TP Nro 6 Validación de Métodos Analíticos 1. Introducción: La

TP Nro 6
Validación de Métodos Analíticos
1. Introducción:
La validación de un método es el procedimiento por medio del cual se definen los
requerimientos analíticos y se confirma que el método en consideración cumple las
condiciones de necesarias.
Esto implica que es necesario evaluar esas características de performance de los métodos
utilizados. Queda sobreentendido que el equipamiento utilizado en la validación se encuentra
adecuadamente calibrado y funcionando correctamente dentro de las especificaciones.
Además, el personal que lleva a cabo estos estudios debe ser experimentado y competente,
tener suficiente conocimiento sobre la técnica en cuestión para poder tomar decisiones
acertadas a medida que avanza el estudio.
Los parámetros más importantes que se evalúan durante el proceso de validación son:
 Selectividad
 Linealidad
 Sensibilidad: límite de detección, límite de cuantificación
 Exactitud
 Precisión: repetibilidad, precisión intermedia, reproducibilidad
 Incertidumbre
 Robustez
La definición de cada uno de estos parámetros se encuentra en el anexo I de esta guía.
Una vez que se está trabajando con un método validado es necesario demostrar que en todo
momento el mismo cumple con los criterios de aceptación previamente definidos. Para ello
deben utilizarse muestras cuyos resultados sean conocidos y efectuar controles de calidad
programados.
2. Objetivo:
El objetivo del presente trabajo es definir rango lineal, límite de cuantificación, límite de
detección, exactitud, repetibilidad y precisión intermedia a partir de datos obtenidos en el
laboratorio en el desarrollo de una metodología analítica para detección del antibiótico
cefquinome en carne de cerdo.
3. Datos
Los datos necesarios para calcular cada uno de los parámetros se encuentran en el anexo II de
esta guía. Para los cálculos se utilizará el programa Excel.
4. Resultados
A partir de los resultados presentados en el punto 3. defina los siguientes parámetros del
método
4.1. Linealidad y rango lineal
4.2 Límite de cuantificación
4.3 Exactitud
4.5 Repetibilidad
4.6 Explique de qué manera se preparan las muestras que se utilizarán para el desarrollo de la
validación
4.7 Explique qué ensayo debería realizar para conocer la reproducibilidad del método. ¿En
qué momento de la validación considera que debe realizarse este paso?
4.8 Además de los parámetros de validación del método, ¿qué debe definirse para determinar
si el mismo podrá cumplir con el propósito para el cual fue desarrollado?
ANEXO I
DEFINICIONES
Validación de métodos analíticos
Son innumerables las razones para realizar mediciones analíticas, por ejemplo evaluar la calidad de
agua para consumo, realizar con éxito estudios farmacológicos, apoyar al cuidado de la salud,
determinar la presencia de residuos de metales pesados. Cada aspecto de la sociedad es mantenido de
alguna manera por mediciones analíticas.
Es importante determinar el resultado correcto y poder determinar que es correcto ya que el
resultado que emita el laboratorio permitirá tomar decisiones que condicionará el destino del
producto en cuestión. Para que un resultado analítico sea específico para tal propósito debe ser
suficientemente confiable para que cada decisión basada en él pueda ser tomada con confianza.
La validación bioanalítica de un método incluye todos los procedimientos que demuestran que un
método particular usado para medir cuantitativamente analitos en una determinada matriz biológica,
tales como sangre, plasma, suero, u orina es confiable y reproducible para el propósito previsto.
Generalmente el laboratorio que desarrolla y valida un método se basa en una guía que proporciona
recomendaciones, aunque estas recomendaciones pueden ajustarse o modificarse dependiendo del
método específico usado. El laboratorio también debe decidir que parámetros se deben caracterizar
para validar el método y confirmar mediante la provisión de evidencia objetiva que los requerimientos
particulares para tal propósito específico fueron realizados.
Decidiendo el nivel de validación requerido
Los métodos analíticos publicados a menudo se modifican para satisfacer los requisitos del laboratorio
que realiza el análisis. Estas modificaciones se deben validar para asegurar el funcionamiento
conveniente del método analítico. Los diferentes tipos y niveles de la validación se definen:
Validación completa: La validación completa es importante al desarrollar e implementar un método
analítico por primera vez, o para determinar una droga nueva o si se determinan metabolitos en la
cuantificación de una droga en un análisis existente
Validación parcial: Las validaciones parciales son modificaciones de métodos analíticos ya validados.
La validación parcial puede extenderse de tan poco como una determinación de la exactitud y de la
precisión intra-laboratorio a una validación casi completa. Los cambios analíticos típicos del método
que caen en esta categoría incluyen por ejemplo: transferencias del método analítico entre
laboratorios o analistas; cambios en la metodología analítica (por ej., cambio en el sistema de
detección); cambios en el anticoagulante usado en la recolección del fluido biológico; cambios en la
matriz dentro de la especie (ej., plasma humano y orina humana) o cambios de la especie dentro de la
misma matriz (ej., plasma de rata y plasma humano). También si se realizan cambios en el
procesamiento de la muestra o se debe demostrar la selectividad de un analito en presencia de
metabolitos específicos, entre otros.
La fase del desarrollo del método define el análisis químico. La guía internacional Bioanalytical
Method Validation, Guidance for Industry, 2001, define los parámetros a determinar para realizar la
validación de un método bioanalítico: linealidad, selectividad, exactitud, precisión, recuperación,
límite de cuantificación y estabilidad.
Linealidad es la capacidad de una metodología analítica para obtener resultados
directamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito en un rango
definido. Se determina mediante la elaboración de una curva de calibración, la cual relaciona la
respuesta del instrumento y concentraciones conocidas del analito. La curva se debe preparar en la
misma matriz biológica de las muestras, fortificando la matriz con concentraciones conocidas del
analito. De esta manera se define rango lineal: es el intervalo entre la concentración superior e
inferior de analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del
método descrito.
Selectividad es la capacidad de un método analítico de distinguir y de cuantificar el analito en
presencia de otros componentes presentes en la muestra, como ser, componentes endógenos de la
matriz, metabolitos, productos de la descomposición, impurezas.
La exactitud describe la proximidad entre el resultado obtenido y el valor considerado como
verdadero (concentración nominal) del analito. Se expresa como el error relativo (ER). Este
parámetro puede ser referido como recuperación. La recuperación describe la eficacia de la
extracción de un proceso analítico. El recupero de un analito se obtiene comparando la
respuesta del detector obtenida de una muestra fortificada con una cantidad conocida del
analito extraída desde la matriz biológica con la respuesta obtenida del detector para la misma
concentración de estándar analítico, el cual representa el 100% de recupero. La recuperación se
debe demostrar para 3 concentraciones (baja, media y alta) del rango lineal.
La precisión describe la proximidad de los valores de una serie repetida de ensayos analíticos que se
realizan sobre una muestra homogénea. Se expresa como coeficiente de variación (CV).
Precisión y exactitud deben determinarse para al menos 3 concentraciones en el rango lineal.
límite de cuantificación (LDC): Se define como la cantidad mínima de un analito en una muestra que
se puede determinar cuantitativamente con la precisión y la exactitud convenientes. El punto mas bajo
de la curva de calibración se debe aceptar como el límite de la cuantificación si se cumplen las
siguientes condiciones:
-
La respuesta del analito en el LDC debe ser por lo menos 5 veces la respuesta comparada a la
respuesta de un blanco.
El pico del analito debe ser identificable, discreto, con una precisión inferior a 20% y exactitud
de ± 20%.
Estabilidad: La estabilidad de la droga en la matriz biológica es una función de las condiciones de
almacenaje, de las características químicas de la droga, de la matriz, y del tipo de envase. Los
procedimientos de la estabilidad deben evaluar la estabilidad de los analitos durante la recolección y
manipulación de la muestra, almacenaje a largo plazo (congelado en la temperatura prevista del
almacenaje) y a corto plazo (en la mesada de trabajo a temperatura ambiente), y después de pasar
ciclos de congelado y descongelado. Las condiciones usadas en experimentos de la estabilidad deben
reflejar las situaciones probablemente que se encontrarán durante la manipulación y el análisis real de
la muestra.