modifica la
funcionalidad de los linfocitos Th CD4+CD25-lo que no está mediado por un incremento en
la actividad supresora de los linfocitos T reguladores naturales (de Leon et al., 2006).
Se ha demostrado también que la exposición de esplenocitos de ratón a algunos
gangliósidos, conduce a una reducción de la transcripción de los genes que codifican para
las citocinas asociadas a las células Th1: IL-2 e IFNα. Sin embargo, la transcripción de los
genes que codifican para las citocinas asociadas a las células Th tipo 2 (Th2), como la IL-4,
así como para la citocina inmunosupresora IL-10, no se afecta por el tratamiento de las
células del bazo con los gangliósidos (Irani et al., 1996). Estos resultados sugieren que los
gangliósidos liberados por los tumores modifican el balance de la respuesta inmune
antitumoral de un patrón Th1 a un patrón Th2, lo que provoca una reducción en la
respuesta inmune celular que puede resultar crítica para la eliminación del tumor (Birkle et
al., 2003).
Las DC también son afectadas por los gangliósidos. Se ha informado que los gangliósidos
NAcGM3 y GD3 purificados de melanoma humano inhiben la diferenciación fenotípica y
funcional de las DC derivadas de monocitos, e inducen su apoptosis (Peguet-Navarro et al.,
2003; Bennaceur et al., 2006). Se ha descrito además, que el gangliósido NGcGM3 afecta
la diferenciación de las DC, así como su maduración ante una señal inflamatoria (de Leon
et al. 2008). El gangliósido GD1a es capaz de inhibir la función de DC, las que tienen un
papel crucial en la generación de la respuesta inmune. Las DC humanas incubadas con el
gangliósido GD1a muestran una expresión constitutiva reducida del CD40 y del CD80 pero
no del CD86, así como una marcada inhibición de la secreción de las citocinas IL6 e IL12
(Caldwell et al., 2003).
31
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
Los linfocitos B también resultan afectados por los gangliósidos, los cuales inhiben su
proliferación y la producción de Ac (Berenson et al., 1991; Frugoni et al., 1994). De hecho el
gangliósido GM2 inhibe la producción de Ac por células B linfoblastoides humanas y por
células B activadas in vivo, en alguna medida como consecuencia del bloqueo de la
producción autocrina de IL10 (Kimata et al., 1996).
2.2.5
Papel del gangliósido NGcGM3 en la progresión tumoral
El papel de los gangliósidos en la progresión tumoral no está ligado sólo a su demostrado
efecto supresor sobre la actividad del sistema inmunitario. Los gangliósidos asociados a los
tumores tienen un papel importante en la ocurrencia de los eventos relacionados con el
establecimiento de los tumores y las metástasis (Cheresh, 1985; Birkle et al., 2003).
La relación del gangliósido NGcGM3 y la progresión de los tumores ha sido poco abordada.
Los primeros estudios en esta dirección fueron realizaados por de León y cols. (2006), que
estudiaron la influencia del gangliósido NGcGM3 en el modelo celular de mieloma de ratón
P3X63. Estos autores demostraron una disminución del crecimiento de los tumores
desarrollados en los animales por el tratamiento de las células tumorales P3X63 con un
inhibidor de la glucosil-ceramida sintasa (D-PDMP, del inglés: D-threo-1-phenyl-2decanoylamino-3-morpholino-1-propanol), efecto que se revirtió eliminando la población de
células T CD4+ (de Leon et al., 2006; de Leon et al., 2008).
Posteriormente, Gabri y cols. (2009) demostraron que las células tumorales de ratón de
melanoma B16 y de carcinoma mamario F3II, incubadas con mucinas ricas en AS Nglicolilados, incorporan este AS y expresan, de manera transciente, el gangliósido NGcGM3
en la membrana. Ambas líneas tumorales implantadas in vivo en ratones mostraron un
aumento del número de metástasis experimentales en el pulmón con respecto a los
32
Revisión bibliográfica
controles carentes del gangliósido NGcGM3; así como una disminución de la carga tumoral
necesaria para lograr el implante del tumor SC (Gabri et al., 2009).
Estudios ulteriores, con el carcinoma de ratón de pulmón de Lewis 3LL-D122, demostraron
que la preincubación de estas las células tumorales con AS N-glicolilado, da lugar a células
3LL-D122 que expresan el gangliósido NGcGM3 y las mismas forman más nódulos
metastásicos pulmonares, que sus controles no tratados (Segatori et al., 2012b). En
cambio, este mismo grupo de autores demostraron que las células de melanoma murino
B16 transfectadas con el gen Cmah expresan el gangliósido NGcGM3, pero disminuyen su
proliferación y adhesión in vitro, y muestran una menor habilidad de desarrollar tumores en
ratones, comparadas con la línea celular parental (Segatori et al., 2012a).
Adicionalmente, Casadesús y cols. (2013) mostraron que los cambios en la biología celular
debido a la disminución de la síntesis de AS N-glicolilado disminuyen la tumorigenicidad
tanto in vitro como in vivo. Estos autores demostraron que la línea parental de leucemia
linfocítica murina L1210, la cual expresa altos niveles del gangliósido NGcGM3, tiene una
mayor ventaja de crecimiento en ratones comparada con la línea L1210 modificada, que
carece permanentemente de la expresión de la enzima CMAH y muestra una disminución
notable del gangliósido NGcGM3 con un aumento del gangliósido NAcGM3. La línea L1210
modificada muestra una disminución de la frecuencia de tumores desarrollados por su
implante en ratones (Casadesus et al., 2013).
2.3
Vacunas de cáncer basadas en gangliósidos
Los cambios que ocurren en la expresión de los gangliósidos durante las transformaciones
oncogénicas los convierten en candidatos atractivos para la IT del cáncer.
Muchos aspectos complican el uso de los gangliósidos como vacunas de cáncer. En primer
lugar, su aislamiento de las células tumorales es muy difícil, debido a su heterogeneidad en
33
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
la superficie celular. Una solución a este problema es el empleo de la síntesis química para
la obtención de los mismos (Buskas et al., 2009). En segundo lugar, los gangliósidos son
Ag T-independientes, dando lugar a respuestas de Ac de baja afinidad y de corta duración,
en la que predomina el isotipo IgM a pesar de repetidas inmunizaciones (Livingston, 1995a).
Adicionalmente, como los gangliósidos son Ag propios, expresados en bajos niveles en las
células normales, son tolerados por el sistema inmunitario, con inmunogenicidad baja. Esta
tolerancia se refuerza además porque se liberan hacia el microambiente del tumor y hacia
la circulación sistémica, inactivando las células del sistema inmunitario. Además, la
presencia en las células tumorales de otros autoantígenos rodeando a los gangliósidos
contribuye a la poca inmunogenicidad de estos últimos (Livingston et al., 1997b). La
posibilidad de romper esta tolerancia en individuos normales y en pacientes con tumores,
ha sido demostrada por la presencia en el suero de Ac naturales específicos contra estos
Ag propios y de las células B que los producen, lo que indica que los linfocitos B antigangliósidos no han sido eliminados por deleción clonal y se encuentran funcionalmente
silentes (Marcus, 1984; Alfonso et al., 1996).
Varias estrategias vacunales se han llevado a cabo con el objetivo de eliminar la tolerancia
y aumentar la inmunogenicidad de los gangliósidos frente a los tumores (Tabla 1).
Uno de los candidatos vacunales evaluados es el GD2-KLH. La vacunación de pacientes
con este preparado dio lugar a una pequeña respuesta de Ac, mientras que la variante
GD2-lactona-KLH logró respuesta de Ac en el 83% de los pacientes tratados. Los pacientes
inmunizados con altas dosis de GD2-lactona-KLH tuvieron una alta respuesta de Ac con
capacidad de inducir CDC en células tumorales GD2 positivas (Ragupathi et al., 2003a;
Ragupathi et al., 2003b).
34
Revisión bibliográfica
Pacientes de cáncer de pulmón de células pequeñas, inmunizados con la variante sintética
y fucosilada de GM1-KLH en presencia de QS-21, mostraron respuestas de Ac IgM, pero un
solo paciente demostró una respuesta tipo IgG, de bajo título (Krug et al., 2004).
Otro resultado fallido se obtuvo con el candidato GD3-KLH, que no levantó respuesta de Ac
en los pacientes tratados (Livingston, 1995a). Sin embargo, pacientes de melanoma
inyectados con GD3-lactona-KLH en presencia de QS-21, dieron lugar a respuestas de IgM.
Con el objetivo de levantar la respuesta de Ac anti-GD3, se realizó otro intento, usando el
AcM anti-idiotipo BEC2, que mimetiza al gangliósido, como inmunógeno (Chapman et al.,
2004). A pesar de que los primeros resultados en pacientes de cáncer de pulmón fueron
prometedores, el ensayo clínico fase III no demostró ninguna ventaja de supervivencia para
los pacientes vacunados (Giaccone et al., 2005).
Tabla 1. Gangliósidos identificados como antígenos tumorales que han sido blancos de la
ITAE.
Gangliósido Tipo de
Tumor
GD2
Melanoma
Fucosil-GM1
SCLC
GD3
Melanoma
Pulmón
GM2
Melanoma
Tratamiento
Respuesta
inmune
Ac IgM
GD2-lactona-KLH
AcM anti-idiotipo
1A7
Fucosil-GM1Ac IgM
KLH/QS-21
GD3-lactonaAc IgM
KLH/QS-21
AcM anti-idiotipo
BEC2
GM2-KLH/QS-21 Ac IgM
IgG
Referencia
(Ragupathi
et
al.,
2003a; Ragupathi et al.,
2003b)
(Dickler et al., 1999);
(Krug et al., 2004)
(Livingston, 1995a)
(Chapman et al., 2004;
Giaccone et al., 2005)
e (Slovin et al., 2005;
Eggermont et al., 2013)
El preparado más prometedor usando la KLH fue con el gangliósido GM2. Las primeras
preparaciones vacunales con el gangliósido GM2 utilizaron BCG o ciclofosfamida, y
lograron respuestas de Ac IgM, predominantemente. A pesar de la ausencia de respuesta
de Ac de afinidad madurada, o cambio de clase de los Ac generados, se observó un
significativo aumento en el intervalo libre de enfermedad y en la sobrevida total en el 17%
35
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
de los pacientes tratados con GM2/BCG (Livingston et al., 1994a). Con el objetivo de
aumentar la inmunogenicidad del GM2, el mismo se conjugó con la KLH. La administración
de GM2-KLH resultó en el incremento de los títulos de Ac IgM e IgG en los pacientes
(Kitamura et al., 1995). Otros adyuvantes se emplearon también para incrementar la
inmunogenicidad del GM2, tal es el caso del Detox y de QS-21 (Helling et al., 1995). La
vacuna GM2-KLH mostró resultados prometedores en los primeros ensayos clínicos
realizados (Slovin et al., 2005), sin embargo, en el ensayo clínico fase III, a pesar de
demostrar una correlación entre la respuesta de Ac y la sobrevida, no se obtuvo beneficio
clínico con la vacunación cuando se comparó con los grupos placebo y control no tratado
(Eggermont et al., 2013).
2.4
Mecanismos de acción de las vacunas de cáncer basadas en gangliósidos
El papel de los Ac en el efecto antitumoral inducido por las vacunas basadas en
gangliósidos ha sido considerado predominante en este tipo de terapia (Livingston et al.,
1997a). Evidencias procedentes de los modelos animales y los estudios clínicos han
mostrado que la frecuencia de inducción de Ac anti-gangliósidos correlaciona con la
supervivencia (Zhang et al., 1998; Takahashi et al., 1999). Está descrito en la literatura que
los niveles de Ac IgM específicos por los gangliósidos GD2, GM2, GD3 y NAcGM3
correlaciona con la supervivencia de pacientes de melanoma al ser tratados con una
vacuna de células completas (Takahashi et al., 1999). Por otra parte, los trabajos de
Livingston y cols., demostraron que pacientes de melanoma en estadío III, que
desarrollaban Ac naturales o inducidos por vacunación contra el gangliósido GM2
mostraban un incremento en el intervalo libre de enfermedad y en la supervivencia
(Livingston et al., 1994b).
36
Revisión bibliográfica
Los Ac específicos por los gangliósidos son capaces de mediar la CDC de células positivas
a la expresión del Ag. En este sentido, Hsueh y cols. describieron una correlación
significativa entre el intervalo libre de enfermedad y la propiedad del suero de lisar células
tumorales mediante CDC, en pacientes de melanoma estadio III vacunados con Canvaxin
como terapia adyuvante (Hsueh et al., 1998).
En otro estudio sobre el papel de los Ac anti-gangliósidos de isotipo IgM, Kawashima y cols.
demostraron que en ratones transgénicos para Ac IgM contra el gangliósido GD2 se inhibía
el crecimiento de la línea de linfoma T EL-4, la cual expresa este gangliósido. Además, en
el bazo de estos ratones se encontró un incremento del número de células NK comparado
con animales no transgénicos. La eliminación de esta población redujo o eliminó el efecto
antitumoral, lo que sugiere que las células NK desempeñan un importante papel en la
erradicación del tumor en este tipo de ratones (Kawashima et al., 2003).
Se ha publicado la detección de células T específicas por los gangliósidos presentados en
moléculas de presentación no clásica como el CD1. Estas células se han encontrado en
donantes sanos y pacientes de esclerosis múltiple (Shamshiev et al., 1999). Chapman y
cols. demostraron que ratones inmunizados con células de melanoma humano las cuales
expresaban GD3 desarrollaron una respuesta de células NKT restringidas a CD1d y
específicas por este gangliósido. En estos estudios se demostró además que el GD3 era
presentado de forma cruzada por las APC murinas (Wu et al., 2003).
Los resultados obtenidos en los modelos preclínicos sugieren que aunque no se ha
demostrado la inducción de células T ni NKT específicas por los gangliósidos con la
inmunización con vacunas compuestas por este tipo de moléculas, no se puede descartar la
posibilidad de que la rama celular de la respuesta inmune esté involucrada en los
mecanismos antitumorales inducidos por estas terapias.
37
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
2.5
El gangliósido GM3 como blanco de la IT de cáncer
El gangliósido GM3, en sus variantes N-acetilada y N-glicolilada, se ha utilizado como
blanco de la IT de cáncer (Fernandez et al., 2010; Fuentes et al., 2010; Hernandez et al.,
2011).
La efectividad de vacunas que contienen el gangliósido NAcGM3 en su composición ha sido
estudiada en el modelo del melanoma murino B16 puesto que es el gangliósido mayoritario
(Vedralova et al., 1995). Los esfuerzos para aumentar la inmunogenicidad de esta molécula
no han sido del todo exitosos debido a su abundancia en los tejidos normales. Los
resultados obtenidos por Livingston y cols., demostraron que la inmunización de ratones
con el gangliósido NAcGM3 unido a un mutante de Salmonella minnesota no indujo
respuesta de Ac contra el gangliósido (Livingston et al., 1989a).
Por otra parte, Ravindranath y cols., inmunizaron ratones con vacunas celulares de
melanoma B16 que contenían monofosforil lípido A, logrando respuesta de Ac solo de
isotipo IgM contra el gangliósido en todos los ratones inmunizados y rechazo del tumor en
menos del 40 por ciento de ellos (Ravindranath et al., 1994).
Otra variante fue la vacuna Canvaxin, compuesta por tres líneas alogénicas de melanoma
humano adyuvada con BCG, que se administró a pacientes de melanoma avanzado. Los
resultados del ensayo clínico en un pequeño número de pacientes demostraron una mayor
supervivencia en aquellos sujetos con altos títulos de Ac contra el gangliósido NAcGM3
(Chung et al., 2003). Sin embargo, estos hallazgos no se corroboraron en un ensayo clínico
fase III, el cual no mostró ningun beneficio clínico para los pacientes vacunados respecto a
los pacientes que recibieron placebo (Kelland, 2006).
38
Revisión bibliográfica
2.5.1
El preparado vacunal NAcGM3/VSSP
Otra terapia contra el gangliósido NAcGM3 es el preparado vacunal NAcGM3/VSSP. Los
estudios realizados con el NAcGM3/VSSP demostraron que la inmunización de ratones,
monos y humanos con este preparado en adyuvante oleoso estimuló la producción de Ac
de tipo IgM e IgG específicos tanto por el gangliósido NAcGM3 como por las proteínas de
Nm (Estevez et al., 1999; Guthmann et al., 2004). Por otra parte, la inmunización de ratones
C57BL/6 con NAcGM3/VSSP adyuvado con Montanide ISA 51, indujo la protección de
estos animales ante el reto con la línea tumoral de melanoma B16 (Carr et al., 2001).
Por otra parte, en un ensayo clínico fase I en pacientes de melanoma avanzado, la vacuna
NAcGM3/VSSP emulsionada en Montanide ISA 51 indujo altos títulos de anticuerpos de
isotipo IgM en el 44 % de los pacientes, sin evidencias de respuesta celular contra el
gangliósido. Desde el punto de vista clínico en un paciente se indujo primero estabilización
de la enfermedad y luego una reducción del tumor en lesiones de tejido blando
acompañada por aparición de vitiligo (Guthmann et al., 2004). Sin embargo, el fracaso de la
inmunoterapia activa en pacientes con estadíos avanzados de la enfermedad, motivó a
buscar un inmunógeno efectivo contra el melanoma en el escenario de enfermedad residual
mínima e incluso en el preventivo. Mazorra y cols (2008) demostraron en estudios en
ratones C57 con el modelo de melanoma murino B16 que el preparado NAcGM3/VSSP,
emulsionado en Montanide ISA 51, protege a los ratones de la recurrencia del melanoma
B16, lo cual sugiere una mayor posibilidad de éxito terapéutico en el escenario de
enfermedad residual mínima. Estos autores señalaron que los Ac de isotipo IgG específicos
al gangliósido NAcGM3 participan en el mecanismo inmunológico antitumoral inducido por
el inmunógeno en el escenario preventivo. En este mismo trabajo, se demostró que el
preparado vacunal NAcGM3/VSSP, emulsionado en Montanide ISA 51, estimuló la
expansión de células T CD8+ secretoras de IFNγ específicas al melanoma B16 en los
39
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
animales portadores de tumor, que están involucradas en la capacidad antitumoral del
preparado (Mazorra et al., 2008).
2.5.2
Racotumumab
Una de las estrategias vacunales que tiene como blanco a la variante N-glicolilada del
gangliósido GM3 consiste en el uso del AcM anti-idiotípico Racotumumab (inicialmente
conocido como 1E10), también referido como Ab2, que funciona como subrogado del
gangliósido NGcGM3 (Hernandez et al., 2005) e induce una respuesta específica de Ac IgM
e IgG anti-NGcGM3. Vaxira, que es el nombre que se le dió a la formulación de
Racotumumab en hidróxido de aluminio (Alúmina) fue registrada en Cuba y Argentina en el
año 2013 para el tratamiento de pacientes de cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Vaxira es segura y bien tolerada, con mínima toxicidad (Alfonso et al., 2014).
La eficacia de Racotumumab en Alúmina se evaluó en varios ensayos clínicos fase I en
pacientes de melanoma maligno avanzado, cáncer de pulmón de células pequeñas, en
cáncer de mama estadíos III/IV y metastásico, y en cáncer de células no pequeñas estadíos
IIIb y IV (Diaz et al., 2003; Alfonso et al., 2007; Neninger et al., 2007). En todos los ensayos
clínicos fase I la mayoría de los pacientes tratados con Racotumumab en Alúmina
desarrollaron Ac IgM e IgG anti-NGcGM3. Particularmente, en el ensayo con los pacientes
de cáncer de células no pequeñas estadíos IIIb y IV, se encontraron diferencias
estadísticamente significativas en la mediana de supervivencia de los pacientes que
generaron respuesta de Ac IgM e IgG anti-NGcGM3 y los que no (Hernandez et al., 2008).
En el ensayo clínico fase II, en pacientes de cáncer de pulmón de células no pequeñas, .la
administración de Racotumumab en Alúmina demostró un beneficio en la supervivencia de
los pacientes tratados respecto a los controles que recibieron placebo (Vazquez et al.,
2012).
40
Revisión bibliográfica
2.5.3
El preparado vacunal NGcGM3/VSSP
El segundo candidato dirigido a este mismo blanco, conjuga al gangliósido NGcGM3 en
VSSP, obtenido a partir de las VME de la Nm (Estevez et al., 1999).
Estévez y cols. (1999) describieron que la inmunización con preparaciones de los
gangliósidos NAcGM3, NGcGM3 y GD3, en VSSP y adyuvante oleoso, indujo la respuesta
de Ac anti-gangliósidos tanto tipo IgM como IgG (Estevez et al., 1999). En los ratones, la
fracción IgG de Ac anti-gangliósidos no se restringió isotipo IgG3, típico de las respuestas a
Ag T-independentes. De manera inesperada, esos autores encontraron Ac anti-gangliósidos
de los isotipos IgG1, IgG2a e IgG2b. Resultados similares se alcanzaron cuando las
mismas preparaciones se administraron en pollos y monos (Estevez et al., 1999).
Con el preparado vacunal NGcGM3/VSSP adyuvado en Montanide ISA 51 se han realizado
varios ensayos clínicos en Cuba, en pacientes de melanoma (Osorio et al., 2008; Osorio et
al., 2012; Perez et al., 2013) y cáncer de mama (Carr et al., 2003; Mulens et al., 2010). Los
eventos adversos producidos por la vacunación se clasificaron como leves. Todos los
pacientes tratados con NGcGM3/VSSP desarrollaron títulos de Ac anti-NGcGM3, y el suero
hiperinmune reconoció las líneas tumorales P3X63 y L1210, ambas NGcGM3 positivas
(Carr et al., 2003; Mulens et al., 2010). Los ensayos clínicos fase III que se encuentran en
curso, validarán el beneficio en supervivencia.
41
3. MATERÍALES Y METODOS
3.1
Animales
Se utilizaron dos modelos animales: pollos Leghorn, de 10-12 semanas, mantenidos en el
Centro Nacional de Salud Animal (CENSA, Cuba); y ratones hembras C57BL/6, de 8-12
semanas de edad, del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio
(CENPALAB, Cuba) que se mantuvieron en el bioterio del CIM con alimentación ad libitum.
Las manipulaciones y los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices
establecidas por este centro para el manejo de los animales de laboratorio.
3.2
Líneas celulares y medios de cultivo
La línea celular murina del clon metastásico del carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122
(Eisenbach et al., 1984), la línea celular de mieloma murino P3X63 (Kearney et al., 1979) y
los hibridomas de rata, productores de inmunoglobulinas específicos por las moléculas
murinas NK 1.1 (PK136), CD4 (YTS191) y CD8 (YTS169) se obtuvieron de la Colección
Americana de Tipos Celulares (ATCC, del inglés: American Type Culture Collection). Para
los cultivos celulares se utlilizó el medio Dulbecco Modificado (DMEM-F12, Hyclone),
suplementado al 10% con suero fetal de ternera inactivado (SFT, HyClone), 2 mM de Lglutamina, 10 mM de HEPES, 20 µM de β-mercaptoetanol, 100 U/mL de penicilina y 100
U/mL de estreptomicina.
3.3
AcM utilizados para la eliminación de poblaciones linfocitarias
Para los experimentos de eliminación in vivo de poblaciones linfocitarias se utilizaron
preparaciones de AcM específicos por las moléculas NK1.1, CD8 y CD4, purificadas
mediante precipitación con NH4SO4, a partir del sobrenadante de cultivo de los hibridomas
PK136, YTS169 y YTS 191, respectivamente.
43
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
3.4
AcM utilizados en la citometría de flujo
La determinación de moléculas en la superficie celular se realizó a través de ensayos de
citometría de flujo (FACS, del inglés: fluorescence activated cell sorter). Todos los AcM
conjugados a los fluoróforos se emplearon a una dilución final de 1:200 en solución salina
tamponada con fosfatos (SSTF) con SFT al 1%.
3.4.1
Para la detección del gangliósido NGcGM3 en la membrana plasmática de las
células tumorales
Se utilizó el AcM 14F7 humanizado (Fernandez-Marrero et al., 2011), específico por el
gangliósido NGcGM3. En el revelado de este Ac se empleó un suero de conejo anti-IgG
humana (F0056, Dako) conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC, del inglés:
fluorescein iso-thiocyanate). Se empleó el AcM irrelevante hR3 como control de isotipo.
3.4.2
Para la determinación de moléculas de superficie en las DC
Se utilizaron los siguientes AcM, generados en hámster o rata, adquiridos de la firma BD
Pharmingen, conjugados a FITC o a ficoeritrina (PE, del inglés: phycoerythrin), específicos
por las moléculas murinas CD11c (HL3) conjugado a PE; CD40 (3/23) conjugado a FITC;
CD80 (16-10A1) conjugado a FITC; CD86 (GL1) conjugado a FITC; CD11c (HL3)
conjugado a FITC; CD1d (1B1) conjugado a PE; B220 (RA3-6B2) conjugado a PE.
3.4.3
Para la detección de linfocitos infiltrantes en pulmón
Se utilizaron los siguientes AcM, generados en rata o hámster, adquiridos de la firma
eBioscience, conjugados a FITC o a PE, específicos por las moléculas murinas NK 1.1
(PK136) conjugado a PE; CD3 (145-2C11) conjugado a FITC; CD45 (30-F11) conjugado a
ficoeritrina-cianina (PECy5, del inglés: phycoerythrin and cyanine), CD3 (145-2C11)
conjugado a PECy5; CD4 (RM4-5) conjugado a FITC; CD8 (53-6.7) conjugado a PE; FoxP3
44
Materiales y Métodos
(NRRF-30) conjugado a PE, CD25 (PC61.5) conjugado a PECy5; Gr1 (RB6-8C5) conjugado
a PE, CD11b (Mac-1a) conjugado a PECy5.
3.5
Gangliósidos NGcGM3 y NAcGM3
Ambos gangliósidos los suministró el Centro de Química Biomolecular (CQB, Cuba). El
gangliósido NGcGM3 de fuente natural se obtuvo a partir de eritrocitos de sangre de caballo
(Estevez et al., 1999) y el sintético, mediante síntesis química por el método descrito por
Duclos (Duclos, 2000) y Sherman (Sherman et al., 2002). El gangliósido NAcGM3 se obtuvo
de eritrocitos de perro (Estevez et al., 1999). La pureza se monitoreó por cromatografía de
alta resolución en placa delgada (HPTLC, del inglés: high performance thin layer
chromatography).
3.6
Los preparados vacunales NGcGM3/VSSP y NAcGM3/VSSP
Todos los preparados vacunales fueron proveídos por la Dirección de Desarrollo del CIM.
Los preparados NGcGM3/VSSP y NAcGM3/VSSP se obtuvieron a partir de la incorporación
hidrofóbica del gangliósido purificado de eritrocitos de caballo (NGcGM3) o de perro
(NAcGM3) respectivamente, a las VME de la Nm, según el método descrito por Estévez y
cols. (Estevez et al., 1999). Para los experimentos en pollos se construyó, por el mismo
método, un preparado NGcGM3/VSSP con el gangliósido NGcGM3 sintético (SAg/VSSP).
En el resto de los experimentos, tanto in vivo como in vitro, se utilizó el preparado vacunal
NGcGM3/VSSP con Ag natural. La relación de masa entre gangliósidos y proteínas de cada
preparado osciló entre 0,6-0,8. Los mismos se dosificaron a partir del contenido de
gangliósidos.
La preparación vacunal NGcGM3/VSSP emulsionada con Montanide se preparó con el
adyuvante oleoso Montanide ISA 51 (Seppic, Francia), al unir iguales volúmenes de vacuna
45
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
y adyuvante. Para lograr la emulsión se agitó la mezcla en un vórtex (Hettich, Alemania)
durante 5 min.
3.7
Desarrollo de tumores primarios del carcinoma de pulmón de Lewis 3LL-D122
Los tumores primarios utilizados para la determinación del contenido del gangliósido
NGcGM3 se obtuvieron a partir de la inoculación subcutánea (SC) de línea tumoral 3LLD122 (5x105 células) en el flanco de ratones C57BL/6. Veinticuatro días después de crecido
el tumor los animales se sometieron a sacrificio humanitario y se extrajeron los tumores
primarios crecidos en el flanco de los mismos.
3.8
Modelo de metástasis espontánea del carcinoma de pulmón de Lewis 3LL-D122
La actividad antitumoral del preparado vacunal NGcGM3/VSSP se evaluó en el modelo
murino de metástasis espontánea con la línea tumoral 3LL-D122 descrito por Eisenbach y
cols. (Eisenbach et al., 1983). El día cero del experimento se realizó la inoculación de las
células de la línea tumoral 3LL-D122 (2x105) en la almohadilla plantal de ratones C57BL/6.
El momento de aparición de los tumores se monitoreó por palpación. Se siguió el
crecimiento de los tumores primarios mediante la medición del diámetro del tumor con pie
de rey. Entre los 26-30 días el diámetro del tumor crecido en la pata de los animales
alcanzó 0,8-0,9 mm, momento en el cual estos tumores fueron removidos por cirugía, luego
de anestesiar a los animales. Veintiún días después los animales se sometieron a sacrificio
humanitario y se extrajeron los pulmones.
Para la determinación del efecto antimetastásico del preparado vacunal los pulmones se
pesaron en una balanza analítica. En este modelo el peso del pulmón correlaciona
directamente con la talla y el número de las metástasis (Gorelik et al., 1980; Eisenbach et
al., 1983).
46
Materiales y Métodos
Las metástasis pulmonares para la determinación del contenido del gangliósido NGcGM3
se obtuvieron por separación de la masa tumoral metastásica con pinzas y tijeras bajo
microscopio estereoscopio, con el cuidado de no incluir tejido pulmonar.
3.9
Extracción de gangliósidos de las muestras tumorales
Las muestras tumorales del carcinoma pulmonar 3LL-D122: línea celular, tumor primario y
metástasis, se procesaron para la extracción de gangliósidos según se describe a
continuación. Primeramente se homogenizaron en agua y se extrajeron los lípidos totales
en cloroformo:metanol:agua en proporción 4:8:3 (v:v:v) durante una hora. El homogenado
obtenido de cada muestra tumoral se centrifugó a 3 000 rpm, 15 minutos y la fracción
lipídica se recuperó en el sobrenadante (SN). La mezcla de solventes se evaporó por
rotoevaporación (Büchi, Suiza), los lípidos secos se disolvieron en cloroformo:metanol en
proporción 1:1 (v:v) y se mantuvieron a 4°C durante toda la noche. A continuación se
centrifugaron a 3 000 rpm, 15 minutos y se recuperó en el SN la mezcla de lípidos totales.
Los solventes contenidos en los SN se rotoevaporaron, los lípidos secos se disolvieron en
cloroformo:metanol:agua en proporción 30:60:8 (v:v:v) y se aplicaron en una columna de
DEAE-Sefarosa A-25, con vistas a obtener los gangliósidos monosialilados. La fracción de
los monosialo-gangliósidos se despegó de la columna con acetato de sodio 0,02 M en
metanol. Las mezclas de gangliósidos obtenidas se utilizaron para la identificación del
gangliósido NGcGM3.
3.10 Identificación química del gangliósido NGcGM3
Para la identificación química del gangliósido NGcGM3, las mezclas de gangliósidos se
sometieron a HPTLC en placas de sílica gel (Merck) (Estevez et al., 1999). Las placas se
corrieron en cloroformo:metanol:2,5 M NH3 en proporción 65:35:8 (v:v:v). Los patrones de
los gangliósidos NAcGM3 y NGcGM3 se corrieron en paralelo con las muestras de
47
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
gangliósidos procedentes de las muestras tumorales. El revelado químico de los
gangliósidos se realizó con el reactivo de resorcinol-HCl (Svennerholm, 1963). Se calculó el
valor del factor de retención (Rf) relativo a los controles de gangliósidos empleados para
determinar la banda correspondiente a los gangliósidos NGcGM3 y NAcGM3. Las imágenes
de la HPTLC se capturaron con un escáner (Powerlook III, Amersham Biosciences). El
porcentaje de los gangliósidos NGcGM3 y NAcGM3 del total de los monosialio-gangliósidos
obtenidos se calculó por análisis densitométrico con el programa TotalLab120 (Nonlinear
Dynamics).
3.11 Identificación inmuno-química del gangliósido NGcGM3 en HPTLC
Las mezclas de gangliósidos se sometieron a una inmuno-tinción de las placas HPTLC, con
el AcM 14F7 murino (Carr et al., 2000), de acuerdo al protocolo descrito por Saito y cols.
(Saito et al., 1985) con pequeñas modificaciones. Brevemente, las mezclas de gangliósidos
se separaron por HPTLC, las placas se sumergieron en una solución al 0,1% de
poliisobutilmetacrilato (Aldrich Chemical) en hexano durante 75 segundos y se pusieron a
secar al aire. Posteriormente, las placas bloqueadas con SSTF conteniendo 1% de BSA
(Sigma), se incubaron a 4°C (toda la noche) con 10 μg/ml del AcM 14F7 murino. Después
de los lavados, se adicionó el Ac anti-IgG de ratón conjugado a fosfatasa alcalina (Jackson).
Las manchas se visualizaron con una solución de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato a 1
mg/ml en tampón glicina 0,1 M (pH 10,4). La reacción se detuvo lavando con agua.
3.12 Identificación inmuno-histoquímica del gangliósido NGcGM3
Para la detección del gangliósido mediante inmunohistoquímica (IHQ) con el AcM 14F7
murino se utilizaron cortes de tumor primario y de metástasis pulmonares de la línea 3LLD122. Para la detección se empleó el ensayo Vectastain ABC (Vector Laboratories) y se
siguieron las instrucciones del fabricante. Brevemente, las muestras de los tumores
48
Materiales y Métodos
subcutáneos y de las metástasis pulmonares se fijaron en formalina y se procesaron
usando la técnica de rutina de parafina (Alonso et al., 1999). Secciones de los tumores (5
μm) se incubaron se durante 1h con el AcM 14F7 murino (20 μg/ml en SSTF). A
continuación se incubaron primero con un suero de caballo anti-IgG de ratón por 30 min y
después con un complejo avidina-biotina conjugado a peroxidasa durante 30 min. Luego se
añadió el sustrato de la peroxidasa (diaminobencidina) y las secciones de tumor se
contrastaron con hematoxilina. Se realizaron los controles pertinentes de especificidad, que
incluyeron el bloqueo de la peroxidasa endógena, la omisión del primer Ac y la utilización de
un Ac no relacionado (AcM 1E10).
3.13 Detección del gangliósido NGcGM3 por espectrometría de masa
La detección del gangliósido NGcGM3 se realizó a través de un MALDI/MS en un
espectrómetro de masa (Shimadzu Biotech Axima). El ácido gentísico (ácido 2,5dihidroxibenzoico) 10 mM (Sigma) se usó como matriz. Las muestras (5 µg/ 1 µl) se
depositaron en el soporte, cubiertas con 1 µl de la matriz en solución acuosa y se secaron.
Los iones analitos se desorbieron de la matriz con pulsos de un láser de nitrógeno de 337
nm. Los espectros se obtuvieron en el modo de ión reflectivo positivo con un promedio de
128 pulsos, la ventana de iones se fijó en 1 000-1 500 Da. Se calculó el promedio de la
masa obtenida en dos determinaciones.
3.14 Procedimientos de inmunización en los experimentos con animales
3.14.1 Experimentos de inmunogenicidad en pollos
Se utilizaron dos variantes del preparado vacunal NGcGM3/VSSP construidas con el
gangliósido NGcGM3 de fuente natural (NAg/VSSP) y con el gangliósido sintético
(SAg/VSSP). Ambas preparaciones vacunales se emuslificaron con Montanide ISA 51
(Seppic). Grupos de 10 pollos recibieron 200 µg de cada preparado vacunal con Montanide,
49
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
por vía intramuscular (IM), los días cero y 14. Los sueros inmunes se colectaron el día 21
para el análisis de los Ac anti-NGcGM3. La extracción de sangre se realizó a partir de las
venas de las alas.
3.14.2 Experimentos de inmunogenicidad en ratones
Los ratones recibieron 200 µg del preparado vacunal NGcGM3/VSSP, con Ag natural, sin
emulsión por vía subcutánea (SC). Los ratones sanos (n=10) recibieron las inmunizaciones
los días cero y 14, y las extracciones de sangre se realizaron el día cero (suero preinmune)
y el día 21. Los ratones portadores del tumor 3LL-D122 (n=4) recibieron las inmunizaciones
los días siete y 21. Las extracciones de sangre se realizaron el día cero (suero preinmune)
y los días 24, 28 y 35 después de implantadas las células tumorales. Las extracciones se
realizaron por punción submandibular (Golde et al., 2005).
3.14.3 Experimentos de evaluación del efecto del preparado vacunal en el modelo murino
de metástasis espontánea a pulmón del carcinoma de Lewis 3LL-D122
Para evaluar el efecto del preparado vacunal NGcGM3/VSSP en el modelo murino de
metástasis espontánea del carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122, treinta ratones
C57BL/6 se inocularon con células tumorales 3LL-D122 (2x105/ratón) en la almohadilla
plantal y se aleatorizaron en grupos de 15 animales. Un grupo recibió dos dosis de 200 µg
del preparado vacunal NGcGM3/VSSP no emulsivo, por vía SC, siete y 21 días después de
la inoculación del tumor, mientras el otro recibió SSTF (grupo control). En los experimentos
de evaluación de las vías IM e intraparitoneal (IP) se empleó el mismo esquema de dosis y
frecuencia.
Para la comparación del efecto del preparado vacunal NGcGM3/VSSP no emulsionado, y
emulsionado con Montanide, grupos aleatorizados de 7-10 ratones C57BL/6 inoculados con
las células tumorales 3LL-D122 (2x105/ratón) en la almohadilla plantal, se trataron con dos
50
Materiales y Métodos
dosis de 200 µg del preparado vacunal NGcGM3/VSSP sin adyuvante oleoso (por vía SC),
o adyuvado en Montanide ISA 51 (por vía IM), siete y 21 días después de la inoculación del
tumor. Los ratones del grupo control recibieron SSTF.
Para el estudio de la relevancia del gangliósido NGcGM3 en la actividad de la vacuna
NGcGM3/VSSP, grupos de ratones portadores del tumor de Lewis 3LL-D122 en la
almohadilla plantal (aleatorizados a razón de 10 animales por grupo) recibieron por vía SC,
dos dosis de 200 µg del preparado vacunal NGcGM3/VSSP, 200 µg del preparado
NAcGM3/VSSP y la dosis equivalente de VME, los días siete y 21 del experimento. Los
ratones del grupo control recibieron SSTF.
3.14.4 Experimentos de medición in vivo de maduración de DC
Ratones sanos (n=3) se vacunaron con 200 μg del preparado vacunal NGcGM3/VSSP por
vía SC (en el lomo) y luego de tres días se aislaron las células de los ganglios linfáticos
aferentes (axilares) mediante maceración, para evaluar mediante FACS, la expresión de
marcadores de maduración en las DC. Los ratones del grupo control recibieron SSTF.
3.14.5 Experimentos de medición de citocinas en suero
Ratones sanos se vacunaron (n=3) con 200 μg del preparado vacunal NGcGM3/VSSP por
vía IP y luego de 2, 4, 6 y 24 h se colectó el suero por punción submandibular (Golde et al.,
2005). Grupos controles, de tres animales cada uno, recibieron LPS (15 µg), poli I:C (200
µg) y SSTF, todos por vía IP.
3.15 Determinación de anticuerpos séricos
Los Ac séricos contra los gangliósidos NGcGM3 y NAcGM3 se determinaron mediante un
ensayo inmunoenzimático colorimétrico (ELISA) indirecto, que se describe brevemente. Una
parte de la placa de 96 pozos Polysorp (Nunc,) se recubrió con el gangliósido NGcGM3 o
51
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
NAcGM3 (4 µg/ml) disuelto en metanol, y la otra con el solvente orgánico sin gangliósido.
Los pozos se secaron a 37ºC y se bloquearon con el tampón de bloqueo que contenía 1%
de BSA en SSTF. Posterior a la incubación con las muestras de los sueros de los animales
tratados, se realizó la incubación con el conjugado adecuado unido a la fosfatasa alcalina.
Después de lavar las placas, se adicionaron 100 μl por pozo de la solución de sustrato que
contenía 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato en tampón dietanolamina pH 9,8. La absorbancia del
producto de la reacción se midió a los 30 min en un lector de placas (Organon Teknika) a
405 nm. Los sueros se consideraron positivos cuando la absorbancia fue mayor de 0,1.
Estos valores se obtuvieron luego de sustraer al valor medio de las absorbancias
experimentales obtenida para cada dilución en los pozos recubiertos con el Ag, los valores
obtenidos al enfrentar los sueros a los pozos tratados de igual forma pero donde no se
añadió el gangliósido.
3.15.1 Preparación de las muestras para la titulación de los Ac anti-gangliósido en los
pollos
Los sueros se diluyeron de forma seriada desde 1:80 hasta 1:5 120, se adicionaron a los
pozos (50 μl por pozo) por duplicado y las placas se incubaron toda la noche a 4ºC.
Después de lavar los pozos con 0,05% Tween 20-SSTF, se añadieron 50 μl de suero antiinmunoglobulinas IgY de pollo conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma) diluido 1: 1 000.
3.15.2 Preparación de las muestras para la evaluación de los Ac anti-gangliósido en los
ratones
Los sueros de los ratones sanos vacunados se evaluaron a una dilución fija de 1:80. En el
caso de la estimación de los Ac anti-gangliósido en los ratones portadores del tumor 3LLD122, los sueros se evaluaron en una dilución fija (1:100) y se titularon a partir de
diluciones seriadas desde 1:100 hasta 1:1 600. En todos los casos se añadieron 50 μl por
52
Materiales y Métodos
pozo, por duplicado y se incubaron toda la noche a 4ºC. A continuación los pozos se
lavaron con 0,05% Tween 20-SSTF, y se añadieron 50 μl de suero anti-IgM de ratón
conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma) diluido 1: 5 000; ó 50 μl de suero anti-IgG de ratón
conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma) diluido 1: 5 000.
3.16 Reconocimiento de la línea tumoral P3X63 por los sueros de los animales vacunados
Las células P3X63 se lavaron con SSTF, a continuación con solución de lavado para FACS
(SLC: 0,1% BSA y 0,1% NaN3 en SSTF) y después se ajustaron a 1x105 células por
muestra. Las células se incubaron por 30 min a 4°C con los sueros de los pollos, todos
diluidos 1/10 en SLC. Posteriormente, se lavaron las muestras con SLC. A continuación se
adicionó el Ac anti-IgY pollo conjugado a biotina (diluido 1/200). Luego de 15 minutos de
incubación a 4°C y dos lavados con SLC, se adicionó el complejo estreptavidina-FITC,
diluido 1/200, durante otros 15 min y a 4°C. Finalmente, las células se lavaron con SSTF, y
se adicionó 200 µl de SSFT por muestra para el análisis en el citómetro de flujo.
3.17 Obtención de las células dendríticas murinas a partir de la médula ósea
Las DC murinas se obtuvieron a partir de precursores aislados de la médula ósea (bm-DC,
del inglés: bone marrow DC). Con este objetivo se extrajeron, en condiciones estériles, los
huesos fémur y tibia de los ratones recién sacrificados por dislocación cervical. Los
extremos de los huesos se cortaron y la médula se aisló mediante el paso de un flujo de
medio de cultivo por el interior del hueso con una aguja 23Gx1. Las células de la médula
ósea se centrifugaron y se resuspendieron en cloruro de amonio al 0,83% (a temperatura
ambiente por 2 minutos) para lisar los eritrocitos.
3.17.1 Obtención de las DC convencionales
Para obtener las DC convencionales (cDC) las células extraídas se sembraron en placas de
cultivo de seis pozos, a una densidad de 6x105 células/ml en 3 ml de medio RPMI 1640
53
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
suplementado con 20 ng/mL del factor estimulador de colonias de granulocitos y
macrófagos (GM-CSF, del inglés: granulocyte-macrophage colony stimulating factor) (R&D
Systems). Entre las 72 y 90 h de cultivo, se añadieron otros 3 ml de medio de cultivo
suplementado con GM-CSF (Inaba et al., 1992). A los siete días de cultivo las células se
colectaron y se utilizaron frescas para los experimentos celulares.
3.17.2 Obtención de las DC plasmacitoides
Para obtener las DC plasmacitoides (pDC), las células extraídas se sembraron en placas de
cultivo de 24 pozos, a una densidad de 2x106 células/ml en 1 ml de medio IMDM (Gibco)
suplementado al 15% con ligando de tirosina cinasa Fms-3 (FLt3-L, del inglés: Fms-related
tyrosine kinase 3 ligand), obtenido en el SN del cultivo de las células Sp2/0 secretoras de
FLT3-L (Brasel et al., 2000). Cada 24 h a las placas se le cambiaron el 50% del medio
metabolizado por medio fresco, siempre suplementado con 15% de FLt3-L. A los siete días
del cultivo, las bm-pDC se purificaron mediante selección positiva con perlas magnéticas
conjugadas a AcM anti-B220+ (Miltenyi Biotec). Las bm-pDC se utilizaron frescas para los
experimentos celulares.
Para determinar la pureza de cada población se estudió la expresión de los marcadores por
citometría de flujo. La pureza de las células estuvo por encima del 80%.
3.18 Maduración de células dendríticas con NGcGM3/VSSP
Las bm-cDC inmaduras se cultivaron durante toda la noche (18h) en medio (RPMI 1640,
Gibco), y en presencia de LPS (1 µg/ml, Sigma) y NGcGM3/VSSP (1 µg/ml). Las células
obtenidas se utilizaron para evaluar mediante FACS, la expresión de marcadores de
maduración. Los SN del cultivo se colectaron para la determinación de IL-6 e IL12.
54
Materiales y Métodos
Las bm-pDC inmaduras se cultivaron cultivadas toda la noche (18 h) en medio (IMDM,
Gibco), y en presencia de LPS (0,5 µg/ml, Sigma), CpG-A (5 µg/ml, InVivoGen) y
NGcGM3/VSSP (0,1 µg/ml). Las células obtenidas se utilizaron para evaluar mediante
FACS, la expresión de marcadores de maduración. Los SN del cultivo se colectaron 18 h
después para la determinación de IFNα.
3.19 Determinación de la expresión de moléculas de superficie por FACS
Las DC y de linfocitos se estudiaron a través del marcaje de moléculas en la membrana
plasmática. Con este objetivo, las células se incubaron durante 15 min en SSTF, azida
sódica 0.01% y SFT al 1%, para minimizar las uniones inespecíficas. A continuación, 2x105
células por cada muestra se incubaron durante 15 min a 4 ºC, en la oscuridad, con los
diferentes AcM conjugados a fluoróforos diluidos en una solución de SSTF, azida sódica
0,01% y SFT al 1%. Una vez marcadas las células se lavaron con la misma solución
centrifugando 2 min a 2 000 rpm y se adquirieron en el citómetro de flujo.
3.20 Determinación de la frecuencia de células inmunes en pulmones
El infiltrado inmune pulmonar se determinó por FACS. La frecuencia de células NK1.1+ se
midió en grupos de 3 ratones C57BL/6, en el modelo de metástasis espontánea con la línea
3LL-D122, a los 3 días después de la segunda dosis de vacuna. La frecuencia de células
efectoras de la inmunidad adaptativa y de células reguladoras se evaluó en grupos de 4-6
ratones C57BL/6, en el mismo modelo, a los 21 días de operados los tumores primarios. En
todos los casos se administraron dos dosis de 200 µg de NGcGM3/VSSP por vía SC, los
días siete y 21 después del reto tumoral. Los leucocitos del pulmón se obtuvieron por
digestión del órgano en DMEM-F12 (Hyclone) conteniendo colagenasa D (1 mg/ml; Sigma)
y DNasa I (1 mg/ml; Sigma), durante 30 min a 37°C.
55
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
3.21 Medición de citocinas producidas por las DC
Se analizó el contenido de IFNα, IL-6 e IL-12 mediante ensayos ELISA comerciales,
procedentes de PBL Biomedical Laboratories (IFNα) y Thermo Fischer Scientific (IL-12 y IL6). Se siguieron las instrucciones del fabricante en cada caso. Para la determinación de
IFNα las muestras se evaluaron sin diluir. Para la evaluación de IL-6 los SN se diluyeron 1/5
y los sueros 1/10. Para la estimación de IL-12 los SN se diluyeron 1/20 y los sueros 1/10.
3.22 Experimentos de eliminación de poblaciones celulares in vivo
Para evaluar la relevancia de las poblaciones celulares en la respuesta inmune, grupos de
ratones C57BL/6, en el modelo de metástasis espontánea con la línea 3LL-D122,
vacunados con dos dosis de 200 μg del preparado vacunal NGcGM3/VSSP y controles
(SSTF), recibieron además por vía IP 1 mg de AcM específicos por las moléculas NK1.1,
CD8 y CD4, un día después de la administración del preparado vacunal o de la SSTF. Esta
dosis de los AcM demostró, en experimentos previos, eliminar más del 98% de la población
celular.
3.23 Análisis estadístico
Para calcular los valores de los coeficientes r de Pearson y de probabilidad de la
correlación, así como para los demás análisis estadísticos realizados se utilizó el editor de
gráficos GraphPad Prism versión 5.03. En todas las variables se evaluó la normalidad
mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la homogeneidad de varianza mediante la
prueba de Levene.
Para el análisis de los datos de la población celulares infiltrantes de pulmón se empleó la
prueba no paramétrica de comparaciones pareadas U de Mann-Whitney, con un nivel de
significación de 0,01.
56
Materiales y Métodos
Para la evaluación de las diferencias de la variable peso de pulmón en los ensayos de
actividad anti-metastásica del preparado vacunal NGcGM3/VSSP se utilizó la prueba t de
Student para muestras no pareadas cuando se compararon sólo dos grupos; mientras que
cuando el experimento tenía tres o más grupos se realizó un análisis de varianza de
clasificación simple (ANOVA, del inglés: Analysis of Variance) y se aplicó la prueba de
Tuckey.
Las comparaciones del crecimiento de los diámetros tumorales en el modelo de metástasis
espontánea se realizaron mediante un ANOVA de dos vías.
Las diferencias se consideraron significativas cuando p<0,05.
57
4. RESULTADOS
4.1
La expresión del gangliósido NGcGM3 en el modelo de carcinoma pulmonar de Lewis
3LL-D122 se incrementa en las metástasis respecto a los tumores primarios
La relevancia del modelo de metástasis espontánea a pulmón con la línea 3LL-D122 y el
hecho de que no se ha descrito anteriormente la expresión del gangliósido NGcGM3 en
este tipo de tumor, motivó determinar la presencia del mismo en las diferentes etapas por
las que transita el modelo (línea tumoral 3LL-D122, tumor primario y metástasis). Las
muestras tumorales se procesaron para la extracción química y la purificación de
monosialo-gangliósidos de forma individual, según se describe en Materiales y Métodos.
La presencia del gangliósido NGcGM3 en las diferentes fracciones de los monosialogangliósidos (Figura 1), derivadas de las tres etapas del modelo tumoral, se hizo evidente a
partir de los valores del Rf relativo a los controles de gangliósidos empleados en la técnica
HPTLC. El componente principal de la fracción de gangliósidos derivados de la línea
tumoral 3LL-D122 en cultivo fue el gangliósido NAcGM3, representando el 87.4% del total
de los ácidos siálicos unidos a lípidos, mientras que su variante N-glicolilada constituyó sólo
el 12.6% (Figura 1A). Por otra parte, en los tumores primarios, la diferencia en la expresión
de ambas especies fue menor. El gangliósido NAcGM3 constituyó el 56.1% del total de los
monosialo-gangliósidos y el gangliósido NGcGM3 el 32.2% (Figura 1B). En las lesiones
metastásicas (Figura 1C) esta situación se invirtió, pues el gangliósido NGcGM3 constituyó
el 73.4% de los monosialo-gangliósidos, mientras que la variante N-acetilada representó
sólo el 11.2%.
La presencia del gangliósido NGcGM3 en las diferentes fracciones se corroboró además
mediante inmuno-tinción de las placas de HPTLC con el AcM 14F7 y mediante
espectrometría de masa.
59
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
Los experimentos de inmuno-tinción con el AcM 14F7 confirmaron la presencia de esta
sialil-lactosil-ceramida en las fracciones de los monosialo-gangliósidos derivadas de las
células 3LL-D122, ya fueran cultivadas in vitro, o provenientes de los tumores subcutáneos
o de las lesiones metastásicas de los pulmones (Figura 1D).
Adicionalmente en las Figuras 1B y 1C puede observarse que gangliósido NAcGM3 se
desdobló en dos bandas, hallazgo que indica heterogeneidad en la estructura de la
ceramida. Esto no se observó para el gangliósido NGcGM3.
Figura 1. Análisis químico e inmunoquímico del contenido gangliósidos extraídos de las
diferentes etapas del modelo tumoral murino de metástasis espontánea con 3LL-D122. A-C:
HPTLC de gangliósidos provenientes de (a) la línea tumoral 3LL-D122, (b) de los tumores
primarios, y (c): de las metástasis pulmonares. D: Identificación inmuno-química del
gangliósido NGcGM3 con el AcM 14F7. Leyenda: 1) patrón del gangliósido NGcGM3
(fuente: eritrocitos de caballo), 2) patrón del gangliósido NAcGM3 (fuente: eritrocitos de
perro).
De manera similar el análisis de los espectros de masa MALDI evidenciaron el proceso
típico de decarboxilación (m/z 1274) visto frecuentemente como parte del proceso de
ionización de estas moléculas, previo a sufrir la completa pérdida de los motivos de AS, en
el espectro correspondiente de las mezclas de tumores subcutáneos (Figura 2A) y las
metástasis (Figura 2B).
Una vez que se estableció inequívocamente la presencia de la entidad química en los
extractos lipídicos de las diferentes muestras celulares, se evaluó si el gangliósido NGcGM3
podría ser detectado en el material biológico intacto. Para esto se analizó la línea tumoral
3LL-D122 por citometría de flujo usando el AcM 14F7.
60
Resultados
Como se puede apreciar en la Figura 3, si bien se obtuvo una tinción marcada de las
células de mieloma P3X63 (NGcGM3-positivas, Figura 3A), fue nulo el reconocimiento de la
línea de carcinoma 3LL-D122 (Figura 3B) por el AcM específico, lo cual confirmó los
resultados químicos previos.
Figura 2. Espectros de masa por MALDI-TOF de los gangliósidos extraídos del tumor
primario (A) y de las lesiones metastásicas (B).
La comparación de los patrones de expresión del gangliósido NGcGM3 entre los tumores
primarios y las lesiones metastásicas se realizó mediante inmuno-histoquímica con el AcM
14F7. El resultado fue similar al obtenido con el HPTLC, es decir, los tumores primarios
mostraron una tinción positiva y menos intensa para el gangliósido NGcGM3 (Figura 3C),
que las correspondientes lesiones metastásicas (Figura 3D). En este último caso se
61
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
observó un patrón heterogéneo de inmunoreactividad con áreas de células del carcinoma
de pulmón mostrando una tinción citoplasmática difusa.
Figura 3. Detección del gangliósido NGcGM3 en las diferentes etapas del modelo de
metástasis espontánea con el carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122. A-B: Identificación
del gangliósido NGcGM3, mediante citometría de flujo con el AcM 14F7, en la línea tumoral
P3X63 (A) y en la línea tumoral 3LL-D122 (B). Leyenda: histograma relleno y gris: células
sin marcar, histograma gris claro sin relleno: marcaje de un AcM control de isotipo,
histograma negro sin relleno: marcaje con AcM 14F7. C-F: Identificación del gangliósido
NGcGM3 en cortes del tumor primario (C y E) y en cortes de metástasis pulmonares
espontáneas (D y F) del carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122, mediante inmunohistoquímica con el AcM 14F7 (C-D) o el AcM irrelevante 1E10 (E-F).
En conjunto, estos resultados apoyan la idea de la expresión del gangliósido NGcGM3
como marcador de malignidad en este modelo experimental.
4.2
El preparado vacunal NGcGM3/VSSP es inmunogénico en modelos animales
Para realizar la evaluación de la inmunogenicidad del preparado vacunal NGcGM3/VSSP
se utilizaron dos modelos animales. En un primer grupo de experimentos se utilizaron
pollos, pues son el modelo experimental más apropiado ya que, al igual que el hombre
62
Resultados
(Ozawa et al., 1992a), carecen de Ag N-glicolilados en los tejidos normales (Kawai et al.,
1991).
Para los experimentos de inmunogenicidad en pollos se utilizaron las variantes del
preparado vacunal NGcGM3/VSSP construidas con el gangliósido NGcGM3 aislado de
eritrocitos de caballo (NAg) y con el gangliósido NGcGM3 obtenido mediante síntesis
química (SAg). Previo a la evaluación de la inmunogenicidad de las dos variantes vacunales
(NAg/VSSP y SAg/VSSP) se corroboró la similitud antigénica de los dos gangliósidos Nglicolilados de diferentes orígenes. En la Figura 4A se puede apreciar que hubo diferencias
en los Rf de ambos gangliósidos, sin embargo, tanto el gangliósido NAg como el SAg
reaccionaron con al AcM 14F7 en un experimento de inmuno-tinción sobre placas de
HPTLC (Figura 4B), confirmando la antigenicidad similar de ambos gangliósidos NGcGM3.
Figura 4. Pureza e identidad del gangliósido NGcGM3 utilizado en el preparado vacunal
NGcGM3/VSSP. A: HPTLC teñidas con orcinol, B: Inmunotinción de los gangliósidos
corridos en HPTLC con el AcM 14F7. Leyenda: 1) patrón del gangliósido NGcGM3 (fuente:
eritrocitos de caballo, Rf: 0,5), 2) NAg (Rf: 0,5) y 3) SAg (Rf: 0,4).
Las dos composiciones del preparado vacunal NGcGM3/VSSP emulsionadas en Montanide
ISA51 (Seppic) y administradas de manera independiente a grupos de 10 pollos por vía IM,
generaron importantes niveles de Ac IgY contra el gangliósido NGcGM3 en el suero de la
totalidad de los animales (Figura 5A). Los valores de absorbancia a 405 nm de los sueros
pre-inmunes fueron inferiores a 0,1. La media de los títulos de Ac anti-NGcGM3 detectados
en los pollos inmunizados fue 1 280, independientemente de cuál Ag se usó para la
63
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
obtención del preparado administrado (p > 0,05, prueba t de Student para muestras no
pareadas), lo que indica que ambas preparaciones vacunales estimularon de igual manera
al sistema inmunitario.
Se observó además, mediante experimentos de FACS, que ambos anti-sueros
reconocieron de forma silimar al gangliósido NGcGM3 expresado en las membranas de la
línea tumoral P3X63 (Figura 5B-C).
Figura 5. Respuesta de Ac IgY anti-NGcGM3 en pollos tratados con los preparados
NAg/VSSP o SAg/VSSP, emulsionados en Montanide. A: Títulos de Ac IgY anti-NGcGM3
de 10 animales por grupo inmunizados por vía IM (columna: media de los valores, barra de
error: desviación estándar). Se aplicó la prueba t de Student para muestras no pareadas,
con un nivel de significación de 0,05 (p>0,05). B-C: Reconocimiento de la línea tumoral
P3X63 por los sueros inmunes obtenidos por la vacunación con NAg/VSSP/ Montanide (B),
o con SAg/VSSP/ Montanide (C). Leyenda: histograma negro relleno: células P3X63 sin
marcar, histograma gris claro: suero preimmune, histograma gris oscuro: Ac anti-IgYbiotina, histograma negro: suero inmune. IMF: intensidad media de fluorescencia.
En un segundo grupo de experimentos se evaluó la inmunogenicidad del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP (con Ag natural) sin adyuvante oleoso, en ratones C57BL/6, que es la cepa
de origen de la línea tumoral 3LL-D122. En los ratones el gangliósido NGcGM3 constituye
un Ag propio, por lo que evaluar la inmunogenicidad en este modelo es crítico para
demostrar que el preparado tiene la capacidad de movilizar la rama humoral de la respuesta
inmune.
64
Resultados
La evaluación de los niveles de Ac anti-NGcGM3 generados a partir de la administración
SC no emulsiva del preparado vacunal NGcGM3/VSSP en grupos de 10 ratones sanos se
realizó siete días después de la segunda dosis. Como se puede observar en las Figura 6, el
80% de los animales vacunados seroconvirtieron y desarrollaron respuestas de Ac antiNGcGM3 de tipo IgM e IgG, medidas como la absorbacia a 405 nm a una dilución fija del
suero (1/80), en el ensayo tipo ELISA descrito. Los valores de absorbancia a 405 nm de los
sueros pre-inmunes fueron inferiores a 0,1.
Figura 6. Inmunogenicidad del preparado vacunal NGcGM3/VSSP en ratones sanos. Diez
animales fueron inmunizados con 200 µg del preparado vacunal NGcGM3/VSSP
(NAg/VSSP) por vía SC los días cero y 14. La evaluación de los niveles de Ac antiNGcGM3 se realizó mediante ELISA con los sueros extraídos el día 21. Las figuras
muestran los valores de absorbancia a 405 nm de la dilución 1/80 del suero de los
animales.
Por otra parte, la evaluación de los niveles de Ac anti-NGcGM3 y anti-NAcGM3 en grupos
de cuatro ratones portadores del tumor 3LL-D122 evidenció que la presencia del tumor no
fue suficiente para generar una respuesta inmune humoral anti-gangliósidos (Figura 7) que,
como se mostró anteriormente en el acápite 4.1, se encuentran expresados en los tumores
del carcinoma de Lewis 3LL-D122.
Los ratones no vacunados, ya fueran sanos o portadores del tumor, no presentaron Ac antiNGcGM3 ni anti-NAcGM3. Después de la administración de dos dosis del preparado
vacunal NGcGM3/VSSP, los ratones portadores del tumor de Lewis 3LL-D122 generaron
65
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
Ac anti-NGcGM3 de tipo IgM e IgG (Figura 7A-B). Estos Ac no mostraron reactividad
cruzada con la variante N-acetilada del gangliósido GM3 (Figura 7C-D).
Figura 7. Inmunogenicidad del preparado vacunal NGcGM3/VSSP en ratones portadores
del tumor 3LL-D122. Los animales fueron inoculados con las células tumorales en la
almohadilla plantal el día cero, y posteriormente inmunizados con 200 µg del preparado
vacunal NGcGM3/VSSP por vía SC los días 7 y 21. La evaluación de los niveles de Ac antiNGcGM3 se realizó mediante ELISA con los sueros extraídos los días 24, 28 y 35, de
cuatro ratones por grupo cada día. Las figuras A-D muestran los valores de absorbancia a
405nm de la dilución 1/100 del suero de los animales, para Ac anti-NGcGM3 tipo IgM (A) e
IgG (B), y para Ac anti-NAcGM3 tipo IgM (C) e IgG (D). E: muestra las medianas de los
títulos de Ac IgM e IgG anti-NGcGM3 de los ratones portadores del tumor y vacunados.
Tres días después de la segunda dosis (día 24 en el gráfico de la Figura 7E) la mediana de
los títulos de Ac IgM anti-NGcGM3 fue 1/600, respuesta que en los siguientes 14 días
disminuyó hasta 1/200 (día 35 en el gráfico de la Figura 7E). Para la respuesta de Ac IgG
anti-NGcGM3, se observó que los títulos se elevaron desde 1/200 tres días después de
terminar el esquema de vacunación, hasta 1/600 luego de siete días, volviendo a alcanzar
niveles medios de 1/200 a los 14 días de concluido el tratamiento (Figura 7E).
66
Resultados
4.3
El preparado vacunal NGcGM3/VSSP disminuye las metástasis pulmonares en el
modelo murino estudiado
La actividad antitumoral del preparado vacunal NGcGM3/VSSP se evaluó en el modelo de
metástasis espontánea del carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122.
Con este propósito, grupos de 15 ratones C57BL/6 retados con las células tumorales 3LLD122 en la almohadilla plantal, fueron tratados con dos dosis del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP sin emulsión, o con SSTF (control), por vía SC, siete y 21 días después de
la inoculación del tumor.
El monitoreo del crecimiento de los tumores primarios en la pata de los animales no mostró
ningún efecto del preparado estudiado sobre la velocidad de crecimiento de los mismos, no
observándose diferencias estadísticamente significativas en los diámetros de los tumores al
comparar las curvas de crecimiento en los animales vacunados y los controles (p>0,05).
Como puede distinguirse en la Figura 8A, los tumores aparecieron en los dos grupos a la
misma vez, no observándose tampoco diferencias en los tiempos de prendimiento (p>0,05).
A los 18 días de implantado el tumor en la almohadilla plantal los tumores tenían un
diámetro promedio de 0,4 cm en todos los grupos. La remoción quirúrgica de los mismos se
realizó a los 26 días del implante tumoral, cuando el diámetro promedio de los tumores en
el grupo control fue superior a 0,8 cm. La incapacidad del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP de impedir el crecimiento de los tumores primarios se manifestó de forma
similar en todas las réplicas experimentales.
Para evaluar el efecto del tratamiento sobre las metástasis, los ratones se sacrificaron 21
días después de la cirugía del tumor primario. Como se observa en la Figura 8B, el grupo
control tratado con SSTF desarrolló metástasis en pulmones, por los elevados valores de
peso obtenidos (media 0,65 g). Los animales vacunados con NGcGM3/VSSP, tuvieron
67
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
significativamente menos metástasis pulmonares (p<0,05), según el peso de los pulmones
(media de 0,39 g), comparado con el grupo control.
Figura 8. Efecto del preparado vacunal NGcGM3/VSSP sobre las metástasis en pulmón, en
el modelo de metástasis espontánea del carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122. Treinta
ratones C57BL/6 se inocularon con células tumorales 3LL-D122 (2x105/ratón) en la
almohadilla plantal, de los cuales 15 se trataron con dos dosis del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP no emulsivo, por vía SC, siete y 21 días después de la inoculación del
tumor. Los otros 15 ratones recibieron SSTF (grupo control). A: Cinética de crecimiento de
los tumores primarios. Cada punto corresponde con la media de las observaciones y las
barras de error corresponden a los errores estándar. Se aplicó la prueba ANOVA de dos
vías, con un nivel de significación de p<0,05. B: Evaluación de la metastización a pulmón.
Las barras representan los valores de la media y las barras de error corresponden a los
errores estándar. Se aplicó la prueba t de Student, con un nivel de significación de p<0,05.
La Figura 9 muestra el meta-análisis realizado reuniendo los resultados de actividad antimetastásica de la vacuna NGcGM3/VSSP en 10 experimentos independientes con el
modelo murino de metástasis espontánea con 3LL-D122. La agrupación de los
experimentos permitió comparar el peso de los pulmones de 72 animales controles (media
del peso de pulmón: 0,75 g) y 98 vacunados (media del peso de pulmón: 0,42 g). La
aplicación de la prueba t de Student dió un valor de probabilidad inferior a 0,0001. Con el
meta-análisis se demostró la solidez del efecto antimetastásico del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP en el modelo murino de metástasis espontánea con 3LL-D122.
68
Resultados
Figura
9.
Solidez
del
efecto
antimetastásico del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP en el modelo murino
de metástasis espontánea con 3LLD122. Meta-análisis de los resultados
de 10 experimentos independientes.
Grupos de 7-10 ratones C57BL/6 se
incularon con células tumorales 3LLD122 (2x105/ratón) en la almohadilla
plantal y se trataron con dos dosis del
preparado en estudio, por vía SC, siete
y 21 días después del reto tumoral. Los
ratones control recibieron SSTF. Las
barras horizontales representan los
valores de la media y las barras de
error corresponden a los errores
estándar. Se aplicó la prueba t de
Student con un nivel de significación
de 0,0001.
En otro grupo de experimentos nos propusimos comparar el efecto obtenido por la
administración SC no emulsiva del preparado vacunal NGcGM3/VSSP, con la
administración emulsiva en Montanide ISA 51 (Seppic), ya que el mismo ha sido empleado
como adyuvante en esquemas de vacunación en cáncer.
Luego de la inoculación de las células tumorales 3LL-D122 en la almohadilla plantal de los
ratones, éstos fueron tratados con dos dosis del preparado vacunal NGcGM3/VSSP sin
adyuvante oleoso (por vía SC), o adyuvado en Montanide ISA 51 (por vía IM), siete y 21
días después de la inoculación del tumor. Los ratones control recibieron SSTF. Como se
puede observar en la Figura 10, ambas formulaciones del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP lograron la disminución de la metastización respecto al grupo control
(media peso pulmón de 0,64 g), no observándose diferencias estadísticamente
significativas entre los valores obtenidos con la formulación no emulsiva (media 0,37 g) y la
emulsiva (media 0,37 g).
69
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
Figura 10. Comparación del efecto
del
preparado
vacunal
NGcGM3/VSSP no emulsionado, y
emulsionado
con
Montanide.
Ratones C57BL/6 (7-10 por grupo)
se inocularon con células tumorales
3LL-D122 (2x105/ratón)
en la
almohadilla plantal, y se trataron con
dos dosis del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP
sin
adyuvante
oleoso (por vía SC), o adyuvado en
Montanide ISA 51 (por vía IM), siete
y 21 días después de la inoculación
del tumor. Los ratones control
recibieron
SSTF.
Las
barras
representan los valores de la media
y las barras de error corresponden a
los errores estándar. Se aplicó el
ANOVA
y
el
ensayo
de
comparaciones múltiples de Tukey,
con un nivel de significación de 0,01.
Letras diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas. Se
muestra un resultado representativo
de 2 experimentos realizados.
4.4
La presencia del gangliósido NGcGM3 en la vacuna es necesaria para la actividad
antitumoral del preparado NGcGM3/VSSP
Para estudiar la relevancia del gangliósido NGcGM3 en la actividad antitumoral del
preparado vacunal NGcGM3/VSSP, se realizaron experimentos antitumorales en el modelo
murino de metástasis espontánea de células 3LL-D122, utilizando como controles una
preparación construida con el gangliósido NAcGM3 (NAcGM3/VSSP) y otra a partir de las
proteínas solubilizadas de las VME de la Nm. Todos los preparados fueron administrados a
los animales por vía SC y sin el empleo de adyuvante oleoso.
Como se puede observar en la Figura 11, los tratamientos que no incluyeron al gangliósido
NGcGM3, dígase VME o NAcGM3/VSSP, no mostraron disminución significativa (p>0,05)
70
Resultados
de los pesos de los pulmones al compararlos con el grupo control.
Figura 11. Estudio de la
relevancia
del
gangliósido
NGcGM3
para
la
actividad
antimetastásica de la vacuna.
Tratamiento de ratones C57BL/6
(10 por grupo) en el modelo
murino de metástasis espontánea
con
el
preparado
vacunal
NGcGM3/VSSP, con las VME de
Nm
y
con
el
preparado
NAcGM3/VSSP. Se aplicó el
ANOVA
y
el
ensayo
de
comparaciones
múltiples
de
Tukey,
con
un
nivel
de
significación de 0,01. Letras
diferentes
indican
diferencias
estadísticamente significativas. Se
muestra
un
resultado
representativo de 2 experimentos
realizados.
Los valores de las medias de los pesos de pulmón fueron: 0,67 g para el grupo control, 0,60
g para el tratado con NAcGM3/VSSP y 0,60 g para VME; mientras que para el grupo al que
se le administró NGcGM3/VSSP la media de peso pulmonar fue de 0,40 g, valor inferior y
estadísticamente diferente a los anteriores.
4.5
La actividad antimetastásica del preparado vacunal NGcGM3/VSSP es independiente
de la vía de administración
Para evaluar si el efecto antimetastásico del preparado vacunal, en el modelo estudiado
depende de la vía de administración, se procedió a inmunizar con NGcGM3/VSSP por vía
SC, IM o IP a ratones C57BL/6 que fueron retados con las células tumorales según se ha
descrito anteriormente. La evaluación del efecto antimetastásico se realizó a través del
pesaje de los pulmones 21 días después de realizar la cirugía de los tumores primarios. En
este experimento el grupo control (tratado con SSTF) tuvo una media de peso de pulmón de
0,73 g (Figura 12).
71
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
Figura 12. Efecto del preparado
vacunal
NGcGM3/VSSP
administrado por vía SC, IM o IP, a
ratones C57BL/6 (15-16 por grupo)
retados con las células tumorales
3LL-D122 en la almohadilla plantal.
Las barras representan los valores
de la media y las barras de error
corresponden
a
los
errores
estándar. Se aplicó el ANOVA y el
ensayo
de
comparaciones
múltiples de Tukey, con un nivel de
significación de 0,0001. Letras
diferentes
indican
diferencias
estadísticamente significativas. Se
muestra
un
resultado
representativo de 2 experimentos
realizados.
Como se puede observar, las medias de peso pulmonar de los grupos vacunados fueron de
0,41 g (SC), 0,48 g (IM) y 0,40 g (IP); no existiendo diferencias significativas entre ellos, por
lo que el preparado vacunal NGcGM3/VSSP disminuyó la metastización a pulmón
independientemente de la vía por la que fue administrado. Los tres grupos vacunados
fueron estadísticamente inferiores al grupo control.
Este resultado podría indicar la capacidad del preparado vacunal de interactuar con
poblaciones de DC residentes en diferentes sitios.
4.6
La vacunación con NGcGM3/VSSP induce la maduración de células dendríticas
En el presente trabajo se evaluó in vitro e in vivo el efecto del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP sobre las DC.
En los experimentos in vitro, precursores de médula ósea de ratones C57BL/6 se
diferenciaron a cDC con medio rico en GM-CSF. Las cDC obtenidas se estimularon con
LPS y con el preparado vacunal NGcGM3/VSSP, y posteriormente se realizó la evaluación
72
Resultados
de la expresión de marcadores de maduración en la membrana celular por citometría de
flujo con Ac específicos. Como se puede observar en la Figura 13A, el preparado vacunal
NGcGM3/VSSP estimuló un 50% de células CD11c+CD40+, similar a como lo hizo el LPS
(45%), un inductor bien conocido de maduración de DC. La inducción de células
expresando la molécula coestimuladora CD86 por el preparado vacunal NGcGM3/VSSP fue
incluso superior (43%) que el provocado por el LPS (28%).
La expresión de la molécula CD1d también se examinó en las cDC obtenidas in vitro,
debido al papel de esta molécula en la presentación de Ag glicolipídicos a las células NKT
(MacDonald, 2002; Speak et al., 2008). Como se observa en la Figura 13A, sólo el 4,5% de
las cDC inmaduras fueron CD1d+, mientras que luego del tratamiento con el preparado
NGcGM3/VSSP, las DC CD1d+ aumentaron hasta el 27%.
A partir del conocimiento de que la IL-6 e IL-12 son citocinas importantes en la atracción de
otros mediadores celulares y la direccionalización hacia el patrón de respuesta Th1,
respectivamente, se midió la liberación de ambas citocinas en el sobrenadante de las cDC
diferenciadas
e
incubadas
con
cantidades
crecientes
del
preparado
vacunal
NGcGM3/VSSP. Como se muestra en la Figura 13B las cDC secretaron altos niveles de
IL-6 e IL-12, de manera dosis dependiente y similar a las tratadas con LPS (control
positivo).
Para confirmar estas evidencias en un escenario in vivo, tres ratones ratones C57BL/6 se
vacunaron por vía SC con NGcGM3/VSSP y luego de tres días se extrajeron los ganglios
linfáticos aferentes al sitio de inoculación (axilares), para evaluar por citometría de flujo la
expresión de las moléculas marcadoras de maduración en las células DC. Este análisis
mostró que el porcentaje de las DC en el ganglio linfático de los animales vacunados
aumentó tres veces respecto al control, así como también se incrementó la frecuencia de
73
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
DC maduras, lo cual se evidenció al analizar los porcentajes de células expresando las
moléculas CD40 (aumentó 10 veces), CD80 (4 veces) y CD86 (4 veces, Figura 13C).
Figura 13. Efecto del preparado vacunal NGcGM3/VSSP sobre DC convencionales. A-B:
bm-cDC se cultivaron toda la noche con LPS (1µg/ml), NGcGM3/VSSP (1µg/ml) o medio
(inmaduras) y se midió la frecuencia de células CD11c+ maduras (A) y la secreción de IL-6
e IL-12p40 (B). C: Ratones C57BL/6 (n=3) se inyectaron por vía SC con NGcGM3/VSSP. El
diagrama de barras muestra el porcentaje de células maduras CD11c+ en el linfonodo
aferente, tres días después del tratamiento con NGcGM3/VSSP o SSTF (control). Los datos
son representativos de dos experimentos independientes.
74
Resultados
A partir del resultado de actividad antitumoral por las diferentes vías de administración, se
estudió la capacidad de la vacuna de activar y madurar pDC, las cuales son residentes en
sangre y esenciales para la secreción de citocinas, como el IFNα que media la activación
de otras células del sistema inmunitario. Para ello, se purificaron las pDC del cultivo (en
medio enriquecido con FLT3-L) de precursores de médula ósea de ratones C57BL/6. Las
pDC obtenidas fueron cultivadas durante toda la noche con LPS, CpG-A y el preparado
vacunal NGcGM3/VSSP.
Como se puede observar en la Figura 14A, la adición del preparado NGcGM3/VSSP
provocó la maduración de las pDC inmaduras obtenidas in vitro, de manera similar a como
lo hizo el control positivo LPS y el CpG-A. Sin embargo, cuando se analizó la presencia de
IFNα en el sobrenadante del cultivo, sólo el CpG-A fue capaz de inducir la secreción de
dicha citocina (Figura 14B).
Adicionalmente se administró por vía IP el preparado NGcGM3/VSSP a tres ratones
C57BL/6 y se evaluaron los niveles de IFNα, IL-6 e IL-12 en el suero de los animales, en
intervalos de 2 h, mediante ELISA. Como se puede observar en la Figura 14C los niveles de
IFNα en suero se elevaron rápidamente en los animales tratados con el preparado vacunal,
obteniéndose un pico de secreción a las 2h, anterior incluso al pico de IFNα estimulado por
el Poli I:C. No se detectaron niveles de IFNγ en los sueros evaluados.
La detección in vivo de las citocinas IL-6 e IL-12 confirmaron el hallazgo in vitro del efecto
modulador que ejerce la vacuna sobre la funcionalidad de las DC.
Estos datos, en conjunto, muestran que el preparado vacunal NGcGM3/VSSP indujo una
fuerte respuesta de secreción de citocinas in vivo y la maduración in vitro de las DC
convencionales y las plasmacitoides.
75
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
Figura 14. Efecto del preparado vacunal NGcGM3/VSSP sobre DC plasmacitoides. A-B:
pDC purificadas a partir de bm-pDC, se cultivaron toda la noche con LPS (0,5 µg/ml), CpGA (5 µg/ml), NGcGM3/VSSP (0,1 µg/ml) o medio (inmaduras) y se midió la frequencia de
células B220+ maduras (A) y la secreción de IFNα (B). C: Tres ratones C57BL/6 fueron
inyectados por vía IP con NGcGM3/VSSP y se midieron los niveles de IFNα, IL6 e IL12 en
intervalos de dos horas en el suero por ELISA. Los datos son representativos de dos
experimentos independientes.
4.7
Las células NK y NKT están involucradas en la actividad anti-metastásica del
preparado vacunal NGcGM3/VSSP
Debido al gran potencial que tiene la respuesta inmune mediada por células NK1.1 para
erradicar células tumorales en varios modelos de metástasis en pulmón y teniendo en
cuenta la naturaleza glicolipídica del blanco seleccionado, se evaluó el papel de las células
NK y las células NKT (específicas por Ag no proteicos), en la actividad antimetastásica
demostrada para el preparado vacunal NGcGM3/VSSP en el modelo estudiado.
76
Resultados
Se realizó un primer acercamiento mediante experimentos de eliminación de dichas
poblaciones celulares, utilizando un AcM que elimina la población NK1.1+ in vivo. Los
controles de este experimento fueron el grupo tratado con SSTF (animales que desarrollan
metástasis en pulmones) y el grupo vacunado por vía SC con el preparado NGcGM3/VSSP
no emulsionado (control de que la vacuna disminuye la metastización), ambos sin
administrar el AcM que elimina la población a estudiar. Como se esperaba, el preparado
vacunal disminuyó la metastización a pulmón, pues se observaron diferencias
estadísticamente significativas entre los animales vacunados (media peso pulmonar: 0,36 g)
y los controles (media: 0,64 g) (Figura 15).
El papel de las células NK1.1+ se analizó a partir de la comparación entre los grupos control
y NGcGM3/VSSP, cuando a los mismos además, se les administró el AcM que eliminó la
población NK1.1+ (Figura 15).
Cuando los animales se trataron con una dosis de 1 mg de AcM anti-NK1.1 un día después
de la administración del preparado vacunal, se observó que el preparado vacunal fue
incapaz de disminuir la metastización a pulmón. Los valores de la media del peso de
pulmón corresponden a 0,93 g y 1,01 g, para control+anti-NK1.1 y NGcGM3/VSSP+antiNK1.1 respectivamente,
valores que compararlos estadísticamente no mostraron
diferencias significativas (p > 0,05). Este resultado sugiere que las células con el marcador
NK1.1 (tanto NK como NKT) están involucradas en la respuesta inmune contra las
metástasis de 3LL-D122, generada a partir de la vacunación con NGcGM3/VSSP, pues al
eliminar esta población se pierde el efecto anti-metastásico.
A partir de este resultado y con el objetivo de comprobar la movilización de las células con
el marcador NK1.1 al pulmón de los animales vacunados, se realizó otro experimento
donde animales del modelo de metástasis espontánea a pulmón con las células 3LL-D122
77
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
se trataron con el preparado vacunal NGcGM3/VSSP y tres días después se analizó el
infiltrado pulmonar por citometría con el objetivo de detectar la presencia de células NK
(NK1.1+CD3-) y NKT (NK1.1+CD3+).
Figura 15. Papel de las células NK1.1+
en la actividad antimetastásica del
preparado vacunal NGcGM3/VSSP. La
figura representa los valores de los
pesos de los pulmones en función del
tratamiento recibido. Grupos de 15
ratones C57BL/6 portadores del tumor
3LL-D122 en la almohadilla plantal,
fueron tratados con el AcM que elimina
las células NK1.1+, un día después de
cada dosis del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP. Los grupos controles
recibieron SSTF o SSTF+anti-NK1.1.
Las barras de columnas representan
los valores de la media y las barras de
error, la desviación estándar. Se aplicó
el
ANOVA
y
el
ensayo
de
comparaciones múltiples de Tukey, con
un nivel de significación de 0,05. Letras
diferentes
indican
diferencias
estadísticamente
significativas.
Se
muestra un resultado representativo de
2 experimentos realizados.
Como se puede observar en la Figura 16, en los animales controles el porcentaje de células
NK que infiltraron los pulmones fue el 9,5% y se incrementó 1,8 veces en los animales
vacunados (alcanzó el 16.8%).
Un resultado similar se obtuvo para la población NKT (NK1.1+CD3+), las cuales fueron el
2,7% de las células de los pulmones en los controles, mientras que en los vacunados
alcanzaron el 6,2%, mostrando un incremento de 2,3 veces.
78
Resultados
Figura 16. Frecuencia de células NK1.1+ en los pulmones de los ratones vacunados
portadores del tumor. Ratones C57BL/6 (n=3) portadores del tumor 3LL-D122, tratados con
NGcGM3/VSSP o SSTF (Control), se sacrificaron 3 días después de la segunda
administración de vacuna y se midió la frecuencia de células NK and NKT en los pulmones
por citometría de flujo. A: Gráficos de puntos de un animal representativo por grupo. B:
Gráfico de las frecuencias de células NK o NKT en el infiltrado pulmonar (porcentaje) en
tres animales de cada grupo. Los datos son representativos de dos experimentos
independientes. Se aplicó la prueba no paramétrica de comparaciones pareadas U de
Mann-Whitney (p<0.05).
4.8
Las células CD8 y CD4 participan en la actividad anti-metastásica del preparado
vacunal NGcGM3/VSSP
El papel de las células de la inmunidad adquirida, CD8 y CD4, sobre la actividad antitumoral
del preparado vacunal NGcGM3/VSSP, administrado por vía SC sin emulsión, se valoró
también en el modelo murino 3LL-D122 metastásico. En esta dirección, se procedió de
manera similar al análisis realizado para las poblaciones efectoras de la inmunidad innata.
En un primer grupo de experimentos se analizó el papel de las células CD8. La
comparación entre el grupo tratado con SSTF (media peso pulmón 0,67 g) y el grupo
vacunado con NGcGM3/VSSP (0,35 g), en ausencia del AcM que elimina la población CD8
(Figura 17A), mostró que el preparado vacunal inhibió la metastización a pulmón.
Cuando a ambos grupos de animales se les administró además el AcM que elimina la
población CD8, se observó la pérdidad del efecto antimetastásico obtenido con el
preparado vacunal NGcGM3/VSSP. En este caso, la media del peso de los pulmones de los
79
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
animales controles fue 0,47 g, y la de los animales vacunados fue 0,53 g, valores que no
mostraron diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05). Este resultado sugiere que
las células CD8 participan en la actividad antimetastásica observada al tratar a los animales
con el preparado vacunal NGcGM3/VSSP.
Figura 17. Papel de las células T CD8 y T CD4 en la actividad antimetastásica del
preparado vacunal NGcGM3/VSSP. La figura representa los valores de los pesos de los
pulmones en función del tratamiento recibido. Ratones C57BL/6 portadores del tumor 3LLD122 en la almohadilla planta, fueron tratados con el AcM que elimina las células CD8+ (A)
o ,con el AcM que elimina las células CD4+ (B), un día después de cada dosis del preparado
vacunal. Los grupos controles recibieron SSTF o SSTF + AcM anti-CD8 o SSTF + AcM antiCD4. Las barras de columnas representan los valores de la media y las barras de error, la
desviación estándar. Se aplicó el ANOVA y el ensayo de comparaciones múltiples de
Tukey, con un nivel de significación de 0,05. Letras diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas. Se muestran resultados representativos de 2 experimentos
realizados.
Para evaluar la participación de las células T CD4 se realizó en un experimento similar,
pero esta vez se administró un AcM que elimina la población CD4. Nuevamente la
disminución de la metastización del preparado vacunal, en ausencia del AcM que elimina la
población CD4, se verificó al observarse diferencias significativas entre el grupo tratado con
SSTF (media peso pulmón 0,69 g) y el grupo vacunado con NGcGM3/VSSP (0,36 g)
(Figura 17B). Los animales inmunizados con el preparado NGcGM3/VSSP y tratados con el
AcM anti-CD4, por el contrario, no disminuyeron significativamente el peso de los pulmones
(0,73 g) al compararlos con el grupo control al que también se le inyectó el AcM anti-CD4
(0,97 g, p > 0,05). Este resultado sugiere que las células CD4 están involucradas en la
80
Resultados
actividad antimetastásica observada al inmunizar a los animales con el preparado vacunal
NGcGM3/VSSP, ya que su ausencia implica la pérdida del efecto.
4.9
La vacunación con NGcGM3/VSSP promueve la infiltración de células efectoras de la
inmunidad adquirida al sitio metastásico
A partir de la observación de que el efecto anti-metastásico del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP en el modelo de cáncer de pulmón de Lewis dependía tanto de células T
CD4+ como de T CD8+, se procedió a determinar la frecuencia de estas poblaciones
celulares en los pulmones de ratones portadores del tumor 3LL-D122, tratados con SSTF o
inmunizados por vía SC con NGcGM3/VSSP (sin emulsión). Los animales (4-7 por grupo)
se sacrificaron veintiún días después de operados los tumores primarios. Los pulmones se
pesaron para comprobar el efecto antimetastásico del preparado vacunal, y se procesaron
para determinar la frecuencia de leucocitos mediante citometría de flujo. La mediana de
peso de pulmón del grupo control fue de 0,94 g, mientras que la del grupo vacunado fue de
0,34 g, diferencia que resultó estadísticamente significativa al aplicar la prueba de MannWhitney (p < 0,005). El porcentaje de células CD45+ infiltrantes del pulmón fue
significativamente superior en los pulmones de los ratones vacunados (74,7%) comparado
con los controles (28,5%) (Figura 18A).
Este incremento también se encontró en las poblaciones de células T, identificadas como
CD3+CD45+, CD3+CD4+ y CD3+CD8+, siendo en este orden: el 5,1%, el 1,0% y el 0,6% de
las células infiltrantes del pulmón de los animales controles, para alcanzar en el mismo
orden: el 23,1%, el 8,0% y el 2,8%, de las células infiltrantes del pulmón de los animales
vacunados (Figura 18A).
Se analizó adicionalmente el porcentaje de células T reguladoras (Tregs: CD4+Foxp3+) y de
células supresoras de origen mieloide (CD11b+Gr1+).
81
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
Figura 18. Frecuencia en pulmón de efectores celulares de la inmunidad adaptativa
inducidos por la vacunación SC con NGcGM3/VSSP en animales portadores de tumor de
Lewis 3LL-D122. Grupos de 4-6 ratones C57BL/6, retados con las células 3LL-D122,
controles o vacunados (Vac) fueron sacrificados 21 días después de operados los tumores
primarios. La frecuencia de células efectoras y reguladoras fue determinada en los
pulmones de los animales por citometría de flujo. A: Frecuencias de células CD45+, CD3+,
CD4+ o CD8+ en el total de células infiltrantes (porcentaje) en ratones vacunados y
controles. B: Frecuencia de poblaciones regulatorias, arriba: células T reguladoras
(CD4+Foxp3+) y abajo: células supresoras de origen mieloide (CD11b+Gr1+). Se empleó la
prueba no paramétrica de comparaciones pareadas U de Mann-Whitney, con un nivel de
significación de 0,01. Se muestran resultados representativos de 2 experimentos realizados.
La frecuencia de estas poblaciones reguladoras, a diferencia de las anteriores, fue similar
en ambos grupos de animales, no mostrando diferencias estadísticamente significativas en
ninguno de los dos casos. Las células Tregs representaron el 2,1% y el 4,4% de las células
infiltrantes del pulmón de los animales controles y vacunados, respectivamente. Los
porcentajes de células MDSC infiltrantes de pulmón fueron 2,3% y 5,3%, en animales
controles y vacunados, respectivamente (Figura 18B).
82
Resultados
4.10 El infiltrado de leucocitos correlaciona con la inhibición de la metastización provocada
por la vacunación con NGcGM3/VSSP
Para verificar el posible vínculo entre el infiltrado inmune inducido por la vacunación y el
efecto anti-metastásico, se correlacionaron los porcentajes de células CD45+, CD3+CD45+,
CD3+CD4+ y CD3+CD8+ obtenidos y los correspondientes pesos de los pulmones (como
subrogado de la metastización) de los ratones individuales. Mientras que los ratones
portadores de tumor no vacunados mostraron elevados pesos de pulmones (alta
metastización, mediana 0,94 g) con un bajo porcentaje de leucocitos y células T infiltrantes,
en los ratones vacunados los bajos pesos de pulmones (pocas metástasis, mediana 0,34 g)
estuvo asociado con un incremento en el porcentaje de éstas poblaciones (Figura 19A-B).
El análisis estadístico de estas dos variables reveló coeficientes r de correlación de Pearson
negativos, oscilando entre 0,855 y 0,498 (Figura 19C-D, Tabla 2), lo cual establece una
relación inversa entre el infiltrado celular inducido por la vacunación y la metastización del
tumor. La significación de la correlación obtenida (p < 0,05) para las células infiltrantes
CD45+, CD3+CD45+y CD3+CD4+ sostiene la idea de que estas células, correctamente
movilizadas a los pulmones en los animales vacunados, fueron responsables de controlar la
metastización. No se alcanzó significación para la correlación con las células CD3+CD8+.
Tabla 2. Coeficientes r de Pearson y valores de probabilidad de la correlación entre el
infiltrado de células efectoras de la inmunidad adaptativa, y la inhibición de la metastización
inducida por la vacunación SC con NGcGM3/VSSP.
% CD45+
% CD3+CD45+
%CD3+CD4+
%CD3+CD8+
Coeficiente r de Pearson
-0,8553
-0,7489
-0,6609
-0,4975
Valor de probabilidad
0,0002
0,0032
0,0139
0,0837
83
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
Figura 19. Correlación entre el infiltrado de células efectoras de la inmunidad adaptativa, y
la inhibición de la metastización inducida por la vacunación SC con NGcGM3/VSSP.
Ratones C57BL/6 controles o tratados con NGcGM3/VSSP por vía SC, retados con las
células 3LL-D122, se sacrificaron 21 días después de operar los tumores primarios y se
correlacionó la frecuencia de células (A-C) CD45+, CD3+, (B-D) CD4+ y CD8+ presentes en
los pulmones de los animales, con la metastización en pulmón (cuantificado como peso del
pulmón). A-B: representación de la relación entre el porcentaje de células infiltrantes y el
valor del peso de pulmón por grupo de animales (control o vacunado), C-D: correlación
entre el porcentaje de células infiltrantes y el peso de pulmón por población celular en el
total de los animales (control + vacunado). Se muestran resultados representativos de 2
experimentos realizados.
84
5. DÍSCUSÍON
Muchas estrategias se han llevado a cabo a lo largo de los años con el objetivo de controlar
el cáncer, debido al problema de salud que representa esta enfermedad a nivel mundial.
Entre ellas está la IT activa de cáncer, la cual se basa en el empleo de vacunas que
induzcan una respuesta inmune específica al Ag tumoral, capaz de eliminar el tumor y
proteger al paciente de la aparición de metástasis, con un beneficio en la supervivencia.
Dentro de estas, las vacunas basadas en gangliósidos han sido objeto de diferentes
estudios al tener en cuenta la expresión alterada de dichas moléculas en las células
tumorales (Ravindranath et al., 2003; Kavanagh et al., 2005) y a su baja inmunogenicidad
(Livingston, 1995a).
En el presente trabajo se estudió el mecanismo de acción del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP, cuyo blanco es el gangliósido NGcGM3 expresado específicamente en
varios tipos de tumores en humanos (Carr et al., 2000; Oliva et al., 2006; Blanco et al.,
2011a; Scursoni et al., 2011; Blanco et al., 2012; Zhong et al., 2012; Blanco et al., 2013).
Para este estudio se empleó el modelo murino de metástasis espontánea a pulmón con la
línea 3LL-D122 (Eisenbach et al., 1984). El modelo tiene un comportamiento muy similar a
la enfermedad metastásica que se presenta en los pacientes de cáncer, donde en muchos
casos las lesiones metastásicas se hacen evidentes un tiempo después de la cirugía de los
tumores primarios, y son las metástasis las que causan la muerte del paciente. En este
modelo tumoral no se había descrito la expresión del gangliósido NGcGM3. Por lo tanto,
primeramente se definió la presencia del gangliósido NGcGM3 en las etapas por las que
transita el modelo: línea celular, tumor primario y metástasis pulmonares.
Como primer resultado se encontró que el modelo fue coherente con el incremento de la
expresión del gangliósido NGcGM3 desde el tumor primario hasta la lesión metastásica en
85
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
pulmón (Figura 1), como se ha observado en muestras de pacientes de cáncer (Blanco et
al., 2011b; Hayashi et al., 2013). Este resultado permite su uso como modelo relevante para
evaluar el efecto de terapias antitumorales basadas en el gangliósido NGcGM3.
Los resultados obtenidos, relativos al cambio del patrón de sialilación, coinciden con los
estudios realizados por El-Abbadi y cols. (2001) en un modelo tumoral de metastización
espontánea a cerebro. Estos autores mostraron resultados análogos con respecto al
contenido total de AS en los gangliósidos de tumores que crecían subcutáneos (70% del AS
estaba en la forma de ácido NGcNeu) en relación con las células tumorales mantenidas en
cultivo (casi exclusivamente AS NAcNeu) (El-Abbadi et al., 2001). Además, otros autores
han asociado la capacidad metastásica de las células tumorales con el patrón de expresión
de gangliósidos y con cambios en la sialilación (Alessandri et al., 1987; Coulombe et al.,
1993; Makatsori et al., 1998). Yin y cols. (2010) propusieron que los cambios en la
sialilación se debían a la hipoxia que se genera en los tumores localmente avanzados y
demostraron que en condiciones de hipoxia se sobre-expresa el gen de la sialina, lo que
provoca el aumento de la expresión de gangliósidos N-acetilados y N-glicolilados en las
células tumorales (Yin et al., 2010). La aparición de gangliósidos N-glicolilados en ratones
está favorecida además por la acción de la enzima CMAH, que convierte el AS N-acetilado
en N-glicolilado (Hedlund et al., 2007; Chandrasekharan et al., 2010), mientras que en
pacientes se ha propuesto que es la dieta la fuente de AS N-glicolilado (Tangvoranuntakul
et al., 2003). La hipoxia afecta además la transcripción de genes asociados con la síntesis
de la ceramida (Yin et al., 2010), lo que explicaría los cambios en la movilidad de las
bandas en HPTLC del gangliósido NAcGM3 presente en los tumores SC y en las
metástasis (Figura 1B-C).
86
Discusión
El resultado obtenido en esta tesis, referente al incremento de la expresión del gangliósido
NGcGM3 en el modelo de metastización espontánea a pulmón con el carcinoma de Lewis
3LL-D122, apoya los resultados demostrados por otros autores acerca del papel del
gangliósido NGcGM3 en la progresión tumoral (de Leon et al., 2006; de Leon et al., 2008;
Gabri et al., 2009; Segatori et al., 2012a; Segatori et al., 2012b; Casadesus et al., 2013).
El empleo del gangliósido NGcGM3 sintético en el preparado vacunal confirmó el valor de
esta molécula como blanco de la IT de cáncer. Los resultados alcanzados demostraron que
los perfiles de inmunogenicidad contra el gangliósido NGcGM3 fueron equivalentes
independientemente del origen del Ag (Figura 5). Este resultado permite el desarrollo de un
producto vacunal más consistente desde un enfoque regulatorio.
Estudios previos de inmunización de ratones con otros candidatos vacunales basados en
gangliósidos también han sido exitosos en la generación de respuesta humoral contra estas
moléculas (Livingston et al., 1987; Livingston et al., 1989a; Livingston et al., 1989b;
Livingston et al., 1993; Dumontet et al., 1997; Dickler et al., 1999). La respuesta de Ac antigangliósidos ha sido fundamentalmente de isotipo IgM, y estos Ac han mediado la
protección en modelos animales retados con tumores que expresaban el gangliósido blanco
(Zhang et al., 1998). Los resultados obtenidos en la presente tesis, relativos a la
inmunogenicidad del preparado en pollos y ratones, coinciden con los resultados mostrados
por Estévez y cols. (1999), quienes describieron la generación de respuestas IgM e IgG con
preparaciones de los gangliósidos NAcGM3, NGcGM3 y GD3, en VSSP y adyuvante oleoso
(Estevez et al., 1999).
Adicionalmente, los resultados del actual trabajo de tesis mostraron como los Ac de los
sueros inmunes de los pollos vacunados con el preparado reconocieron a las células de
mieloma P3X63, que son gangliósido NGcGM3 positivas (Figura 5B). El ensayo clínico fase
87
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
I realizado con el preparado vacunal NGcGM3/VSSP /Montanide en pacientes de cáncer de
mama avanzado evidenció como todos los pacientes tratados desarrollan Ac anti-NGcGM3
(IgM e IgG) que median la citotoxicidad dependiente de complemento contra la línea
tumoral de mieloma P3X63, así como una marcada reactividad frente a muestras del
carcinoma ductal de mama (Carr et al., 2003). Estudios clínicos posteriores con el
preparado vacunal NGcGM3/VSSP /Montanide demostraron que los Ac anti-NGcGM3
generados por la vacunación, también son capaces de prevenir la disminución de la
expresión de la molécula CD4 en los linfocitos T, provocado por el gangliósido NGcGM3 (de
Leon et al., 2006; Mulens et al., 2010). Adicionalmente, el hallazgo de que AcM antiNGcGM3 median la muerte de las células tumorales por mecanismos independientes de la
acción del complemento (Roque-Navarro et al., 2008; Casadesus et al., 2013) permite
especular que los Ac anti-NGcGM3 generados por la administración del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP pudieran iniciar eventos de MCI que favorezcan la respuesta antitumoral.
Estudios futuros permitirán profundizar en el papel de los Ac generados con la vacunación.
En el presente trabajo se demostró el beneficio terapéutico de
la administración del
preparado vacunal NGcGM3/VSSP en los ratones portadores del tumor de Lewis 3LL-D122,
en el modelo de metastización espontánea a pulmón. Dos administraciones subcutáneas
del preparado vacunal en el escenario neoadyuvante (antes de la cirugía del tumor) sin
adyuvante oleoso, inhibieron las metástasis espontáneas en los pulmones de los animales
tratados (Figura 9). Conocer que el preparado NGcGM3/VSSP tiene una potente actividad
antimetastásica en régimen de administración terapéutico y sin adyuvante oleoso es el
principal aporte práctico de este trabajo. En las modalidades de vacunación de pacientes
con cáncer donde se ha usado un adyuvante oleoso, se ha preferido el Montanide ISA 51
(Aucouturier et al., 2002; Aucouturier et al., 2006). Sin embargo, el Montanide ISA 51 ha
dado lugar a la aparición de induraciones, enrojecimiento y dolor en el sitio de inoculación,
88
Discusión
además de entorpecer el movimiento de los efectores de células T CD8
+
generados por
vacunación hacia el microambiente tumoral (Hailemichael et al., 2013). Por todo esto una
preparación vacunal que no contenga este componente y que además mantenga sus
propiedades antitumorales sería un mejor candidato a considerar para ser aplicado en
pacientes de cáncer.
Otro grupo de experimentos realizados en el modelo metastásico demostraron la relevancia
de la presencia del gangliósido NGcGM3 en el preparado vacunal, para lograr el efecto
antitumoral observado. En este sentido, los experimentos con el preparado NAcGM3/VSSP
y con las VME de la Nm mostraron que la respuesta antimetastásica frente a la terapia fue
dependiente de la inclusión del Ag en el preparado (Figura 11). Estos resultados, unidos al
incremento de la expresión del gangliósido NGcGM3 en las metástasis (73.4% de los
monosialo-gangliósidos) con respecto a los tumores primarios (32.2%), demostraron que la
presencia del gangliósido NGcGM3 en el tumor es crítica para la actividad antitumoral del
preparado vacunal NGcGM3/VSSP. Un resultado comparable fue descrito por Segatori y
cols. (Segatori et al., 2012a), al clonar el ARN mensajero murino del gen de la enzima
CMAH, que cataliza la síntesis del AS N-glicolil neuroamínico, y transfectar la línea celular
murina de melanoma B16. Al usar las células transfectadas (B16-H) como modelo tumoral
NGcGM3-positivo para la evaluación de la actividad terapéutica del preparado vacunal
NGcGM3/VSSP, estos autores demostraron que la presencia del gangliósido NGcGM3 es
crítica para la actividad antitumoral, ya que sólo observaron el efecto en aquellos animales
que desarrollaron los tumores de la línea B16-H y no en aquellos donde se implantaron las
células tumorales parentales B16 (NGcGM3 negativas, NAcGM3 positivas) o las B16-H que
habían perdido la expresión del gangliósido NGcGM3. Estos resultados sustentan la
necesidad de pre-definir la presencia del gangliósisdo NGcGM3 en las muestras de
89
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
biopsisas de los tumores de los pacientes que eventualmente serán sometidos a
tratamiento.
La inmunidad protectiva es el resultado de la interrelación de dos sistemas fundamentales:
la inmunidad innata no Ag específica y la inmunidad adquirida Ag específica. Un vínculo
esencial entre la inmunidad innata y la adaptativa es suministrado por las células
presentadoras de Ag, entre las cuales las DC son las más eficientes inductoras de las
respuestas inmunes. Por otra parte, se conoce que la ruta de administración es un factor
crítico que influye la respuesta inmune asociada a la vacunación. En este trabajo, se
describió que el efecto antimetastásico obtenido con el preparado vacunal NGcGM3/VSSP
sobre el modelo de metástasis espontánea utilizado, es independiente de la vía de
administración (Figura 12). Este resultado inesperado, nos permitió sugerir que el
preparado vacunal sería capaz de activar poblaciones de DC residentes en diferentes sitios.
En este sentido, se conoce que las rutas SC e IM involucran típicamente a las cDC y que la
vía IP implica a las pDC. Nuestros resultados mostraron que el preparado vacunal
NGcGM3/VSSP promovió el incremento, la maduración y la secreción de IL-12 e IL-6 por
las cDC. La IL-12 producida por las DC es crucial para el desarrollo de respuestas tipo Th1
(Chamilos et al., 2008; Gilliet et al., 2008b). Por otra parte, se conoce que la producción de
IL-6 por las DC es crítica para la activación de células T y que da lugar a células T Agespecíficas, que son refractarias a la actividad supresora de las células T (Kmieciak et al.,
2011). Nuestros resultados están de acuerdo con los publicados por Mesa y cols. (2006),
quienes con la variante acetilada del gangliósido NAcGM3 incluido en las VME de Nm
(NAcGM3/VSSP), demostraron una potente activación y secreción de citocinas por las DC
después del tratamiento con el preparado (Mesa et al., 2006b). En conjunto, estos
resultados sugieren que el componente bacteriano del preparado vacunal es importante
para la activación y la funcionalidad de las APC.
90
Discusión
En contraste con las cDC, las pDC han sido descritas como células secretoras de IFN tipo I
luego de la estimulación a través de sus receptores endosomales TLR, lo cual constituye la
línea inicial de defensa del hospedero frente a las infecciones virales (Gilliet et al., 2008a;
Swiecki et al., 2010). Varios estudios han indicado que las pDC activadas, asociadas al
tumor, son importantes para la regresión de tumores en modelos murinos (Vermi et al.,
2011). En esta dirección, un resultado significativo fue el obtenido al demostrar que el
preparado vacunal NGcGM3/VSSP promovió la maduración de las pDC diferenciadas a
partir de precursores de médula ósea (Figura 14). Sin embargo, esas pDC maduras no
produjeron niveles detectables de IFNα en el sobrenadante del cultivo. El rápido incremento
de los niveles de IFNα en el suero de los animales luego de la administración IP del
preparado vacunal, sugiere la activación in vivo de las pDC por una vía indirecta, o la
participación de otras poblaciones celulares, como los macrófagos, que son capaces de
secretar IFNα en respuesta a determinados estímulos.
Otro resultado importante es el aumento de la expresión de la molécula CD1d en las cDC
derivadas de precursores de médula ósea, luego de la incubación con NGcGM3/VSSP, al
considerar la naturaleza glicolipídica del gangliósido NGcGM3 (Figura 13A). La expresión
de la molécula CD1d es esencial para la selección y activación de las células NKT
(Moodycliffe et al., 2000; MacDonald, 2002). En ratones, la molécula CD1d ha sido
detectada en APC profesionales, incluyendo monocitos, macrófagos y algunas poblaciones
de DC (Spada et al., 2000; Kmieciak et al., 2011). En la literatura se ha descrito que los
niveles de expresión de la molécula CD1d pueden ser modulados durante procesos
infecciosos (Lin et al., 2005). Skold y cols. (2005) revelaron que la expresión de la molécula
CD1d en la superficie celular de las APC es regulada y afecta la activación de células T
bajo determinadas condiciones fisiológicas (Skold et al., 2005). El aumento de la expresión
de la molécula CD1d depende de dos señales, una dada por el IFNγ y la otra mediada por
91
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
productos microbianos o por la citocina proinflamatoria TNF. Asimismo, Raghuraman y cols.
(Raghuraman et al., 2006) demostraron que la infección intracelular con el patógeno Listeria
monocitogenes conduce a la sobre-expresión de la molécula CD1d, y que además el IFNβ
mediaba esta sobre-expresión. Los cambios en la expresión de la molécula CD1d en la
superficie de las DC soportan la idea de la activación de células NKT durante la
inmunización con el preparado vacunal NGcGM3/VSSP.
En nuestro trabajo se comprobó mediante el experimento de eliminación de poblaciones
celulares, que la actividad antimetastásica del preparado vacunal NGcGM3/VSSP en
ratones C57BL/6 portadores del tumor de Lewis 3LL-D122, dependía de las células NK1.1
positivas (Figura 15). Los resultados obtenidos mostraron un aumento de la población
celular NK en los pulmones de estos animales, lo que constituye la primera evidencia de
movilización de células efectoras del sistema inmunitario innato por esta vacuna, al órgano
donde se efectúa la respuesta antimetastásica. Una gran cantidad de estudios clínicos y
pre-clínicos se han enfocado a la inducción de respuesta celular contra el tumor, la cual
incluye la generación de células NK y linfocitos CTL específicos. Sin embargo, existen
pocos estudios que demuestren la capacidad que tienen las vacunas, ya sean celulares o
moleculares, para movilizar células NK. En este sentido, se informó por Chaput y cols.
(Chaput et al., 2006) que un preparado vacunal compuesto por exosomas derivados de
DCs expande células NK activadas en pacientes con melanoma y cáncer de pulmón. Otros
autores con la vacuna Oncophage, compuesta por la proteína de estrés térmico gp-96
derivada de melanoma o colon, lograron la activación de células NK en los pacientes
tratados, lo cual contribuye al desarrollo de una respuesta primaria de células T y a una
disminución del tumor (Pilla et al., 2006).
92
Discusión
Para el caso particular de las vacunas que contienen como entidad molecular a los
gangliósidos no existen estudios relacionados con la movilización y activación de células
NK. En la literatura consultada se encontró un trabajo que demostró el aumento de células
NK activadas en ratones transgénicos para Ac IgM contra el GD2, retados con el tumor EL4 que expresa dicho gangliósido. Debido a este hallazgo, los autores especularon que las
células NK pudieran ser activadas por Ac anti-gangliósidos o que dichos Ac, al neutralizar el
GD2 secretado por los tumores, pudieran revertir la supresión de las células NK
(Kawashima et al., 2003).
Teniendo en cuenta que la vacuna NGcGM3/VSSP, contiene como entidad molecular un
gangliósido, el cual pudiera ser presentado en la molécula CD1d y producir activación de
las células NKT, se decidió estudiar el comportamiento de esta población linfocitaria una
vez vacunados los animales portadores del tumor 3LL-D122. En nuestro trabajo se obtuvo
un aumento estadísticamente significativo de la frecuencia de las células NKT en los
pulmones de los animales tratados que fueron vacunados con NGcGM3/VSSP en
comparación con el grupo control (Figura 16). En ratones las células NKT son capaces de
reconocer al gangliósido GD3 (Wu et al., 2003) y al NAcGM3 (Park et al., 2008),
presentados en la molécula CD1d y dar una respuesta contra estos Ag. Por otra parte, las
células NKT desempeñan un importante papel en la respuesta contra tumores (Zhang et al.,
2006). Estudios sucesivos serían necesarios para profundizar la relación entre el
gangliósido NGcGM3 y la biología de las células NKT.
Los linfocitos CTL no están relacionados con la respuesta immune a los gangliósidos
debido a la naturaleza glicolipídica de estas moléculas (Livingston, 1995b). Sin embargo, el
hallazgo de vitiligo en tres de 12 pacientes de melanoma cutáneo avanzado tratados con el
preparado vacunal NGcGM3/VSSP (Osorio et al., 2008), propició la búsqueda de esta
población en los animales vacunados portadores del tumor de Lewis. Los resultados
93
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
obtenidos con el modelo murino empleado, sugieren la contribución de una respuesta
inmune celular CTL en el efecto antimetastásico generado por la vacunación con
NGcGM3/VSSP.
Luego de utilizar experimentos de eliminación específica de poblaciones celulares in vivo,
en el presente trabajo de tesis se demostró la participación de las células T CD8+ y T CD4+
en la capacidad del preparado vacunal de inhibir la metastización de las células 3LL-D122 a
pulmón. El efecto antimetastásico del preparado vacunal NGcGM3/VSSP se abrogó en los
animales deficientes de las células T CD8+ o T CD4+ (Figura 17). A partir de este resultado,
se evaluó la frecuencia de estas poblaciones en los pulmones de los animales portadores
del tumor 3LL-D122, veintiún días después de eliminar mediante cirugía los tumores
primarios. Los resultados alcanzados mostraron un incremento del infiltrado de células
CD45+ en los pulmones de los animales vacunados con respecto a los animales controles,
así como también se observó el incrementó del porcentaje de los linfocitos T CD4+ y T CD8+
(Figura 18). Mazorra y cols. (2008) realizaron experimentos similares de eliminación in vivo
de poblaciones inmunes, en el modelo tumoral de melanoma, mediante la administración
preventiva de un preparado análogo basado en el gangliósido NAcGM3, y demostraron la
contribución de las células T CD8+, pero no de células T CD4+, ni de células NK1.1+ en la
fase efectora de la respuesta inmune antitumoral (Mazorra et al., 2008).
Se ha descrito que el análisis, localización y orientación funcional de las diferentes
poblaciones celulares inmunes infiltrando los tumores humanos, conocido como el inmuno
contexto (Galon et al., 2007), ha permitido la identificación de componentes del inmuno
contexto cuya presencia puede ser utilizada como marcador pronóstico para los pacientes.
Los resultados obtenidos en esta tesis constituyen las primeras evidencias de la
movilización de células efectoras del sistema inmunitario innato y adaptativo hacia el sitio
94
Discusión
metastásico en ratones portadores de tumor, por una vacuna basada en un gangliósido. De
la misma forma, el infiltrado de leucocitos en los pulmones metastásicos, así como de
células TCD4+, correlacionó con la inhibición de la metastización provocada por la
vacunación con NGcGM3/VSSP (Figura 19). Varios autores han encontrado una fuerte
asociación entre el infiltrado linfocítico en los tumores y el beneficio clínico, en diferentes
tipos de cáncer, donde se incluye el cáncer de pulmón. Recientemente, en tumores
provenientes de pacientes con cáncer colo-rectal se demostró una clara asociación entre la
alta densidad de células totales T CD3+, T CD8+ citotóxicas y células T CD45RO+ de
memoria, con una mayor supervivencia libre de enfermedad y supervivencia total (Galon et
al., 2006; Fridman et al., 2012). No obstante, el análisis del efecto de las poblaciones de
células T CD4+ en la respuesta clínica ha derivado en aparentes resultados contradictorios,
por lo que la participación de estas células o sus efectos sobre las respuestas antitumorales
continúa siendo materia de debate en la actualidad. Estudios futuros serán necesarios para
estudiar la actividad funcional y la especificidad de la respuesta generada.
El análisis conjunto de los resultados obtenidos en esta tesis permiten pensar que en el
mecanismo de acción del preparado vacunal NGcGM3/VSSP los Ac anti-NGcGM3 serían
los efectores primarios que facilitarían la interacción de las DC con los tumores y
desencadenarían una respuesta efectora de las células NK1.1+ y de las células de la
inmunidad adaptativa. En este sentido se propone que los Ac anti-NGcGM3 generados por
la administración del preparado NGcGM3/VSSP en individuos con tumores que porten el
gangliósido NGcGM3, secuestren al gangliósido y ayuden a restaurar la inmunidad del
hospedero, a la vez que desencadenen la lisis de las células tumorales por mecanismos
diversos que incluyan la MCI. Los Ac anti-NGcGM3 generados pudieran además ayudar a
las células NK1.1+ estimuladas por la vacunación a destruir las células tumorales, lo que
liberaría nuevos Ag, así como mediadores solubles o de superficie, que constribuirán a la
95
Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
atracción y estimulación de las DC activadas por la vacunación. Este ambiente inflamatorio
propiciará la interacción entre las células de la inmunidad innata y el desencadenamiento de
la respuesta de células efectoras de la inmunidad adaptativa (ver esquema en Anexo 1).
96
6. CONCLUSÍONES
1. El carcinoma pulmonar de Lewis 3LL-D122 aumenta la expresión del gangliósido
NGcGM3 en la misma medida que se incrementa el grado de malignidad, lo que lo
hace un modelo apropiado para el estudio de terapias contra el cáncer basadas en
este Ag tumoral.
2. El preparado vacunal NGcGM3/VSSP es inmunogénico en animales y los perfiles de
inmunogenicidad son similares para el gangliósido NGcGM3 de origen natural y
sintético, lo cual propicia su desarrollo como vacuna de cáncer.
3. La vacuna terapéutica NGcGM3/VSSP posee un efecto anti-metastásico en el
modelo de carcinoma pulmonar de Lewis 3LL, independientemente del carácter
emulsivo de la formulación empleada y de la ruta de administración, y dependiente
de la presencia del Ag en el preparado vacunal, lo que refuerza su valía como medio
para la ITAE de cáncer.
4. La actividad anti-metastásica de la vacuna NGcGM3/VSSP depende de la
participación de efectores celulares de la inmunidad adaptativa y de la inmunidad
innata.
5. El efecto anti-metastásico de la vacuna NGcGM3/VSSP depende significativamente
de la movilización de células TCD4+ en el órgano diana de la metastización, lo cual
le incorpora un nuevo atributo relativo a su capacidad inmunomoduladora.
97
7. RECOMENDACÍONES
1. Estudiar el papel de los anticuerpos en la actividad antitumoral del preparado
vacunal NGcGM3/VSSP.
2. Identificar si el preparado vacunal NGcGM3/VSSP moviliza células NKT con
especificidad por el gangliósido NGcGM3.
3. Estudiar la especificidad de las células de la inmunidad adquirida involucradas.
4. Estudiar la participación de otras poblaciones de la inmunidad innata, como los
macrófagos.
99
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125
9. ANEXOS
Anexo 1. Esquema del mecanismo de acción del preparado vacunal NGcGM3/VSSP.
Leyenda:
127
AUTOBÍBLÍOGRAFÍA
Publicaciones relacionadas con el tema de la tesis:
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2. International Workshop (IT2010), 2010. Direct validation of NGcGM3 ganglioside as a new
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3. X Congreso de Oncología, 2009. NGcGM3/VSSP vaccine: Preclinical studies of the
mechanism of action. Presentación Oral.
4. 1er Congreso Internacional de Farmacología de Vacunas (VacciPharma), 2009. Cellular
immune response dependence for antimetastatic effect of a tumor associated gangliosidecontaining vaccine. Cartel.
5. Inmunología 2008. VI Congreso Nacional de Inmunología, 2008. Efecto antimetastásico de la
vacuna NGcGM3/VSSP en un modelo de metástasis pulmonar espontánea. Cartel.
6. International Workshop (IT2008), 2008. Cellular immune response dependence for
antimetastatic effect of a tumor associated ganglioside-containing vaccine. Presentación
Oral.
7. International Workshop “Immunotherapy for the new century”, 2004. Inhibitory effect of
NGcGM3/VSSP vaccine on metastasis in mice. Cartel.
8. International Workshop “Immunotherapy for the new century”, 2004. Antitumor activity of
VSSP∕GM3 vaccine depends on CD4+ and CD8+ T lymphocytes. Cartel.
Otras publicaciones de la autora:
1.
Prete, F., Catucci, M., Labrada, M., Gobessi, S., Castiello, M. C., Bonomi, E., Aiuti, A., Vermi,
W., Cancrini, C., Metin, A., Hambleton, S., Bredius, R., Notarangelo, L. D., van der Burg, M.,
Kalinke, U., Villa, A. and Benvenuti, F. (2013). "Wiskott-Aldrich syndrome protein-mediated
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Mecanismos inmunológicos asociados a la vacunación con NGcGM3/VSSP
2.
Labrada, M., Alonso, D.F., Gabri, M., Clavell, M., Bebelagua, Y., de León, J., Fernández, L.E.
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de León, J., Fernández, A., Clavel, M., López, A. , Labrada, M., Bebelagua, Y. , Mesa, C.,
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